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白细胞介素22对表达IL-23的新生小鼠胰腺功能的影响

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发表时间:2019-10-08 10:28作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

白细胞介素22对表达IL-23的新生小鼠胰腺功能的影响

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摘要

新生儿炎症性疾病与严重的发病率有关,但其背后的炎症因子及其潜在的效应机制尚不清楚。本研究表明,新生小鼠坏死性小肠结肠炎同时伴有IL-23和IL-22的升高,胰腺酶的产生减少。这些表型反映在CX3CR1过表达IL-23的新生小鼠身上。+髓样细胞或角质形成细胞。小鼠不能过早生长和死亡,表现为全身炎症,营养吸收不良,肠道和胰腺基因表达下降,介导消化和吸收碳水化合物、蛋白质和脂质。无菌环境得到改善,IL-22的基因消融恢复了过度表达IL-23的小鼠的正常生长。机械地说,IL-22直接作用于胰腺腺泡细胞水平,降低胰腺相关转录因子1a(PTF1a)的表达。这些结果表明,早期IL-23和IL-22的增加对胰腺酶的分泌和食物吸收有负面影响。

导言

刚出生的老鼠的肠道是不成熟的,就像早产儿一样。1,2..它缺乏专用于抗菌防御的细胞,例如Paneth细胞。3,含有少量T细胞和B细胞,主要由髓系免疫细胞组成。2,4..这一阶段的淋巴室主要由能对细菌产生反应的固有淋巴样细胞(ILCs)所代表,对Peyer‘s斑块(PPS)和肠系膜淋巴结等结构的形成很重要。5..肠道屏障和免疫系统的成熟似乎依赖于共菌的定植。6,7..新生儿肠的定植始于出生,新获得的细菌来自阴道管或皮肤,并引发与免疫系统细胞的复杂相互作用。6..这一过程还受到母奶中存在的免疫调节因子的影响。8.

新生儿肠道内先天免疫系统的细胞进行了精确和平衡的反应,但在许多情况下,这种反应是不平衡的,因此出现了重大的免疫病理。髓系和ILC的重要调节因子之一是细胞因子白介素-23(IL-23)。9,10..IL-23曾与成人的几种炎症疾病有牵连,但其在新生儿中的作用仍只是部分特征。IL-23信号通路的缺失与新生小鼠免疫功能的严重缺陷无关,但在新生小鼠肠道中的过表达会引起严重的肠道炎症、肠出血和围产期死亡。11.

为了进一步了解白细胞介素23(IL-23)在早期表达的病理后果,我们分别在CX3CR1阳性髓系细胞和角质形成细胞中产生了IL-23高表达的两种新型小鼠品系。我们在此表明,IL-23的表达增加会导致两种小鼠生长发育迟缓和过早死亡。该表型是由IL-23下游细胞因子IL-22介导的,其水平在循环中增加.新生小鼠循环中IL-22水平的升高会影响胰腺和肠道产生的抗菌肽和消化酶基因的表达,从而导致吸收不良。在表达IL-23的小鼠中删除IL-22可以逆转这些变化并防止早期死亡。我们的结果揭示了IL-23诱导的IL-22在早期控制胰腺酶分泌和食物吸收方面的作用。

结果

CX3CR1表达IL-23的小鼠早期致死性研究+细胞

从Villin启动子中表达IL-23的动物(v23(老鼠)出生时死亡11..死亡原因似乎与小肠出血有关。为了进一步研究IL-23在新生儿中的生物学作用,我们构建了以CX3CR1为靶点表达IL-23的小鼠模型。+细胞是在肠道中主要表达IL-23的细胞.这是通过交叉小鼠完成的,其中含有一盒IL-23盒式磁带,在rosa 26位点前有一个浮动停止信号(R23(老鼠)12,将含有cre-重组酶基因的小鼠插入到CX3CR1轨迹(CX3CR1-cre(老鼠)13(无花果)1A)。我们把这些动物称为CXR 23老鼠(图1.1A)。小肠组织中检测到IL-23亚基p19和p40的表达。CXR 23,但不能控制老鼠。1B,c). CXR 23小鼠出生时正常,但50%的幼仔在出生后48小时内死亡,其余幼仔在第8天前死亡(图1)。1D). CXR 23小鼠出生时体重正常,但出生后没有增长(图1)。1E,f)。新生小鼠的尸检显示SI内有血液存在。大鼠的组织学分析CXR 23肠道显示出血来源于破裂的绒毛和与PP Anlagen相似的细胞聚集物(见图)。1g)。病变位于SI(十二指肠,空肠),而不在结肠(附图)。1A)。然后用流式细胞仪检测CX3CR1的数量和定位。+小鼠出生时肠道中的细胞。我们发现CX3CR1的数量+野生型(WT)小鼠SI中的细胞数高于大肠(图1)。和补充图。2A)。的SI中CX3CR1+细胞数CXR 23老鼠比对照组的SI高出2倍(图1)。1I和补充图。2A)。细胞聚集在CXR 23小鼠体内含有大量的中性粒细胞,这些中性粒细胞破坏了上皮细胞的覆盖(如图所示)。1g),以及在IL-22中+细胞(图1.1J),提示这些细胞在病理学中具有一定的作用。值得注意的是,白细胞介素3的数量,有可能产生白细胞介素-22和白细胞介素-17。11,在CXR 23小鼠与对照组比较(图1)。1K和补充图。2B)。常规组织学分析未发现其他器官(肾、心、肺和脑)出现异常(补充图)。1A)。综上所述,这些发现证实了我们先前观察到的小鼠肠道中IL-23的表达会导致早期致命性。11.

