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在创伤后膝盖骨关节炎的大鼠模型中,类似于临床的冷冻疗法可改善足迹模式并减少滑膜炎症

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发表时间:2019-10-10 09:44作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

在创伤后膝盖骨关节炎的大鼠模型中,类似于临床的冷冻疗法可改善足迹模式并减少滑膜炎症


摘要

冷冻治疗是一种非药物治疗,通常用于控制急性创伤后炎症和改善功能。然而,关于其对慢性关节疾病如膝关节骨关节炎(KOA)的影响还没有明确的发现。本研究的目的是研究临床类冷冻疗法对前交叉韧带横断(ACLT)所致大鼠膝关节骨关节炎模型的功能损害和滑膜炎症的影响。三十二男Wistar将大鼠随机分为对照组、KOA组、KOA+冷冻组和KOA+安慰剂组,每组8只。最后两组接受相关干预,每天两次,共5天(61至65次),每次20分钟。在ACLT手术前和术前(60)分别进行步态试验、皮肤温度、热反应阈值和关节肿胀的评估。TH日)和邮政(66天)TH(日)干预方案。第66天处死动物,取出滑膜进行组织病理学检查,滑液测定白细胞计数和细胞因子浓度。干预期后(66次)TH(日),KOA+冷冻治疗组仅增加脚印面积(P(与KOA和KOA+安慰剂比较,分别为0.004;14%),但与对照组无明显差异。冷冻治疗降低滑膜液白细胞计数(P < 0.0001; ≥95.0%) and cytokine concentration (P < 0.0001; ≥55%) when compared to the KOA and Placebo groups. Synovial score and synovial fibrosis did not differ in the KOA groups. In conclusion, footprint patterns improved in rats with ACLT-induced KOA as a result of clinical-like cryotherapy, which also lowered the synovial fluid leukocyte count and inflammatory cytokine concentration in these rats.

导言

膝关节骨关节炎(KOA)是成人和老年人中最常见的退行性关节紊乱症,被认为是疼痛和功能残疾的主要原因之一。1,2..一系列的危险因素都与KOA有关。3..众所周知,前交叉韧带破裂或重建增加了膝关节骨关节炎进展的可能性。4..前交叉韧带切断术(Aclt)等胫部不稳定的动物模型被用来诱导类似于创伤后和慢性kOA的改变。5,6..最近的一项研究表明,ACLT诱导的大鼠膝骨关节炎促进了股四头肌和胫前肌的神经肌肉接头重塑和萎缩,与炎症征象、步态改变以及肌肉基因和蛋白表达的变化有关。7..创伤后生化和生物力学的改变了软骨细胞的代谢模式,从而激活适应性反应,包括促炎细胞因子。8,9..在这些细胞因子中,白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)因其对关节的分解和破坏作用,在膝关节骨关节炎的病理生理中尤为突出。8..这些变化是渐进的,通常由放射学和症状学征象来鉴别。10.

促炎细胞因子的控制被认为是治疗kOA的一种药物治疗方法。11..然而,与其他药物疗法一样,抗药性药物也有潜在的医源性作用。12,13倾向于寻找补充疗法。摘要冷冻治疗是一种非药理资源,用于控制急性肌肉骨骼创伤后的炎症反应,改善临床状况。14,15,16..而且成本低,安全可靠,使用方便。17..虽然冷冻疗法被广泛应用于控制急性创伤后的疼痛和炎症,但有强有力的证据证明了它的有益作用。18,19,人们对其对慢性关节损伤的影响知之甚少。20..最近的一次回顾显示,虽然一些临床指南建议冷冻疗法来控制膝骨性关节炎的症状,但是没有足够的证据证明冷冻疗法在这个人群中的应用。21..很少有动物研究对此进行研究,异基因治疗方案(使用物理药物、应用时间和周期)主要侧重于冷冻疗法在膝关节关节炎动物模型中的即时反应。22,23,24,25,26..最近的研究表明,连续14天的局部冷冻疗法对佐剂性关节炎有局部和系统的抗炎作用,主要是通过抑制IL-6/IL-17途径,而不依赖于tf-α。27..虽然这是一个相关的发现,但这项研究是在类风湿关节炎的动物模型上进行的,对关节有潜在的破坏性免疫效应。28,冷冻治疗方案没有遵循肌肉骨骼疾病的临床建议。21,29..我们没有发现先前的研究可以评估冷冻疗法在KOA动物模型中的作用,其特征与在人类身上观察到的相似。冷冻治疗在动物模型中控制KOA炎症方面可能有积极的作用,为其临床应用提供了新的科学依据。本研究的目的是研究临床类冷冻疗法对ACLT所致大鼠膝关节骨关节炎模型的功能损害和滑膜炎症的影响。我们的假设是冷冻疗法可以改善动物的步态功能,减少炎症征象。

