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IL-6驱动的FasL促进NF-κBp 65/PUMA介导的门脉高压性胃病细胞凋亡

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发表时间:2019-10-08 14:36作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

IL-6驱动的FasL促进NF-κBp 65/PUMA介导的门脉高压性胃病细胞凋亡

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摘要

粘膜上皮细胞凋亡伴非特异性炎症是门脉高压性胃病(PHG)的重要病理特征。然而,髓系细胞与参与PHG的上皮细胞之间是否有协调的串扰尚不清楚。IL-6通过增强髓系细胞NF-κbp 65的激活,而通过tocilizumab阻断IL-6信号转导或缺失等途径,在phg患者和小鼠粘膜中诱导产生FasL。NF-κBp 65髓系细胞可减轻PHG的炎症反应和Fas/FasL介导的上皮细胞凋亡。髓系细胞IL-6驱动的FasL与上皮Fas受体结合,促进NF-κBp 65/PUMA介导的细胞凋亡,抑制NF-κBp 65或敲除美洲狮减轻PHG中Fas/FasL介导的上皮细胞凋亡。这些结果提示IL-6通过NF-κBp 65在髓系细胞中促进Fas/NF-κBp 65/PUMA介导的细胞凋亡,这种相互作用的髓系细胞与上皮细胞之间的相互作用可能为其提供一个潜在的治疗靶点。

导言

门脉高压性胃病(PHG)是肝硬化或非肝硬化门脉高压症患者中最常见的胃粘膜损伤。1,2,3,4..越来越多的研究表明,门静脉高压症、前列腺素(prostaglandins,Pgs)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和过量一氧化氮(NO)、氧自由基和脂质过氧化参与了PHG的发病机制。2,5,6..我们和其他人已经确认胃上皮细胞凋亡在PHG的形成中起着至关重要的作用。7,8..在许多病理条件下,细胞凋亡与一系列生化步骤和组织损伤密切相关。9..三个经典的信号网络,即肿瘤坏死因子α/肿瘤坏死因子受体1(Tnfr 1)、Fas配体(Fas配体)/Fas和肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)/死亡受体4(DR4)(又称TRAIL R1)/死亡受体5(DR5),通过调节核因子-κB(NF-κB)等信号通路来保护介导caspase依赖性细胞凋亡的调控因子。7,10,11,12..我们先前的研究表明,门脉高压可触发肿瘤坏死因子-α、Fas/FasL水平和内质网应激/p53上调的凋亡调节剂(Pfma)诱导的PHG粘膜上皮细胞凋亡。7,8..Fas在FasL参与后,导致具有死亡结构域的Fas相关蛋白和启动子proaspase-8通过其死亡效应域被招募到死亡诱导信号复合物(Disk)中,从而产生刽子手caspase裂解,从而导致细胞死亡。11,13,14..虽然肿瘤坏死因子-α在胃上皮细胞凋亡中的作用已得到广泛的阐明,但其Fas/FasL系统在胃上皮细胞凋亡中的作用尚不清楚。

NF-κB是一种普遍存在的转录因子,属于NF-κB/rel家族的二聚体亚基:NF-κB1(p50及其前体p 105)、NF-κB2(p52及其前体P 100)、p65(Rela)、RelB和c-rel。15..NF-κbp 65作为主要的功能元件,在不同的生理和病理过程中起着介导炎症、发育、损伤、凋亡和增殖的作用。8,16,17..以前的报道已经证实NF-κbp 65的激活参与了肿瘤坏死因子-α或IL-6信号在结肠炎、乳腺癌、结直肠癌、淋巴瘤细胞的发展中的作用。15,18,19..IL-6作为一种多向性细胞因子,由多种细胞分泌并引起反应.它不仅通过影响中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的产生、募集、分泌和转化来调节免疫,而且还通过调节信号转导子和转录激活因子3(信号转导子和转录激活因子3)和NF-κB通路,促进B细胞产生抗体,从而促进T细胞平衡的形成。20,21.

本研究发现IL-6通过NF-κBp 65激活促进髓系细胞产生FasL,并与上皮Fas受体结合,促进NF-κBp 65/PUMA介导的细胞凋亡。此外,抑制IL-6信号或特异性缺失NF-κBp 65髓系细胞可减轻PHG的炎症反应和Fas/FasL介导的上皮细胞凋亡。提示IL-6通过NF-κBp 65促进髓系细胞产生FasL,促进Fas/NF-κBp 65/PUMA介导的细胞凋亡。

结果

IL-6参与PHG

以往的研究表明,前列腺素、肿瘤坏死因子-α、氧自由基和转化生长因子-β等多种元素参与了原发性肝癌的发病过程。8,22,23..根据炎症反应在粘膜损伤中的重要性,采用实时定量PCR方法对胃内几种炎症因子进行定量检测。水平IL-1α, IL-1β, 肿瘤坏死因子-α, 转化生长因子-β, 伊-6,和ICAM-1PHG黏膜组织中明显增加(图1)。1A)。用部分门静脉结扎(PVL)小鼠模型,上述中介物的水平也增加了(图一)。1B)。表达伊-6在PHG患者和小鼠的PHG中,与其他因素相比,差异有统计学意义(P<0.05)。对PHG患者和健康志愿者血液中IL-6超家族成员的基因表达变化进行了基因显微分析,发现PHG标本中IL-6及其信号转导子的表达水平高于正常人(图1)。1C,d)。病理组织学检查显示PHG中存在胃组织结构缺失,PHG患者和PVL小鼠组织中IL-6的表达明显高于正常组,IL-6几乎位于胃间充质细胞中。1E,f)。WESTERNBLOTTING也显示了类似的情况。1g,h)。在此基础上,我们得出结论,IL-6与PHG有关.

