您好,请问有什么可以帮到您的。 点击这里给我发消息
武汉新启迪生物科技有限公司
新启迪-您的生物科研好伙伴!2008-2021
Wuhan Xinqidi Biotech Co.Ltd
本企业通过iso9001质量体系认证

自身免疫风险等位基因对表面和可溶性IL7R表达的特异性调节

 二维码
发表时间:2019-10-09 16:14作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

自身免疫风险等位基因对表面和可溶性IL7R表达的特异性调节


自然通讯 体积 10,条款编号:4575 (2019)


摘要

IL-7是T细胞免疫的关键因素,也是T细胞免疫功能的一个常见变异因子。IL7R,编码其受体,与自身免疫性疾病易感性有关。IL7RmRNA在受刺激的单核细胞中被诱导,但在单核细胞生物学中IL7R的功能尚未被探索。本文从蛋白质水平对白细胞介素7R(IL7R)的遗传调控进行了研究,发现脂多糖对单核细胞表面和可溶性IL7R(SIL7R)有明显的诱导作用。在单核细胞中,表面IL7R和sIL7R的表达与疾病相关的rs 6897932的等位基因携带密切相关。IL7R多态单核细胞比CD4+T细胞产生更多的sIL7R,其数量还与CD4+T细胞的表达有关。DDX39A编码剪接因子。脊柱炎患者滑膜液来源的单核细胞对IL7R有富集作用。+细胞具有独特的转录谱,与IL-7诱导的基因集重叠.因此,我们的数据表明,在IL-7生物学和IL7R相关疾病中,单核细胞具有以前未被重视的功能。

导言

IL-7在淋巴发生和外周血T细胞稳态中起着至关重要的作用.遗传多态性IL7R,编码IL-7受体α链的位点与多种自身免疫性疾病的易感性有关,包括强直性脊柱炎、多发性硬化症和原发性胆汁性肝硬化。1,2,3..内部的非同义多态IL7R(Rs 6897932)导致编码受体跨膜结构域的第6外显子的差异剪接,导致转录本的表达,该转录本被翻译成可溶性受体(SIL7R)。1..C风险等位基因与sIL7R循环水平增加有关,这被认为延长了IL-7的半衰期。4..虽然这种受体的细胞来源被认为是淋巴样,但这还没有被明确地证明,大部分数据来自细胞株和混合细胞群体。

了解疾病危险位点引起功能活动的细胞类型和背景,可以为了解致病机制提供新的见解。表达数量性状位点(EQTL)分析对基因表达的遗传决定因素提供了公正的见解。在原代单核细胞中,一个主要的eQTL定位到rs 931555(连锁不平衡(LD)与rs 6897932(r2=0.75,D‘=0.87)和顺式IL7R)与长期暴露于LPS后的IL7R表达有着独特的联系。5..尽管IL7R具有淋巴功能,但在T细胞数据集中还没有观察到eQTL。6,7,8..鉴于该eQTL对LPS刺激后IL7R基因表达的影响较大,且LD高,且具有疾病相关的多态,我们旨在进一步从大群体免疫细胞亚群的蛋白质水平上对这一观察结果进行表征。我们在相同的条件下对分离的单核细胞进行了与我们先前的eQTL分析相同的平行实验,并利用流式细胞术对混合细胞群体进行了平行实验。

我们发现健康人的单核细胞在暴露于天然免疫激活因子后,表面蛋白IL7R和sIL7R的表达明显依赖于rs 6897932等位基因。LPS刺激的单核细胞暴露于IL-7与特定的转录谱有关,这与滑膜IL7R中差异表达的基因相对应。+单核细胞亚群,其特点是高表达Tcf7CCL 5..我们演示IL7R+单核细胞在活动性脊柱炎患者的滑膜液中相对丰富,通过单细胞RNA测序,我们发现滑膜IL7R。+单核细胞有一个离散的表达谱,同样有明显的上调。LTB, Tcf7..和CCL 5..这些数据表明IL7R在炎症的背景下影响IL-7的生物学,并提出了一个关键的,迄今未被认识的,髓系在疾病风险变体的功能机制中的作用。