结果

步态分析

ACLT后60天(图1)。1),KOA、KOA+冷冻治疗组和KOA+安慰剂组的脚印面积较对照组低[平均差异:−4478像素(−16.3%),95%CI:−6831,−2124,P < 0.0001; mean difference: −3445 pixels (−12.5%), 95% CI: −5798, −1092, P=0.002;平均差:−4280像素(−15.6%),95%CI:−6633,−1926P < 0.0001, respectively]. With respect to the KOA groups, footprint area only increased in the group submitted to cryotherapy [KOA, mean difference: 3936 pixels (15%), 95% CI: 1021, 6850, P=0.004;KOA+安慰剂,平均差值:3779像素(14%),95%CI:864,6694,P干预后与对照组相比无明显变化(95%CI:−2671,3158;P>0.05)。2(A)]。为了估计两侧肢体的负重平衡与动物大小和步行速度无关,我们对与对侧肢体相关的数据进行了归一化处理(左、右足迹面积减去像素大小)。在60THACLT后第二天,KOA组左侧(未受影响)爪负重明显高于对照组[KOA,平均差值:4284像素(96.2%),95%CI:3114,5796;P < 0.001; KOA + cryotherapy, mean difference: 3915 pixels (95.8%), 95% CI: 1367, 6803; P=0.02;KOA+安慰剂,平均差值:5606像素(97.0%),95%CI:8264,3064,P < 0.001]. Among KOA groups, only the Cryotherapy group walked with more symmetrical weight-bearing between paws on the 66TH日[KOA,平均差异:2972(96.7%);95%CI:180,6329;PKOA+安慰剂,平均差异:6712(98.5%),95%CI:4071,9559;P < 0.001)], with no differences in relation to controls (95% CI: −1967, 1384; P>0.05)。2(B)..与步态分析有关的其他变量没有变化(补充附录)I).

图1
figure1

实验程序。两组动物每天接受两次20分钟的干预,一次在早上,一次在下午。膝骨关节炎,ACLT-前交叉韧带横断。

图2
figure2

足迹面积(A),规范化足迹区域(B)皮肤温度(C),接头直径(D)在基线(0天,术前),前(60天)TH日)及干预后(66天)TH所有团体的礼节。膝关节手术(前交叉韧带横断)。数据表示为平均±SD(n=8/组)。#P < 0.01: Control group VSKOA、KOA+冷冻疗法和KOA+安慰剂组;*P < 0.05: both Control and KOA + Cryotherapy groups VSKOA和KOA+安慰剂组。

膝关节皮肤温度

在60TH日间比较,KOA组皮肤温度高于对照组(KOA,平均差1.5°,95%CI:−2.4,−0.6;KOA+冷冻治疗,平均差:1.5°C,95%CI:−2.4,−0.6;KOA+安慰剂,平均差值:1.6°C,95%CI:−2.5,−0.7,P < 0.0001). These differences continued on the 66TH无论干预情况如何(KOA,平均差值:1.9°,95%CI:−2.8,−1.1;KOA+冷冻治疗,平均差异:2.0°C,95%CI:−2.9,−1.2;KOA+安慰剂,平均差异:1.8°C,95%CI:−2.7,−0.9,P < 0.0001) [Fig. 2(C)].

膝关节肿胀

在60THKOA组膝关节直径大于对照组(KOA,平均1.4mm,95%CI:−2.0,−0.9;KOA+冷冻治疗,平均差值:1.3mm,95%CI:−1.8,−0.8;KOA+安慰剂,平均差值:1.1mm,95%CI:−1.6,−0.6分。P < 0.0001). These differences were unchanged on the 66TH不计干预日(KOA:平均1.4mm,95%CI:−1.9,−0.9;KOA+冷冻治疗,平均差值:1.3mm,95%CI:−1.8,−0.8;KOA+安慰剂,平均差异:1.1mm,95%CI:−1.8,−0.7;P < 0.0001) [Fig. 2(D)].