图1:参与PHG的IL-6。
figure1

a, b分析相关胃粘膜炎性细胞因子的表达。β-肌动蛋白被用作内部控制。n每组均为均值±扫描电镜。邦菲罗尼的比较后特别测试。*P < 0.05 versus uninvolved tissues or SO (sham operation) mice, respectively. cPHG患者与健康志愿者IL-6超家族基因的二维层次聚类结果(n=每组6人)。d褶皱变了P通过微阵列实验,研究了PHG组织相对于正常组织(未参与组织)mRNA水平的变化。e本文报道了PHG患者胃黏膜组织和胃黏膜组织的内镜成像和IL-6免疫组化染色(褐色,×400)。n=每组6人)。fSO和PVL小鼠(棕色,×400,n=每组6人)。g, h采用Westernblotting法测定3对不同代表标本的胃粘膜IL-6和IL-6R水平。以β-肌动蛋白为加载对照.n=每组6

IL-6信号抑制减轻PHG炎症反应及Fas介导的上皮细胞凋亡

根据IL-6在PHG中的参与情况,采用选择性IL-6受体抑制剂Tocilizumab。托西利单抗能明显减轻PVL处理小鼠胃粘膜组织中的巨噬细胞(CD 68)、B细胞(CD 19)、T细胞(CD3)和中性粒细胞(髓过氧化物酶,MPO)浸润,并减轻胃黏膜细胞凋亡。2A,b)。细胞凋亡是通过一系列生化步骤介导的,三种常见的信号网络:肿瘤坏死因子-α/tnfr 1、Fas/FasL和TRAIL/DR4/DR5可能参与诱导细胞凋亡。7,11..在SO(假手术)小鼠中,检测到少量的胃粘膜TNF-α/TNFR 1、Fas/FasL和TRAIL/DR4/DR5。2C,d)。PVL组小鼠胃粘膜TNF-α/TNFR 1、Fas/FasL、TRAIL/DR4/DR5含量明显高于SO组。Tocilizumab抑制IL-6R可抑制Fas/FasL水平,但不影响TNF-α/TNFR 1和TRAIL/DR4/DR5的诱导,但能减轻PVL处理小鼠粘膜上皮细胞的凋亡(见图一)。2C,d)。上述结果提示,抑制IL-6网络可减轻PHG的炎症反应和Fas/FasL介导的细胞凋亡。

图2:抑制IL-6信号通路可减轻PHG的炎症反应和Fas介导的上皮细胞凋亡.
figure2

a分析组织中的炎性细胞染色和粘膜TUNEL染色(褐色,×400),n=每组6人)。b检测胃损伤指数(左)、CD 68指数(巨噬细胞)、CD 19指数(B细胞)、CD3指数(T细胞)、MPO指数(中性粒细胞)和凋亡指数(TUNEL染色)。a). n每组均为均值±扫描电镜。cWesternblotting检测胃粘膜Fas、FasL和caspase-3的表达.以β-肌动蛋白为加载对照.n=每组6人。dWesternblotting分析表明,Tocilizumab对PVL小鼠TNF-α/TNFR 1和TRAIL/DR4/DR5水平无影响。以β-肌动蛋白为加载对照.n=每组6

IL-6通过上调髓系FasL促进上皮细胞凋亡

为探讨IL-6通过Fas/FasL信号途径诱导粘膜上皮细胞凋亡的机制,采用重组小鼠静脉注射IL-6。组织病理学分析显示IL-6处理可诱导Fas和FasL的表达,与PBS(Vehicle)相比,如图所示。3A)。通过对IL-6或pbs处理小鼠的原代上皮细胞和髓系细胞mRNA的分析,我们发现IL-6诱导了小鼠骨髓原代上皮细胞和髓样细胞的mRNA表达。FasL几乎在髓系细胞中,而Fas上皮细胞增加。3B)。细胞计数试剂盒8(CCK-8)分析表明,在不加任何处理的情况下,培养48h后,它们的存活率最高(图1)。3C)。IL-6治疗后,Fas蛋白主要在胃粘膜上皮细胞中表达,而Fas蛋白主要在胃粘膜上皮细胞中表达(见图)。三维空间)。此外,IL-6对原代上皮细胞和胃上皮细胞株(GES-1)的Fas表达和凋亡均无促进作用(图1)。3E,f和补充图。1IL-6不能直接促进胃上皮细胞Fas的上调和凋亡,IL-6通过上调PHG中髓样FasL的表达而增强Fas介导的上皮细胞凋亡。

图3:IL-6通过上调髓样FasL促进上皮细胞凋亡.
figure3

a免疫组织化学染色显示IL-6可上调小鼠胃粘膜Fas和FasL的表达。n=每组6人)。b Fas法斯尔分离原代上皮细胞和髓系细胞mRNA的PCR分析。β-肌动蛋白被用作内部控制。n每组均为均值±扫描电镜。邦菲罗尼的比较后特别测试。c分离原代髓系细胞和上皮细胞的活力P65f/f(浮P65)老鼠或P65ΔM/ΔM(髓系细胞特异性NF-κBp 65分别用细胞计数试剂盒8(CCK-8)分析小鼠的缺失。n=每组6人。d诱导IL-6小鼠原代髓系细胞(左侧)产生FasL,而不诱导Fas和Caspase-3的切割。IL-6处理小鼠原代上皮细胞(右侧)可诱导Fas和Caspase-3断裂,而不诱导FasL。n每组均为均值±扫描电镜。eWesternblotting分析GES-1细胞中Fas、FasL和Caspase-3的表达。以β-肌动蛋白为加载对照.n每组均为均值±扫描电镜。fFas(绿色)免疫荧光染色和TUNEL染色显示IL-6不能促进原代上皮细胞凋亡。细胞核(蓝色)用DAPI(×800)染色。Fas指数和凋亡指数也有表达。n每组均为均值±扫描电镜。纳什,没有意义

