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微生物群衍生的乙酸盐通过GPR43-型1干扰素反应保护免受呼吸道合胞病毒感染

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发表时间:2019-09-18 08:26作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

微生物群衍生的乙酸盐通过GPR43-型1干扰素反应保护免受呼吸道合胞病毒感染


摘要

严重呼吸道合胞体病毒(RSV)感染是一种发病率和死亡率的主要原因婴儿< 2岁。 在这里,我们描述,高纤维饮食保护小鼠免受RSV感染。 这种效应依赖于肠道菌群与醋酸的生产。 口服醋酸的介导interferon-β(IFN-β)响应通过增加肺的干扰素刺激基因的表达。 这些影响与减少病毒载量和有关RSV-infected小鼠肺部炎症。 1型干扰素信号通过醋酸IFN-1受体(IFNAR)是必不可少的抗病毒活性在肺上皮细胞系和醋酸RSV-infected小鼠的保护作用。 激活Gpr43肺上皮细胞减少病毒诱导细胞毒性和推广抗病毒效果通过IFN-β响应。 醋酸的影响在RSV感染被废除Gpr43/老鼠。 我们的发现显示抗病毒醋酸的影响涉及IFN-β肺上皮细胞和参与GPR43 IFNAR。

介绍

呼吸道合胞病毒(RSV)是一个季节性严重病毒性病原体负责大多数情况下毛细支气管炎在2岁以下的儿童1,据估计全世界每年导致118000人死亡2。 此外,有证据表明严重的RSV感染的童年可能与反复喘息和哮喘3.,4。 尽管诱导抗体和t细胞反应原发感染后,RSV再感染发生时,即使没有检测到病毒表面糖蛋白抗原变化5。 RSV涉及到几个通过逃避宿主免疫进化策略,包括调制抗病毒1型干扰素通路,抑制的RSV NS-1和NS-2蛋白质6,7。 小说的发展,安全,低成本在生命的早期治疗,以减少RSV的负担是非常可取的,因为没有临床批准疫苗。

几项研究证明了肠道微生物群的相关性在炎症和感染条件包括哮喘、结肠炎、细菌和病毒感染8,9,10。 细菌代谢产物短链脂肪酸(SCFAs),特别是乙酸,丙酸,丁酸盐,现在被肠道微生物群与宿主细胞之间的联系。 这些分子是通过新陈代谢产生的可溶性纤维组件的肠道微生物群,等Faecalibacterium prausnitzii,双歧杆菌属,拟杆菌,真细菌11,12。 SCFAs肠道和系统性影响。 调节免疫细胞的激活和功能8,13,14,15通过机制包括激活g蛋白耦合受体(即。 Gpr41 Gpr43,或Gpr109a)和抑制组蛋白去乙酰酶抑制剂,他们已经被证明能够促进肠道内稳态和口服耐受16,17

先前的调查表明,改变在SCFAs肠道微生物群组成和浓度也与RSV感染相关。 此前的一项研究相关增加水果和蔬菜的摄入量(来源的膳食纤维,用于SCFA生产)孕妇与新生儿预防严重RSV的结果18。 膳食纤维对严重RSV感染的保护作用也由实验研究。 老鼠接受了饮食含有低聚糖开发对RSV的Th1保护性免疫反应19。 此外,其他研究表明,膳食纤维和SCFAs有保护作用的结果过敏和炎症性疾病和呼吸道感染的实验模型8,15,20.,21,22,23

在目前的研究中我们调查的保护作用机制与高可溶性纤维的饮食和SCFA生产RSV感染。 我们的研究结果表明microbiota-derived乙酸酯的抗病毒作用。 通过Gpr43激活,这种细菌代谢物调制1型反应肺上皮细胞从而保护对RSV感染。

结果

高频饮食预防RSV疾病减少病毒载量

老鼠控制饮食(CF; 与纤维素(ain - 93 m,美国营养学会、美国),或一个高纤维的饮食(高频),从柑橘含有纤维素和果胶244周,然后感染RSV鼻内(无花果。1)。 高频保护小鼠免受RSV-induced饮食减肥(图。1 b),同时也减少了肺病毒载量(无花果。1 c)。 高频饮食的数量显著降低总细胞在支气管肺泡灌洗液(BALF),主要归因于减少巨噬细胞(图。1 d)。 高频饮食也减少肺组织学炎症评分(无花果。1 e)和CD11c+CD86+细胞在腋窝淋巴结(无花果。1 f)。 没有显著的影响饮食CD8上被发现+CD69+CD62L或CD4+CD25+FoxP3+细胞在淋巴结(补充图。1,一个)。 高频的饮食也不改变细胞的模式出现在肺(补充图。1,B)。 证实纤维在预防RSV感染的重要性,也进行相同的实验和小鼠低纤维饮食(纤维素取代淀粉)。 老鼠低纤维饮食开发了一个更糟糕的RSV感染加重了体重和增加的损失数字BALF的炎症细胞在感染后相比,老鼠在CF或高频饮食(无花果。1克和h)。

图1
figure1

高纤维饮食能保护小鼠免受RSV-induced疾病。一个雌性BALB / c小鼠喂食了控制纤维(CF)或高纤维饮食(高频)四个星期之前和期间RSV感染。 在感染后的五天分析。b减肥后感染的比例相对于初始体重(0)(n= 9)。cRSV病毒载量检测肺组织的实时PCR(肺组织病毒复制/ g) (n= 9)。d总细胞数和微分细胞计数支气管肺泡灌洗液(BALF) (n= 9)。e代表图像的肺组织切片苏木精和伊红染色(圆))及其各自的炎症评分(n= 3)。 酒吧= 100μm规模。fCD11c的百分比+CD86+在腋窝淋巴结细胞(n= 6)。g,h雌性BALB / c小鼠喂食了控制纤维(CF)、高纤维(高频)或低纤维饮食(低频)四个星期之前和期间RSV感染。 分析在感染后的第五天。g减肥后感染的比例相对于初始体重(天0)。h总BALF中细胞数量(n= 5)。分析粪便微生物群组成的老鼠与CF和高频饮食在家庭层面(相对丰度)。jSCFA量化在结肠细胞腔的内容(毫克/克粪便)(n= 8)。k斯皮尔曼线性相关性病毒载量和醋酸的动物美联储量化控制和高纤维的饮食。 数据一个- - - - - -ej来自两个独立的实验。 所有数据都表示为±SEM和比较利用克鲁斯卡尔-沃利斯。 在其他情况下,使用Mann-Whitney。 *p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001。 数据b,c,d,g,h,j作为一个源数据文件提供吗

高频的饮食影响肠道微生物群的构成RSV-infected老鼠(补充图。2,得了)。 虽然没有统计学差异在门级或细菌多样性,我们发现的相对丰度的增加Lachnospiraceae spp。 (门壁厚菌门、类梭状芽胞杆菌)(无花果。1我和补充表1)。 Lachnospiraceae家族一直与SCFA生产有关25。 事实上,我们发现醋酸浓度增加与高频饮食的老鼠(无花果。1 j与病毒载量)和这个相关的负面肺(图。1 k)。 这些调查结果表明抑制高频RSV-induced疾病的饮食干预和建议醋酸的作用在这个保护。