热响应阈值

热响应阈值无组间差异(P=0.184;补充附录).

在现场白细胞向滑膜液迁移

KOA+冷冻治疗组白细胞数较KOA明显减少[均值差异:−0.65×10]3/ml(−95.0%),95%CI:−1.01,−0.29,P < 0.0001] and KOA + Placebo [mean difference: −1.05 × 103/ml(−97.0%),95%CI:−1.41,−0.69,P < 0.0001] groups, but with no difference compared to Control group (95% CI: −0.34,0.38, P=0.99)。KOA组和KOA+安慰剂组白细胞较对照组多[平均差异:0.67×10]3/ml(99.1%),95%CI:0.31,1.03,P < 0.0001; mean difference: 1.07 × 103/ml(99.5%),95%CI:0.70,1.43,P < 0.0001, respectively]. The number of leukocytes was 43.1% higher in the KOA + Placebo group when compared to the KOA group (mean difference: 0.39 × 103/ml,95%CI:0.03,0.76,P=0.028)[图1。3(A)].

图3
figure3

膝关节滑液细胞数。白细胞总数(A)和差异巨噬细胞(B)、淋巴细胞(C)和中性粒细胞计数。(D膝手术(前交叉韧带横断);冷冻治疗。数据表示为平均±SD(n=7-8/组)。#P < 0.05 vs Control group; P < 0.05 vs KOA group; *P < 0.05 vs KOA + Cryotherapy group.

差异白细胞计数3(B-D)]KOA+冷冻治疗组与KOA组[巨噬细胞数,平均差异:−23.07×10]相比,细胞数明显减少。3/ml(−94.0%),95%CI:−33.19,−12.95,P < 0.0001; neutrophils, mean difference: −2.53 × 103/ml(−99.3%),95%CI:−4.45,−0.62,P=0.008;淋巴细胞平均值:−6.34×103/ml(−97.1%),95%CI:−11.67,−1.0 1,PKOA+安慰剂[巨噬细胞,平均差异:−30.87×10]3/ml(−95.0%),95%CI:−40.41,−21.33,P < 0.0001; neutrophils, mean difference: −1.82 × 103/ml(−99.0%),95%CI:−3.55,−0.09,P=0.039;淋巴细胞,平均差异:−10.02×103/ml(−98.1%),95%CI:−15.34,−4.68,P=0.001]。

膝关节滑液细胞因子

KOA+冷冻治疗组细胞因子浓度低于KOA[IL-1β,平均差异:−5 5.70 pg/ml(−6 5.3%),95%CI:−73.84,−37.48,TNF-α,平均差异:−2 8.65 pg/ml(−70.0%),95%CI:−41.13,−16.17;IL-6,平均差:−11.02 pg/ml(−70.7%),95%CI:−14.46,−7.59;IL-17,平均差:−62.51 pg/ml(−61.9%),95%CI:−77.14,−47.88;IL-10,平均差异:−19.34 pg/ml(−68.9%),95%CI:−26.42,−12.26;P<0.0001;KOA+安慰剂组[IL-1β,平均差异:−46.8pg/ml(−61.3%),95%CI:−64.9,−28.6;α:−26.8pg/ml(−68.6%),95%CI:−39.3,−14.4;IL-6,平均差:−7.6pg/ml(−62.5%),95%CI:−11.0,−4.2;IL-17,平均差异:−48.5(−55.9%),95%CI:−63.1,−33.9,IL-10,平均差异:−15.1(−63.4%),95%CI:−22.1,−7.9;P < 0.0001], Fig. 4..KOA+冷冻治疗组IL-6浓度也较低[平均差异:−11.0pg/ml(−48.7%),95%CI:−14.5,−7.6;P < 0.0001], IL-17 [mean difference: −48.5 pg/ml (−36.6%), 95% CI: −63.8, −33.3; P < 0.0001] and IL-10 [mean difference: −15.1 pg/ml (−61.4%), 95% CI: −22.1, −7.9; P < 0.0001] compared to Control group (Fig. 3C-E)。KOA组IL-1β浓度较高[平均4 4.2 1pg/ml(5 1.9%),95%CI:2 6.7,6 1.7;P < 0.0001]; TNF-α [mean difference: 17.1 pg/ml (41.7%), 95% CI: 4.6, 29.5; P=0.005]和IL-17[平均差异:40.5pg/ml(60.1%),95%CI:25.8,55.1;P < 0.0001] compared to Control group [Fig. 4(A)、(B)、(D)]。KOA+安慰剂组细胞因子浓度较高[IL-1β,平均差异:35.3pg/ml(46.3%),95%CI:17.9,52.8,P<0.01]。P < 0.0001; TNF-α, mean difference: 15.2 pg/ml (38.9%), 95% CI: 2.7, 27.7, PIL-17,平均差:26.5pg/ml(30.55%),95%CI:11.8,41.1,P < 0.0001] compared to Control group [Fig. 4(A、B、D)].