IL-6通过NF-κBp 65上调肝癌髓系细胞FasL水平

利用原代髓系细胞,我们发现,与SO小鼠相比,PVL处理小鼠的原代髓系细胞中的FasL水平和NF-κBp 65磷酸化水平(NF-κBP-p65)均有升高。4A而对PVL处理的小鼠,STAT 3和ERK 1/2的激活不受影响。4B)。原代髓系细胞Fas在SO小鼠与PVL小鼠之间无显着性差异(图5)。4A提示IL-6可能不通过Fas信号途径促进髓系细胞凋亡,这与我们先前的研究表明胃上皮细胞凋亡而不是其他细胞凋亡在PHG的发病机制中起着特定的作用。PVL处理P65ΔM/ΔM(髓系细胞特异性NF-κBp 65(删除)小鼠和P65f/f(浮P65)小鼠被使用,并表明有针对性地删除了NF-κBp 65在髓系细胞中,pvl处理后小鼠的FasL沉积没有改变IL-6的状态,但两者之间没有明显差异。P65f/fP65ΔM/ΔM对照组小鼠。4C)。pvl处理后的原代髓系细胞NF-κ、bp-p65和FasL水平被阻断。P65ΔM/ΔM老鼠,与老鼠的水平形成对比P65f/f老鼠(图1.4D)。在体外培养的RAW 264.7细胞中,IL-6诱导NF-κBp 65磷酸化和Fas生成,而Bay11708(BAY)抑制NF-κBp 65的激活,同时阻断NF-κBp 65的分泌(附图)。2A-d)。转染NF-κBp 65在原264.7细胞诱导的FasLmRNA和蛋白质水平后,IL-6处理(补充图)。2E,f)。提示IL-6通过NF-κBp 65上调髓系细胞的FasL。

图4:IL-6通过NF-κBp 65上调肝癌髓系细胞FasL水平.
figure4

a用pvl处理小鼠的原代髓系细胞诱导FasL和NF-κBp 65磷酸化(NF-κBP-p65,作为p-p65),而不是诱导Fas。以β-肌动蛋白为加载对照.n=每组6人。b在SO(假手术)和PVL处理小鼠的原代髓系细胞中检测STAT 3和ERK 1/2的活性。以β-肌动蛋白为加载对照.n=每组6人。c NF-κBp 65髓系细胞缺乏可下调PVL小鼠胃粘膜FasL表达,而不影响胃黏膜IL-6水平(棕,×400)。n=每组6人)。d测定了分离于PVL小鼠的原代髓系细胞NF-κBP-p65、NF-κBp 65、IκBα、FasL和Fas水平。P65f/f,浮P65老鼠。P65ΔM/ΔM,髓系细胞特异性NF-κBp 65删除小鼠。以β-肌动蛋白为加载对照.n=每组6

IL-6驱动的FasL通过Fas促进PHG上皮细胞凋亡

与对照组比较,PHG组织中Fas、FasL表达增加,凋亡细胞增多。5A)。Fas和TUNEL双重染色显示Fas参与PHG粘膜凋亡。5B)。用细胞角蛋白标记上皮细胞显示Fas信号主要定位于粘膜上皮细胞。5C)。WESTERNBLOTTING结果显示,PHG患者和小鼠Fas和FasL同时伴有caspase-3的断裂(图二)。5E,f)。通过对分离自相关切片的原代上皮细胞和髓样细胞的分析,发现在人和小鼠PHG组织中,原代上皮细胞中Fas和Caspase-3的水平升高,而髓系细胞中FasL水平增加。5E,f)。对SO和PVL处理小鼠的原代髓细胞和上皮细胞进行流式细胞分析,结果表明:PVL处理小鼠的原代髓样细胞中FasL阳性率为41.8%,而PVL处理小鼠的原代上皮细胞中Fas阳性率为27.6%。5D)。结果表明,IL-6驱动的FasL通过Fas促进PHG胃上皮细胞凋亡.

图5:IL-6驱动的FasL通过Fas促进PHG上皮细胞凋亡.
figure5

aFas,FasL染色和TUNEL染色显示:棕色,×400,n=每组6人)。bFas(绿色)和TUNEL(红色)双重染色显示Fas介导的细胞凋亡对PHG有促进作用,细胞核(蓝色)被DAPI(×800)染色。n=每组6人)。cFas(绿色)和细胞角蛋白(红色)共染色显示Fas主要位于PHG患者和小鼠的上皮细胞,细胞核(蓝色)与DAPI(×800,n=每组6人)。d抗Fas或抗FasL抗体治疗SO(假手术)和PVL小鼠原代髓细胞和上皮细胞的流式细胞术分析(n=每组6人)。eWesternblotting显示,PHG切片(左侧)总粘膜中Fas、FasL和caspase-3的表达增强。检测PHG患者和健康志愿者(非正常人)的原代髓系和上皮细胞中Fas、FasL和Caspase-3的水平。以β-肌动蛋白为加载对照.n=每组6人。fFas、FasL和Caspase-3在PVL处理后均增强.测定SO和PVL处理小鼠原代髓系和上皮细胞中Fas、FasL和Caspase-3的表达。以β-肌动蛋白为加载对照.n=每组6

NF-κBp 65胃髓样细胞缺乏抑制PHG中Fas介导的上皮细胞凋亡

PHG模型的建立P65f/fP65ΔM/ΔM用小鼠进一步研究Fas介导的上皮细胞凋亡是否对PHG中的髓系细胞有反应。同时,在SO小鼠胃黏膜中均未检出TUNEL阳性细胞。P65f/fP65ΔM/ΔM老鼠。然而,pvl处理的细胞凋亡减弱。P65ΔM/ΔM小鼠与PVL组比较P65f/f老鼠(图1.6A,c)。利用上皮标记物细胞角蛋白,我们发现凋亡细胞主要定位于上皮细胞。6B)。原代上皮细胞P65f/fP65ΔM/ΔM小鼠证实NF-κBp 65胃髓样细胞缺乏症明显抑制pvl小鼠上皮细胞Fas水平、caspase-3的活化和NF-κbp 65的磷酸化,但两者在上皮细胞中检出的FasL较少。P65f/fP65ΔM/ΔM老鼠(图1.6d)。这些数据表明删除NF-κBp 65在髓系细胞中,Fas介导的PHG上皮细胞凋亡减弱。

