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功能性CD8的快速筛选与鉴定+来自大型肽编码库的T细胞表位

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发表时间:2019-10-08 14:32作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

功能性CD8的快速筛选与鉴定+来自大型肽编码库的T细胞表位

文章度量

摘要

细胞毒性CD8+T细胞识别并消除感染或恶性细胞,这些细胞表面存在着从细胞内加工的抗原中提取的肽表位。然而,综合分析特定的主要组织相容性复合体(Mhc)结合肽表位,这些肽表位是自然加工的,能够激发功能性T细胞反应,这一直是一项具有挑战性的工作。在此,我们报道了一种用CD8体外共培养法进行T细胞表位分析的方法。+T细胞与靶细胞通过高复杂度、表位编码的微基因文库进行转导.在共培养过程中受到T细胞毒性攻击的靶细胞是在细胞凋亡之前通过荧光激活的细胞分类分离出来的,其特征是对编码的微基因进行了序列分析。然后,我们使用已知的小鼠T细胞受体/肽-MHC对和不同的微基因编码表位库验证了这种高度并行化的方法。因此,我们的数据表明,这种表位分析方法允许明确和敏感地鉴定自然加工和MHC提出的肽表位。

导言

由于抗原特异性T细胞活化的复杂性,识别T细胞表位是一项困难的任务.造成这种复杂性的因素有几个。首先,可能存在的独特的短肽数量使得一个巨大的T细胞表位空间被搜索。第二,肽提呈的主要组织相容性复合物(Mhc)分子编码于人体内。赫拉具有多基因和高度多等位基因的基因赫拉编码MHC变异体的等位基因具有不同的肽结合和T细胞受体(TCR)结合偏好。第三,蛋白水解过程中抗原蛋白和酶的胞内表达水平的变化也影响到pMHC的免疫原性。1..最后,TCR/肽-mhc(PMHC)相互作用是短暂的。2,滥交3,与抗体识别表位相比,亲和力相对较低。4.

目前,各种基于功能和亲和的抗原筛选方法都在使用中。5..在基于功能的方法类中,候选T细胞肽出现在靶细胞表面,并测试其产生功能性T细胞反应的能力。然后,通过基于T细胞的读出来识别这些反应,例如释放细胞因子。6,激活与nft链接的记者7,8,9,或者监测抗原提呈细胞(Apc)的破坏,以测量功能T细胞的激活。10..所有这些配置都有一个共同的要求,即用单个候选抗原加载目标细胞群体,并在不同的反应中测试每一种抗原的T细胞识别“一对一”。合并策略可以增加搜索空间,但随后需要进行艰苦的解构。11,12,13..因此,功能细胞分析还有待于以一种可以想象的方式来进行大规模的潜在表位的彻底筛选,例如那些跨越整个蛋白质组的表位。

与基于功能的筛选方法不同,基于亲和力的方法如单链mhc显示。14,15,16或组合/条形码pMHC-多聚物表面染色17,18已经开发出来,试图规避上述许多限制。虽然可扩展,但这些方法绕过了自然抗原的处理、表达和T细胞激活,而仅仅依靠tcr/pMHC亲和力作为T细胞识别的代理。重要的生物物理参数,包括动力学开关率、tcr对下游信号的变构效应、pmhc半衰期以及共受体的作用,都被认为对T细胞的激活至关重要。19,20,21,22,23,24,但在这些技术中没有考虑到。因此,在某些情况下,基于亲和力的方法可能产生生理无关的高亲和力表位,而缺少其他亲和力低但生理重要的表位。25.

将基于功能的方法的优点与基于亲和力的方法的可伸缩性结合起来的新方法对于进一步理解T细胞生物学至关重要。目前,tcr测序(tcr-seq)研究经常被用来揭示每一个人数以百万计的tcrα和/或β链,并对每项研究中数十个人的T细胞序列进行调查。26..事实上,近年来产生了大量的tcr-seq数据,因此有必要创建包含10个左右的大型公共存储库。8–109TCR序列27..从这些庞大的tcr-seq资源中,我们进行了大量的数据挖掘工作,以了解tcr序列收敛的模式。28,29找出特别有趣的TCR克隆型。然而,TCR-seq数据并不提供任何关于这些克隆型特定抗原决定因素的信息。此外,T细胞交叉反应的现象现在被认为是T细胞受体的固有特性。3因此,现在重要的是,对大量的、无偏的肽库进行T细胞群体的合理筛选,以揭示他们所认识的表位的全貌或表位。

我们的方法30要进行高通量的基于功能的T细胞抗原发现是基于一种与经典T细胞活性分析从根本上不同的设计,其中主要的概念是候选表位的共同表达(在apc中编码的微型基因)和一个报告系统,该系统是apc固有的,而不是T细胞。这一配置使得在T细胞共培养中,靶向APC可以与非靶向APC区分开来,并有助于从大量人群中不相关的旁观者中选择性地恢复携带免疫原抗原的细胞。

为了实现这一设计,我们充分利用了颗粒酶-穿孔素通路的特异性.在体内,一个识别目标细胞的细胞毒性T细胞(Ctl)利用这一途径将一类名为颗粒酶B(Gzmb)的蛋白酶导入靶细胞,而不进入旁观者细胞。31..一旦进入目标细胞,GZMB启动一个凋亡级联,导致细胞死亡。我们构建了由绿色荧光蛋白(Cfp)和黄色荧光蛋白(Yfp)组成的报告融合蛋白。32,33..融合后,CFP-YFP报告蛋白在紫光激发下产生F rster共振能量转移(FRET)信号,部分猝灭CFP发射。GZMB对融合蛋白的切割导致FRET信号的丢失和游离CFP信号的挽救。在FACS中,携带切割FRET报告的细胞所产生的移位很容易被区分,因此,允许分离和恢复目标细胞(图1)。1A).