图4
figure4

膝关节滑液中细胞因子浓度。(A)肿瘤坏死因子-α;(B)IL1-β;(C)IL-6;(D)IL-17;(E)IL-10。膝关节手术(前交叉韧带横断);冷冻治疗。数据表示为平均±SD(n=7-8/组)。#P < 0.05 vs Control group; *P < 0.05 vs KOA + Cryotherapy group.

滑膜炎的组织病理学评价

膝骨关节炎滑膜无改变(P=0.017),KOA+安慰剂(P=0.115)和KOA+冷冻疗法(P=0.013)组与对照组比较[图6]。5(A、B)]。关于滑膜纤维化,[图6]。5(A、C)KOA组胶原含量明显高于对照组[KOA:−28.0%,95%CI:−39.5,−16.6;P≤0.0001,KOA+安慰剂,平均差异:−16.1%,95%CI:−28,4,−3,7,P=0.01,KOA+冷冻治疗,平均差异:−18.5%,95%CI:−29.9,−7.1;P=0.02]。此外,KOA组滑膜炎或纤维化评分无显着性差异[图1]。5(B、C); P>0.05]。

图5
figure5

滑膜组织病理学观察。对照组、KOA、KOA+冷冻治疗冰组和KOA+安慰剂组(标度:40 m;放大倍数:200 x)的滑膜切片上有代表性的显微照片(比例尺:40 m;放大倍数200倍)(A)。滑膜炎评分的图示(B)和纤维化(C)对照组、KOA+冷冻治疗组和KOA+安慰剂组。箭头表示滑膜的底部并显示其厚度。膝关节手术(前交叉韧带横断);冷冻治疗。数据表示为平均±SD(n=3~5/组);#P < 0.05 vs Control group.

讨论

我们的结果首次表明,临床类冷冻疗法是对ACLT诱导的膝关节骨关节炎的一种有益的干预措施,因为它改善了足印模式,其作用是通过关节滑膜炎症的下调来介导的。冷冻治疗组由于白细胞向关节腔迁移减少,炎症过程减少,对滑膜炎症的控制有一定的作用。这些发现表明冷冻疗法作为治疗膝关节骨关节炎的非药物疗法的潜力。

虽然冷冻疗法在关节炎动物模型中的抗炎作用研究甚少。30,已经提出了许多作用机制来解释其在减轻关节炎症过程中的作用。单次长期冰敷(4小时)可降低尿酸结晶性滑膜炎患者膝关节滑液中白细胞吞噬功能。其原因是滑液粘度增加,这可能阻碍了白细胞向晶体的移动。23..在另一项研究中,冰袋(30分钟,每天一次,持续10天)可减少兔酵母诱导的关节炎模型细胞浸润和滑膜增生。31..在创伤模型中,有桡腕韧带扭伤的猪在两次使用冰袋(各20分钟)后白细胞数量减少。26..在这些研究中,滑膜炎和炎症是通过降低关节内温度来抑制的.根据以前的研究,导致基质降解的酶活性(即胶原酶)在较低温度下降。22,32..虽然我们没有测量关节内温度,但这些机制也有可能发生,导致关节炎症减少。另一个与冷冻治疗相关的机制是局部代谢减少,这在早期的一项研究中得到了证实。33,导致滑膜细胞浸润减少,炎症介质活化减少。