图6:NF-κBp 65胃髓样细胞缺乏可减轻PHG中Fas介导的上皮细胞凋亡。
figure6

aPVL对胃粘膜细胞凋亡的抑制作用P65ΔM/ΔM(髓系细胞特异性NF-κBp 65(删除)小鼠与P65f/f(浮P65)小鼠(TUNEL染色,×400,n=每组6人)。b细胞角蛋白(Green)和凋亡细胞(TUNEL)的双重染色表明,PVL小鼠胃黏膜上皮细胞主要位于胃凋亡细胞(上,×400;下面板,×800)。n=每组6例)。cTUNEL染色显示凋亡指数。n每组均为均值±扫描电镜。*P < 0.05 versus SO (sham operation) mice, #P < 0.05 versus PVL-treated P65f/f老鼠。dWesternblotting分析显示NF-κBp 65髓系细胞阻断Fas、caspase-3水平及NF-κBp 65磷酸化。以β-肌动蛋白为加载对照.n=每组6

Fas/FasL通过NF-κBp 65促进PHG上皮细胞凋亡

我们先前的数据证明NF-κbp 65激活参与了胃上皮细胞凋亡。8..组织学和蛋白质分析表明,患者和小鼠的PHG切片中NF-κBp 65磷酸化(NF-κBP-p65)明显增加,并伴有明显的上皮细胞凋亡。7a,b)。能抑制NF-κBp 65活化的BAY能阻断pvl处理的黏膜细胞凋亡。P65f/fP65ΔM/ΔM老鼠(图1.7C,f)。然而,BAY抑制caspase-3的裂解和粘膜凋亡,对pvl处理的Fas和FasL的抑制均无明显影响。P65ΔM/ΔM小鼠,虽然它确实减轻了Fas和FasL在PVL治疗中的表达。P65f/f老鼠(图1.7D)。双重染色显示NF-κ、BP-p65和Fas信号均位于类似的细胞内(附图)。3AFas与上皮标记细胞角蛋白共染色主要共存(附图)。3B)。此外,PHG患者和小鼠均同时观察到明显的胃细胞凋亡和p-p 65的高表达(图1)。7E)。这些数据表明,髓系细胞NF-κBp 65促进了FasL的产生,而在上皮细胞中,NF-Bp 65促进了Fas介导的粘膜凋亡。

图7:Fas/FasL通过NF-κBp 65促进PHG上皮细胞凋亡。
figure7

aNF-κBP-p65和TUNEL染色的典型图像(棕色,×400,n=每组6人)。bWESTERNBLOTTING显示NF-κBP-p65在胃粘膜组织中表达上调。以β-肌动蛋白为加载对照.n=每组6人。cNF-κB抑制剂BAY对PVL处理后黏膜细胞凋亡的抑制作用P65f/fP65ΔM/ΔM小鼠,不影响SO(假手术)小鼠(TUNEL染色,棕色,×400,n=每组6人)。d贝抑制pvl处理的caspase-3裂解、Fas、FasL、粘膜凋亡及NF-κbp 65磷酸化P65f/f老鼠。以β-肌动蛋白为加载对照.n=每组6人。eNF-κBP-p65(绿色)和TUNEL(红色)、细胞核(蓝色)双重染色用DAPI(×800)染色,n=每组6人)。f细胞凋亡指数为:c)(上面板)。n每组均为均值±扫描电镜。*P < 0.05 versus P65f/f无湾给药小鼠#P < 0.05 versus P65ΔM/ΔM无湾给药小鼠

美洲狮参与Fas/FasL/NF-κBp 65介导的PHG上皮细胞凋亡

Puma已被证明是NF-κbp 65的新靶点,也是胃上皮细胞凋亡的重要介导因子。19,24,25..PHG组与正常组比较,PUMAmRNA和蛋白表达均明显增强。8a,b)。删除NF-κBp 65髓系细胞美洲狮PVL组的WT小鼠抑制了PUMA的表达,在SO小鼠胃粘膜中检测到的PUMA阳性细胞较少。P65f/f/美洲狮-WT小鼠和P65ΔM/ΔM/美洲狮-WT小鼠(图1.8C)。pvl处理后caspase-3的断裂受到抑制。P65ΔM/ΔM/美洲狮-WT小鼠(图1.8D). 美洲狮-KO小鼠P65f/f我们发现删除美洲狮在……里面P65f/f小鼠在不影响NF-κBp 65活性和Fas水平的情况下,减轻PVL诱导的上皮细胞凋亡和胃损伤。8E,h). 美洲狮缺乏症P65f/f小鼠抑制促凋亡蛋白caspase-3的活化,而不影响PHG小鼠Fas、FasL和NF-κBp 65的活性。8F,gNF-κBp 65是PUMA的上游调节因子,参与Fas/FasL介导的上皮细胞凋亡。利用与原代髓系细胞和小鼠上皮细胞的共培养实验(见图)。9A),我们发现,在IL-6处理下,共培养体系培养基中FasL的浓度增加,而删除NF-κBp 65髓系细胞美洲狮-WT小鼠抑制了这种增加(图1)。9B)。IL-6增强髓系细胞NF-κBp 65和FasL水平的活化,同时靶向性地缺失NF-κBp 65髓系细胞美洲狮-WT小鼠取消了上述反应(图1)。9B)。流式细胞仪分析显示,IL-6处理后原代上皮细胞的早期和晚期凋亡率明显高于对照组,而缺失细胞的凋亡率则明显高于对照组(P<0.0 5)。NF-κBp 65IL-6联合培养体系中髓系细胞抑制早期和晚期上皮细胞凋亡(早期凋亡细胞为13.60%,晚期凋亡细胞为21.80%;晚期凋亡细胞为4.75%,晚期凋亡细胞为18.3%)。9C)。IL-6处理后,原代上皮细胞中Fas、nf-κbp-p65、pu-ma和caspase-3的表达水平明显升高,而非bid和caspase-8的切割。NF-κBp 65髓系细胞美洲狮-WT小鼠抑制上皮细胞的变化。9d)。CCK-8检测结果显示,IL-6处理后,系统中上皮细胞活力明显降低,而不受细胞凋亡的影响。NF-κBp 65是否存在于髓系细胞中(见图)。9d)。提示IL-6通过NF-κBp 65在髓系细胞中驱动FasL,促进NF-κBp 65/PUMA介导的上皮细胞凋亡,抑制细胞体外存活。结果发现,IL-6处理不能直接调节正常小鼠原代上皮细胞Fas、FasL、PUMA和Caspase-3的表达,而FasL能促进原代上皮细胞Fas、NF-κ、BP-p65、PUMA和Caspase-3的表达。9E,f)。为探讨PUMA介导的内源性凋亡的机制,采用差速离心法从共培养系统中的原代上皮细胞中分离纯化了线粒体和胞浆组分。Western印迹法检测细胞色素c的释放。在pbs处理的共培养体系中,细胞色素c在线粒体组分中检测到,而在胞质组分中未检出,而IL-6处理组分中细胞色素c的含量在共培养系统中增加,特别是在与髓系细胞共培养的上皮细胞中。P65f/f/美洲狮-WT小鼠(图1.9g)。总之,PUMA是Fas/FasL/NF-κBp 65介导的PHG上皮细胞凋亡的重要介导因子。