图1
figure1

表位筛选方法综述。a在没有GZMB的情况下,当被紫光激发时,报告蛋白会发出一个静止的烦躁信号。当GZMB进入细胞时,记者就会被劈裂。静止FRET信号的丢失,再加上对游离CFP信号的拯救,导致FRET移位,可以在FACS中监测,以隔离接受T细胞靶向的细胞。b靶细胞被提供慢病毒短肽编码的微型基因序列的文库,并暴露在感兴趣的T细胞中。任何被T细胞识别的目标都会受到GZMB的加载和其内部表达的FRET报告的切割。用流式细胞仪分离携带抗原微基因的细胞,用聚合酶链反应(PCR)对这些细胞内编码的微基因进行PCR扩增,并对扩增产物进行深序列分析。

在T细胞表位筛选中,将短肽编码DNA微基因序列的大型文库与GZMB可切割的FRET报告一起克隆到慢病毒转移质粒中(补充图)。1),用于生成慢病毒微型基因库。带有库的血清匹配目标细胞的感染是在感染的多重性(MOI)上进行的,这有利于每个APC有一个微型基因,而转导的靶细胞与扩大的ctl群体共同孵育。在共培养后,FACS是根据烦扰转移状态进行的,目的是只分离携带抗原微基因的靶细胞。回收的微型基因进行PCR扩增和测序,以揭示从筛选的CTL中激发反应性的表位(图)。1B).

在此,我们验证了我们的FRET-移位FACS/深片段测序方法在GZMB体外传递的有效性、特异性和动力学方面的有效性、特异性和动力学,以及该方法从候选肽编码序列的大型文库中检测善意抗原的敏感性,以及该方法对混合输入T细胞群体的鲁棒性。我们提出了一种辅助研究细胞免疫功能的方法,以补充现有的T细胞表位知识库。34,指导基于T细胞的新型免疫疗法在癌症、自身免疫和传染病方面的发展。

结果

GZMB靶向细胞的高效检测

我们首先试图验证GZMB可切割报告基因作为T细胞表位鉴定的有用工具。以小鼠卵巢癌细胞系id8为apc,对tcr,OT-i进行了研究。35..将编码鸡卵清蛋白(OVAL 241-280)40个氨基酸片段的微小基因结构导入ID8细胞,OVAL 241-280含有完整的OT-I最小表位(SIINFEKL),或在该区域的中心处有该表位的置乱版本(LKNFISEI)。CD8+转基因小鼠脾细胞经抗CD3/28刺激扩增T细胞的实验研究36,分别与各靶细胞共培养。流式细胞仪对共培养物的分析表明,SIINFEKL+细胞经历了显著的(p < 0.0001 by unpaired, one-tailed Student’s t(测试)和实质(科恩的d>40)与加扰阴性对照相比,其编码的报告蛋白被切割。这些数据提供了证据,证明本文描述的FRET移位分析能够有效地检测携带正确抗原的靶细胞(图1)。2A,b).

图2
figure2

FRET-移位分析测试。a, bID8细胞表达原始表位的Ova微基因片段(OVAL 241-280)或含有扰频表位的ova微基因(OVAL 257-264 SIINFEKL→LKNFISEI)。+T细胞按1:1比例培养4h。a有代表性的FRET信号(ex405/em525)与CFP信号(ex405/em450)和(b)细胞在所有复制体中转移到目标门的比例(n3,显示了贴面条形图和误差条表示平均±SD)。意义是用一个不成对的,单尾学生的t测试一下。效应大小计算为标准化均值(Cohen的效应大小)的差异。ce以1:1的比例组合表达卵微基因的靶细胞或置乱对照细胞,形成二元混合目标群体。在FACS分析前,将混合靶标与OT-ⅠCTL共孵育4h,1:1效应器:靶比为1:1,每种条件一式三份(底面条形图和误差条表示均值±SD)。用自定义TaqMan法对回收的细胞进行裂解,纯化基因组DNA,作为qPCR的模板。意义是用一个不成对的,单尾学生的t测试一下。源数据作为源数据文件提供

GZMB对目标细胞的传递具有高度的特异性。

一旦GZMB敏感的FRET-移位法在同质靶细胞群体中被证明是表位特异性的,我们就在混合群体中测试该方法的特异性。由于GZMB是CTL在识别同源表位时释放的一种可溶性效应分子,我们认为穿孔素和GZMB可能从CTL与APC之间形成的免疫突触中逸出,有可能扩散到不相关的旁观者细胞中,产生假阳性信号。为此,将Ova微基因表达细胞与杂乱对照微基因表达细胞按1:1比例混合,与OT-ⅠCTL共培养。共培养完成后,根据图中所示的门控方案对细胞进行分类.二维空间..介导ID8细胞在T细胞压力下进入“移位”门和CTL“未接触”门中的细胞对照组为未受T细胞压力影响的基础微基因表达群体,用基因组qPCR方法进行恢复和分析,以确定这两个群体中Ova微基因和杂合微基因的相对比例。用qPCR(补充图)校正各转导的ID8细胞的平均整合率/细胞数。2我们发现,在靶门捕获的细胞中,95%以上的细胞表达了Ova微基因(如图所示)。2E, p < 0.0001 by unpaired, one-tailed Student’s t测试),虽然在未接触的大门中捕捉到的细胞仍保持在大约1:1的Ova微型基因快速表达者与混乱的控制高速公路的比例(如图所示)。2C, p>0.2,无配对单尾学生差异无显着性t测试)。