结果

单核细胞活化诱导表面IL7R表达

外周血单个核细胞(PBMCs)和分离的CD 14+将健康志愿者的单核细胞与LPS共孵育24h,用流式细胞仪对其表面IL7R进行表征(附图)。1)。在这两种制剂中,LPS处理导致表面IL7R的明显诱导(如图所示)。1A,b),显示LPS诱导IL7RmRNA伴随着易于检测的表面受体的表达。LPs引起单核细胞释放多种细胞因子,包括IL-4和IL-6,从而改变T细胞表面IL7R。9..与此相一致,我们观察到了CD4。+、CD8+T细胞与CD 56+NK细胞表面IL7R在刺激后明显下降(图1)。1C)。我们发现IL7R对LPS的反应具有高度的个体间差异,特别是在单核细胞中,并且观察到细胞类型之间的相关性很小(见图)。1D),指示细胞型特异性调节。值得注意的是,IL7R在细胞内的类型相关性。+处理后的淋巴样细胞与未处理的淋巴样细胞间有较高的相关性,IL7R与未处理的+未经治疗的CD 14和LPS治疗的CD 14较弱(CD 14)。+在PBMC培养中:r=0.20,P=0.03;纯化的单核细胞:r=0.05,P=0.66,双面t-统计)强调IL7R对LPS反应的细胞类型和上下文特异性。为了探讨其他先天刺激的作用,我们分别将单核细胞暴露在Pam3CysK4和Imiquimod、TLR 1:2和TLR 7激动剂中。当Pam3CysK4诱导单核细胞IL7R在所有个体中表达时,对Imiquimod的反应是可变的,且无显着性(图1)。1E)。由于LPS引起多种细胞因子的释放,我们推测IL7R的晚期诱导可能与早期(自分泌)细胞因子反应的大小有关。为了检验这个,单核细胞的表达IL7R2 h LPS后2 h,228人各基因的表达与LPS后24 h的表达水平呈显著正相关。5..我们注意到382/15421探针(FDR<0.0 5),其中2小时的表达与24小时相关IL7R(补充数据)1)。在前10名相关基因中,我们发现了两个肿瘤坏死因子(肿瘤坏死因子)和趋化因子配体5(CCL 5)密切相关(肿瘤坏死因子: r=0.34,P;=2.9−4;CCL 5:r=0.36,P;=1.1−4;图1.1F双面t-统计)。鉴于抗TNF治疗在治疗多种自身免疫疾病中的关键作用,我们通过将抗TNF单克隆抗体Infliximab与LPS结合,检测释放的TNF是否能以自分泌的方式诱导单核细胞IL7R。这大大降低了IL7R+单核细胞(平均−8.1%,95%CI:−5.7:−10.5%;P=5.6−9,双面配对t-测试,无花果1g,补充图。2)。最后,我们用TNF(10 ng/ml)孵育24小时,在78人体内直接检测TNF,表明TNF与LPS类似,能明显诱导单核细胞表面IL7R的表达(如图1所示)。),同时降低T细胞IL7R表面水平。

图1
figure1

LPS诱导单核细胞IL7R细胞表面表达。a具有代表性的流式细胞仪从活门控阳性细胞中筛选出CD 14单核细胞,其中单个细胞单独孵育24 h(顶板)或有LPS存在(下板)。b小提琴作图显示IL7R的显著诱导作用+正选单核细胞配对培养中的单核细胞(单核细胞IL7R)+LPS后-中位数:23.8,最小:6.5,最大值:55.8,IQR:15.6~34.9%;n=84,成对t-测试)。cLPS对IL7R的比较效应+CD 14计数+单核细胞,CD4+和CD8+T细胞和CD 56+相同PBMC培养的NK细胞,未处理或LPS作用24h(PBMC IL7R)+LPS后-中位数:29.9%,最小:5.9,最大:66.40,IQR:22.3~40.0;n=103,成对t-测试)。d通过皮尔逊相关分析,研究了指示细胞与处理对IL7R数量的影响。+细胞。***P < 0.001, **P < 0.01. eIL7R的比较诱导+6例单核细胞经TLR 7激动剂Imiquimod、TLR 1/2激动剂Pam3CysK4或TLR 4激动剂LPS处理24h后的单核细胞(配对)t-测试)。误差条显示平均值,IQR,最小和最大。f数组衍生RNA表达肿瘤坏死因子2 h LPS对rna表达的测定IL7R来自同一个体的单核细胞24小时LPS。g单核细胞单独比较培养(n用LPS或LPS+抗TNF单克隆抗体(Infliximab)。TNF拮抗剂孵育显著降低LPS诱导的IL7R+单核细胞计数(配对)t-测试)。h单用TNF处理的PBMCs不同细胞类型的小提琴反应图导致IL7R的显著诱导。+单核细胞显著降低CD4和CD8 T细胞IL7R+积极(n=78,成对t-测试)。源数据作为源数据文件提供