微生物群对预防RSV感染至关重要

我们下一个探索微生物群和醋酸SCFA是否参与预防RSV感染。 饮用水中HF-diet-fed小鼠接受抗生素鸡尾酒RSV接种前3天(无花果。2)和破坏肠道微生物群的证实了抗生素治疗显著降低粪便细菌负荷(补充图。2,维)。 保护对减肥的高频饮食被废除当老鼠使用抗生素治疗(无花果。2 b)。 同样,减少肺病毒载量时没有发现老鼠使用抗生素治疗(无花果。2摄氏度),我们发现BALF中细胞总数增加,包括巨噬细胞和淋巴细胞(图。二维)。 抗生素治疗也增加了炎症细胞浸润肺(图。2 e)。 4倍减少醋酸浓度在结肠内容被发现抗生素5天后停止(无花果。2 f)。 丙酸和丁酸浓度也降低了抗生素治疗小鼠在一定程度上低于检测极限(补充图。2 e)。 醋酸补充antibiotic-treated小鼠减少体重损失造成的RSV感染(图。2 b)和部分恢复先前观察到的表型(如。 ,减少肺病毒载量(无花果。2摄氏度)和肺的炎症细胞浸润(无花果。二维e)]。 虽然我们不能排除其他机制参与保护观察高频饮食后,这些实验的数据支持的假设高频饮食预防RSV感染取决于保存肠道微生物群,其中乙酸是一种重要的中介作用。

图2
figure2

微生物群和醋酸高频饮食预防RSV感染至关重要。一个BALB / c小鼠喂食高频饮食四个星期之前和期间RSV感染。 三天前感染小鼠接受抗生素混合(Abx)饮用水。 乙酸在去除饮用水中管理abx治疗。 在感染后的五天分析。b感染后的体重损失的比例相对于初始重量(0)(n= 9)。cRSV病毒载量检测肺组织的实时PCR (/ g肺组织病毒副本)(n= 9)。d总细胞数和微分BALF中细胞计数(n= 9)。e代表图像的肺组织切片染色)和各自的炎症评分(n= 3)。 酒吧= 100μm规模。f醋酸量化在结肠细胞腔的内容(毫克/克粪便)(n= 5)。 数据来自两个独立的实验。 所有数据都表示为±SEM。 组是利用克鲁斯卡尔-沃利斯相比,除了在无花果。2 f对比组中,是使用Mann-Whitney测试完成的。 *p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001。 数据b,c,d,f作为一个源数据文件提供吗

乙酸治疗能保护小鼠免受RSV感染

醋酸是添加到饮用水之前感染,在某种程度上类似于实验与饮食(图。3)。 治疗RSV感染后引起体重下降较低(图。3 b肺病毒载量(图),一个被探测。3 c),降低BALF中细胞总数(无花果。3 d)和减少肺部炎症细胞(图。3 e)。 RSV-F蛋白质并没有检测到肺组织免疫组织化学分析预处理的醋酸,老鼠证实醋酸的保护作用与病毒感染(无花果。3 f)。 丙酸和丁酸盐预处理引起类似的保护作用(图。3 f)。 这些发现表明预防性SCFAs对RSV感染的影响。 我们也对小鼠醋酸的饮用水与鼻内同时RSV滴剂,为了测试一个可能的治疗效果乙酸(无花果。4)。 值得注意的是,醋酸保护老鼠对减肥引起的感染(无花果。4b)。醋酸开始显著减少病毒载量在感染后的第三天,最终在一个检测不到病毒载量的肺在5天(无花果。4摄氏度)。 治疗降低BALF中细胞数量,包括巨噬细胞和淋巴细胞数量显著减少(图4 d)。 因此,醋酸处理降低了肺部炎症评分(无花果。4 e),减少TNF-α和BALF中il - 10浓度增加(图4 f)。 乙酸治疗也减少IL-4-producing CD4 T细胞在肺和腋窝淋巴结,但同样减少IFN-γ——没有被观察到,IL-17a-producing-T细胞或FoxP3-positive细胞(图4 g h和补充图。3,C)。 CD11c没有发现显著差异+CD86+,和CD8+CD69+CD62L在腋窝淋巴结和肺(补充图。3 D醋酸和E)。我们还发现治疗由鼻内路线(感染后24 h)防止减肥和细胞招聘造成肺部感染(无花果。4我j)。

图3
figure3

SCFAs预处理能保护小鼠免受RSV感染。一个BALB / c小鼠,乙酸钠、丙酸钠或丁酸钠在无菌饮用水200毫米的最终浓度为3周之前和期间RSV感染。 在感染后的五天分析。b减肥后感染相对于初始体重百分比(0)(n= 5)。cRSV病毒载量检测肺组织的实时PCR (n= 5)。d总BALF中细胞数量(n= 5)。 E代表苏木精和伊红染色(圆))肺组织图片和其各自的炎症评分。 酒吧= 100μm规模。f免疫组织化学染色(包含IHC)使用一个anti-RSV融合蛋白抗体。 规模200μm酒吧。 表示为均值±SEM的结果。 没有检测到。 团体之间的统计学意义是由克鲁斯卡尔-沃利斯,除了c,Mann-Whitney被用来比较组。 *p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001。 数据b- - - - - -d作为一个源数据文件提供吗

图4
figure4

乙酸治疗能保护小鼠免受RSV感染。一个RSV感染BALB / c小鼠同时和200毫米醋酸处理饮用水。 在感染后的五天分析。b减肥后感染相对于初始体重百分比(0)(n= 9)。cRSV病毒载量测定24、48、72和120 h在肺部感染后检测到实时PCR (/ g肺组织病毒副本)(24、48和72小时,n= 5; 120 h,n= 9)。 未检测到ND =。d总细胞数和微分BALF中细胞计数(n= 9)。e代表图像的肺组织沾)及其各自的炎症评分(n= 3)。 酒吧= 100μm规模。f释放TNF-α和BALF中il - 10在感染后不同时间测量(n= 4)。gCD4 + il - 4 + T细胞比例在肺癌和其代表流式细胞仪配置文件(n= 6)。hIFNγ的百分比+,IL-17a+FoxP3 CD4 T细胞在肺。 代表流式细胞仪资料补充图3 A和B所示。,j雌性BALB / c小鼠感染RSV (107空斑形成单位/毫升)和醋酸在感染后24小时开始治疗通过鼻内路线(10毫米)。 治疗进行日常感染后5天。减肥后感染相对于初始体重百分比(0)(n= 5)。j总BALF中细胞数量(n= 5)。 所有数据都表示为±SEM。 数据b,c,d来自两个独立的实验。 团体之间的统计学意义是由克鲁斯卡尔-沃利斯,除了g,h,j,Mann-Whitney被用来比较组。 *p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001。 数据b,c,d,g,,j作为一个源数据文件提供吗

醋酸诱发IFN-1反应肺细胞

基于我们的研究结果,即高频饮食和醋酸处理减少IL-4-producing CD4 T细胞,我们测试是否T细胞介导的醋酸对RSV-induced疾病的保护作用。破布1−−/小鼠醋酸处理视图描述使用相同的协议一个。 乙酸治疗防止RSV-induced体重损失(无花果。5),减少肺病毒载量即使没有B / t淋巴球(无花果。5 b)和巨噬细胞的数量减少,中性粒细胞,BALF中细胞的总数(无花果。5度醋酸和d)。这些数据表明,有一个B / T-cell-independent对RSV感染的保护作用。