已知促炎细胞因子如IL1-β和tf-α发挥分解作用,并在多种方式促进关节退行性变,包括蛋白酶激活和抑制Ⅱ型胶原,Ⅱ型胶原是细胞外基质的主要成分之一。8,9..其他细胞因子,如白细胞介素-17,在中性粒细胞的合成、迁移和活化中起着重要的中介作用。34..根据我们的研究结果,冷冻治疗能有效降低滑膜液中促炎细胞因子(≥55%)的水平。早期对关节炎大鼠爪子的冷冻治疗(30分钟,每天两次,持续14天)显示了局部和全身的抗炎作用,这种作用主要是由IL-6和IL-17的基因和蛋白表达介导的,与肿瘤坏死因子-α无关。27..不同病理生理条件下冷冻治疗对NF-kβ依赖的IL-1β、TNF-α和IL-6基因抑制作用的研究30,35..这些途径也参与了在本研究中观察到的冷冻疗法的作用。

尽管在接受冷冻治疗的KOA组中观察到的炎症过程明显减少,但滑膜的组织病理学征象没有改善。这一结果表明,所用的实验模型诱发了膝关节骨关节炎(KOA),经冷冻治疗后,滑膜病变的体征没有改变。

在步态分析方面,与KOA和KOA+安慰剂组相比,KOA+冷冻疗法所影响的脚印面积更大,且与对照组相似,显示出更均匀的负重,倾向于步态正常。KOA大鼠模型的研究结果与以往的研究结果相似。36在ACLT治疗4周和8周后,小鼠的脚印面积也有所下降。冷镇痛直接影响步态控制,降低伤害感受器兴奋性阈值和神经传导速度。37..通过初级传入传递到脊髓的伤害性信息减少,将导致行为体征减少和背角神经元活动减少,导致扩大的感受场减少,这可能会影响步态反应。25..与KOA患者的观察结果相反38,39在步态分析的其他变量中,如步长和步幅,我们没有发现任何变化。虽然我们的结果证实了以前在大鼠身上的发现36,40,41我们没有控制动物的步态速度,这是几乎所有步态参数的一个重要的协变量。在未来的研究中,这可以通过记录到达暗室所需的时间(以秒为单位)来衡量(距离除以覆盖这个距离所需的时间)。42,统计模型43,跑步机速度控制44,45或者使用现代高速视频摄影(即T型台),这更有可能提供对空间参数的稳健分析。46.

最后,膝骨关节炎的慢性特征可能解释了冷冻治疗对皮肤温度和膝关节肿胀都没有影响。在kOA模型中,热痛觉过敏也没有变化,这是以前对创伤后kOA模型的研究支持的。47,48..在文献中通常报道的行为变化包括其他参数的评估,如步态适应、机械痛觉过敏、机械性异基因痛和负重不对称。

这项研究的局限性之一是使用脚印测试来评估步态,因为它不能准确地评估动物的速度。另一个弱点是缺乏手术的假组(没有ACLT的膝关节手术);未来的研究应该包括一个假组,以便进行比较。

材料和方法

实验议定书符合“国家保护和使用实验动物指南”(国家研究委员会,1996年)。49..圣卡洛斯联邦大学道德委员会批准了实验程序(编号7949291116/2017),这项研究是由经过培训的专业人员进行的,他们对实验组的身份视而不见。49..使用G*Power进行了先验样本计算(Version3.1;Trier大学,德国)50..在前期研究(n=10)的基础上,采用α=0.0 5,功率(1-β)=0.95,相关系数=0.5,效应大小=0.37。计算采用步态试验和白细胞迁移法。因此,估计总共有32只动物(每组8只)将是一个足够的样本。

实验设计

分析的动物是两个月大的雄性。Wistar大鼠(褐家鼠(n=32;297±25 g),24°C±1°C(每笼3次),逆光循环(12/12光/暗),每笼3次,每笼2 4°C±1°C,每笼2 4°C±1°C;计算机程序(www.随机性)将动物随机分为4组(每组8只):对照组(由未接受手术或干预的单纯动物组成);ACLT膝关节手术(KOA,未治疗组);ACLT膝关节手术和冰袋(KOA+冷冻疗法);ACLT膝关节手术(包括类似于冰袋的沙包手术(KOA+安慰剂)。49..在ACLT手术前一天和手术后60d分别对两组进行评估,首先进行压力最低的测试,然后再进行压力最大的测试:皮肤温度、步态测试、热反应阈值和肿胀。然后在KOA+冷冻治疗组和KOA+安慰剂组进行干预(冰袋或沙包),每天两次,共5天(61~65天),每次20分钟。第66天对所有4组动物进行评估,并对其进行安乐死和放血,取出滑膜和滑膜液(见图)。1).