rs 6897932调节单核细胞表面IL7R水平

在受刺激单核细胞的eQTL分析中,我们观察到最显著的关联是IL7Rrs931555(Rs931555)与LPS作用24h后mRNA表达的变化P=2.1−26双面t-统计),2小时后也可检测到。2A)。进一步查询这些数据,我们发现rs 6897932与IL7R表达(P=8.6−14)反映这两个位点之间的LD程度。对rs 931555的条件处理解决了rs 6897932关联(P=0.92,附图。3),而对rs 6897932的控制留下了rs 931555的残余效应(P=7.6−11),指示rs 931555在mRNA水平上标记功能单倍型。在完成流式细胞术实验后,该队列在IlluminaOmniExpress上进行了全基因组基因分型,并使用UK10k数据集进行了估算。10..分析LPS刺激后单核细胞表面表达的遗传相关性。这表明IL7R与rs6897932的表面表达有最显著的局部联系,而在未受刺激的样本中没有显著的相关性(图1)。2B,c)。在受刺激PBMC内的单核细胞中,与rs 6897932显著相关(图1)。二维空间)。值得注意的是,我们无法观察到表面IL7R与rs6897932之间的遗传关联。+或CD8+T细胞,在基底(补充图)。4或LPS/TNF刺激状态。二维空间)。我们认为,如果T细胞中IL7R表达的基因调控是上下文依赖的,那么可能需要一种替代LPS或TNF的刺激剂。为了探讨此点,我们在一组样本中检测了T细胞特异性刺激CD3/CD 28的效果。这降低了T细胞IL7R的表面水平,而诱导单核细胞表面IL7R的表达没有遗传关联的证据(补充图)。5)。与LPS相似,rs 6897932基因型与TNF后单核细胞表面IL7R相关,发病危险等位基因平均表面IL7R较低(P=0.0007,方差分析,图1。2E)。这些数据表明,rs6897932在炎症介质LPS和TNF暴露后,在调节单核细胞IL7R表面表达方面具有以前未被认识到的作用。

图2
figure2

rs 6897932特异性调节单核细胞表面IL7R水平。a显示eQTL的微阵列数据IL7R在LPS治疗2和24小时后,在rs 931555中注意到(2小时LPS:n=261,24小时LPSn=322)。b单核细胞局部关联图IL7R从积极选择的单核细胞中暴露于LPS后,与rs 6897932呈峰值关联(n=84)。c正选单核细胞表面IL7R的批次校正对数值与基线单核细胞相比,显示了rs6897932刺激后运输的显著效果。n=84,线性模型的方差分析(ANOVA)。dLPS暴露后PBMCs表面IL7R跨细胞亚群。(n=87,注rs6897932对表面IL7R的显著影响仅在CD 14中观察到。+单核细胞,线性模型的方差分析(ANOVA)。ed肿瘤坏死因子(TNF)作用于PBMC 24h(n=62)。错误条显示平均值、IQR、MIN和最大值。源数据作为源数据文件提供

sIL7R由rs 6897932调控,与DDX39A相关。

rs6897932在测定PBMCs可溶性IL7R剪接中的作用4引导我们研究刺激后的单核细胞是否产生sIL7R,以及这是否处于等位基因控制之下。我们在随机选取的单核细胞样本上测定了sIL7R,用LPS处理了24小时,这与我们先前的eQTL研究(n=161)。值得注意的是,单核细胞分泌大量sIL7R,rs6897932载体对单细胞产量有显著影响(平均CC等位基因=3149.5 ng/ml,TT等位基因=916.9 ng/ml,P等位基因效应=4.7)。−15、图1.3A)。我们发现eQTL位点rs 931555仅对sIL7R有微弱的影响(P=0.006,双面t-统计),当对rs 6897932进行控制时,我们发现rs 931555等位基因对sIL7R具有加性效应。3B),与独立于rs 6897932的上游eQTL相一致,以调节sIL7R。

图3
figure3

单核细胞来源的可溶性IL7R由rs 6897932载体和DDX39A表情。asIL7R酶联免疫吸附试验(ELISA)对LPS处理24 h的单核细胞上清液进行了sIL7R酶联免疫吸附试验(ELISA),从原始的eQTL数据集中随机抽取样本,并在rs 6897932上检出基因型。n=161,线性模型的方差分析(ANOVA)。bELISA数据ars931555基因型对sIL7R(线性模型)的附加效应。c15421种芯片探针与可溶性IL7R的相关性分析(y-轴心)确定DDX39A表达(x-轴)与可溶性IL7R水平呈显著负相关,为其调节可溶性IL7R提供了佐证。趋势线显示等位基因与Rho和Rho的相关性。P-所有数据的价值(n=161,Spearman等级分析)。d分离原代CD 14细胞sIL7R的ELISA检测+和CD4+单独或在LPS、LPS+IL-7和CD3/CD 28激活珠存在下培养24h。(n=6)。e分离原代CD 14细胞sIL7R的ELISA检测+单独培养24h,在TNF存在下或在LPS存在下(n=5,方差分析)。误差条显示平均值,IQR,最小和最大。源数据作为源数据文件提供