图8:美洲狮参与Fas/FasL/NF-κBp 65介导的PHG上皮细胞凋亡。
figure8

a实时PCR美洲狮PHG组和PVL组小鼠的mRNA表达分别是对照组的5倍和4倍。β-肌动蛋白被用作内部控制。n每组均为均值±扫描电镜。邦菲罗尼的比较后特别测试。bPUMA免疫组化染色(棕色,上面板,×400,n=每组6人)。采用Westernblotting(下板)法分析所示组织中PUMA的含量。以β-肌动蛋白为加载对照.c美洲狮染色显示NF-κBp 65髓系细胞美洲狮-WT小鼠抑制PUMA的表达(棕,×400,n=每组6例)。dWESTERNBLOTTING显示NF-κBp 65髓系细胞美洲狮-WT小鼠抑制PUMA介导的细胞凋亡(左面板)。以β-肌动蛋白为加载对照.n=每组6人。e免疫组织化学染色显示美洲狮在……里面P65f/f小鼠抑制PVL诱导的凋亡(TUNEL染色),而不影响NF-κBp 65活性(p-p65染色)和Fas水平(棕,×400)。n=每组6人)。f, gWESTERNBLOTTING描述了美洲狮缺乏症P65f/f在不影响Fas、FasL和NF-κBp 65活性的情况下,小鼠抑制caspase-3的表达。以β-肌动蛋白为加载对照.n=每组6人。h胃损伤指数分析提示PVL治疗后胃粘膜损伤减轻。P65f/f/美洲狮-KO小鼠与P65f/f/美洲狮-WT小鼠。n每组均为均值±扫描电镜。*P < 0.05 versus SO mice, #P < 0.05 versus PVL-treated P65f/f/美洲狮-WT小鼠

图9:IL-6驱动的FasL在体外促进了PUMA介导的上皮细胞凋亡.
figure9

a小鼠原代髓系细胞和上皮细胞共培养实验示意图。b指示培养基中FasL的浓度a)用ELISA法检测(左面板,n=每组6人)。数值为均值±扫描电镜。*P < 0.05 versus the medium of PBS-treated cells, #P < 0.05 versus the medium of IL-6-treated P65f/f/美洲狮-WT细胞。用Westernblotting方法检测原代髓系细胞相关蛋白的表达(右面板,n=每组6人)。c用AnnexinV-PE/7-AAD染色试剂盒(流式细胞仪)检测原代上皮细胞凋亡程度。d在共培养实验中发现了原代上皮细胞中的指示蛋白,并对其进行了缺失。NF-κBp 65髓系细胞美洲狮-WT小鼠在IL-6共培养条件下(上板)抑制Fas、NF-κBP-p65、PUMA和Caspase-3的切割,而不影响Bid和Caspase-8的裂解。用CCK-8法(下板)分析上皮细胞活力。*P < 0.05 versus the medium of PBS-treated cells. eWesternblotting显示IL-6处理不影响离体原代上皮细胞Fas、FasL、PUMA和Caspase-3的水平。以β-肌动蛋白为加载对照.n=每组6人。fFas、NF-κ、BP-p65、PUMA和Caspase-3的表达明显增强。以β-肌动蛋白为加载对照.n=每组6人。g线粒体an用Westernblotting分析了细胞色素c的胞浆组分。n=每组6人)。分别以β-actin和cox IV作为细胞浆和线粒体组分的负载控制。

讨论

与正常胃黏膜相比,PHG组胃粘膜结构明显破坏,水肿和糜烂,血管扩张伴炎性细胞浸润,上皮细胞凋亡明显。2,3,6..我们先前的研究表明,肿瘤坏死因子-α/tnfr 1和FasL/Fas通过增加caspase家族成员的活性而促进胃粘膜细胞凋亡,炎症细胞驱动的α通过调节pfn-κbp 65/诱导型一氧化氮合酶(INOS)/一氧化氮合酶(INOS)/NO信号而在ER应激/pfma介导的粘膜上皮细胞凋亡中发挥重要作用。3,7..然而,Fas/FasL在PHG中激活的深入机制尚不清楚。在本研究中,我们发现IL-6通过NF-κbp 65在髓系细胞中促进FasL的产生,从而通过Fas受体促进phg中NF-κbp 65/PUMA介导的粘膜损伤和上皮细胞凋亡,抑制IL-6网络或缺失。NF-κBp 65髓系细胞炎症反应减轻,Fas/FasL介导的上皮细胞凋亡减轻,提示IL-6驱动的Fas/FasL分子在PHG的粘膜损伤和凋亡中起着特殊作用。