GZMB峰信号先于靶细胞凋亡

与此相反,GZMB的FRET移位实验依赖于从活化的CTL中获得颗粒酶B并诱导凋亡的抗原编码靶细胞的分离。因此,我们寻求研究在体外共培养系统中与凋亡进展动力学有关的FRET-移位信号的动力学,并建立一个安全分选的时间框架。再次采用OT-ⅠCTL/OVA微基因模型系统。建立四种不同的效应物:在10个不同的时间点建立靶标比率,监测%fret-移位和%碘化丙酸丙酯(PI)阳性。CTL/靶细胞共培养后1 h就可检测到FRET-移位信号,6~8h后逐渐上升至峰值(附图6~8)。3A)。PI染色显示细胞膜完整性丧失和细胞死亡的信号在峰值频移信号出现后2~4h出现峰值(补充图)。3B)由于细胞凋亡而急剧下降。因此,有一个安全的分类窗口,在此期间,已收到颗粒酶击中的APC可以被恢复和DNA提取,以进行表位鉴定。

抗原微基因检测灵敏度高。

接下来,我们测量了该方法的灵敏度,定义为当抗原存在于背景微基因群体中时,当该抗原在减少丰度时检测标准试验抗原的极限。为了探索这一点,我们构建并测试了一个多样化的随机微基因文库。合成含有48个随机碱基的简并寡核苷酸,经PCR扩增,连接到含FRET报告的慢病毒转移质粒的微基因位点(补充图)。1)。将质粒连接产物转化为电敏感菌,在固体琼脂上扩增,得到≈1.8×10。6随机微基因克隆,从中分离质粒DNA并用于产生慢病毒。扁豆病毒被滴度,并被转移到id8细胞中,在moi中偏爱每个细胞一个插入事件,从而产生一个随机的小基因表达的目标细胞群体(补充表)。1).

将Ova微基因表达的ID8细胞与随机微基因表达的ID8细胞相结合,在1:10~1:100,000的范围内筛选出5个不同的细胞群体。随机微基因表达细胞与典型的微基因表达细胞在细胞水平上进行掺杂,而不是在DNA水平上结合不同比例的不同质粒结构。这样做的理由是,由于需要经过长时间的纯度分类,才能在病毒转导后分离出一个高多样性的随机微基因表达群体,因此,一次准备库并从基础图书馆群体中生成尖峰种群将是更有效的方法,而不是反复对dna水平增强的库进行密集的fcs准备工作。我们进行了一项钉入法的比较研究,并证实微基因加钉法在下游分析中并没有显着地改变加钉序列的检测(补充图)。4).

每个细胞水平最高的细胞群体与OT-ⅠCTL共培养,并按FRET状态进行分类,以获得所有尖峰水平的移位和未移位的门(图一)。3A)。门是通过在ctl上建立静止fret签名的边界来定义的。控制人口。从每个收集的细胞群体中提取基因组DNA,利用Illumina适配器尾引物在Illumina MiSeq平台上直接测序,作为PCR扩增整合微基因的模板。通过分析每个尖峰库屏幕的移位门和解移门中检测到的Δ相对丰度,我们确定在1:10,1:100和1:1000的穗数水平上,Ova-microgene是移位门中检测到的最普遍的序列,相对于未移位的群体而言,Ova-microgene基因是最常见的序列(图1)。3A)。在1:10,已不再观察到Ova-min基因是最主要的富集序列,但它仍然位于前5位高富集微型基因中,并在背景以上的10种标准差(σ)中检测到(图1)。3B)。这些数据表明,即使在群体频率为1:10,也很容易检测到呈现相关表位的细胞,这通常被认为是常规检测的信号检测截止点。37.

图3
figure3

不是-我在图书馆里加了检查。在FACS分析前,将Ova微基因表达细胞与Ova微基因表达细胞以1:1的效应:靶比与CTL共同孵育4 h,获得随机的微基因文库。用PCR引物对回收的细胞进行裂解,从基因组DNA中扩增出整合的微基因,并对微基因位点两侧保守的转基因区域进行PCR扩增。采用带有指数化的Illumina适配器尾的引物,对2×250对末端化学的IlluminaMiSeq平台上的扩增产物进行直接测序。a在每个编码SIINFEKL表位的门中检测到的读取百分比。填充的白条代表未移动的门,黑色的圆圈代表移动的门。每个点代表一个单独的度量。源数据作为源数据文件提供。b在1:10,000尖峰抽样中发现的所有唯一序列的读取计数频率表示为移位门和未移位门的相对频率之间的差异。虚线表示比平均Δ相对丰度值高出10σ。

用第二只小鼠TCR/pMHC对和另一株宿主靶细胞检测FRET-Shift信号。我们使用来自pmel-1 tcr转基因小鼠的细胞毒性T细胞。38,已知通过识别hgp 100(25-33)肽KVPRNQDWL在小鼠H-2Kd环境中受到刺激。为此,构建了编码最小表位的hgp 100微基因序列和内源侧翼序列的16个氨基酸,并以类似上述方式插入到微基因-fret慢病毒盒中。病毒产生后,将hgp 100微基因和Ova微基因导入C57BL/6株小鼠T细胞淋巴瘤EL4细胞中。分别用OT-ⅠCTL和PMEL-1 TCR CTL对Ova微基因和hgp 100微基因表达的EL4细胞进行共培养。从这些实验中,我们观察到与ID8细胞相比,在Ova微基因表达的EL4细胞中,靶细胞有更高比例的FRET-移位,由此产生的FRET-移位幅度更大(补充图)。5),这可能是MHC-I表达差异的潜在反映(补充图)。6).

然后,我们确定在pmel-1 tcr/hgp 100系统中,通过将hgp 100微基因表达的el4细胞插入随机微基因表达的el4,可在pmel-1 tcr/hgp 100系统中重新获得在OT-i/ova系统中所显示的敏感性。2)细胞丰度为1:10,与PMEL-1 TCR CTL共培养。移转和未移位的群体都是通过FACS分离出来的,并用于制备小基因扩增文库,用于Illumina的测序。对原始读取进行了处理和分析,就像以前使用Ova尖峰库所做的那样,以揭示hgp 100实际上也可以被检测到超过10σ以上的背景(如图所示)。4A).