图1
figure1

CX3CR1中IL-23的本构表达式+细胞导致早期死亡。a发电计划CXR 23老鼠。R23在rosa 26位点上含有IL-23p19和p40的基因敲入的小鼠被杂交到CX3CR1-cre小鼠产生CXR 23老鼠。b, c相对表达P19 (b)和P40 (c)在WT和CXR 23小鼠出生后第1天(P1)(n=10只小鼠/组)。dWT和WT的生存曲线CXR 23小鼠(WT,n=35,CXR 23, n=87)。e体重(WT)和CXR 23老鼠(n=11-24只小鼠/组)。f具有代表性的WT和CXR 23老鼠在P3。g具有代表性的小波及小肠H&E染色切片CXR 23老鼠在P1。inset显示在肠道内有红细胞存在。CXR 23老鼠。小肠糜烂性病变的典型图像CXR 23小白鼠在P1(右侧)。标尺=50μm。h, iCX3CR1的流式细胞分析+野生型大(Li)和小(SI)肠壁中的细胞(h)和CXR 23 (i)小鼠出生后第1天(n=3~5只小鼠/组。j小肠免疫染色伊尔-22tdTomato(WT)和CXR 23/IL-22tdTomato (CXR 23)用抗-tdTomato抗体免疫小鼠P1。注意白细胞介素-22阳性细胞在大鼠肠道内的积聚CXR 23有侵蚀性病变的小鼠(右面板)。标尺=50μm。k第3组先天性淋巴样细胞总数+)小肠中的细胞CXR 23老鼠在P1。ILC 3+细胞在CD 45上有门控+Thy1+SCA-1(n=8只小鼠/组)。数据显示为平均值±扫描电镜。非参数Mann-Whitney检验的统计分析b, c, h, i,和k..用对数秩检验进行统计分析d..ANOVA与Bonferroni后自组织检验的统计分析e. **p < 0.01 and ***p < 0.001. Source data are provided as a Source Data file

无菌CXR 23老鼠的寿命增加了

我们实验室先前的工作表明,IL-23的表达可以改变肠道的通透性,并促进细菌在新生儿时期的易位。11..为了研究细菌是否与早期致命性的表型有关,我们CXR 23无菌小鼠(简称GF)CXR 23 GF老鼠)。如前所述,大约50%的CXR 23SPF小鼠出生后48小时内死亡。超过95%CXR 23GF小鼠在这一点上还活着,并且活到30天(补充图)。3A)。肠壁未见出血CXR 23 GF老鼠出生时或以后(附图)。3B)。中性粒细胞存在于SI中,但不破坏上皮细胞(附图)。3C)。结果表明,新获得的微生物区系参与了观察到的肠出血表型的形成。CXR 23SPF级新生儿。

小鼠皮肤表达IL-23的早期致死性研究

为了进一步研究白细胞介素-23(IL-23)表达引起的早期致死性和身体发育迟缓的相关因素,我们设计了另一个菌株,将IL-23的表达定向于角质形成细胞,通过杂交将IL-23导入角质形成细胞。R23小鼠12小鼠携带由K14启动子驱动的cre-重组酶。2A)。这些动物,我们称之为KS 23小鼠,在皮肤中表达的IL-23水平高于对照组(如图所示)。2B,c在皮肤中表达的IL-23水平高于其他器官(舌头、食道和肠)(如图所示)。2B,c)。这个KS 23小鼠出生时体重正常。二维空间)。到第5天KSR 23老鼠的胃里有牛奶,但比它们的对照小得多(图中所示)。2D,e)。类似于CXR 23老鼠,KSR 23小鼠过早死亡(15天前)(见图)。2F),但在皮肤、肠道或检查的其他器官中没有显示疾病的迹象(附图)。1B)。在动物身上一个值得注意的发现是腹泻,还有黄色的凳子(图一)。2G),这表明食物吸收不良。导致吸收不良的情况与粪便脂肪含量增加有关,通常称为脂肪漏。以确定KSR 23小鼠出现脂肪漏,测定粪便和血清中的甘油三酯(TGS)。2H,i)。在第五天,KSR 23小鼠粪便TG升高(图一)。2H)和降低血清TG水平(图一)。2I)与WT小控件相比。这些结果表明角质形成细胞中IL-23的本构性表达导致脂肪吸收不良、生长迟缓和早期死亡。

图2
figure2

IL-23在K14中的本构表达+细胞导致早期死亡。a发电计划KSR 23老鼠。KSR 23小鼠通过杂交产生。R23小鼠从K14启动子中表达cre-重组酶(K14-cre老鼠)。b, c相对表达P19 (b)和P40(c)mRNA在WT和KSR 23P7小鼠(n=4~13只/组。d体重(WT)和KSR 23老鼠在生命的第一周(n=14-26只小鼠/组)。e具有代表性的WT和KSR 23小鼠在P5。fWT和WT的生存曲线KSR 23小鼠(WT,n=54;KSR 23, n=105)。gWt和WT大肠的代表性图KSR 23老鼠在第5天。注意到结肠内有软黄色的大便。KSR 23老鼠。h中药大便中甘油三酯的定量研究(n=12)和KSR 23 (n=21)P5小鼠。i西葫芦血清甘油三酯的含量测定(英文)n=35)和KSR 23 (n=18)P5小鼠。数据显示为平均值±扫描电镜。单因素方差分析b, c..ANOVA与Bonferroni后自组织检验的统计分析d..用对数秩检验进行统计分析f..非参数Mann-Whitney检验的统计分析h, i. *p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001. Source data are provided as a Source Data file

IL-23表达小鼠血清细胞因子水平的升高

为了开始评估导致生长发育迟缓和早期死亡与IL-23表达相关的机制,我们检测了小鼠血清中IL-23和其他细胞因子的水平。CXR 23KSR 23老鼠。血清IL-23水平升高CXCR 3KSR 23小鼠(分别是对照组的7倍和2.5倍)(补充图)。4A4B)。血清IL-22、IL-17、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-1(IL-1β)水平显著升高,而粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子水平无明显升高(P>0.0 5)。CXR 23小鼠(附图)4A)。血清中IL-22、IFN-γ和IL-1β水平显著升高(P<0.0 5)。KSR 23小鼠(附图)4B)。一般来说,血清中的细胞因子水平与白细胞介素-23的水平相关,其变化更明显。CXR 23老鼠。血清中最上调的细胞因子CXR 23KSR 23小鼠为IL-22,总水平分别为10 ng/ml和4 ng/ml(附图)。4A,b)。血清中细胞因子水平明显升高,提示这些分子在发病机制中可能起一定作用。