图5
figure5

乙酸治疗预防RSV感染T细胞的缺失。一个- - - - - -dRag1基因敲除小鼠(背景C57BL / 6)同时感染RSV和200毫米醋酸处理饮用水。 在感染后的五天分析。一个减肥后感染相对于初始体重百分比(0)(n= 8)。 Ctrl =未经处理的和未受感染的老鼠。bRSV病毒载量检测肺组织的实时PCR (/ g肺组织病毒副本)(n= 8)。c总细胞数和d微分(BALF细胞计数的c,n= 8;d,n= 5)。 所有数据都表示为±SEM。 数据来自两个独立的。 团体之间的统计学意义决心利用克鲁斯卡尔-沃利斯测试除了b使用,Mann-Whitney。 *p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001。 数据一个- - - - - -d作为一个源数据文件提供吗

我们假设醋酸直接对肺细胞抗病毒作用,由于其显著的影响在减少病毒载量的肺。 人肺上皮细胞(A549和MRC-5)服用醋酸在不同浓度和时间(6 h, 12 h(补充图。4,一个),或者24小时之前感染(补充图。4,A, B)或2 h与RSV感染后(补充图。4摄氏度))。 乙酸治疗前24小时保护细胞免受感染RSV引起的细胞死亡(图。6a和补充图。4、一个B和D),减少了RSV F蛋白的RNA水平和病毒空斑形成(图。6 b, cd和补充图。4,E, F和G),丙酸和丁酸盐也保护肺上皮细胞在体外(补充图。4,一个)。 我们在维洛细胞然后测试相同的治疗。 保护作用对RSV-induced细胞死亡并没有观察到在这个细胞株(补充图。5、模拟)。 因为维洛细胞含有一个突变,损害IFN-β的生产26醋酸,我们假设保护可以部分归因于诱导细胞因子。 为了验证这一点,我们测量IFN-βMRC-5的上层清液中醋酸和A549细胞,发现细胞治疗和感染RSV IFN-β水平(图的增量。6 e和补充图5、E)。 没有显著增加干扰素λA549细胞基因表达处理醋酸(补充图。5、F)。 醋酸没有保护CRISPR / Cas9-generated A459 1型干扰素受体敲除(Ifnar−−/从RSV-induced细胞死亡(图)细胞。6 f),并没有影响病毒的复制(无花果。6克,h和补充图5克)。 更好地理解醋酸的机制介导IFN-β生产,在这个过程中我们调查NF-kB的作用。 NF-κB信号转导通路中的一个重要的角色,认识到病毒核酸在RSV感染,可导致IFN-β的感应27,28。 我们首先研究了醋酸是否介导NF-κB激活我们发现治疗增加了核易位p65 A549细胞感染RSV(无花果。6我j)。 这一发现证实了免疫印迹结果中我们观察到增加p65核溶解产物acetate-treated和来华的细胞(无花果。6 k)。 预处理细胞NF-κB通路抑制剂(湾11 - 7085,不可逆抑制剂IκBα磷酸化)废除保护作用(无花果。6 l和m)。此外,IFN-β的诱导A549细胞是依赖NF-κB激活(图。6 n)。 这些发现表明,乙酸对RSV感染的体外保护作用是由IFN-βIFNAR订婚,这与NF-κB激活机制。

图6
figure6

乙酸治疗肺细胞介导IFN-β反应线减少病毒载量。一个- - - - - -d醋酸A549细胞预处理与260年µM 24 h和感染RSV 96 h。一个百分比的π(碘化propidium)阳性细胞流式细胞仪探测到。b使用实时PCR (2 RSV RNA水平检测-ΔCt)。c量化的RSV微升。d代表图像的病毒滴定分析表明病毒空斑。 使用anti-RSV抗体溶解板进行滴定。eIFN-β上层清液中蛋白质含量的A549细胞预处理与260年µM醋酸24 h和感染RSV进一步24小时。f细胞的可行性A549 WT A549Ifnar1流式细胞仪使用π- /评估。g使用实时PCR (2 RSV RNA水平检测-ΔCt分析)。h量化的RSV PFU化验。量化的易位NF-kB p65亚基在A549细胞预处理与260醋酸µM 24 h和感染2 h (n= 2第六的实验)。j的荧光图像NF-kB p65(绿色-一个)并使用DAPI细胞核(蓝色-B)。 面板C显示数据co-localization(合并)。 酒吧= 20µm规模。k免疫印迹分析NF-kB p65细胞质和核溶解产物。 细胞质蛋白质乐队被β-actin规范化和核乐队被PCNA规范化。 L-N A549细胞预处理的1 h和2µM湾11 - 7085。 细胞治疗260µM醋酸24 h和感染。l通过MTT测定细胞生存能力评估。使用实时PCR RSV RNA水平检测。nIFN-β蛋白质含量检测的ELISA文化上层清液感染后24小时。 所有数据都表示为±SEM。 数据一个,f,h,从3实验一式四份的意思。 数据b,g,l,从两个实验第六的意思。 *显著差异相对于ctrl; 相对于RSV #显著差异。 统计学意义与克鲁斯卡尔-沃利斯决心,除了b,c,g,h,Mann-Whitney。 *p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001。 数据一个,b,c,e,f,g,h,,k,作为一个源数据文件提供吗

醋酸预防RSV IFNAR-dependent方式

我们最初测试IFN-β生产醋酸的可能作用,发现增加的表达Ifnb1,但不Ifna1肺的RSV-infected小鼠醋酸处理相比,治疗RSV-infected老鼠感染(图3和5天后。7一个和补充图6)。 我们发现增加浓度BALF和肺部的IFN-βacetate-treated小鼠感染后(图72和120 h。7 b醋酸和c)。治疗也引起IFN-1刺激基因的表达(isg),Oas1Isg15(无花果。7 d)。 确认醋酸在肺上皮细胞诱导IFN-β生产,我们执行一个体外测定。 我们从天真的老鼠和收集新鲜肺上皮细胞培养。 细胞与醋酸预处理的24 h,然后RSV感染另一个24小时。 乙酸治疗增加IFN-β生产(以文化上层清液),以及Ifnb1表达比较摘要RSV-infected细胞(图。7 e)。 此外,上皮细胞(CD45-CD326+),白细胞(CD45+CD326)排序分离肺的老鼠接受醋酸和感染RSV的表达进行分析Ifnb1。 在无花果。7 f、醋酸处理增加了这种基因的表达在上皮细胞,但不是白细胞的隔间。 没有显著区别干扰素和isg lambda表达式(补充图。6B和C)。这些发现证实了这一事实,我们没有发现任何体外或体外效果IFN-β生产醋酸的肺泡巨噬细胞(图7 g)。 高频饮食诱导IFN-α和IFN-β生产(补充图。6 d和E)。与我们的体外数据一致,乙酸对RSV感染的保护被废除在缺乏1型干扰素受体(Ifnar−/−)体内。 没有发现显著差异在身体减肥(图。7小时)、BALF中细胞总数(补充图6 f),肺病毒载量,在肺病毒效价(无花果。7我j和补充图。6克),或肺部炎症评分(无花果。7 k和补充图6小时)之间的/ Ifnar−−小鼠醋酸处理或车辆。 此外,在缺乏受体的情况下,醋酸无法导致肺部(图病毒清除。7 l)。 在DCs没有变化,CD8 T, T reg细胞群被发现(补充图6我醋酸和J)。这些数据确认预防RSV感染是依赖的存在Ifnar它是由IFN-β在肺上皮细胞。