KOA诱导

我们使用了一种适应的ACLT诱导的kOA模型,它在大鼠体内引起类似于人类观察到的关节变化。5..简单地说,用腹腔注射(12 mg/kg Xylazine和95 mg/kg氯胺酮)麻醉动物,然后用碘溶液剃去右膝。然后,制作内侧纵行鞍旁切口,用眼剪造成关节囊损伤和ACLT。采用前抽屉试验(与股骨相关的胫骨前游离前移位)证实ACLT。缝合皮肤后,将动物送回笼中,术后48小时在饮水中加入对乙酰氨基酚(13.5 mg/100 mL)作为术后镇痛。5..在这个模型中,我们先前描述了KOA组(ACLT后60天)的人类组织学评分高于对照组(天真的动物)。7.

步态试验

在ACLT动物模型中,采用脚印试验进行步态分析。36..老鼠的后爪用墨水擦过。接下来,这些动物被允许在一条60厘米长,7厘米宽的跑道上奔跑,跑道上覆盖着白纸。在铁轨的尽头放了一个黑暗的房间来引诱老鼠。测试完成后,论文被扫描到300 dpi。右脚掌周围的测量定义为:脚印面积(像素)、第一趾到第五趾之间的距离为爪宽(Cm)、步长相同的两步之间的距离(Cm)、以左右爪为底的水平距离(Cm)、第三趾与脚跟之间的距离为爪长(Cm)、爪角为第五趾与跟骨之间的角度和水平线(°)。

皮肤温度

根据获取热图像的标准51在暗室(15 min,23°C±1)驯化。用热像仪测量各组右膝皮肤温度,采用FLIR T 420红外热像仪(FLIR系统,美国),安装在离动物膝关节50厘米处的三脚架上。用FLIR工具软件对图像进行分析,结果用°C表示。对KOA+冷冻治疗组在单次治疗后即刻进行一次中试研究(n=8),以确定皮肤冷却情况。膝关节皮肤温度由36.9±0.7°C降至10.1±1.5°C,下降了26.8±0.4°C。

膝关节肿胀

在麻醉下仰卧位测量膝关节厚度(2ml/MLO)。21.5%异氟醚)52,使用数字卡尺(Fisher Science,150毫米,美国),位于股骨内侧和外侧髁上,位于膝关节线间水平。7..采用两种计量的平均数,数据以毫米表示。

热响应阈值

这些动物被放置在52°C(51.8-52.4°C)的热板上(Insight Equipanentos Litda,Brasil)。53..爪子反应的潜伏期(跳跃、摇动或舔)被认为是在一次重复中的响应时间(秒)。动物在热板上停留的最长时间是25秒。

协议可靠性

类内相关系数1,28只大鼠术前进行热像图分析(A)和关节肿胀(B)。第一次评估后48小时再对大鼠进行评估。这两个变量具有很好的可靠性:a)ICC=0.92,SEM=0.20°C;B)ICC=0.94;SEM=0.28 mm。

冷冻疗法和安慰剂干预

KOA+冷冻疗法(20 g冰片)和KOA+安慰剂组(20克沙袋)在实验室中每天两次,间隔约4小时。每次干预持续20分钟21并在麻醉下(2ml/MLO)应用。21.5%异氟醚)52,双足仰卧位(髋关节±45°)。冰和沙包被放置在膝盖周围,使用橡皮筋进行压缩。冷冻治疗方案根据价格协议(保护、休息、冰上、压缩和抬高)遵循治疗肌肉骨骼损伤的临床建议。29..尽管对照组和KOA组没有进行干预,但他们接受了与干预组相同的麻醉。

滑液收集

麻醉动物(240 mg/kg氯胺酮和60 mg/kg西拉津;I.P.)流过血54,55..最后一次手术是为了尽量减少滑液中血液污染的可能性。取皮肤及右膝关节韧带,用含10 mm乙二胺四乙酸(EDTA)的200 L磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗滑膜腔。本联合灌洗液用于细胞计数、白细胞差异计数和细胞因子水平测定。55.