PHG发病机制复杂,存在诸多争议。对内脏血流量、胃血分布、各种因素、局部紊乱和门脉压力等进行了检测,以阐明其发病机制。26..除了血管改变和胃血流量改变外,PHG还描述了非特异性炎症的组织学证据,固有层结膜血管周围经常出现炎性细胞浸润和细胞因子生成。27,28..通过检测pvl诱导的pgg小鼠和患者的粘膜,我们发现,伴随着炎症的浸润,IL-1α, IL-1β, 肿瘤坏死因子-α, 转化生长因子-β, 伊-6,和ICAM-1PHG组织中明显增加。其中IL-6在胃间充质细胞中表达水平最高,几乎分布于所有胃间充质细胞。此外,选择性IL-6受体抑制剂Tocilizumab可减轻PHG小鼠巨噬细胞、B细胞、T细胞和中性粒细胞浸润。此外,阻断IL-6可抑制Fas/FasL水平,而不影响TNF-α/TNFR 1和TRAIL/DR4/DR5诱导,但能减轻PVL小鼠粘膜上皮细胞凋亡,提示IL-6介导的粘膜上皮细胞凋亡依赖于Fas/FasL信号通路,而不是TNF-α/TNFR 1和TRAIL/DR4/DR5网络。

IL-6是由广泛的靶细胞产生并引起反应,并通过IL-6R对中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的产生、募集和功能表型的影响来调节免疫。21,29..IL-6以及其他炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β,被认为参与了多种蛋白的产生,如C-反应蛋白、血清淀粉样蛋白A、纤维蛋白原、血管内皮生长因子和胰高血糖素样肽-1,这些蛋白通过激活NF-κB或STAT 3途径参与免疫细胞,从而导致各种疾病的发生或发展。21,30..通过对小鼠原代上皮细胞和髓系细胞的分析,发现IL-6几乎通过NF-κBp 65激活而非STAT 3和ERK 1/2元件在髓系细胞中诱导FasL,从而进一步刺激其受体Fas在上皮细胞中的表达。此外,删除NF-κBp 65在髓系细胞中,PHG小鼠的FasL沉积和Fas介导的上皮细胞凋亡明显改善。而IL-6不能直接通过原代上皮细胞和胃上皮细胞系ges-1介导上皮细胞Fas的诱导和凋亡,尽管有报道称IL-6参与了肝细胞、骨髓瘤细胞和结肠癌细胞等免疫细胞和非免疫细胞的凋亡抵抗。31,32,这可能与不同细胞类型、组织微环境和不同紊乱状态下的受体/信号系统有关,值得进一步评价。

我们以前和现在的数据表明,Fas/FasL水平与凋亡上皮细胞的增加同时存在于PHG的粘膜中。7..细胞凋亡是通过FasL与其受体Fas在细胞表面的结合和协同作用来实现的,然后通过多种细胞内元素的相互作用来协调caspase的递阶激活和细胞死亡。33..分离的原代细胞和共染色分析显示Fas主要定位于粘膜上皮细胞,并参与其凋亡的发生。有趣的是,NF-κBp 65胃髓样细胞缺乏症抑制FasL表达,随后Fas下调,提示IL-6驱动的FasL通过Fas促进PHG上皮细胞凋亡,这与免疫细胞促进门静脉高压不同并发症(如PHG)病理生理机制的整合是一致的。

作为NF-κB家族的主要功能元件,NF-κbp 65在phg中通过ER应激/pu MA途径介导α介导的上皮细胞凋亡,并在各种组织和细胞类型(包括小肠上皮细胞、肝细胞和胸腺细胞)中诱导凋亡。19..为检测Fas/FasL介导的pgp是否也有此情况,采用NF-κbp 65抑制剂Bay11708(BAY),BAY抑制粘膜细胞凋亡,但对Fas和FasL均无抑制作用。P65ΔM/ΔMPHG小鼠虽然能减轻pvl处理后Fas和FasL的表达P65f/f提示NF-κBp 65在胃髓系细胞和胃粘膜上皮细胞中起着不同的作用,即促进髓系细胞产生FasL,促进上皮细胞凋亡。我们和其他人鉴定了puma作为NF-κbp 65的新靶点,表明它在体内外介导细胞凋亡中起着重要的作用。8,34..当NF-κbp 65通过肿瘤坏死因子-α或Fas/FasL等细胞死亡受体激活时,pUMA促进caspase活化,触发细胞死亡。19,35..击倒美洲狮对缺血再灌注诱导的肠细胞凋亡、门脉高压诱导的胃细胞凋亡、炎症诱导的结肠凋亡等均有明显的预防作用。8,36,37..在本研究中,我们发现髓系细胞的缺失NF-κBp 65抑制PHG中PUMA和PUMA介导的细胞凋亡。此外,作为NF-κBp 65下游靶点的PUMA明显增强Fas/FasL/NF-κBp 65网络诱导的上皮损伤和凋亡。这些发现进一步拓宽了上皮细胞凋亡的调控网络,加深了我们对PHG分子机制的认识。

综上所述,IL-6通过NF-κBp 65促进髓系细胞产生FasL,促进Fas/NF-κBp 65/PUMA介导的PHG上皮细胞凋亡,为PHG提供了一个潜在的治疗靶点。

材料和方法

组织样本

15例PHG患者胃粘膜标本(女/男:8/7,年龄:49.47±7.33)。其中8例为乙型肝炎病毒(HBV)感染的肝硬化,7例为门静脉阻塞(因门静脉海绵状转变或无肝硬化门脉血栓形成)。幽门螺杆菌15名健康志愿者(女/男:7/8;年龄:50.00±5.12)在任何治疗干预前,均在中山大学附属第三医院内镜中心进行定期健康体检,未参与的健康志愿者和PHG患者的特征见“补充表”。1..PHG患者和健康志愿者在性别和年龄上进行了匹配(性别:P=1.000;年龄:49.47±7.33vs50.00±5.12,P=0.819)。由于PHG最常见的部位是胃体和胃底,PHG的眼底总是与胃静脉曲张有关。1,2,4健康志愿者和PHG患者的胃标本均来自胃体。在纳入研究之前,从每个患者和健康志愿者那里获得书面知情同意,内镜检查人员在内镜检查前对各小组视而不见。研究方案和组织样本的获取得到中山大学第三附属医院机构审查委员会的批准。