图7
figure7

醋酸预防RSV感染IFNAR-dependent地。 雌性BALB / c小鼠接受200毫米醋酸在饮用水和感染RSV (107空斑形成单位/毫升)24、48、72和120 h。一个 Ifnb1基因表达在肺部感染后不同时间点检测(2-ΔCt分析实时PCR) (n= 5)。bIFN-β蛋白质检测BALF或肺匀浆c在感染后不同时间点(n= 5)。d Oas1Isg15基因表达在肺(2-ΔCt分析实时PCR) (n= 5)。e肺上皮细胞从女性天真的BALB / c小鼠醋酸处理(260µM) 24 h,然后感染RSV (104空斑形成单位/毫升)进一步24小时检测IFN-β生产(ELISA)和Ifnb1表达式(褶皱变化比未经处理的/未感染控制)(n= 4动物的一式四份的意思)。f Ifnb1CD45的表达+CD326-和CD45-CD326+排序的老鼠细胞肺acetate-treated RSV-infected 72 h (n = 5)。gIFN-β肺泡巨噬细胞生产的鼠标未经处理或处理饮用水中醋酸(200毫米)5天与RSV感染体外(104空斑形成单位/毫升)24 h (n= 6)。 门的策略,预先和post-sorting面板补充图所示。9h- - - - - -l野生型和Ifnar- / -小鼠同时RSV感染和200毫米醋酸处理饮用水中。 分析在感染后的第五天。h减肥后感染相对于初始体重百分比(0)(n= 8)。RSV病毒载量检测肺组织的实时PCR (/ g肺组织病毒副本)(n= 8)。j在肺病毒效价(pfu / g肺组织)(n= 5)。k肺组织学炎症评分(n= 3)。l免疫组织化学染色RSV的肺组织部分。 所有数据都表示为±SEM。 数据来自两个独立的实验。 团体之间的统计学意义与克鲁斯卡尔-沃利斯决心,除了e使用,Mann-Whitney。 *p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001。 数据一个,b,c,d,f,h,,j作为一个源数据文件提供吗

IFNAR1rs2257167 C等位基因保护严重的RSV疾病

评估的重要性Ifnar在RSV感染,我们查询NIEHS TagSNP数据库来识别TagSNP提供足够的基因覆盖(补充图。7)。IFNAR1SNP基因分型结果rs2257167被选为儿童的DNA样本的病例对照研究和健康足月的婴儿(< 1岁)呈现与毛细支气管炎(n= 401)29

详细的临床和人口数据曾被描述29。 感兴趣的表型是临床定义为“严重”或“轻微”RSV疾病和作为两个因变量。 估计小等位基因频率(加)IFNAR1SNP rs2257167 0.2288(位于染色体21:33343393)是在1000年的人口基因组。 在我们的研究人群中,整个加器为0.2687,在RSV-positive患者的子总体中(n= 401),加器为0.2681(补充表2)。 我们假设三个潜在影响功能的SNP与逻辑回归模型和测试这些。 我们发现所有模型显著关联(补充表进行测试3.)。 在测试中变异的影响,我们发现优势比分别为0.5932和0.3549的“主导模式”和“隐性模式”的95%置信区间[0.3966,0.8874]和[0.1694,0.7437],分别。 因此,变体C (Leu168)是预防严重疾病的个体感染RSV。 将母乳喂养增加基因的影响在所有三个模型(p值分别为0.0014、0.0098和0.0054,分别)。

GPR43对醋酸预防RSV至关重要

鉴于g蛋白耦合受体的重要性(即。 、GPR41 GPR43和GPR109a) SCFA反应16,我们研究了醋酸的抗病毒效果是否被激活这些受体介导。 肺上皮细胞系MRC5 A549表达Gpr43,Gpr41,Gpr109A(补充图。8)。 可以激活,GPR41 GPR43,醋酸。 考虑到这一点,我们重复了体外实验使用有效和选择性GPR43-synthetic受体激动剂30.。 GPR43受体激动剂引起相同的模式与醋酸反应观察。 它保护细胞免受感染(无花果。8b负载(图),降低了病毒。8 c)和诱导IFN-β(无花果。8 d),但在一个更早的时间点比醋酸(12小时)(图8 d)。 按照我们之前的结果,合成受体激动剂IFN-β生产的影响依赖于NF-kB激活(图。8 d)。 这些发现表明,GPR43可能占IFN-β生产醋酸在细胞治疗。

图8
figure8

具体的激活GPR43防止体外RSV感染。 A549细胞治疗260µM醋酸或GPR43-synthetic受体激动剂(10µM 4-CMTB) 24 h,然后感染RSV (104空斑形成单位/毫升)。 四天后响应参数进行了分析。一个细胞的生存能力是通过MTT测定访问。b细胞死亡的百分比由π染色。cRSV RNA水平检测使用实时PCR(2-ΔCt分析)。d浓度的IFN-β细胞在感染后上层清液12 h被ELISA检测。 所有数据都表示为±SEM。 数据一个b一式四份的意思是两个实验。 数据cd是一个实验的第六的意思。 统计学意义与Krukal-wallis决定。 * *p< 0.01,* * *p< 0.001。 数据b- - - - - -d作为一个源数据文件提供吗

进一步调查GPR43在醋酸的作用效果,我们重复的体内实验Gpr43−−/图中描述的老鼠使用相同的协议。4。 醋酸保护缺乏GPR43 RSV-induced疾病被废除。 没有acetate-treated和对照组之间的差异Gpr43−−/老鼠身体减肥(无花果。9肺(图),病毒载量。9 b)和BALF中细胞结构(图9 c),这些老鼠也没有保护授予醋酸对炎症(补充图8 b)。 醋酸抗病毒效应也废除这些老鼠(无花果。9 d)。 此外,醋酸诱导Ifnb1,Oas1,isg15基因表达(图。9 ef(图)或增加IFN-β生产。9克)Gpr43−−/老鼠。 来验证是否失去保护作用的醋酸是由于对上皮细胞的影响,我们做了相同的体外分析上述使用肺上皮细胞从C57BL / 6野生型和孤立Gpr43−−/老鼠。 这表明,乙酸处理鼠标上皮细胞免受病毒引起的细胞死亡并没有废除了这一效应GPR43(无花果。9小时)。 醋酸IFN-β的感应很明显当使用WT鼠肺上皮细胞,但当实验进行缺席Gpr43−/−细胞(图。9我)。 这种反应被发现使用合成GPR43受体激动剂代替醋酸(补充图8C)。 符合这些结果使用醋酸的鼻内路线管理,我们发现增加三倍IFN-β水平落下帷幕在感染后24 h(无花果。9 j)。 同样的实验是重复GPR43缺陷小鼠,但没有区别对待和控制(图中被发现。9 k)。 这些数据表明,乙酸对RSV抗病毒活性,其中包括IFN-I生产的感应,也由GPR43激活。