据报道,rs 2523506位于6p21基因上。DDX39B,这两个位点的等位基因组合进一步增加了多发性硬化症的风险。11. DDX39B编码RNA解旋酶,构成剪接体的一个组成部分。12..危险基因多态性与rs 6897932危险等位基因携带者sIL7R增高有关。11..根据这些发现,我们继续在我们的队列中探索这种联系。我们没有观察到rs2523506对单核细胞sIL7R的调节作用(补充图)。6),尽管这可能反映出,即使在这个相对较大的队列中,rs 2523506处的小等位基因频率较低,复制上位性效应的能力也在减弱。为了进一步了解sIL7R的转录驱动因子,我们利用这些样本中已有的基因表达数据,探讨了sIL7R与mRNA表达之间的关联。在支持可溶性蛋白与总转录本的相对独立性方面,我们没有发现总蛋白与总转录本之间的关联。IL7R文字记录和sIL7R(附图)7A)。我们同样没有观察到DDX39B在LPS-3探针的2小时或24小时表达DDX39B(BAT 1)在数组上,所有P>0.1)和sILR。然而,在强烈支持剪接体对sIL7R水平的假设作用时,我们发现sIL7R的表达与sIL7R的表达之间存在显著的相关性。DDX39B副戒律,DDX39A,24小时后,LPS和sIL7R表达增加。DDX39A与sIL7R降低有关(2小时LPS)DDX39A相对于sIL7RRho=−0.25,P=0.01;24小时LPSDDX39A相对于sIL7RRho=−0.483,P=5.1−10,双面斯皮尔曼试验,图1。3C,补充数据2)。这与DDX39B转染HeLa细胞的报道11..IL7R转录本和DDX39A表达无相关性(附图)。7b)的具体作用。DDX39A在sIL7R剪接中,与表达式相反。接下来,我们检测了单核细胞与CD4细胞中sIL7R的相对产生量。+T细胞,显示最高水平的IL7R表面表达。三维空间)。而未经治疗的CD 14+或CD4+细胞释放sIL7R,只有CD 14+细胞在LPS作用下释放sIL7R,且不受IL-7的影响。相反,尽管IL7R的表达水平要高得多,但CD4的表达水平却要高得多。+即使用CD3/CD 28微球刺激T细胞也很少释放sIL7R。最后,我们还观察到TNF刺激后单核细胞对sIL7R有明显的诱导作用,尽管这一水平低于LPS(图1)。3E)。这些数据表明,当CD 14激活时,+单核细胞可形成sIL7R的主要来源。

IL-7刺激激活单核细胞转录途径

为了探讨白细胞介素-7在单核细胞中的作用,我们在重组人白细胞介素-7存在下,将新鲜的PBMCs与LPS共同孵育,并对一部分人进行了流式细胞术。我们重复以前观察到T细胞上IL7R表达减少的情况。9当接触IL-7和发现IL-7同样降低单核细胞表面IL7R的表达,表明单核细胞IL7R对释放IL-7的敏感性(图7)。4A)。为探讨单核细胞中IL7R的结扎是否能调节基因表达,将单核细胞与LPS孵育诱导IL7R作用2h,对这些细胞和单独LPS处理的细胞进行RNA测序。配对差异表达分析显示,短时接触IL-7可导致3240/16186份转录本的差异表达(FDR<0.0 5,补充数据)3还有无花果。4B,c)包括转录因子Tcf713,这是未成熟胸腺细胞存活所必需的,这是转录激活剂。我的B,非编码RNAMALAT 1和已知的IL-7调节细胞因子阿特A和LTB是胚胎周围淋巴结形成的关键14..诱导基因的基因本体论分析与已知的IL-7抗凋亡作用一致,与翻译和核糖体小亚单位生物发生相关的基因显著富集(附图)。8).

图4
figure4

单核细胞表面IL7R具有功能,激活多种转录途径。a小提琴图显示PBMC培养的单核细胞在未处理状态下,在LPS暴露后和用重组IL-7暴露于LPS后。IL-7导致IL7R对LPS刺激的单核细胞的明显下调,提示对外源性细胞因子的敏感性(成对)。t-测试)。b8例配对单核细胞标本RNA seq实验中的mRNA火山图,要么单独用LPS处理24h,要么在培养的最后2h加入附加IL-7的LPS。治疗导致广泛的差异转录表达,其中最重要的20个转录本标记。c重组白细胞介素-7在单核细胞中差异调控的基因盒图(线性模型)。d单细胞实时定量聚合酶链反应(rt-qPCR)数据的t-sne图(rt-qPCR):10人(1218个细胞),无论是未经处理的还是在LPS存在的情况下,膜结合的表达。IL7R (IL7R(MB),可溶性的IL7R(S)IL7R), CLEC4E、TNF、CUX 1、AKT1、STAB 1、CD 163、CSF1R、CCL 5、DDX39A、DDX39B、MALAT 1、LTB、IFNB1、CD 14、FCGR3B、Lyz、ACTB. ers6897932基因型:未处理单核细胞和LPS处理单核细胞中sIL7R和mbIL7R表达的单细胞RTqPCR表达密度图。Kolmogorov Smirnov试验f大鼠单细胞RT-qPCR表达小提琴图MALAT 1在LPS刺激的单核细胞中,无论是单独还是在重组人IL-7存在的情况下,根据rs 6897932基因型,t-测试