小鼠与门脉高压的诱导

所有动物实验均经中山大学动物保护与利用机构委员会批准.氧氟沙星NF-κBp 65 (雷拉,P65浮标/浮标)在C57BL/6基因背景下产生小鼠。表达溶菌酶启动子驱动的小鼠CRE重组酶基因LysM-creC57BL/6基因背景上的小鼠,由叶建平博士(美国洛杉矶巴吞鲁日路易斯安那州立大学彭宁顿生物医学研究中心)提供。髓系细胞特异性NF-κBp 65删除小鼠(P65ΔM/ΔM)是通过横过浮标生成的。P65小白鼠LysM-cre老鼠,这说明NF-κBp 65仅在髓系细胞中消融,包括单核细胞、成熟巨噬细胞和粒细胞。浮起P65小白蚁(P65浮标/浮标,也是P65f/f)作为野生型(WT)小鼠。美洲狮+/–C57BL/6背景下的杂合子小鼠(美国缅因州巴尔港杰克逊实验室)与P65ΔM/ΔMP65f/f生成P65ΔM/ΔM/PUMA-WT,P65ΔM/ΔM/PUMA-KO,P65f/f/PUMA-WT,和P65f/f/PUMA-KO的条款,分别。小鼠在上午7:00至晚上7:00(12:12 h光:暗周期;气候控制的环境(22±2°C)的房间内被安置在微型隔离笼中,并被允许进入水和Libitum。所有实验均以盲的方式进行,将小鼠随机分为两组。实验结束时,所有小鼠都被过量的二氧化碳吸入杀死。

如前所述,门静脉结扎(PVL)技术可诱发小鼠门静脉高压性胃病。3,8..门静脉经仔细分离和校准后,在氯胺酮和川芎嗪混合麻醉剂的麻醉下,采用单根3~0丝结扎门静脉和20英寸钝针头进行收缩。然后,针被移除,留下一个校准的狭窄,其直径约为其初始门静脉直径的50%。在假手术(SO)小鼠中,同样的手术是在隔离门静脉后不结扎的情况下进行的。上述手术后,所有动物都被关在笼子里,并允许他们免费获得食物和水2周。在一些实验中,小鼠术后每隔一天分别注射载体(对照组)或选择性IL-6受体抑制剂Tocilizumab(6mg/kg,CalBiochem,La Jolla,CA,USA),连续2周,或每只小鼠每天注射200μg/(BAY,NF-κB抑制剂,CalBiochem),连续2周。在IL-6治疗实验中,小鼠分别注射载体(PBS)或重组小鼠IL-6(每只小鼠80 ng/只,研发系统,明尼阿波利斯,美国MN)。PBS或IL-6注射后8h处死小鼠。

样本采集

在动物被杀死后,整个胃被小心地移除,用冰凉的生理盐水彻底冲洗,然后像前面描述的那样打开,露出胃黏膜。3,8..取黏膜层,在−80°C保存,然后进行蛋白质和mRNA分析。整个胃用中性缓冲福尔马林固定,制备石蜡切片。健康志愿者和PHG患者的胃标本均采用同样的方法处理。

组织学和TUNEL染色

末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记(TUNEL)是根据制造商的指示使用检测试剂盒进行的。凋亡指数是通过将凋亡细胞的数量除以至少20个随机选择的字段(×200)中的细胞总数来确定的。3,8,38..整个胃被仔细切除和冲洗彻底,然后在其较小的弯曲上纵向打开以暴露胃粘膜,并根据上述标准盲目地分析胃损伤指数。3:0:正常;1:粘膜糜烂;2:粘膜溃疡(<1mm);3:粘膜伴溃疡(1-2mm);4:粘膜有溃疡(3-4 mm);5:粘膜有溃疡(>5mm)。

免疫组织化学和免疫荧光染色

免疫组织化学(IHC)染色:切片经离体、再水化和抗原提取处理,然后与所指示的抗体孵育。以HRP结合抗体为第二抗体,ABC染色法检测,最后用苏木精染色。免疫荧光染色采用生物素结合二次抗体和链霉亲和素Alexa 488(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)或594(分子探针,Eugene,OR,USA)孵育,用2 mg/ml的4‘,6-二氨基-2-苯环吲哚二盐酸盐(DAPI,分子探针)对抗体-抗原复合物进行染色。共染色法在完成第一次蛋白检测后,采用玻片检测次级靶蛋白。组织染色用抗IL-6、CD 68和MPO(均来自美国圣克鲁斯)、细胞角蛋白和PUMA(均来自ABCAM、剑桥、MA、美国)和CD3、CD 19、NF-κBP-p65(均来自细胞信号技术、丹佛斯、MA、美国)和Fas、FasL(均来自Sigma、St Louis、MO、USA)的原抗体孵育。

细胞色素c释放的分析

为了分析细胞色素c的释放,我们用上述的差速离心法分离了每个上皮样本中的线粒体和细胞质组分。38,39.