图9
figure9

GPR43醋酸保护RSV-induced疾病是必要的。一个- - - - - -gGpr43 (g蛋白耦合43)受体基因敲除小鼠C57BL / 6(背景)和控制(WT) RSV感染和200毫米醋酸处理饮用水。 在感染后的五天分析。一个减肥后感染比例相对于原始重量(0)(WT,n= 6;/ Gpr43−−,n= 9)。bRSV病毒载量检测肺组织的实时PCR(肺组织病毒复制/ g) (WT,n= 6;/ Gpr43−−,n= 9)。c总细胞数和微分BALF中细胞计数(WT,n= 6;/ Gpr43−−,n= 8)。d免疫组织化学染色RSV的肺组织部分。e信使rna的表达Ifnb1肺(2-ΔCt分析)(WT,n= 6;/ Gpr43−−,n= 8)。f信使rna的表达Oas1Isg15基因在肺(2-ΔCt分析)(WT,n= 6;/ Gpr43−−,n= 8)。gIFN-β蛋白质含量检测BALF或肺匀浆(WT,n= 4;/ Gpr43−−,n= 6)。h,从女性C57BL / 6野生型和肺上皮细胞/ Gpr43−−小鼠醋酸处理260µM 24 h,然后感染RSV (104空斑形成单位/毫升)24小时或4天。h通过MTT测定细胞生存能力评估。 控制治疗/未显示为虚线。IFN-β水平在上层清液的主要发现老鼠的肺细胞文化(n= 4动物的一式四份的意思)。j,k,女C57BL6野生型/ Gpr43−−老鼠感染RSV (107空斑形成单位/毫升)24 h,然后处理醋酸通过鼻内路线(10毫米)。 24小时后收集肺由ELISA检测IFNβ生产和加工。 所有数据都表示为±SEM。 数据一个- - - - - -g来自两个独立的实验。 集团决心与克鲁斯卡尔-沃利斯之间的统计学意义。 *p< 0.05,* *p< 0.01,* * *p< 0.001。 数据一个,b,c,f,g,作为一个源数据文件提供吗

为了更好地理解基因的贡献的潜力Ifnar1Gpr43(Ffar2)对RSV的回应,我们搜查了杰克逊实验室老鼠现象学数据库信息SNPs在与RSV-induced表型相关的基因以确定他们是否确认在之前研究30近交品系的老鼠31。 为分析,被认为是次要的等位基因snp一定是出现在≥10%的表现型近交品种。 一个非同义SNP rs31418313编码(A / G)Ifnar1导致一个精氨酸组氨酸替换在274氨基酸残基明显(P< 0.05)与更大的多形核白细胞(中性粒细胞)的意思是数字矿山和%的体重比株小鼠与野生型等位基因(补充表4)。 一个非同义SNP rs47500117编码(T / G)Gpr43导致一个异亮氨酸亮氨酸替换在291氨基酸残基显著(P< 0.05)与更大的矿山总蛋白(上皮通透性的一个标志)菌株与野生型小鼠相比,T等位基因(补充表4)。 最后,我们发现另一个Gpr43非同义SNP rs236386097编码(T / C; 甲硫氨酸,缬氨酸,剩余298)与显著相关(P< 0.05)落下帷幕总更多的细胞,单核细胞,蛋白质以及上皮内细胞粘液的菌株C等位基因比野生型菌株(T等位基因)。 这些结果证实IFNAR的重要性和GPR43 RSV感染的潜在作用进一步调查并提供理由同源候选人实用snp的人群。

讨论

我们确定了醋酸截然不同的机制,一个microbiota-derived代谢物,影响免疫反应在病毒感染的肺。 醋酸防止RSV-induced疾病通过改善1型干扰素反应和增加干扰素刺激基因表达在肺上皮细胞,通过一个机制,包括GPR43膜受体的激活。 这些发现强调了相关性的肠道微生物群和相关代谢物non-intestinal炎症和感染状况。 我们的数据也支持使用的概念高纤维饮食,富含纤维的公式甚至醋酸作为廉价的干预措施预防和治疗毛细支气管炎的RSV引起的。

林奇et al。(2018)展示了一种肠道菌群与丙酸的作用,早期预防毛细支气管炎和哮喘的发展成年老鼠21。 在我们的研究中,我们发现了一个类似的预防效果与丙酸口服补充后,乙酸、丁酸之前RSV感染。 有趣的是,我们也发现有利影响当治疗小鼠醋酸通过口服途径同时感染和鼻内感染后24小时。 这一结果表明,乙酸治疗RSV感染可能是有用的。 林奇与et al . (2018)21表明丙酸的保护效果是依赖T reg细胞,乙酸的影响在我们的研究涉及T-cell-independent机制。 我们发现醋酸调制IFN-β响应人类肺细胞在体外和体内的肺RSV-infected老鼠。 这种机制是相关的醋酸赋予的保护因为我们发现这种效应对RSV感染废除在缺乏1型干扰素受体(IFNAR)的体内和体外。 先前的研究已经描述的功能IFN-β在RSV感染32,33,34。 此外,微生物群的重要性IFN-1的生产35,预防呼吸道病毒感染已经被证明20.,36,37。 这里我们建立精确的分子途径的肠道微生物群作用抗病毒反应由醋酸生产和感应IFN-β肺部IFNAR订婚。

IFN-1通常分泌后病毒识别和结合IFNAR 1或2,并启动信号级联,JAK / STAT通路、isg诱发转录直接抗病毒活性38。 IFNAR1有独特的细胞外four-domain架构组成的子域SD1 SD4,而IFNAR2只有两个39。 I型受体的亲和力IFN-beta是高于其他1型干扰素是最强有力的受体的激活。 在协议相关的角色IFNAR醋酸的保护作用,我们发现乙酸治疗诱导的转录特征明显抗病毒isgOas1(编码oligoadenylate合成酶)和Isg15RSV-infected肺的老鼠。 编码的蛋白质,Oas1已经被证明可以减少RSV复制40醋酸,这种机制可以解释的影响。 赋予的抗病毒活性酯治疗没有预防RSV感染,所展示的存在类似的病毒载量控制和acetated-treated老鼠的肺感染后24 h,但令人印象深刻的和一致的减少造成较长时间(即后这个参数。 、72和120 h(感染)。

I型干扰素的生产在RSV感染必须仔细平衡,减少病毒载量不允许过度肺细胞浸润。 我们发现醋酸调制1型干扰素反应肺上皮细胞,在口腔和鼻内治疗。 我们假设这个醋酸的影响可能会直接影响上皮细胞克服病毒抑制机制,按照IFN-I通路。 RSV NS蛋白可以抑制IFN-β生产相关的若干途径和信号包括RIG-141,IRF342,STAT243,同时增加miR-24抑制IFNAR的表达44。 肺泡巨噬细胞提出I型干扰素的主要来源,是重要的招募炎症单核细胞肺从而减少疾病严重程度34。 然而,我们没有发现巨噬细胞产生乙酸1型干扰素的回应; IFN-b的主要来源在我们研究肺上皮细胞。 巨噬细胞是抗RSV描述复制,不会导致病毒颗粒的生产。 这可能会导致这些细胞的敏感性降低的影响RSV NS蛋白是一种天然抑制剂1型反应45。 Goritzka, m . et al . 2015建议在他们的研究中,肺上皮细胞并不1型干扰素的主要来源甚至被RSV感染的普遍目标由于RSV NS蛋白阻塞1型干扰素的生产34。 醋酸对上皮细胞可能有直接影响,克服,至少部分RSV NS蛋白的病毒抑制机制作用于IFN-I通路,醋酸和可能的原因提出了它的影响在上皮细胞和巨噬细胞。