IL-22基因消融降低致命性

为了检验白细胞介素-22在体内是否参与了白细胞介素-23的致病作用,我们进行了交叉杂交。CXR 23KS 23小鼠白细胞介素-缺乏(伊-22−/−)小鼠在我们的实验室(补充图。52C)。IL-22缺乏CXR 23(CXR 23/IL-22)−/−)KSR 23(KSR 23)/IL-22−/−)小鼠的寿命延长了(如图所示)。3A,d)和正常生长。3B,e表明IL-22在这些动物的发育迟缓和致死性表型中起着重要作用。值得注意的是,没有一个白细胞介素-22缺乏症。CXR 23被检查的小鼠有肠出血(图一)。3C)。为了进一步证明IL-22在发病机制中的作用,我们检查了仍表达IL-23和IL-22的动物,但缺乏IL-22R(IL-10R2)的一条链。这些老鼠被称为CXR 23/IL-10R2−/−老鼠。类似于上面观察到的情况,IL-22信号被灭活的动物存活时间更长(见图)。3A),在P3时体重正常(如图所示)。3B)。这些结果表明IL-22是小鼠出生时表达IL-23的主要细胞因子。

图3
figure3

IL-22或IL-10R2的基因消融降低了表达IL-23的新生儿的致死率,恢复了正常的身体生长。a生存曲线CXR 23, CXR 23/IL-22−/−,和CXR 23/IL-10R2−/−老鼠(CXR 23, n=87,CXR 23/IL-22−/−, n=28,CXR 23/IL-10R2−/−, n=12)。b体重,CXR 23,CXR 23/IL-22−/−,和CXR 23/IL-10R2−/−在P3(n=3~25只小鼠/组)。c小肠代表H&E染色切片CXR 23/IL-22+/+CXR 23/IL-22−/−老鼠。INSET显示肠内有糜烂性病变和淋巴聚集区的放大。CXR 23/IL-22+/+CXR 23/IL-22−/−分别是老鼠。标尺=50μm。d生存曲线KSR 23KSR 23/IL-22−/−老鼠(KSR 23, n=108;KSR 23/IL-22−/−, n=25)。eWT的重量曲线,伊-22/, KSR 23,和KSR 23/IL-22−/−老鼠随着时间的推移(n=5-33只小鼠/组)。数据显示为平均值±扫描电镜。用对数秩检验进行统计分析a, d..单因素方差分析b..ANOVA与Bonferroni后自组织检验的统计分析e. 注:p>0.05和*p < 0.001. Source data are provided as a Source Data file

肠道和胰腺基因表达异常

血清中IL-23及其他细胞因子水平较高。CXR 23KSR 23小鼠多于WT小鼠(补充图。4)。我们推测这些变化可能会影响新生小鼠的生长。新生儿的身体生长取决于他们摄取、加工和吸收营养的能力。CXR 23KSR 23老鼠的胃里有牛奶,表明食物摄入没有受到影响。为了研究细胞因子的升高是否会影响身体的生长,我们检查了胰腺和肠道的转录组,这些器官对营养物质的加工和吸收至关重要。为此,我们从表达IL-23的5日龄小鼠胰腺和空肠中提取RNA。KSR 23并进行RNA测序(RNAseq)。

如图所示。4A,b,胰腺的转录体KSR 23P5小鼠与对照组小鼠差异显著。KEGG通路分析显示,与胰腺分泌有关的几个基因在胰腺中被下调。KSR 23老鼠(图1.4C)。胰腺分泌途径包括编码几种参与食物消化的胰腺酶的基因和参与分泌途径的基因(如图所示)。4C)。在下调的基因中KSR 23老鼠是那些编码胰酶的人,包括胰淀粉酶(淀粉酶2a,Amy2a;淀粉酶2b,AMY2B)、脂肪酶(普利普),弹性蛋白酶(弹性酶1,凯拉1; 弹性蛋白酶2a, (Cela2a),以及蛋白酶(羧肽酶1,CPA 1;羧肽酶2,CPA 2与激肽释放酶1相关的肽酶b5,Klk1b5类糜蛋白酶克特;糜蛋白酶C,CTRC)(图1.4D)。其他参与胰腺腺泡分泌的基因也被下调,包括合成胶原蛋白。赛肯),一种调节酶原颗粒融合的蛋白质14..水通道蛋白12(AQP 12),一种腺泡特有的水通道,控制胰液的分泌。15,在胰腺中也被下调。KSR 23老鼠(图1.4E)。其中一些变化被定量PCR(QPCR)证实。4F).

图4
figure4

胰腺分泌途径减少KSR 23老鼠。aWT和WT生物复制体RNAseq表达数据的主成分分析KSR 23胰腺(n=5/组)。b在所有检测到的转录本中,LOG 2 FC(Log 2 Fc)和log 2 CPM(log 2每百万计数)的图。根据表达状态对点进行着色:非显着性基因(灰色)和显着性基因(385个基因);Q < 0.05; log 2 FC > 1 or log 2 FC < −1; red). c大鼠胰腺中明显下调基因的KEGG通路分析KSR 23老鼠(Q < 0.05; terms >3 genes; % Genes/term >4; κ 0.4). d Z-与GO术语“胰腺分泌”和腺泡分泌酶相关的下调基因的热图。e与酶原包装有关的下调基因的热图。f编码消化酶基因的qPCR验证。数据以均值±扫描电镜显示,用非参数Mann-Whitney检验进行统计分析.*p < 0.05 and **p < 0.01. Source data are provided as a Source Data file