为了确定单个细胞是否能共同表达IL7Rmb和sIL7R,同时考虑到rs6897932的基因型,我们在单核细胞上进行了单细胞定量PCR(QPCR)。n在rs6897932(4:TT,6CC)处分离到10个纯合子个体。我们扩增了sIL7R和全长IL7R,以及在对LPS或IL-7的反应中选择的转录本,包括在基线和暴露于LPS或LPS和IL-7后的转录本。应用t分布随机邻域嵌入(t-SNE)算法对这些数据进行了分析,发现单核细胞中有一部分细胞在LPS后强烈表达IL7Rmb。值得注意的是,这些细胞负责sIL7R的表达和共同表达。CCL 5MALAT 1(无花果)4D)。进一步观察到rs6897932对IL7Rmb和sIL7R表达在细胞间的分布有较强的遗传效应,表达sIL7R的细胞较多,与C等位基因纯合的细胞表达较高(图一)。4E)。最后,当我们将LPS后的细胞与LPS+IL-7(24 H)的细胞进行比较时,我们能够观察到白细胞介素-7(IL-7)处理对细胞表达的基因型特异性的影响。MALAT 1(无花果)4F).

IL7R+单核细胞在滑液中形成一个独特的子集。

虽然我们的数据清楚地显示了单核细胞在刺激下诱导和表达表面IL7R的能力,但这些观察的生理和病理意义仍不确定。为了探讨这些细胞在炎症状态下的相关性,我们对4例脊柱炎(2例强直性脊柱炎,2例银屑病性关节炎)患者的血液和滑膜液进行了成对流式细胞术。我们发现,而IL7R+单核细胞在这些个体的PBMCs中并不常见,它们很容易在活跃的炎症关节滑液中观察到,占单核细胞总数的12-35%(图一)。5A,b)。我们使用单细胞RNA测序配对血液和滑膜液,从另外三个人的脊椎关节炎,以研究CD 14髓系室。滑膜单核细胞无监督的t-SNE聚类显示5个不同的簇。5C),集群4显示出很高的IL7R表达式(图1.5D)相对于分析中发现的其他滑膜单核细胞簇。此外,IL7R簇有显著的高表达其他转录本,包括LTB, CCL 5IL 32与所有其他滑膜单核细胞簇相比较(见图)。5E)。图中显示了定义5c滑膜单核细胞簇的前10位基因。5F(完整的基因列表补充数据4)。我们再次证实了膜结合IL7R和sIL7R在IL7R中的表达增加。+qPCR技术在滑膜CD 14上的应用+CD11b+单核细胞(附图)9)。与体外受刺激的大体积单核细胞与IL-7应答基因有明显的重叠(P=8.5−495%CI:1.5:5.1,双侧Fisher‘s精确检验)。在成对的PBMC单核细胞中,相同的聚类参数仅显示3个单核细胞簇,没有明显的IL7R。+集群。(补充图。10)。最后,探讨观察到的IL7R是否+髓系细胞可能是巨噬细胞,我们对三个个体的原代单核细胞进行了标准的巨噬细胞分化试验。然而,我们发现未诱导巨噬细胞表达IL7R,有趣的是,这些细胞对LPS诱导的IL7R上调不起作用(补充图)。11)。总的来说,这些数据证实了IL7R+单核细胞在炎症部位可以很容易地被观察到,并且可能代表基于单细胞基因表达的单核细胞的一个独特的子集。

图5
figure5

IL7R+单核细胞形成一个独特的子集,可在滑液中检测到。a代表型流式细胞术检测与之匹配的PBMC(左)和SFMC(中同型对照,右)CD3门控的IL7R染色-CD 14+按照附图所示的顺序选通策略。1. b结果4例患者外周血单个核细胞(PBMC)和SFMC细胞的IL7R染色结果与流式细胞仪检测结果一致。csfMC单细胞RNA序列分析中单核细胞的t-SNE聚类显示5个团簇(n=3)。d单细胞单核细胞表达IL7R,LTB,CD 14,CCL 5,IL 32,和Tcf7中的t-sne聚类上的覆盖。c. e与所有前20位基因注释的其他SFMC单核细胞组相比,SFMC单核细胞簇4中的基因图明显上调。Wilcoxon秩和检验f中发现的五个SFMC单核细胞簇中前10位基因的热图c