与我们的研究结果一致/ Ifnar−−老鼠,确认IFNAR在RSV感染的重要性,我们发现IFNAR1rs2257167 C等位基因(缬氨酸,亮氨酸替换SD2域)与RSV-positive婴儿预防严重疾病。 的IFNAR1 SD2 SD3接口包含一个铰链中心协调运动对配体参与的两半46,47。 结构建模显示更大的亮氨酸残基与更好的包装提供了一个稳定的构象疏水性SD2腔39。 虽然它不驻留在SD2/3界面,Leu168可能重新定位关键氨基酸配体结合枢纽地区可能会改变IFNAR1信号。 虽然我们只能推测这种变体的功能影响,婴儿与Leu168可能改变IFNAR1动力学,通过改善配体结合或IFN-β招聘,授予保护RSV疾病。 重要的是,IFNAR1rs2257167突变是在强大的连锁不平衡intronic近端和远端启动子单核苷酸多态性与病毒感染有关39,48,49。 Val168Leu替换位于第三β链IFNAR1 SD2域和与病毒有关病原体如乙型肝炎病毒(HBV)和人类免疫缺陷病毒(HIV / AIDS)39,49,50。 我们还发现母乳喂养增加了C等位基因的遗传效应与保护严重的疾病。 虽然母乳喂养婴儿的肠道醋酸含量增加51短链脂肪酸的参与和饮食的遗传保护IFNAR1多态性是未来研究的重点。

除了调制IFN-I生产乙酸治疗降低了招聘的炎症细胞,包括巨噬细胞和淋巴细胞小鼠的肺,和减少Th2和树突状细胞激活后的淋巴结RSV感染5天。 这种效应可能继发于病毒复制的减少,在一定程度上,反映了炎症介质的变化,观察TNFα和il - 10生产acetate-treated老鼠。 这些效应可能与醋酸的很好的描述pro-resolution效应有关15并可能部分解释支气管肺泡组织的维护。 ISG15与il - 10的生产52,这也可以为抗炎效应在我们的模型中观察到。 此外,醋酸和其他SCFAs丁酸和丙酸被描述在激活作用和免疫细胞的功能8,13,53,54,55

我们获得的数据Gpr43−−/老鼠这种受体参与RSV响应特征的表型。 乙酸被激活GPR43,受体表达在不同细胞的膜包括上皮细胞56。 这种受体首先表现为炎症性疾病如结肠炎的上下文9,它的激活了减弱炎症和调解SCFAs在结肠内的保护作用。 之后,这种受体的作用的代谢和传染病也证明57,58,59,60。 这里我们展示的重要性GPR43 IFN-b生产期间RSV感染小鼠醋酸处理。 Trompette et al . 2018年展示了丁酸盐受体的作用,GPR41,在流感感染23。 根据我们的研究,我们假设醋酸激活GPR43肺,从而诱导IFN-β生产和isg表达在上皮细胞对RSV感染的保护。 我们不能排除这种可能性,口服醋酸也激活GPR43其他组织包括肠道上皮细胞或免疫细胞,这可能间接导致IFN-β生产由肺细胞。 一项研究表明,由GPR43 NF-κB是其中一个途径61,也NF-κB 1型干扰素反应的是一个重要的中介28。 我们发现NF-κB乙酸是重要的调节IFN-β反应肺上皮细胞通过GPR43参与。 此外,我们发现更大的敏感性RSV-induced疾病表型丧失snp的老鼠的菌株Ifnar1Gpr43相比近交品系的小鼠与野生型等位基因。 这些结果符合这两个基因的保护作用的响应RSV感染的老鼠。

我们发现HF-diet-fed老鼠增加了肠道细菌的组成部分Lachnospiraceaespp,通常在一个细菌的家庭隔绝人类肠道微生物群,包括从婴儿在生命的第一年62。 一项研究显示下降Lachnospiraceae家庭RSV感染小鼠后63。 增加大量的这个家庭也被报道在其他研究中可发酵的纤维添加醋酸与血清水平的增加有关64

总之,我们的数据显示一个机制来预防RSV感染醋酸,来源于肠道菌群代谢产物诱导IFN-β肺和保护的机制是由GPR43 IFNAR。 这种机制可能也为防止其他病毒感染有关。

方法

病毒

费尔南多博士提供的RSV A2应变是好心的波兰人,Fundacion婴儿,阿根廷。 病毒点状单位(PFU)被确定使用anti-RSV抗体(美国微孔,Billerica的)。

动物和RSV感染

雌性BALB / c,男性和女性1型干扰素受体缺陷(Ifnar−−)129 / Sv,野生型129 / Sv,女Rag-1不足(Rag1−−),女GPR43量不足(Gpr43-/-岁)和C57BL / 6小鼠,所有6 - 8周,被用于这项研究。 老鼠被安置在动物设施研究所的生物学、坎皮纳斯大学。 所有动物程序按照协议进行动物伦理委员会的批准由(协议4022 - 1和4599 - 1)。 RSV感染,老鼠和5%异氟烷麻醉和鼻内感染107空斑形成单位/毫升的RSV A2应变。 所有的动物每天都重。 感染后的数据分析进行了5天或表示。 支气管肺泡灌洗液(BALF)收集并左肺切除后与福尔马林灌注组织病理学和免疫组织化学分析。

饮食和SCFA治疗

老鼠与高纤维饮食(高频)或控制饮食(CF)在感染前4周。 饮食都是基于AIN93M(美国营养学会、美国)和补充表中给出了详细的成分5。 在另一项实验中,高纤维饮食小鼠接受抗生素卡那霉素组成的混合(0.4毫克/毫升)、庆大霉素(0.035毫克/毫升),甲硝哒唑(0.045毫克/毫升),万古霉素(0.045毫克/毫升),和粘菌素(0.035毫克/毫升)稀释饮用水的3天前感染。 所有的抗生素都从Sigma-Aldrich购买。 老鼠给SCFAs之一,乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在无菌饮用水的最终浓度200毫米3周前RSV感染和显示在所有实验示意图表示。 另一个SCFA治疗与感染的同时开始执行最终的浓度。 水量消耗每天测量,没有发现水摄入的差异之间的组织。

支气管肺泡灌洗液(BALF)

通过腹膜内施用氯胺酮(0.4mg / g)/甲苯噻嗪(0.2mg / g)溶液麻醉小鼠,并将气管插管。用RPMI 1640培养基洗肺两次。离心BALF,收集上清液用于细胞因子分析,悬浮颗粒用于总细胞和差异计数和流式细胞术。对于差异细胞计数,将细胞离心涂片用May-Grunwald-Giemsa TM染色,并由经验丰富的研究人员以盲法进行计数。


组织病理学和免疫组织化学分析

将左肺包埋在石蜡块中,切成4-μm切片,用H&E染色或提交用于抗原恢复并随后用抗RSV F蛋白抗体(Millipore,MA,USA)标记。以盲法进行载玻片分析。根据Barends等[65]对支气管周围和血管周围炎症进行评分,如不存在(0),最小(1),轻微(2),中度(3),显着(4)或严重(5)。


病毒载量定量

提取总肺RNA并使用GoScript逆转录酶(Promega)合成互补DNA(cDNA)。使用所示特异性引物和探针进行RSV F蛋白基因的扩增:正向引物-5'-AACAGATGTAAGCAGCTCCGTTATC-3',反向引物-5'-GATTTTTATTGGATGCTGTACATTT-3'和探针-5'FAM / TGCCATAGCATGACACAATGGCTCCT-TAMRA / -3'通过实时PCR。合成引物序列并克隆到pUC57质粒(GenScript,Piscataway,NJ,USA)中,进行10倍稀释并产生用于计算病毒载量的标准曲线。从病毒拷贝获得的值(基于质粒对照的浓度)相对于预先称重的肺部分的重量(每克肺的拷贝数)计算。