图4
figure4

PMEL-1 TCR筛选1:10,000 hgp 100微基因随机文库.a用hgp 100微基因与pMEL-1TCR CTL以1:10,000的丰度加入hgp 100微基因的随机微基因表达的EL4细胞文库中,在FRET-移位FACS分析前,以1:1效应物:靶标比与pMEL-1 TCR CTL共孵育4h。在恢复和测序未移位和移位门捕获的微基因后,绘制了所有不同的微基因序列相对丰度的差异图。虚线表示比平均Δ相对丰度值高出10σ。b以ssDNA寡核苷酸池的形式合成了富集于pMEL-1TCR CTL初筛和1:1万hgp 100随机微基因文库中的480个微基因,并将其插入pMND-沉默-FRET慢病毒转移质粒中。制备了PMEL-1TCR第二轮病毒文库,并将其导入EL4细胞.转染纯化的泛素微基因表达的EL4细胞(1:1 E:t,4h)与新鲜激活和扩增的pMEL-1 TCR CTL共培养,按FRET移位进行分类。经PCR和扩增序列分析,初步确定了摇瓶文库各成员的相对丰度。x-轴线)和第二轴(y-轴)屏幕绘制。编码hgp 100微型基因的16聚体被高亮显示并标记在合成的摇摄库中。虚线表示高于平均Δ相对丰度值10Δ。

改进假定命中的策略

在进行无偏表位发现时,人们对T细胞表位没有先验知识.在这里,我们注意到,一些随机编码的迷你基因满足了10σ截止,除了尖峰的标准迷你基因(图五)。3B,   4A)。因此,我们用netmhpan分析了这些序列中的一个子集是否能包含真正的表位。39确定它们是否含有预测的mhc结合肽,并将它们与blastp的genbank非冗余cds翻译数据库进行比对。40确定它们是否与已知蛋白质有显著的序列相似性(补充表)3)。在这一分析中,我们选择了比已知的抗原微基因更丰富的微基因序列:在每种情况下,这是OT-I/OVA条件下的前三位,而PMEL-1TCR/hgp 100条件下的前15位。

在OT-I/OVA筛选中,除了典型的Ova微基因外,没有发现任何微基因含有预测的MHC结合子,也没有与GenBank中的任何蛋白质序列相一致,表明它们是背景噪声。与预期形成鲜明对比的是,NetMHCPAN对回收的Ova微型基因进行了评估,确定SIINFEKL是一种强大的MHC粘合剂(IC 50=44 NM),BLASTP与GenBank数据库的一致性产生了Oval(G)。(鸡耳)得分最高(E-得分=1.4×10)–18)。在pmel-1 tcr/hgp 100筛选中,此分析产生了标准hgp 100表位中的预期尖峰,即kvprnqdwl,作为预测的mhc结合剂(IC 50=123 nm),并将检测到的hgp 100基因中的尖峰与参考人类gp 100序列(E-Score=3.0×10)对齐。–19)。此外,我们还找到了第二个编码一肽(KVYMPPIL)的微型基因序列,该序列预测将与409.9 NM的IC 50结合H-2kb编码的mhc,这可能代表了以前未报道的这个tcr的表位。

为了验证KVYMPPIL预测的肽,或在pMEL-1TCR/hgp 100筛选到的其他微基因序列是否是PMEL-1TCR的真正抗原,我们从图中重新筛选了480个富集序列。4A..这些序列中的大多数(313/480)低于这里使用的10σ工作极限,然而,这些微基因仍被包括在内,因为初级文库中的稀有微基因仍有可能引起T细胞反应性,但由于在文库中的代表性较低,不能被检测到高度富集。设计合成的寡核苷酸序列,并通过阵列法合成.在我们的摇瓶文库设计中考虑的一个因素是,在第一轮筛选中使用的40个氨基酸格式hgp 100微型基因可能与构成随机微基因库的16个氨基酸格式的微型基因相比,在MHC上具有更高的加工和呈现倾向。为了研究这一点,我们指定了三个不同的hgp 100微型基因,每一个长度为16个氨基酸,被包含在合成池中,而不是40个氨基酸版本。每个短版本hgp 100微型基因被构建,使最小的KVPRNQDWL最小表位被放置在微型基因的不同位置,同时也包含了位置特异性效应可以抑制特定微基因免疫原性的可能性。

将所合成的泛素文库插入含FRET报告的慢病毒转移质粒中,生成在EL4代靶细胞中表达的病毒,并对其进行PMEL-1TCR CTL筛选。对FACS中的微基因进行了扩增测序,结果表明,包含KVPRNQDWL表位的微基因是480个微基因中唯一在第二轮达到10σ阈值的微基因。4B).

此外,根据这些结果,我们得出的结论是,将最初的文库筛选实验中使用的40个氨基酸hgp 100微基因转换成一种反映随机微基因群体的格式,并不会抑制APC处理和呈现的最小表位的能力。为了进一步证实这种情况,我们构建了ova微基因的短格式版本,并确定当长格式的微基因与OT-i ctl而不是短格式的ctl共同培养时,在观察到的%fret-移位信号方面没有优势偏差(补充图)。7).

多克隆T细胞群可作为输入效应物。

利用OT-Ⅰ和PMEL-1转基因小鼠品系进行的验证实验表明,将大量的单克隆T细胞群体作为微基因文库筛选实验的输入是可行的。然而,一个重要的实际考虑是,需要进行大量的初步努力来分离有兴趣的克隆T细胞群体。因此,当反应性T细胞存在于混合T细胞群体中时,我们考虑了在特定抗原刺激下T细胞反应性检测的极限,从而测试了我们的方法。

作为第一次试验,抗CD3/28刺激激活和扩增OT-I脾细胞、PMEL-1脾细胞和野生型C57BL/6脾细胞,并以不同比例的模型T细胞(OT-I或PMEL-1 TCR CTL)与野生型C57BL/6 CTL混合。这些混合的OT-I和pmel-1 TCR CTL细胞分别与表达Ova microgene-fret或hgp 100 microgene-fret盒的EL4细胞群共培养,并评估其是否有能力产生频移信号。在OT-ⅠCTL和PMEL-1 TCR CTL的情况下,观察到,随着微基因反应模型CTL丰度的降低,发生FRET移位的细胞比例也随之降低。然而,在这两种情况下,我们发现即使在1:3000丰度时,模型TCR CTL也能产生相对于野生型C57BL/6脾细胞单来源CTL的显著的频移信号(补充图)。8).