讨论

eQTL对应于随后的蛋白质数量性状位点的程度是可变的。15初级免疫细胞的特征相对较差。这个IL7RLPS后单核细胞的eQTL特别耐人寻味,因为它的效应大小很大(r2(=0.30),与疾病相关位点的连锁,以及缺乏对IL7R在单核细胞中作用的事先探索。在此,我们发现在受刺激的单核细胞中,表面IL7R和sIL7R在蛋白水平上都有很强的表达,疾病相关多态性rs 6897932在调控这一过程中起主导作用。根据eQTL数据,表面受体QTL仅在刺激状态下观察到,并且在单核细胞和PBMC培养中方向一致,从而加强了这些发现的重复性。抗TNF单克隆抗体英利昔单抗可降低LPS诱导IL7R的作用。这与肿瘤坏死因子的自分泌有关,提示我们的观察可能具有致病和临床意义,因为抗肿瘤坏死因子治疗在脊椎关节炎的疾病管理中起着关键的作用。我们进一步证实TNF能诱导单核细胞表面IL7R和sIL7R的表达。在此过程中,我们再次复制rs6897932在单核细胞表面IL7R上的等位基因效应。单核细胞在急性炎症事件中是肿瘤坏死因子的主要分泌者,因此对单核细胞特异性反馈导致白细胞介素7R表达的观察尤其有意义,因为有越来越多的证据表明髓细胞在许多炎症疾病状态中起着重要的作用。16.

sIL7R被认为能增强IL-7信号。4并可能在IL-7生物学和疾病关联中发挥重要作用。虽然T细胞不能被排除为sIL7R的重要来源,但我们发现活化的单核细胞产生的sIL7R明显大于静止或活化的T细胞,这是以rs 6897932所描述的方式发生的,这表明在天然免疫活动的背景下,单核细胞对sIL7R的局部池有显著的贡献。尽管我们确定上位性效应的能力有限,但对rs 6897932个体杂合性的分析表明,rs 931555(在先前鉴定的eQTL方向)对sIL7R的调控具有显著的等位基因效应。因此,rs6897932似乎是单核细胞释放sIL7R的主要决定因素,也是决定表面表达的关键。与最近描述的剪接体组件的角色保持一致DDX39B在IL7R剪接中11,我们观察到DDX39B副命令基因,DDX39A,以及sIL7R水平,随着DDX39A与sIL7R降低有关。缺乏联系DDX39B可能反映细胞类型特异性机制,或可能与刺激诱导的稳态分化。

我们没有观察到rs 6897932对CD4中IL7R表面表达的影响。+或CD8+T细胞处于静息或刺激状态。由于我们没有在所有基因型队列中检测到T细胞来源的sIL7R,我们不能排除rs6897932对此的等位效应,但值得注意的是,刺激的单核细胞产生sIL7R比刺激的T细胞多几倍。有趣的是,sIL7R上这个等位基因以前的关联来自混合细胞群体。4..此外,在rs 6897932的GTEx数据中没有eQTL到IL7R,而在CD4中没有观察到eQTL。+T细胞6..然而,sIL7R水平在自身免疫条件下一直被证明是升高的,特别是MS。4,从原代T细胞中检测sIL7R的特异性尝试还没有证明与rs 6897932有等位基因联系。17,18,19..因此,我们的数据符合该等位基因对sIL7R和活化单核细胞表面蛋白表达的主导作用,并将单核细胞作为疾病关联的贡献细胞类型。

除了单核细胞sIL7R在调节炎症中的作用外,单核细胞通过表面受体对IL-7的直接反应能力也很有趣。炎症关节的单细胞测序实验证实了IL7R。+单核细胞是容易观察和有一个独特的表达谱。值得注意的是,外源性白细胞介素-7对单核细胞有调节作用的基因与在白细胞介素7R内差异表达的基因有很大的重叠。+单核细胞簇来自体内外单细胞数据。虽然我们无法从单细胞测序数据中剖析剪接效应,但来自同一细胞的qtPCR数据表明它们同样表达sIL7R。最后,单细胞qtPCR证明这些单核细胞能够共同表达IL7R的两个转录本,尽管这在rs 6897932的控制下很强。特别令人感兴趣的是对IL-7R的观察。+单核细胞表达许多以前认为是T细胞特异性的基因,例如CD2莱克,这些数据与最近从流排序的智能seq 2数据集中描述的相似子集保持一致。20..我们的数据显示IL7R+炎症关节处的单核细胞,提示这些细胞可能在炎症中起着迄今未知的作用。