流式细胞术

将来自肺或腋窝淋巴结的分离的细胞与小鼠Fc块(#553141 BD Biosciences)一起孵育20分钟,然后用表面抗体抗CD11c(1:100,#561241,克隆HL3),抗I-Ad染色。 / I-Ed(1:200,#558593,克隆2G9),抗CD86(1:100,#553691,克隆GL1),抗CD8(1:100,#561092,克隆53-6.7),抗 - CD4(1:200,#553046,克隆RM4-5),抗CD25(1:100,#552880,PC61)和抗CD62L(1:100,#553152,克隆MEL-14)(BDBiosciences®) )。对于细胞内染色,细胞用cytofix / cytoperm(BDBiosciences®)固定,并用抗-IL-4(1:50,#562045,克隆11B11)(BDBiosciences®),抗FoxP3(1:50,#)染色。 72-5775,克隆FJK-16s),抗-IFNγ(1:50,#RM9001,克隆XMG1.2)(eBioscience)和抗-IL-17a(1:50,#506939,克隆TC11-18H10.1) )(BioLegend)抗体。在Gallios(Beckman Coulter)和BD FACS Verse(BD Biosciences)流式细胞仪上分析样品。使用FlowJo软件(版本10,Tree Star Inc.,MA,USA)分析数据。


微生物组分析

在无菌条件下收获来自喂食高纤维或对照饮食并感染RSV的小鼠的粪便。将样品储存在-80℃。使用QiaAMP DNA Stool Mini Kit(Qiagen,Hilden,Germany)根据制造商的说明分离细菌DNA。使用选择的引物扩增DNA,所述引物用Phusion DNA聚合酶覆盖细菌16s rRNA的V4区域(16S Amplicon PCR Forward Primer = 5'TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG 16S Amplicon PCR Reverse Primer = 5'GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC)。使用Nextera XT指数用磁珠捕获试剂盒(AMPure XP; Agencourt)纯化扩增子,并按照Illumina方案标准化。使用v2 500循环试剂盒(Ilumina,CA,USA)在Miseq平台上进行16s rRNA基因标记的测序,其产生配对末端读数(2×250bp)。分析管道采用基于系统发育和对齐的方法来最大化数据分辨率。基于在文库生成期间通过PCR添加的独特分子条形码对读取对进行解复用,然后使用USEARCH v7.0.109066进行合并。随后的分析步骤利用了贝勒医学院Alkek宏基因组学和微生物组研究中心(CMMR)开发的定制分析软件包,以生成汇总统计和质量控制测量。这使得能够表征大量样品和样品组中的微生物群落。使用UPARSE算法将16个Sv4 rDNA序列聚类成操作分类单位(OTU),相似性截断值为97%。随后将OTU映射到SILVA数据库67的优化版本,该数据库仅包含来自16S rRNA基因的V4区域的序列以确定分类法。通过将解复用的读取映射到UPARSE OTU来恢复丰度。使用自定义脚本从前两个步骤中生成的输出文件构建OTU表,以使用也在CMMR(ATIMA,用于敏感微生物分析的敏捷工具包)开发的可视化工具包进行下游分析。 ATIMA是一种用于分析和可视化微生物组数据集的独立工具。该软件提供了一个集成的解决方案,用于探索微生物群落与其宿主或环境的紧急属性之间的关系。


SCFAs量化

结肠细胞腔的内容样本是从老鼠和用于测量SCFAs,协议类似于由研究员等。70样本加权、粉碎、均质在水里。 氯化钠、柠檬酸、盐酸和丁醇被添加到样本,这是涡离心机和上层的收集。 校准曲线与0.015 - -0.1毫克/毫升SCFAs用于量化。 色谱分析使用气相色谱仪光谱仪(模型GCMS-QP2010超; 日本岛津公司)和熔融石英毛细管Stabilwax列(Restec公司(美国)维度的30米×0.25毫米内直径(证件)和涂上一层厚0.25 -µm聚乙二醇。 样本(1µL)被注入在250°C使用分流比约为25:1。 高档纯氦(他)作为载气与一个常数1.0毫升/分钟的流量。 质量条件如下:电离电压,70电动汽车; 离子源温度、200°C; 全扫描模式在35 - 500质量范围为0.2 s /扫描速度。 每个分析运行时为11.95分钟。

肺细胞分类

左肺从小鼠醋酸RSV感染和治疗后收获72 h。 肺立即被提交给胶原酶IV(1毫克/毫升)协议和总细胞消化沾anti-mouse CD45 FITC(1∶# 553080,克隆30-F11) (BD生物科学®)和anti-mouse CD326 (EpCAM) PE-Cy7(1:10 0, # 25-5791-80,克隆G8.8) (eBioscience)抗体为30分钟。 细胞被收购在BD FACSAria流式细胞分析仪(BD生物科学®),在两个不同人群分类:CD45+CD326(白细胞、淋巴细胞)和CD45CD326+(上皮细胞)。 种群的分离之后,细胞被离心机,悬浮在试剂盒(热费希尔科学)和加工RNA提取和互补脱氧核糖核酸的合成。 的Ifnb1表达式是由如下所述。

1型干扰素的分析

肺cDNA(形成的如上所述)是用来确定IFN-α和IFN-β相对表达水平对TaqMan试验(Mm03030145_gH使用引物和探针Ifna1,Mm00439552_s1Ifnb1热费希尔科学)和鼠标β-actin (Mm02619580_g1 Actb)作为一种内源性基因的控制。 研究小组访问表达式使用以下引物组:Oas1(正向引物:5“-AAAAGGAGGAGCCATGGCAGT-3”反向引物:5“-CTGAGCCCAAGGTCCATCAG-3”);Isg15(正向引物:5“-GAGCTAGAGCCTGCAGCAAT-3”反向引物:5“-TCACGGACACCAGGAAATCG-3”); 和B2M(正向引物:5“-CCCCAGTGAGACTGATACATACG”反向引物:5“-CGATCCCAGTAGACGGTCTTG”)。 PCR条件后GoTaq™探针qPCR大师混合(Promega™,麦迪逊,WI,美国)或者SYBR绿色/混合火箭qPCR主协议(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。 量化的基因表达进行了使用StepOne™(应用生物系统公司)。 ΔΔCt或2-ΔCt分析是用来计算基因表达。 IFN-αIFN-β蛋白质水平量化在BALF上层清液使用干扰素α/β干扰素2-Plex鼠标ProcartaPlex™面板分析工具包(表达载体,热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)。 化验进行根据制造商的指示和阅读MAGPIX b350复用工具(美国默克密理博,Billerica的)。

细胞系

人类腺癌肺泡上皮细胞(A549 -写明ATCC ccl - 185),人类胚胎肺成纤维细胞(写明ATCC ccl - 171)分部MRC-5提取从非洲绿猴肾上皮细胞(写明ATCC ccl - 81)分部州立和A549Ifnar1−−/细胞提供的请博士丹尼尔·曼苏尔在DMEM培养低葡萄糖(Gibco™,热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)都补充10%的热灭活胎牛血清(的边后卫)(Cultilab,坎皮纳斯、SP、巴西)。 所有的细胞都检测支原体污染。