WESTERNBLOTTING

从新分离的组织中提取总蛋白,在Westernblotting分析缓冲液(10 mM Tris-HCl(pH7.4)、150 mM NaCl、1%TritonX-100、1%脱氧胆酸钠、0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)、5mm乙二胺四乙酸(EDTA)、1mm苯甲基磺酰氟(PMSF)、0.28 Ku/L抑肽酶、50 mg/L亮肽、1mm联苯胺和7 mg/L胃蛋白酶A)中制备匀浆酸。然后以10,000×g在4℃下培养20 min,取上清液作为蛋白裂解液,保存在−80°C处进行分析。定量后,将等量的蛋白质裂解液在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上进行恒电流电泳,然后在半干式电转移装置上转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Milli孔隙,Billerica,MA,USA)上。在5%脱脂乳中阻断膜,用抗IL-6、-Fas、-FasL、-裂解caspase-3(细胞信号技术)、-断裂caspase-8(细胞信号技术)、-Bid(细胞信号传递技术)、-细胞色素c(细胞信号技术)、-TNF-α(细胞信号技术)、-ERK 1/2和-p-ERK 1/2(细胞信号技术)、-TNFR 1(ABCAM)、-TRAIL(AbCAM)、-DR4(圣克鲁兹)、-DR5(圣克鲁兹)、-DR4(圣克鲁兹)、-ERK 1/2和-p-ERK 1/2(细胞信号技术)、-PUMA(ABCAM)、-IL-6R(ABCAM)、-NF-κBP-p65、-NF-κBp 65(Sigma)、-IκBα(ABCAM)、-STAT 3(Sigma)、-P-STAT 3(Sigma)、-Cox IV(圣克鲁斯)或-β-Actin(-β-actin)。用上述抗体隔夜孵育后,清洗膜,用合适的辣根过氧化物酶结合二次抗体检测一次抗体/抗原复合物,最后用ECL检测试剂检测信号(美国NJ,美国药典,Piscataway)。3,38.

实时聚合酶链反应

根据制造商的指示,用SuperScriptⅢ逆转录酶(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)分离和反转录总RNA。采用基因特异性引物和Dynamo SYBR绿色主混合(Finnzymes,芬兰)实时PCR系统(BioRad,Hercules,CA,USA),在Chromo 4检测仪(mj Research,塞拉利昂,CA,美国)上进行实时PCR分析。3,38. IL-1α, IL-1β, 肿瘤坏死因子-α, 转化生长因子-β, 伊-6, ICAM-1, Fas, 法斯尔,和美洲狮用引物(Invitrogen)扩增。作为内部控制,表现为β-肌动蛋白在每个样本中也使用感引物(Invitrogen)进行量化。数据分析采用相对定量算法(即相对mRNA比值)。为了控制不需要的变异源,每个样本被标准化为β-肌动蛋白同一样本中的基因。这个公式是基因的相对表达=2。−ΔΔCT,ΔΔCT值=[治疗组靶基因CT值(治疗组−β-actin CT值)−(对照组靶基因CT值−β-actin CT值)]。n每组均为均值±扫描电镜(均值的标准差)。

原代细胞分离与细胞培养

如上文所述,用非循环胶原酶灌注法将原代胃细胞从指示的小鼠中分离出来。3..整个胃被小心切除和冲洗,结扎幽门,然后通过贲门灌注Ca。2+-游离HBSS(汉克氏平衡盐溶液)15 min,加用0.2%蛋白酶溶液100 ml和0.2%胶原酶-IV(Sigma)溶液。取黏膜层制成细胞悬液,经100μm孔径网状尼龙过滤器过滤(中国上海辛帕姆化学试剂)。细胞在300×离心时离心。g取药15 min,分离胃上皮细胞,取原代髓样细胞上清液。制备了30%Percoll(Sigma),并将上述颗粒仔细添加到Percoll的上层,然后以450×分离心。g收集胃上皮细胞20 min。对原代髓样细胞分离,上述上清液在1400×离心。g30 min后,取颗粒进行髓样细胞培养。原代细胞在rpmi培养基1640中加入10%热灭活胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素,在37°C加5%CO加湿培养箱中培养。2培养48h后,经细胞计数试剂盒(CCK-8)测定,原代细胞活率最高(日本熊本省Dojindo)。用CCK-8法检测原代分离细胞的存活率.简单地说,适当的细胞在96孔板中播种24-96 h,在相应的井中加入10μ1的cck-8溶液,并在5%的CO中孵育。2培养2h,然后在450 nm波长处测量。GES-1和原始的264.7细胞系从美国的培养收集(美国,美国马纳萨斯).GES-1细胞在RPMI培养基1640中培养,RAW 264.7细胞在DMEM培养基中培养.

体外实验中,分别加入重组IL-6(10 ng/ml)或FasL(10 ng/ml,Sigma)12 h,收集细胞进行进一步分析。在共培养实验中,将原代髓样细胞和上皮细胞与rpmi培养基1640共培养48h,再加入10 ng/ml重组IL-6(R&D系统)或相同体积的pbs(对照组)共培养12h,流式细胞仪检测分离的原代上皮细胞和髓样细胞,分别用商业用抗Fas或抗FasL染色。应用AnnexinV-PE/7-AAD(7-氨基-放线菌素D)(KeyGEN生物技术)染色试剂盒检测原代上皮细胞凋亡。根据制造商的指示,用BD FACS杯或BD FACS Aria(Becton Dickinson,美国)进行流式细胞术分析,并使用FCS Express软件Flowjo 7.6对数据进行分析。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(中国武汉华美生物科技大学CUSABIO),对共培养体系中FasL浓度进行检测。

微阵列分析

微阵列实验如前所述。40..根据TRIzol试剂(Invitrogen)的指示分离出每个样品的总RNA,用MIVana miRNA分离试剂盒(Ambion,Autin,TX,USA)进行纯化。以Cy3-dCTP标记的cDNA为模板,采用Ebervy线性RNA扩增法和酶促反应法,得到双链cDNA(DsDNA)产物,并根据PCR核蛋白提取液II试剂盒的指示进行纯化和洗脱。然后将洗脱的dsDNA蒸发至16毫升,在37℃下进行40毫升的转录反应14小时,按照前面所述的T7酶混合物的指示进行。40..采用Klenow酶标记策略,然后用CbcScriptⅡ逆转录酶进行逆转录。最后,在Agilent杂交炉进行了一夜的阵列杂交。在此基础上,采用GeneSpring软件V12阵列对数据进行汇总和规范化。利用集群3.0软件的调整数据功能对数据进行Log2变换和分层聚类。JavaTreeView(斯坦福大学医学院,斯坦福,加利福尼亚州,美国)是为了树的可视化。

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