转录调控基因Ptf1a控制腺泡细胞分泌蛋白的加工和包装16..灭活Ptf1a在成年腺泡细胞中,腺泡细胞的同一性降低,这与导管细胞标记物Sox 9和角质形成19(KRT 19)的出现相一致。16,17..我们观察到Ptf1a(无花果)5A)和增加表达SOX 9(无花果)5B)在胰腺中KSR 23老鼠。这些结果提示腺泡细胞在.KSR 23小鼠可获得导管细胞表型。为了确定是否确实如此,我们分析了KRT 19在WT和Wt胰腺中的表达。KSR 23小鼠免疫染色(图1)。5C)。增加的KRT 19+胰腺细胞KSR 23小鼠与WT小鼠比较(图1)。5C)。KRT 19主要定位于WT胰腺的大小叶间导管。5C、箭)。然而,在KSR 23小鼠,KRT 19也标记了一群腺泡细胞(图)。5C、箭)。这些结果进一步表明胰腺腺泡细胞的功能和同一性受到干扰。KSR 23老鼠。

图5
figure5

胰腺导管细胞增多KSR 23老鼠。a, b基因表达的RNAseq分析Ptf1a (a)和SOX 9 (b)在WT和KSR 23P5小鼠(n=5只小鼠/组)。数据为均值±扫描电镜,用非参数Mann-Whitney检验进行统计分析.*p < 0.05 and **p < 0.01. cWT和WT胰腺的免疫染色KSR 23具有抗合成酶和KRT 19抗体的小鼠。箭头显示KRT 19阳性细胞在wt和wt胰腺中的定位。KSR 23老鼠。标尺=50μm.源数据作为源数据文件提供

胰蛋白酶、糜蛋白酶、脂肪酶、弹性蛋白酶和蛋白酶是由腺泡细胞产生的,通过胰管分泌到SI中。在这个地方,这些前体中的一些被SI产生的酶转化为活性形式,导致食物进一步分解。多肽、氨基酸、脂肪酸、甘油和葡萄糖通过肠细胞刷状边界膜中的转运体到达血液。为了询问白细胞介素-23(IL-23)和其他细胞因子循环水平的升高是否与肠道基因表达的显著变化有关,我们分析了从空肠提取的RNA。KSR 23和对照小鼠进行RNAseq。基因表达的总体格局在两组间差异显著。KSR 23和对照鼠(图1)。6A)。有几个基因差异表达,包括白细胞介素-22,以及下游的基因,如Reg3基因和消化酶也由空肠产生。6B)。小波和小波变换的KEGG通路分析KSR 23空肠显示参与蛋白质消化和吸收的基因,如糜蛋白酶原B1(Ctrb 1)、胰蛋白酶原(Prss 1)、胰蛋白酶(第5型Tyr 4)、羧肽酶A1(CPA 1),以及类糜蛋白酶类弹性蛋白酶家族成员3b(Cela3b),在肠道中被下调。KSR 23老鼠(图1.6C)。转录组分析还显示,参与调节极低密度脂蛋白颗粒通路的几个基因的表达降低(如图所示)。6d,e)。这些微粒调节脂肪和胆固醇向血液中的释放。这些结果表明,IL-23和其他细胞因子的全身性表达与调控胰腺和肠道食物加工的基因转录显著相关。

图6
figure6

空肠食物吸收途径的改变KSR 23老鼠。aWT和WT生物复制体RNAseq表达数据的主成分分析KSR 23空肠n=5/组)。b在所有检测到的转录本中,LOG 2 FC(Log 2 Fc)和log 2 CPM(log 2每百万计数)的图。根据表达状况对点进行着色:非显着性基因(灰色)和显着性基因(698个);Q < 0.05; log 2 FC > 2 or log 2 FC < −2; red). c Z所有与“蛋白质消化和吸收”相关的下调基因的热图得分。d对明显下调基因的集群Go分析显示GO足月组“极低密度脂蛋白颗粒”的富集。e Z-与GO组“极低密度脂蛋白颗粒”相关的所有下调基因的热图

IL-22消融纠正胰酶基因异常表达

为了询问IL-22是否影响胰腺酶的表达,我们检测了几个基因在胰腺中的表达。KSR 23KSR 23/IL-22−/−老鼠。qPCR证实KSR 23小鼠信使RNA(MRNA)水平Reg3β(无花果)7A),胰脏脂肪酶,淀粉酶,和赛肯胰腺比WT对照组(图1)。7C,g)。免疫组织化学也记录了蛋白质水平的变化。7b,h)。删除IL-22KSR 23小鼠对这些标记的表达水平以及pSTAT 3的表达水平都有显著的影响,pSTAT 3是一种已知的IL-22信号传导介质。18(无花果)7I)。水平Reg3β,淀粉酶,胰脂肪酶,以及赛肯在胰腺KSR 23/IL-22−/−表明IL-22或其下游基因在调控胰腺基因表达中起主要作用。

图7
figure7

切除IL-22可恢复胰腺基因的表达。KSR 23老鼠。a, c, e, gWt胰腺中所选基因表达的qPCR分析伊-22−/−, KSR 23, 和KSR 23/IL-22−/−小鼠在P5。b, d, f, hWt胰腺免疫染色,KSR 23,和KSR 23/IL-22−/−抗P5抗体小鼠Reg3β (b)、脂肪酶(d)、淀粉酶(f),以及合成酶(h)。嵌体显示出更高的放大率。ipSTAT 3在WT胰腺中的免疫染色KSR 23,和KSR 23/IL-22−/−老鼠。增加的pSTAT 3数目+胰腺细胞KSR 23老鼠。数据以均值±扫描电镜表示,用单因素方差分析进行统计分析.**p < 0.01 and ***p < 0.001. Scale bars = 50 μm. Source data are provided as a Source Data file