在现场白细胞迁移

如前面所述,白细胞迁移是用滑液来确定的。56..用含1mmEDTA的PBS 5μL冲洗两次,用PBS/EDTA稀释至50μL,以评价其在规定时间内的白细胞迁移情况。白细胞在特克氏液稀释的Neubauer室中计数。结果表示为每个关节腔的白细胞数。

差异白细胞计数

取关节灌洗液中的异物,1,500 rpm在4℃下离心10 min,上清液保存于−80°C进行细胞因子测定,细胞颗粒再悬浮于200 L AS PBS+EDTA溶液中。用1,500 rpm细胞离心10 min后冲洗关节液(50μl)制备示差计数片。然后装片,固定4 min,用伊红和苏木精染色。然后,用自来水冲洗,让它们晾干。55.

每片100个细胞在100倍油浸显微镜下计数,以区分细胞类型(巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞)。通过计算关节灌洗液中各细胞类型的百分比(微分计数)和白细胞数,获得关节灌洗液中的细胞计数。55..结果以细胞数×10表示。3/毫升。

细胞因子水平的测定

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定肿瘤坏死因子-α、IL-1β、IL-6、IL-17和IL-10的浓度,并按制造商的指示(双组试剂盒;研发系统,明尼阿波利斯,美国)。用分光度计测量了样品在450 nm处的光密度(光谱MAX-250,分子器件,桑尼维尔,美国加利福尼亚州)。结果以关节液PG/mg中细胞因子水平的平均±SD值表达。57,58.

滑膜炎的组织病理学评价

关节囊标本固定于4%(vol/vol)缓冲福尔马林中,乙醇脱水,石蜡包埋制备滑片。组织切片用苏木精和伊红(H&E)染色分析滑膜炎(炎症细胞内流和滑膜增生)。滑膜病理(即滑膜炎)的严重程度由一个评分系统来确定,该系统在0-3(0=1-2细胞,1=2-4细胞,2=4-9细胞,3=10或更多细胞)的尺度上测量滑膜细胞层的厚度,滑膜基质中的细胞密度为0-3(0=正常细胞,1=略微增加的细胞,2=中度增加的细胞,3=大幅度增加的细胞)。59..用天狼星红染色法染色,以评价关节纤维化程度。采用图像J软件(美国图像J,1.33u),在15个随机高功率场(400倍放大)下,测量滑膜下胶原沉积为天狼星红阳性染色区。结果以胶原蛋白阳性面积的百分比表示.

统计分析

这些分析是用以下方法进行的:社会科学统计软件包软件(SPSS22.0Inc,芝加哥,伊利诺伊州)。分别用Levene和Shapiro Wilk检验方差的均匀性和正态分布.对步态试验、皮肤温度、膝关节肿胀和热反应阈值进行双向方差分析,对照组(对照组,KOA,KOA+冷冻治疗组和KOA+安慰剂组),时间(0,60,66d)。采用单因素方差分析(ANOVA)方法,比较各组白细胞计数、细胞因子水平与关节纤维化的关系。必要时行Tukey‘s HSD后测[α=5%和95%可信区间(CI)].滑膜炎评分不呈正态分布,用非参数检验进行分析。Kruskal-Wallis试验用于评估各组间滑膜炎,而Man-Whitney试验用于鉴别各组间的差异,如果Kruskal-Wallis结果显示有显着性差异。所有非参数比较采用Mann-Whitney检验,根据比较次数调整α水平(对照组×KOA,对照组×KOA+冷冻治疗,对照组×KOA+安慰剂,KOA×KOA+冷冻治疗,KOA×KOA+安慰剂,KOA+冷冻治疗×KOA+安慰剂)或α=0.008/6。因此,P值<0.008,差异有统计学意义。

结语

ACLT诱导的KOA大鼠经临床类冷冻治疗后,其足印形态有所改善,滑膜液白细胞计数和炎症细胞因子浓度也明显降低。这些发现证明了冷冻治疗的好处,证实了它的潜力和作为一种非药物治疗关节炎在膝关节骨关节炎。


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