接下来,我们使用针对CTL混合群体的目标细胞混合群体进行了表位检测。分别制备了三种不同的“混合+混合”共培养条件,对每一种模型的tcr/抗原对进行了筛选,并进行了微基因扩增测序。我们对原始读取数据进行了处理和分析,发现对于两种模型的TCR/抗原对,当T细胞稀释到1:30时,典型的微型基因从1:10 000的混合物中富集出10σ以上的背景(图1:30)。5).

图5
figure5

筛选混合CTL群体+混合靶细胞群体的共培养。加入Ova微基因表达细胞或hgp 100微基因表达细胞的随机微基因文库分别与野生型C57BL/6 CTL与OT-I或PMEL-1 TCR CTL共同孵育。用于测试的特定混合物在面板报头中描述。以1:1的比例组合目标群体和CTL群体,共培养4h,然后按频移状态进行分类。将每种筛选条件下的移位门和未移位门回收的细胞进行裂解,并利用针对微基因位点两侧保守的转基因区的PCR引物,从基因组DNA中扩增整合的微基因。在第二轮PCR中加入Illumina适配器和指标,在IlluminaMiSeq平台上进行2×250对末端化学测序。aOt-I/OVA微基因混合物的移位门和解移门中检测到的所有不同的微基因序列相对丰度的差异。bpmel-1 tcr/hgp 100微基因混合物的移位门和解移门中检测到的所有不同的微基因序列相对丰度的差异

在扩展这些研究的范围后,我们测试了当筛选和测序来自生物学背景的多克隆T细胞群体,而不是准备好的转基因T细胞和野生型T细胞群体时,我们从文库中检测抗原的能力。为此,我们将野生型C57BL/6小鼠移植到稳定表达全长Ova蛋白(B16F10-OVA)的B16F10肿瘤细胞或无OVA的亲本B16F10细胞中。肿瘤生长16天后,携带b16f10-ova肿瘤的小鼠要么接种ova蛋白。41以模拟积极的抗肿瘤反应的条件(补充图。9)或者没有接种疫苗。随后,我们在第21天从所有小鼠中分离出肿瘤组织,进行流式细胞术(FACS)分离CD8。+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL),经抗CD3/28刺激激活/扩增。无论是亲本b16f10肿瘤小鼠还是b16f10-ova小鼠,如果没有疫苗的增强,我们都无法扩增出足够数量的活的CD8。+用于筛选的细胞,表明这些小鼠没有对肿瘤抗原产生可检测的T细胞反应。

然而,我们能够从接种了OVA疫苗的B16F10-Ova小鼠中分离和扩增TIL。经四聚体染色,获得的TIL为1.77%~5.30%,H2kb/SIINFEKL四聚体阳性(3只小鼠平均为3.68%)(附图)。10A)。在IL-2存在下,经抗CD3/28刺激和扩增后,将得到的T细胞与1 0 0 0份Ova刺激的随机微基因表达的EL4细胞共培养。共培养的靶细胞按FRET-移位状态进行分类(附图)。10b,c)进行微基因扩增测序。结果表明,在3只复制小鼠的TIL标本中,Ova微基因在10σ的截止点以上再次被检测到,而在NO-CTL对照中未检测到OVA微基因的富集(如图1所示)。6).

图6
figure6

以肿瘤浸润T细胞为输入效应的FRET移位/扩增序列分析。将b16f10-ova肿瘤块植入野生型c57bl/6小鼠体内,接种ova后,分离出浸润性CD8。+流式细胞术检测T细胞,平板结合抗CD3/28刺激进一步扩增T细胞,随机微基因文库细胞与Ova微基因表达细胞共培养1:10,000。制备了3只复制小鼠,并对每只小鼠的TIL样本进行了独立筛选。TIL种群的体内外生长有限,需要在缩短的E:t比下进行共培养,重复时间从0.5:1到0.7:1(4h长)。在TIL标本的同时,通过对未与任何T细胞共培养的尖峰库靶细胞进行FRET移位FACS/扩增测序,制备了相应的阴性对照样品。所有检测到的微基因的Δ相对丰度显示在三个复制TIL屏幕以及非T细胞控制。虚线表示比平均Δ相对丰度值高出10σ。

讨论

在本文所做的工作中,我们展示了一种烦扰移位/扩增测序方法,它可以同时评估比传统方法更容易处理、呈现、识别和激发反应性的表位。42..这里的实验表明,即使在频率低到十分之一的情况下,也能很容易地检测到上述背景下的相关抗原。然而,对于这些研究的扩展版本,如果在这些研究中进行了天真的库筛选,而没有加钉的试验抗原,则应该可以通过1×10进行筛选。6T细胞反应性的微基因序列。

这个估计是基于这样的假设:给定1:1的效应器:目标比和3×10的小规模。6在实验中使用的每个条件下,携带某一抗原微基因的300个细胞的拷贝数大约是FACS和扩增序列检测所需的最低阈值数(1:10,000=300个细胞/3,000,000个细胞)。对于没有对组成文库抗原的先验知识的天真文库筛选,必须满足这种水平的克隆冗余所有不同的微型基因表达克隆在群体中。要用1×10实现这一点6然后,微型基因序列显示,共培养实验应该在每个屏幕大约3亿个目标细胞的范围内进行,这实际上是一个可以实现的参数。

我们还发现,当T细胞的丰度为1~5%时,这种策略具有足够的鲁棒性,可以检测T细胞多克隆混合物中单个T细胞的反应性。尽管目前正在使用的其他方法在检测复杂T细胞库中的低丰度T细胞克隆型方面表现出了优越的性能,但ffret移位/扩增测序方法的能力仍然应该有助于筛选从相关生物学环境中提取的T细胞群体。直接取自疾病病灶或接种疫苗的人外周血的T细胞偶尔会被观察到含有抗原特异性T细胞,其频率超过1%。43,44..然而,当抗原特异性T细胞的这种T细胞频率不能满足时,人们使用复杂的策略,通过激活pbmc的子池来合理地丰富反应性T细胞,从而产生已知存在于最低阈值频率的反应性T细胞的“迷你线”。45,46.