IL-22直接调控胰腺基因的表达

在表达IL-23的动物中,IL-22的缺失恢复了早期死亡和身体发育迟缓的两种主要表型。此外,IL-22的缺失使胰腺中观察到的基因表达的异常恢复.IL-22R在WT小鼠胰腺腺泡细胞中表达,表明IL-22能直接促进小鼠胰腺中IL-22的表达。Reg3β由这些细胞19..为了研究IL-22是否直接影响参与营养加工的胰腺基因的表达,我们进行了体外实验。短期(24小时)白细胞介素-22(IL-22)对WT胰腺细胞的增殖有显著的促进作用。第3b条如报告所述19,但在表达上没有变化。Ptf1a, 赛肯, Amy2a,和AMY2B(补充图。6)。用白细胞介素-22(60h)培养腺泡细胞后,其表达水平显著下降。Ptf1a(无花果)8)。与.的表达减少相一致Ptf1a,我们观察到赛肯, Amy2a,和Prss 2在白细胞介素-22刺激的培养物中(如图所示)。8),提示IL-22在这些胰腺基因的调控中起着直接作用。为了证实这些变化是由IL-22信号转导引起的,我们研究了IL-22在IL-10R2缺乏小鼠胰腺细胞中的作用。IL-10R2信号缺乏的胰腺腺泡细胞加入IL-22后,其基因表达无明显变化。8和补充图。6),证实所观察到的胰腺基因表达变化是由IL-22受体介导的。这些结果表明,对胰腺基因表达的抑制KSR 23小鼠由IL-22介导。

图8
figure8

在体外培养的腺泡细胞中,IL-22诱导胰腺酶相关基因表达下调。来自WT的腺泡细胞(伊-10R2+/+)和伊-10R2−/−在IL-22重组蛋白存在下培养小鼠.培养60小时后,检测细胞中胰腺转录因子1a(Ptf1a),合成蛋白(赛肯),淀粉酶2a(Amy2a)和丝氨酸蛋白酶2(Prss 2)用qPCR。注意用IL-22培养的WT腺泡细胞下调了几个胰腺相关基因。IL-22不降低IL-10R2缺陷细胞胰腺相关基因的表达.数据以均值±扫描电镜表示,用单因素方差分析进行统计分析.*p < 0.05, **p < 0.01, and ***p < 0.001. Source data are provided as a Source Data file

NEC小鼠胰腺酶表达降低

新生儿死亡的表型v2311CXR 23小鼠使人联想到坏死性小肠结肠炎(Nec),这是一种以新生儿时期肠坏死和多系统器官衰竭为特征的疾病。20..NEC主要影响早产儿,细菌侵入肠壁,导致IL-23分泌失调。为了验证这一假设,我们在C57BL/6小鼠出生后第7天诱导了NEC,这是Hackam和他的同事描述的程序。21,22..qPCR分析表明,与对照组相比,NEC组动物回肠末端IL-23和IL-22表达上调(见图11)。9a,b)。当系统中的IL-22水平被上调时,CXR 23KS 23接下来,我们测试了NEC小鼠肠道中IL-23水平的升高是否与循环中IL-22水平的升高有关。如图所示。9C我们注意到与对照组相比,NEC小鼠循环中IL-22水平显著升高。我们还检测了胰脏酶的表达,赛肯Reg3β,在NEC小鼠胰腺中发生改变。用免疫染色法检测到Reg3β降低淀粉酶A,脂肪酶的表达,赛肯在动物的胰腺中有NEC(图1)。9d,e)。结果表明,新生儿炎症NEC模型的肠组织中IL-23和IL-22的表达增加,这些变化与胰腺酶表达失调有关,与我们的转基因模型相似。

图9
figure9

坏死性小肠结肠炎(NEC)小鼠胰腺酶产生减少。acIL-23p19的表达a)和IL-22(b)mRNA在对照组和动物回肠末端的NEC(n=8只小鼠/组)。c用NEC测定对照组和动物血清IL-22的含量(英文)n=6-12只小鼠/组。d正常小鼠和NEC小鼠胰腺的典型免疫染色。嵌体显示更高的放大率(n=7-8只小鼠/组)。标尺=50μm。e中所示图像中荧光强度的量化d (n=7-8只小鼠/组)。数据以均值±扫描电镜显示,用非参数Mann-Whitney检验进行统计分析.**p < 0.01 and ***p < 0.001. Source data are provided as a Source Data file

讨论

在这里,我们研究IL-23在新生儿中表达的影响。我们报告说,IL-23在cx3cr1出生时就会诱导出严重的表型。+细胞和角质形成细胞。这些表型被IL-22的失活所逆转,提示IL-22介导了新生儿IL-23的致病特性。我们还表明,IL-22引发的一种重要和未被重视的致病机制是降低了几种胰腺酶的表达,从而导致了这些动物未能茁壮成长。

两种表型与新生儿IL-23的表达有关.第一种是在生命的最初48小时内死亡。在Cx3CR1表达IL-23的小鼠中,约有50%存在这种表型。+肠内髓样细胞,角朊细胞不表达IL-23的小鼠,与肠出血有关,类似于从Villin启动子中表达IL-23的动物。v23(老鼠)11..的情况下,表型不那么严重。CXR 23小鼠,可能反映了较低水平的白细胞介素-23的表达。v23老鼠。这两种情况下的死因尚不清楚,但微生物区系可能起着重要作用,如GF。CXR 23小鼠不出现肠出血,并存活到新生儿期以上。也类似于在v23小鼠11,我们观察到小肠中IL 3的数量增加。CXR 23老鼠。我们认为,这一细胞群是发病机制的关键驱动因素。CXR 23老鼠,类似于在v23老鼠。鉴于ILC 3在IL-23刺激下产生大量的IL-22,它们很可能是新生儿肠道中IL-22的主要来源。IL-22水平升高可破坏肠道通透性,有利于细菌进入固有层,引起明显的肠道炎症及肠出血和死亡。11..我们观察到,灭活IL-22信号(使用IL-22和IL-10r2基因敲除(Ko)小鼠)可以挽救50%的大鼠肠出血,这一假设得到了支持。CXR 23老鼠。在此背景下,讨论IL-10R2介导IL-22和IL-10信号传导是很重要的。IL-10R2在IL-23表达表型中的KO进一步强化了IL-22致病作用的假设,提示IL-10信号不影响Il-23表达所致早逝的表型。我们的数据支持IL-22在新生小鼠中的致病作用,增加IL-23的表达。