IL7R也能与胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)受体二聚体结合。21,22,但单核细胞的表达很低,不受LPS的诱导。5因此,我们的研究重点是研究白细胞介素-7在单核细胞生物学中的作用。不能排除sIL7R在调节tslp信号中的另一个作用-事实上,英国的生物数据库数据显示,该等位基因与嗜酸性粒细胞计数有关。23..虽然我们证明TNF同时诱导了表面IL7R和sIL7R的表达,但这种反应的程度往往小于LPS。这不太可能是一种剂量效应,因为较高浓度的TNF会导致细胞死亡(未显示),而是暗示其他细胞因子或TLR 4途径直接发挥作用。最后,虽然我们没有观察到该等位基因对其他细胞亚群的影响,但我们的分析是粗CD4。+和CD8+分数,因此,表面IL7R在较小的子集中的等位基因调制是不能折扣的。

值得注意的是,我们的数据显示,疾病相关的C等位基因具有很强的基因型效应,在炎症过程中单核细胞来源的sIL7R较高。鉴于sIL7R在增强IL-7半衰期和生物利用度方面的已知作用4,这些结果与CD8的升高相一致。+C等位基因携带者中以前报道的T细胞计数2..这一发现通过对英国生物库数据集的分析得到了加强,其中rs 6897932与淋巴细胞百分比有关。23..重要的是,该模型符合IL-7在T细胞驱动的发病机制中的作用。24并与遗传学兼容,在遗传学中,大型数据集无法显示该等位基因对T细胞表达的直接影响。

总之,我们的研究提供了明确的证据,疾病相关多态性rs 6897932与单核细胞特异性调节表面IL7R和sIL7R有关。我们进一步证明,表达IL7R的单核细胞对IL-7有反应,其表达谱与体内外IL7R有明显的重叠。+脊椎关节病患者关节的单核细胞。这些观察突出了单核细胞在IL-7生物学中的作用,并可能对自身免疫性疾病的新疗法的发展产生影响。

方法

研究参与者

外周血来自牛津生物库招募的基因型个体(www.oxfordbiobank.org.uk)获得完全的道德认可(牛津大学REC:06/Q 1605/55)和书面知情同意。基因型在研究时被蒙蔽,直到招募结束时才显示出来。在知情同意下,从牛津大学医院NHS基金会信托基金(Oxford REC:06/Q 1606/139)的炎症性关节炎患者那里收集外周血和滑膜液样本。

细胞分离与刺激

用密度离心法(Ficoll Paque)将全血收集到EDTA管(BD真空保持系统)中,取外周血单个核细胞。CD 14细胞分离采用阳性选择法(Miltenyi),按制造商的指示进行。细胞在37°C(5%CO)下休息一夜(16h)。2在5ml非粘附聚丙烯细胞培养管(BD生物科学)前,刺激试验。在含20%胎牛血清的RPMI 1640培养基中,分别加入20 ng/ml LPS(Invivgen)、100 ng/ml pam 3 cysk4(Invivogen)、100 ng/ml imiquimod(Invivogen)、10 ng/ml TNF(R&D系统)、10 ng/ml IL-7(PeproTech)和CD2/3/28珠(Miltenyi),以1珠/2细胞的比例刺激细胞24 h。在所有的实验中,包括一个未经刺激的孵化器控制。5μg/ml英利昔单抗(Remicade,Janssen)可阻断肿瘤坏死因子(TNF)。巨噬细胞在M-CSF(50 ng/ml)存在的情况下被分化,如前所述。25.

流式细胞术

染色抗体和染料克隆、稀释物和制造商见附表1..细胞在含1%胎牛血清的磷酸盐缓冲液中冷藏20 min,然后用1.6%多聚甲醛固定。所有样品包括固定胺、活性染料和IL-7R异构体对照。流式细胞术对一名BD Fortessa进行每日校准和跟踪来自BD生物科学的珠子。利用Flowjo软件(Treestar)对数据进行分析。®).

ELISA法

从受刺激细胞中提取细胞上清液,并将sIL7R量化,如上文所述。11..一夜之间,用1μg/ml小鼠抗人CD 127单克隆抗体(R&D系统)包被96孔板.用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭板1h,加入细胞上清液2h,用12.5 ng/ml生物素化山羊抗人CD 127多克隆抗体(R&D系统)检测结合sIL7R,用链霉亲和素-HRP(链霉亲和素-HRP)孵育30 min,TMB过氧化物酶底物(TMB Fisher)孵育15 min。H停止了反应2所以4极板在450 nm处读取。用重组人CD 127 Fc嵌合体蛋白(R&D系统)建立标准曲线。

RNA提取

用AllPrepDNA/RNA/miRNA试剂盒进行RNA提取。细胞在350个μl的RLTplus缓冲液中重新悬浮,并转移到2ml管中。然后将样品保存在−80°C进行分批提取。用QIAshredder(齐根)对样品进行均匀化。DNase I在提取过程中被用来减少DNA污染。将RNA洗脱至35μ1的RNase无酶水中。用Qubit对RNA量进行定量,并将样品保存在−80°C保存,直至测序。