可用于进行T细胞抗原筛选的各种方法如图所示.7..在这里验证的FRET-Shift/扩增测序方法在概念上是面向与目前大多数方法相反的方向的,这些方法最初是从分析T细胞库对感兴趣的小抗原板的反应性的角度开发的。相反,我们建议我们的方法作为评估T细胞克隆型的一种手段,这些克隆型已经被确定为有趣或相关的,并且通过将它们暴露在候选抗原的大型库中,了解它们所识别的表位库。

图7
figure7

我们的策略与目前使用的T细胞抗原发现方法的比较。目前可用于T细胞抗原筛选的一系列方法以及我们的ffret移位/扩增测序方法,都是针对它们在从高度混合的T细胞群体(左)中检测T细胞抗原的鲁棒性以及它们筛选候选抗原高多样性库的能力(右)绘制的。14,15,16,17,18,37,42,60,61,62..可以将Li等人所描述的最近的方法。47、Joglekar等人著。48、Kisielow等人。49在这些光谱上,当数据公布时,显示了方法对输入T细胞群的多克隆性和输入抗原库的复杂性的敏感性。

最近还开发了其他方法来进行高通量T细胞抗原的发现,利用这种原理,通过基于目标细胞的读出,从大量的库群体中分离出可能表达抗原的目标细胞,然后通过下一代测序分析来表征恢复的细胞。在这些中,使用的都是单链肽-mhc分子。47或嵌合mhc-CD3ζ分子与nfat连接的报告。48,49是必需的。在前一种格式中,这些单链pMHC配置用于在apc表面生成pmhc复合物的超生理数量,这样做绕过了天然抗原处理和呈现途径,并冒着识别非自然存在的肽表位的风险。在后一种结构中,MHC-CD3ζ嵌合体被用来通过天然TCR复合物和推断激活来近似信号。然而,这种设计改变了内源性免疫突触,而内源性免疫突触通过平衡前信号级联激酶活性和信号抑制磷酸酶而被认为是正常T细胞激活的关键。21或通过调节tcr复合物ITAM结构域与T细胞膜内小叶在生理T细胞活化过程中的静电相互作用。50..相反,本文描述的FRET-移位/扩增测序方法利用了在目标细胞群体中工作的天然抗原处理和呈现途径,维持了天然TCR/pMHC受体-配体相互作用的生物物理背景,并监测活化的细胞毒性T细胞的功能。

在其他高通量T细胞抗原分析中8,15,16,最多10个图书馆8用T细胞或基于TCR的可溶性试剂构建和筛选了不同的微基因序列.然而,重要的是,这些方法依赖于质粒转染APC。转染可使微小基因质粒向宿主细胞传递极高的多重性。51,52因此,这些方法需要多次迭代筛选(摇摄),以充分丰富识别信号。相反,frt-移位/扩增序列分析,而只查询了10的顺序。6独特的微型基因,不需要多次摇瓶来识别抗原微基因。换句话说,慢病毒转导引起的文库多样性的减少是伴随着抗原可以用相对较少的后特设反褶积立即识别出来的红利。

在本研究中,我们使用小鼠T细胞进行原理验证实验,因为mhc匹配的APC系和来自TCR转基因模型的克隆T群体的来源。这些材料允许迭代开发和测试在方法动力学、特异性、敏感性和稳健性方面的FRET-Shift FACS/深层扩增测序方法。然而,这些方法并不局限于小鼠系统,而且很容易移植到人类细胞中。这里使用的gzmb-可切割氨基酸序列也是人类gzmb所特有的。32,33表明本文所用的FRET报告在人体实验中是可以使用的,无需修改。将高通量抗原筛选应用于来自高度落后人类供体的T细胞群体的研究,需要更先进的策略来确保在文库筛选中使用的靶细胞和T细胞之间的组织相容性。在这方面,基于K 562的人工apc是近几年发展起来的,并已被证实为一种可靠的方法,可以生成具有完整抗原处理和呈递功能的mhc匹配的apc。53.

事实上,最近的工作是在我们这里描述的方法的广泛基准基础上开展的。基于GZMB的T细胞抗原筛选在人CTL重组人TCR中微生物和人参考蛋白组中的应用54提供我们前面描述的核心概念的额外验证。55..展望未来,我们预计本文报告的方法将有助于调查肽编码序列的无偏文库,从而更完整地了解T细胞受体/表位相互作用,从而使研究人员更好地理解基本T细胞生物学,开发更好的T细胞反应性预测模型,并合理设计治疗癌症、传染病、移植排斥和自身免疫性疾病的T细胞免疫疗法。

方法

动物伦理声明

所有的动物实验都是由不列颠哥伦比亚省大学动物保护委员会根据道德证书A18-0197进行评估和批准的。

细胞培养

所有细胞培养均保存在rpmi中。加入2 mm GlutaMAX、1mm丙酮酸钠、50μMβ-巯基乙醇、10 mM HEPES、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素和10%热灭活胎牛血清。文化媒体和副刊都来自吉布科。培养保持在37°C和5%CO。2大气层。