另一个值得讨论的发现是,新获得的微生物群似乎有助于肠出血表型的发展。CXR 23SPF级新生儿。我们在这里展示CXR 23GF小鼠不发生肠出血。这一发现表明,要么是细菌直接参与了这个过程,要么是细菌控制了cx3cr1的总数量。+肠道细胞(因此调节产生的IL-23水平)。事实上,我们发现CX3CR1的数量+GF成年小鼠固有层细胞减少23..以检验下列人士在表型上的差异:CXR 23SPF和CXR 23GF小鼠是由于CX3CR1数量减少造成的。+在SI中对GF小鼠进行流式细胞术。我们发现在出生时(P1)CXR 23SPF和CXR 23GF小鼠有相似数量的CX3CR1+SI细胞(SPF 7±0.6×10)6vs.GF 6±0.6×106)。我们的结论是,表型上的差异不能归因于CX3CR1的数量。+SI中的细胞和微生物区系在这个阶段直接导致老鼠的死亡。我们假设他们可能是通过浸润肠壁来做到这一点的。我们以前已经证明,在小肠上皮细胞中表达IL-23的小鼠的SI中,在IL3丰富的淋巴样Anlagen附近的区域,肠道通透性会增加。11.

在这两个菌株中观察到的第二个表型是不能生长。CXR 23存活48小时的小鼠未能生长并过早死亡,类似于KSR 23老鼠。同样,这些表型被IL-22消融逆转,表明IL-22水平升高的致病作用。我们的结果与文献中的其他发现是一致的。从E lCK启动子或胰岛素启动子转IL-22的表达会导致体重小的动物在出生后几天死亡。24..另一方面,白蛋白启动子中IL-22的表达并不能引起早期的死亡,但从5个月开始,动物的体重却低于WT小白鼠的体重。25..这条线上的动物存活的原因,以及其他由E系LCK和胰岛素驱动的菌株24维林11,CX3CR1启动子尚不清楚,但可能与循环中IL-22的整体水平或其表达的地点和时间有关。在腺病毒感染的小鼠或每天注射这种细胞因子的动物身上(2周内注射25毫克),也可以观察到低体重。每日注射白介素-22可使体重下降8%。26..发育迟缓和体重低的原因是多方面的,包括饮食成分吸收减少。事实上,以前曾有人提出,IL-22对肠道脂质转运蛋白的表达有调节作用。27我们在此确认并扩展了这一发现。

在我们的实验过程中最出乎意料的发现是,循环中IL-22水平的升高明显影响了对消化碳水化合物、蛋白质和脂质至关重要的胰腺酶的表达。肠道中酶的表达减少,营养物质吸收减少,从而导致吸收不良,如粪便中脂肪含量的增加所证明的那样。IL-22缺失可使消化酶的表达正常化。因此,很可能在CXR 23KSR 23部分原因是由于胰脏酶和肠转运蛋白的表达减少,导致关键饮食成分吸收不良。

大多数已知的由IL-22调控的组织特异性基因都是上调的.特别令人感兴趣的是,我们发现了IL-22下调的基因。虽然不能排除IL-23同时上调的其他细胞因子可能影响胰腺和肠道基因的表达,但我们在体外证明IL-22可以直接下调胰腺酶基因的表达,提示IL-22是调控IL-23表达的主要因素。我们在此表明,用白细胞介素-22孵育腺泡细胞会显著减少细胞的表达。Ptf1a经过长时间(60h)而不是短时间(20h)的孵化。ptf1a是一种基本的螺旋环螺旋转录因子,对胰腺腺泡细胞的特殊表型至关重要,包括控制分泌消化酶的产生。17..我们显示,pSTAT 3腺泡细胞的数量有所增加。KSR 23并假设这可能是降低消化酶表达的效应机制。有趣的是,Ptf1a在成人中的基因消融导致腺泡分泌产物基因和参与酶原颗粒形成的基因的表达减少。16..同样令人感兴趣的是,Ptf1a表达下降导致导管细胞标记物表达增加。16,17..类似的结果在KSR 23老鼠。我们的观察将高水平的IL-22与ptf1a在胰腺中的表达降低联系在一起。KS 23小鼠,以及白细胞介素-22在腺泡细胞上的直接活性,强烈支持IL-22在小鼠腺泡细胞表达中的作用。Ptf1a..鉴于转基因小鼠体外反应的动力学和体内导管细胞数量的增加,不能排除Ptf1a基因表达下降是由于Ptf1a基因表达降低所致的发育缺陷所致。

白细胞介素-22(IL-22)诱导腺泡细胞对几个抗菌基因的上调是这方面另一个有趣的观察。IL-22直接调控Reg3β在体外,如这里和其他地方所示19..微生物杀菌剂Reg蛋白在肠腔中的额外分泌可能会对肠道微生物区系产生潜在的影响。因此,IL-22可以调节多个胰腺基因的表达,可能在其他肠道疾病的发病机制中起着重要作用。炎症性肠病(IBD)患者有不同程度的胰腺功能不全的报道。28,29,30,这些功能可能与更高水平的IL-22在原地或在循环中。与此相关的是观察到小儿IBD常与生长衰竭有关。31,这是由几个因素引起的,其中包括食物摄入减少和吸收不良。32.