体RNA测序

RNA测序是在威尔康人类遗传学核心设施信托中心进行的。RNA通过生物分析仪(RNA 6000 Nano试剂盒,Agilent)进行质量控制测试,然后进行cDNA文库的制备。在HiSeq 4000平台上,对DNA片段两侧的100个碱基对进行配对测序。总共对每个样本进行了4700万至6900万个读取的排序(平均=5650万),每个通道的样本被复用为8个样本。

大批量RNA测序和图形化的分析方法

利用R.验证的软件包对RNA测序样品进行了生物信息学分析,用HISat将READS定位到人类基因组参考序列GRCH 38。26..基因计数用htseq计数检索。27以及Ensembl基因注释。DESeq 228采用成对模型进行差异表达分析,并对个体进行编码。使用R软件包XGR进行路径和网络分析。29..所有的统计分析均采用基数R进行,批量校正采用Logit转化细胞计数线性回归的方法进行。图是使用ggplot 2包创建的。30和用LocusZoom绘制的关联图31..在所有方格图中,上晶须从75厘米延伸到最大值1.5×IQR,下晶须从25厘米延伸到最小值1.5×IQR。晶须和盒子(铰链)的连接点代表25厘米和75厘米,中间用中心线表示。离群值是在晶须之外单独绘制的。

单细胞RNA-seq的细胞制备

收集周围性关节炎患者的血液和滑膜液,密度离心法立即分离单个核细胞。然后,细胞计数和加载到10×基因组铬机在收集后4小时内,从病人。根据制造商推荐的单细胞3‘协议捕获细胞并进行cDNA制备32为了实现75 bp的读取,在IlluminaHiSeq 4000上对库进行了测序。

单细胞实时定量PCR

CD 14+取正常供体的单核细胞,在20 ng LPS(InvivoGen)存在或不存在的情况下培养24h(±10 ng/ml IL-7(PeproTech)2h后,单细胞荧光激活细胞进入96孔板。细胞在预扩增前用载铂Taq(Thermo Fisher Science)和Superase-in RNase抑制剂(Ambion)的上标III进行裂解和反向转录。利用Taqman基因表达试验(Thermo Fisher Science)对细胞进行预扩增,扩增低表达转录本,并在TE缓冲液中稀释。采用Taqman通用PCR主成分(Thermo Fisher Science)、192:24集成电路(Fluidigm)和BioMark HD系统进行单细胞qPCR。无细胞井和逆转录无酶对照包括阴性和基因组DNA对照,以及一个阳性对照井包含100个细胞。用Fluidigm公司的实时PCR分析软件对数据进行分析。所有使用的引物的序列均在补充表中提供。2.

单细胞RNA-seq分析

序列读取用CellRanger V2.1.0GRCh38(Ensembl注释)映射。质量控制、过滤和聚类分析是用R包Seurat版本2.3.1进行的。为了排除低质量的细胞,基因不足500个的细胞被排除在外。可能是通过过滤出大于2000个基因或1万UMIS的细胞来去除双生子。所有线粒体分数大于7.5%的细胞也被排除在外。8219个PBMC细胞和6668个SFMC细胞通过过滤。对每个细胞条形码的UMI折叠的基因表达值进行图书馆大小的规范化,方法是将转录本的总数缩放,然后乘以10,000。然后使用log1p对数据进行自然日志转换。

PBMC和SFMC分别聚集。9712(Pbmc)和9409(Sfmc)基因具有较高的方差,我们选择的基因采用FindVariableGenes函数,其对数平均表达值在0.0125~4之间,离散度(方差/均值)在0.25~30之间。通过主成分分析降低了数据的维数,并对15个主成分进行了下游分析。然后使用了基于定义的PC机上构造的单元-单元距离矩阵的模块驱动聚类算法。这是使用Seurat的Find集群功能实现的,分辨率为0.6,用于识别PBMC和SFMC中的11个不同的细胞簇。

对关键细胞类型(如单核细胞CD 14)使用规范表达标记进行聚类注释。然后利用子集函数提取单核细胞簇的原始基因表达矩阵进行进一步分析。单核细胞特异性分析涉及基于15个主成分的重新聚类,分辨率为0.6。对于PBMC来说,发现了3个单核细胞簇,而在SFMC室中发现了5个单核细胞簇。在SFMC室,利用FindAllMarkers功能识别SFMC单核细胞簇中前20位基因,生成热图。所有单细胞差异表达检验均采用非参数Wilcoxon秩和检验.


武汉新启迪生物科技有限公司联系邮箱:
service@qidibio.com  techsupport@qidibio.com  
武汉新启迪生物科技有限公司咨询客服:周一至周五8:30-17:30
联系我们
服务保障                        支付方式
武汉新启迪生物科技有限公司联系电话:
027-87610298
027-87610297