CTL活化与膨胀

新鲜冷冻游离脾细胞来自OT-i小鼠(由bc癌症机构deeley研究中心nelson博士赠送)、pmel-1 tcr小鼠(来自杰克逊实验室运送的完整脾脏)或野生型c57bl/6小鼠被解冻、洗涤、调整到5×10的密度。6细胞/mL添加RPMI+50 U/mL rhIL-2(PeproTech)。细胞接种于96孔平板(1×10)。6用低内毒素、叠氮抗小鼠CD3(克隆145-2C11)和抗小鼠CD 28(克隆37.51)(Biolegend)预包被,并在加入细胞之前清洗。48小时后将细胞从涂布板上移除,调整为1×10。6在条件培养基中加入新鲜培养基+rhIL-2,在U底96孔板井中培养。扩张的T细胞在第5天再次分裂,将密度调节到1×10。6,并在第7天的实验中使用。

载体和微基因插入体的构建

慢病毒转移质粒来源于PCCL-c-MNDU3-PGK-EGFP主干.质粒的PGK-EGFP部分通过原载体中的EcoRI/BamHI位点被一个自定义的多重克隆位点取代(在连接过程中被烧蚀)。利用Phusion高可靠性聚合酶(NewEngland Biolabs),从Add基因质粒#11180和#15214中扩增出增强的YFP和mCerulin(Cfp)编码序列。CFP前引物为P2A编码序列,YFP前引物为GZMB可切割底物编码序列。利用FseI/AgeI和AgeI/ASCI限制性克隆技术,将尾状CFP和YFP序列插入慢病毒转移载体骨架PCCL-c-MNDU3-MCS中间。通过BamHI/EcoRI限制性片段克隆,在P2A序列上游插入一个长度为1kb的填充物片段~1kb,获得一个称为pMND沉默FRET的亲本微基因受体质粒。从ID8.G7细胞系中直接扩增出Ova-minin基因,稳定表达卵清蛋白全长蛋白。用ssDNA寡核苷酸重叠延伸PCR方法制备卵子置乱控制和hgp 100微基因插入(补充表)。4)。通过BamHI/EcoRI酶切克隆,将Ova、Ova和hgp 100基因克隆到线性化的pMND-沉默-FRET亲本骨架中。用rm_fwd和rm_rev对合成的rm_模板ssdna(20 nm终浓度)进行30次PCR扩增,获得双链随机微基因。4)。随机微基因文库经BamHI/EcoRI酶切,经3%琼脂糖凝胶电泳纯化,插入pMND-沉默-FRET。以上寡核苷酸的合成均采用DNA整合技术进行。利用CustomArray合成了用于PMEL-1TCR第二轮筛选的平宁文库,作为一个基于阵列的寡核苷酸池.微基因侧翼区的设计与随机微基因文库的设计完全一致,并构建了相应的PMEL-1TCR摇瓶文库,用于构建随机微基因文库。

病毒产生

为产生OVA、Ova-扰码基因或hgp 100微基因慢病毒,分别将40 g质粒与36g pCMV-ΔR8.91和4g pCMV-VSV-G质粒结合。用7.5mL OptiMEM(吉布科)和0.5mL转运-LT1试剂(MIRUS)在室温下孵育30 min。对含有40%融合HEK293T细胞的8×10 cm培养板,每个微基因加入1 mL的转染混合液。将80g转移质粒与72g pCMV-ΔR8.91和8g pCMV-VSV-G质粒组合,产生随机微基因慢病毒。将这些DNA混合物与15 mL OptiMEM(吉布科)和1mL转运-LT1试剂(MIRUS)在室温下孵育30 min。对含有40%融合HEK293T细胞的16×10 cm培养板,每板加入1mL转染混合液。在所有病例中,转染后18h更换培养基,然后在转染后36、48、60和72h收集病毒上清液。浓缩病毒的上清液为超离心(110,000 RCF,90 min,4°C),球粒再悬浮于1 mL OptiMEM(吉布科)中。在5×10上用浓缩病毒1、2、4、8、16或32μL检测病毒滴度。4HeLa细胞24孔格式,最终体积为500μL的完整培养基.流式细胞术检测荧光细胞的百分率,检测细胞的转导效率。

病毒转导

ID8细胞与Ova或Ova置乱的微基因病毒共转染4×106每株病毒在1×10 cm的组织培养盘中以约50%的融合度接种细胞。浓缩病毒(0.4mL)分别用2.6mL的完全培养基稀释后加入平板。平板在3mL体积中孵育18h,37°C,在10 mL完全培养基中恢复正常培养。随机微基因病毒的转导,1.2×107ID8细胞在3×10 cm的组织培养盘中以50%的融合度被镀。浓缩病毒(1.2mL)用7.8mL的完全培养基稀释,每盘加入3mL的转导混合物。平板在3mL体积中孵育18h,37°C,10 mL完全培养基中恢复正常培养。对EL4细胞与OVA或hgp 100微基因病毒的转导,在1×10中加入20μL浓缩病毒。5细胞在500μL的完整介质中,在一个24孔板的单井中.24h后,将细胞在完全培养基中稀释至5mL,转移到T-25瓶中进行连续培养。对于随机微基因病毒的转导,EL4细胞在完全培养基中被调节到7.5×10的密度。5细胞/mL,最终体积为150 mL。在这些细胞中加入1.6mL的浓缩病毒,使细胞/病毒混合被分割成15×10 mm的培养皿(每盘10 mL)。