NEC是一种严重的炎症性疾病,它影响早产儿的肠道,导致肠道缺血和死亡。20..令人感兴趣的是,白细胞介素-22(IL-22)在人的肠道中表达增加。22..为了检测NEC中IL-23/IL-22轴是否发生了改变,我们在受感染的肠组织(回肠末端)进行了RNA定量,观察到这两种细胞因子的水平明显升高。NEC组小鼠循环中IL-22水平升高,并有升高的趋势。Reg3β和降低胰腺酶和赛肯..这些结果与转基因动物的结果非常相似,并支持了这样的假设:白细胞介素23(IL-23)在病变组织中的表达增加,导致局部和全身IL-22水平升高。我们假设在转基因和实验的nec环境中增加的系统IL-22水平是影响胰腺表达的关键。Reg3β, 赛肯以及胰腺酶。

总之,我们已经证明了IL-23在新生儿病理中的重要作用。IL-23触发的主要效应机制是增加IL-22的产生,IL-22作用于胰腺的肠上皮和腺泡细胞水平,调节肠道通透性,抑制营养物质的消化和吸收机制。这些结果表明,IL-23和IL-22的表达失调对新生儿的生存和整体健康有显著的负面影响。

方法

小鼠

C57BL/6(CN 000664),CX3CR1-cre13(Cn 025524),hk 14-cre33(Cn 018964)和IL-10R2-ko34(CN 005027)小鼠从杰克逊实验室购买(巴尔港,ME)。IL-22tdTomato小鼠23由Scott Durham博士提供(国立卫生研究院,贝塞斯达,医学博士)。R23以前曾描述过老鼠12. R23将小鼠回交到C57BL/6背景中,共传代11代。小鼠在特定的无病原体条件下维持。GF小鼠是在室内饲养的,并被安置在我们的GF动物设施的标准柔性薄膜隔离器中。本研究中的所有动物实验均经西奈山伊坎医学院动物保护与使用机构委员会批准,并按照西奈山伊坎医学院动物实验批准指南进行。

IL-22缺陷小鼠的产生

伊-22−/−用CRISPR/Cas9技术直接生成C57BL/6小鼠,如前所述。35..为此,我们使用在线CRISPR设计工具设计了针对IL-22外显子1的单个引导RNA(SgRNA)。http://tools.genome-engineering.org)。表达sgRNA的质粒是通过将寡核苷酸连接到BBSpX 330的I位点(Addgene质粒ID:42230)36..测序证实WT和KO基因型。IL-22-KO小鼠截短蛋白与WT小鼠IL-22氨基酸序列的比对37是由SeqBuilder完成的。IL-22-KO的功能验证如附图所述.5.

NEC的诱导

NEC如所述21,22,38,39在7日龄小鼠幼鼠灌胃(每天5次,连续4天)配方奶[Similac先进婴儿配方(Abbott营养品)和Esbilac犬奶代用品(PetAg)2:1],补充肠内细菌,从NEC婴儿中分离出来。小鼠暴露于短暂的缺氧(5%O)中。2,95%N2每日两次,每次10分钟,共4天。所有动物于第11天被安乐死,所有实验和程序均由约翰·霍普金斯大学动物保护和使用委员会根据“实验室动物护理和使用指南”(第8版,国家科学院出版社,2011年)批准。

免疫染色、成像和定量

取器官解剖,固定于10%磷酸盐缓冲液中,制成石蜡切片.对四微米切片进行脱蜡和水化处理.用微波组织切片在靶检液(DAKO)中进行15 min的抗原提取。组织切片与原抗体(Abs)在4°C的加湿气氛中孵育一夜,洗涤后加入结合的次级抗体,然后孵育35 min。这些幻灯片被冲洗并安装了氟omount-G(SouthernBiotech)。补充表列出了所使用的初级和二级抗体1..免疫荧光显像在荧光显微镜(Nikon EclipseNi)上用PLAN Apo物镜进行。图像采集采用数码相机(DS-Chimc;Nikon)和Nis-元素BR成像软件.在根据最亮样本设置采集条件后,所有采集参数都保持不变,包括激光强度、曝光时间、光电倍增管的增益、直方图的偏移和图像放大。对每只被检查的小鼠平均进行三次测定。荧光强度用图像J/斐济测量。图像由AdobePhotoshop CS3组成。

流式细胞术

P1小鼠SI微切,切碎,用2mg ml消化。−1胶原酶D(Roche)细胞悬液通过70-μm细胞过滤器,分离出单个核细胞.将细胞与抗小鼠CD 16/CD 32共同孵育,阻断FC受体,并与相应的单克隆抗体结合物共同孵育。用碘化丙啶(Sigma-Aldrich)或DAPI(4‘,6-二氨基-2-苯基吲哚)(Invitrogen)在细胞分析中区分活细胞和死亡细胞。染色细胞在FACS Canto或LSRII机器上用Diva软件(BD生物科学)进行分析。数据用Flowjo软件(TreeStar)进行分析。白细胞介素3细胞被定义为CD 45+Thy1+SCA-1如所述11..在指示的稀释液中使用以下氟铬结合抗小鼠抗体:thy-1.2(53-2.1,1:200),sca-1(d7,1:200),CD 45(30-F11,1:200),CD11b(m1/70,1:200),IL-22(1H8PWSR,1:100),IL-17A(eBio17B7,1:100)来自eBioscience;谱系鸡尾酒(CD3,B220,CD11b,Gr-1,Ter119)。)(145-2C11,RA3-6B2,M1/70,RB6-8C5,ter-119,1:100)和CX3CR1(SA011F11,1:200)。