小鼠肿瘤移植

取BC癌症研究中心动物资源中心4~5周龄雄性C57BL/6小鼠,在无病原体条件下移植3×10。5B16F10细胞(+/−OVA转基因)经颈部皮下注射。OVA接种组于移植瘤后16~19天皮下注射含鸡卵清蛋白(MilliporeSigma)(100 G)和TLR 3佐剂(I:C)(InvivoGen)(10μg)的3 0μL无菌过滤PBS液。小鼠在第21天被安乐死,肿瘤肿块被移除,解离,并接受流式细胞术(用单细胞水平的纯度掩蔽)来获得纯的CD8。+直到。用辐射(50 Gy)饲养C57BL/6脾细胞,按100:1的饲养:TIL比例,在混合淋巴细胞反应中体外刺激和扩增细胞。在24孔板上分别加入500 L添加RPMI+100 ng/mL抗CD3/28 mAb(与上述克隆相同)和400 IU/mL rhIL-2(干细胞技术)单井进行刺激。培养基+rhIL-2在第3天完全替换,细胞继续培养15天,每3天用新鲜培养基+rhIL-2替代半数条件培养基,然后再用于实验。

CTL/APC共培养

在刺激后第7天,用活化和扩张的CTL进行FRET-Shift检测。细胞计数使用伯爵自动细胞计数器(Invitrogen)来确定CTL/APC共培养的输入细胞数。用id8衍生的靶细胞作频移试验,在含1×10的12×75 mm fcs管中,以1:1的效应器:靶比共培养4h。5目标细胞。对随机微基因表达的id8文库筛选,共培养大小可达8×10。5在筛选条件下制备靶细胞/管和四管。完成共培养后,在流式细胞仪分析前将复制管汇集在一起.用EL4衍生的靶细胞作频移试验,在含有1×10的U底96孔板中,以1:1的效应物/靶比共培养4h。5目标细胞/井。对于随机微基因表达的EL4文库筛选,在FACS分析之前,每个筛选得到32口井。在所有情况下,共培养保持在37℃,5%的CO。2大气层。

流式细胞术/流式细胞术

病毒转导的APC株经纯度分类,去除未转导的靶细胞和携带非生产性微基因报告基因的细胞。FRET纯度分类选通模板的典型屏幕截图显示在补充资料(补充图。11)。细胞在bd FACSAria融合或bd FACSAriaⅡ上通过对PI的fsc-A vs.fsc-W和ssc-H vs sc-W的门控进行分类。(前。561,Em610),YFP+(前。488埃姆530)并在FRET中发出静止FRET签名(例如。405,嗯525/50+505 LP)诉CFP(前。405,嗯450/50)地块。CTL共培养用PBS洗涤1倍,再悬浮于500μL PBS+5%FBS+1μg/mL碘化丙酸丙酯(PI)中,经40μm尼龙网过滤,待冰分析。对BD-LSRⅡ型Fortessa进行细胞学分析,在BDFACSAria融合上进行FACS细胞分离。有代表性的fcs门控模板屏幕截图显示在补充资料(补充图。12)。对待分析的目标细胞进行PI门控选择。和YFP+单身人士。接受T细胞靶向的细胞根据FRET(EX)中的FRET-移位进行分类。405,嗯525/50+505 LP)诉CFP(前。405,嗯450/50)地块。门控细胞在含55%FBS/45%培养基的15 mL圆锥形猎鹰管中收集。收集后,细胞在300×g,5 min后用DNAzol试剂(Invitrogen)进行gDNA分离。

定量PCR

应用自定义双工TaqMan分析(应用生物系统;分析ID:AHUAOFV;TaqMan通用PCR主混合),对混合目标群体收集细胞基因组DNA中Ova微基因和置乱微基因的拷贝数进行了分析。构建了含任一微基因靶序列的纯化质粒的5点标准曲线,其范围为100~100拷贝。未混合Ova微基因表达细胞和杂乱小基因表达细胞作为对照,以纠正两个群体之间插入拷贝数的差异。样品分为四组技术复制。

测序

从门控细胞的gDNA中扩增微基因,获得测序文库。设计引物对病毒转基因位点两侧的区域进行退火(补充表)。4)或在寡核苷酸合成过程中直接用含有群体特异性指数序列的引物对其进行跟踪,或在第二轮PCR中直接用Illumina适配器/指数进行跟踪。图中的测序库。3本实验采用单轮PCR法制备,用Phusion聚合酶(新英格兰Biolabs)进行25次循环,并对指数化的扩增产物进行聚合和凝胶纯化。所有其他测序文库均采用两轮PCR方法制备,第一轮PCR运行21~30个循环,50%的第一轮产物转到第二轮,第二轮PCR(均使用Phusion聚合酶)进行10次PCR,然后进行池和凝胶纯化。在所有情况下,使用PE 250化学方法在IlluminaMiSeq平台上进行测序。为了提高成簇过程中的%pf,在流式细胞中加入phiX控制DNA,并/或采用交错引物策略,确保每个周期碱基对分布充分均匀。测序完成后,用flash组装成对端读,形成微型基因连体。56默认参数,除了max-重叠=304和“允许外”功能启用。组合读物经过质量过滤(保持90%碱基>q20的读取),并使用FASTX-Toolkit进行修整。57..然后使用Starcode集群读取58在默认参数上折叠由PCR或测序错误引起的发散序列。任何含有残留停止密码子的序列簇都会被删除,并且在进一步分析之前,对回收的微型基因进行进一步的手工检查和管理,以去除普遍存在的已知PCR或数据集中的硅伪影。为了从检测到的微型基因中预测MHC结合物,使用NetMHCpan3.0作为默认参数。对于检测到的微型基因的数据库搜索,BLASTP对齐所有非冗余的GenBank CDS转换+PDB+SwissProt+PIR+PRF,不包括WGS项目中的环境样本(218.0版)59使用默认参数执行(对短输入序列进行自动调整)。

数据分析

用ImageQuantTL v8.1进行凝胶和CFU分析。流式细胞术用FlowjoV10.0.8r1进行分析。用SDS2.4进行定量PCR分析。序列数据处理用GeneiousV8.1.2和生物导体软件包seqinr进行。使用Rv3.1.2和RStudio进行了其他数据处理和统计分析。

报告摘要

有关研究设计的进一步资料,可参阅自然研究报告摘要链接到这篇文章。



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