酶联免疫吸附试验

Chemokines and cytokines(granulocyte-colony-stimulating factor,GM-CSF,chemokine(C-X-C motif)ligand 1(CXCL1),CXCL2,CXCL10,IFNγ,IL-1α,IL-1β,IL-12p70,IL-15/IL-15R,IL-17,IL-18,IL-21,IL-22,IL-23,IL-25,IL-27,leptin,C-C motif chemokine ligand 2(CCL2),CCL3,CCL4,CCL5,CCL7,macrophage colony-stimulating factor,soluble receptor activator of nuclear factor-κB ligand,用ProcartaPlex多重免疫分析法(EBioscience)检测小鼠血清中肿瘤坏死因子(EBioscience)。采用Luminex公司的xMAP技术进行分析。用IL-22小鼠ELISA试剂盒(ThermoFisher Science)检测NEC小鼠血清中白细胞介素-22(IL-22)水平。

甘油三酯

血液从WT和KSR 23小鼠饥饿4h后在P5。采用毛细管采血管(Terumo™Capiject™)进行血清分离。甘油三酯(GPO)试剂盒(Pointe Science,Inc.)测定血清甘油三酯(TG)水平。根据制造商的规格。为了测定粪便中的TGS,我们在1.5ml的Eppendorf管中收集了1mg的粪便,并将其重新悬浮在500μl的磷酸盐缓冲溶液中。在甲醇溶液中加入500微升氯仿(2:1),在粪便悬浮液中加入500微升的氯仿。悬浮液离心(1000×g在室温下,将含有氯仿萃取脂类物质甲醇的低液相转移到新的1.5ml Eppendorf管中。样品在37℃下孵育24h,使所有液体蒸发。然后将脂质颗粒重新悬浮在200μl PBS中,用甘油三酸酯(GPO)试剂集(PointeScience,Inc.)测定甘油三酯(TG)浓度。根据制造商的规格。

腺泡细胞培养

分离胰腺腺泡细胞。40在韦茅斯培养基中单独培养24和60h,或加入重组白细胞介素22(50 ng/ml,翠鸟生物技术)37°C,5%CO。2.

逆转录聚合酶链反应

根据制造商的指示,用RNeaseMini/MicroKit(Chiagen)从组织中提取总RNA。利用上标Ⅲ(Invitrogen)构建互补DNA(CDNA)。用SYBR绿色染料(Roche)在7500实时系统(应用生物系统)上进行qPCR。结果被归一化为管家基因。泛素..相对表达水平计算为2。(Ubiquitin)CT(基因)..引物使用Primer3Plus设计,并列在补充表中2..用于检测补充表中所列基因的表达2在NEC小鼠中,用bio-rad cfx 96实时系统(bio-rad)进行qPCR,并对其进行了相关基因检测。RPLO.

RNA测序

用Trizol试剂(Invitrogen)对SI和胰腺进行同源性分析。根据制造商的指示,用RNeaseMini试剂盒(Chiagen)从组织中提取总RNA。样品被装在干冰上运往位于奥尔巴尼大学(Rensselaer)的功能基因组中心、微阵列和HT测序核心设施。用纳米滴(Thermo Science)和生物分析仪(Agilent)对RNA质量进行评价。RNA完整性数值为8或更高的总RNA被认为是执行后续协议的良好质量。用SMART-Seq v4超低输入RNA试剂盒(Clontech)对100条总RNA进行寡核苷酸-DT启动,用15次PCR扩增得到的cDNA。用AMPure XP磁珠纯化双链cDNA(DscDNA),用Qubit dsDNA HS法和Agilent生物分析仪高灵敏度dscDNA芯片(预期大小为600~9000 bp)对其质量进行鉴定。利用Illumina NextEra XT试剂盒制备文库,其中125 pg dscDNA片段被片段化,适配器序列添加到片段末端,随后进行12次PCR扩增。用AMPure XP磁珠纯化DNA文库,用Qubit dsDNA HS法检测DNA文库的浓度,采用Agilent生物分析仪测定大小(预期范围为600~740 bp)。库量化也是使用一个NEBNext图书馆数量工具包为Illumina。然后将每个库稀释到4 NM,并按照标准的Illumina协议进行合并和变性,生成一个经过变性的20 pm池。将5%PhiX的1.8pm文库加载到75个循环高输出流池上,对IlluminaNextseq 500进行了75 bp的单端测序。在Basesspace上使用IlluminaFastQC算法检查RNAseq数据的质量。

转录组分析

利用tophat版本2.1.0将来自小肠和胰腺的RNAseq数据映射到小鼠参考基因组(UCSC/MM 10)。41..使用htseq-count版本0.6.1提取所有带注释的蛋白质编码基因的基因水平序列计数。42通过严格的交叉阅读和与每个基因相关的转录模型。对原始计数数据进行筛选,去除低表达基因,在任何样本中计数少于5。用生物导体Edger软件包3.10.2版生物导体/R分析各组间差异表达基因43,44..组间差异表达基因的统计学意义(Q < 0.05) were selected in gene-wise log-likelihood ratio tests that were corrected for multiple testing by Benjamini and Hochberg false discovery rate. KEGG pathway enrichment analyses were performed using ClueGo45,46找出参与差异表达基因的途径。截止时间为0.4κ-检索到包括至少三个基因在内的分数和术语。

统计分析

除RNAseq数据外,采用非参数Mann-Whitney检验或单因素方差分析(ANOVA)分析各组间的差异。重复测量采用方差分析和Bonferroni后测。生存曲线采用对数秩检验。所有统计分析均用GraphPad Prism 7软件(GraphPad,La Jolla,CA)进行。当p < 0.05. Data are shown as mean ± SEM unless specified otherwise.

报告摘要

有关研究设计的进一步资料,可参阅自然研究报告摘要链接到这篇文章。

数据可用性

所有生成的RNAseq数据都可在基因表达总括(GEO)上获得,登录号为GSE 137415..作者声明,支持本研究结果的数据可在本文件及其补充资料档案中查阅。根据要求,可以从相应的作者那里获得额外的数据或信息。图中的原始数据。1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9和附图。36都可以在源数据文件中获得。



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