体外SCFA治疗

维罗,MRC-5 A549和A549Ifnar1−−/细胞与醋酸钠预处理(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在不同浓度(60、120、200和260μM) 6、12、24小时细胞在DMEM包含10%的边后卫和感染了104空斑形成单位/毫升的RSV的新媒介。 另外,细胞治疗与SCFA RSV感染后2 h。 96 h后细胞生存能力是决定使用MTT试验或propidium碘(PI)染色使用流式细胞仪。 病毒载量测定通过实时PCR(如上所述)和病毒空斑实验。 此外,MRC-5和A549和丙酸和丁酸钠预处理同样如上所述。

免疫印迹分析

A549细胞,培养在six-well盘子,预处理与醋酸260μM 24 h,然后感染104空斑形成单位/毫升的RSV 2 h。 细胞收获和胞质蛋白提取使用一个特定的缓冲区(10毫米玫瑰; EDTA氯化钾pH值7.5,10毫米,0.1毫米,1毫米二硫苏糖醇(德勤),诺乃清洁剂检测40 0.5%,0.5毫米PMSF和蛋白酶抑制剂的鸡尾酒)其次是核蛋白质提取(20毫米玫瑰(pH值7.5),400毫米氯化钠,EDTA 1毫米,1毫米德勤,1毫米PMSF和蛋白酶抑制剂的鸡尾酒)。 蛋白质样本10% sds - page分离聚丙烯酰胺凝胶和转移到硝酸纤维素(Bio-rad)。 后膜沾NFκB p65 (F-6)单克隆抗体(施用# sc - 8008年,圣克鲁斯生物技术),鼠标β-actin单克隆抗体(1:20 00 # A2228 Sigma-Aldrich)或鼠标PCNA单克隆抗体(摘要,# NCL-L-PCNA Novocastra),其次是二次染色的1:1000兔子anti-Mouse免疫球蛋白(H + L)合抗体(# 61 - 6520,ThermoFisher科学)。 膜阻碍执行和抗体稀释步骤中使用5% (v / v)脱脂牛奶1 x PBS,并与Tween-20洗涤步骤执行。 西方的屁股被可视化增强化学发光(GE Lifescience)。 量化的乐队,ImageJ软件使用。 β-actin(细胞质蛋白质)和PCNA(核蛋白质)被用来量化规范化蛋白质。 吸干uncropped版本可以在源数据文件。

病毒空斑实验

A549和MRC-5细胞,培养在six-well盘子,预处理与醋酸260μM 24 h,然后感染104空斑形成单位/毫升的RSV 96 h。 细胞被收获,提交冻融,然后接种到维洛细胞单层膜。 病毒空斑形成单位确定使用anti-RSV (1:1000 # AB1128,微孔,Billerica,妈,美国)抗体后4天。

老鼠主要细胞培养

获取肺细胞,从天真的老鼠收获,左右肺片切成三块,被酶消化1 x胰蛋白酶为1小时37°C。 完整的消化后,10%的边后卫DMEM培养基培养细胞24 h,然后一个新鲜的培养基是交换另一个48 h。 第一和第二段之间的所有实验的细胞。 获得小鼠肺泡巨噬细胞细胞从BAL acetate-treated老鼠收集和孵化为2 h巨噬细胞粘附然后巨噬细胞被感染RSV感染和进一步治疗体外醋酸(260µM)。 24小时后,IFN-β生产文化上层清液进行了分析。

统计分析

所有体外实验进行了一式三份。 体内实验进行至少两次(n每组在每个实验)= 3 - 9的老鼠。 克鲁斯卡尔-沃利斯测试用于确定统计学意义之间的各种实验团体和Mann-Whitney用于比较两个实验组,每组使用GraphPad棱镜软件(美国圣地亚哥,CA)。 值图中给出的平均值±标准误差(SEM)和一个意思p< 0.05被认为是显著的。 之间的关联Ifnar1Gpr43(Ffar2)基因型和表型(即。 ,等位基因群体意味着)鼠标使用双尾学生的压力t以及。 我们只测试编码非同义单核苷酸多态性。

人口

进行病例对照研究在布宜诺斯艾利斯,阿根廷(2003 - 2006)与健康足月的婴儿(< 1岁)与毛细支气管炎。 RSV感染的诊断是由训练有素的儿科医生根据临床结果(血氧饱和度,Th2极化,RSV效价和pCO2),只有RSV-positive科目(246 172严重和轻微)包括了这项研究。 RSV疾病严重程度的选择标准是基于临床相关端点:健康足月婴儿毛细支气管炎是招募研究如果氧饱和度在入学率低于93%时呼吸室内空气。 排除标准包括已知或疑似免疫功能受损,主要先天性口腔畸形、慢性肺部疾病,心脏疾病,早产(胎龄小于37周),影响吞咽神经肌肉疾病,已知或疑似凝血障碍或出血倾向29。 共有17个样品被排除在基因分析由于没有信号或其他问题的DNA。 法国医院的机构审查委员会(布宜诺斯艾利斯)和网络医院Materno Infantil de San身为(包括三家医院在布宜诺斯艾利斯的东北地区),以及机构审查委员会的约翰霍普金斯大学(美国马里兰州巴尔的摩),批准了这项协议,研究表明符合标准《赫尔辛基宣言》。 知情同意是来自每个登记婴儿的父母。

DNA提取和基因分型IFNAR1rs2257167

所有的数据收集在研究2003 - 2006年执行。 我们查询NIEHS TagSNP数据库来识别IFNAR1tagSNP提供足够的基因覆盖(补充图。7)。 DNA从全血中提取使用Gentra PureGene工具包(Gentra系统,明尼阿波利斯,美国),纯度和浓度的特点,250 ng整除提交使用pcr Illumina公司BeadXpress化验。 短暂的DNA激活并贴上Cy3或Cy5标签,杂化验证IFNAR1sequence-specific顺VeraCode珠子(反向链:3 ' -cttctacacctgaagagtttttccagataa (C / G) taagctatatgtaaagcttaaaccatccaa-5”),并使用BeadXpress荧光信号扫描系统。 集群通过分离和SNP调用频率被额外的质量控制措施和改进分析使用基因组工作室。 基因型电话是出口到Excel和ASCII编码进行关联分析。 多用于IFNAR1使用验证证实了rs2257167等位基因歧视TaqMan SNP基因分型检测(费舍尔科学、马、美国)。 百分之五的样本提交测序并调用整合了100%。 感兴趣的表型是临床定义为“严重”或“轻微”RSV疾病和作为两个因变量在我们的统计模型。 确定是否IFNAR1tagSNP与RSV疾病严重程度,制定三个假设:(1)累加效应模型,包含所有三个基因型:GG, GC, CC作为预测变量的水平; (2)一个变异等位基因的显性效应模型,预测变量有两个水平,对应GG和GC / CC基因型相结合; (3)一种隐性等位基因变体的影响模型,预测变量有两个水平,这与GG / GC和CC基因型相结合。 对于这三个假设,我们执行逻辑回归和显性/隐性效应模型,我们得到的优势比基因型效应和其相应的95%置信区间估计。 除了基础物流模型,我们还测试了其他因素包括性别、母乳喂养、地区/医院位置、物流模型中的协变量和社会经济地位。 所有的测试、估计和调整相应的协变量。

报告总结

进一步研究信息设计是可用的自然研究报告摘要与这篇文章有关。

数据可用性

源数据潜在的无花果。1b, c, d、g h, j。2b, c, d, f;3.罪犯;4b, c, d、g i, j。5模拟;6a, b, c, e, f, g, h,我,k、m;7a, b, c, d, f, h, i, j。8罪犯;9 a, b, c, f, g,我; 和补充图。5a, d, e, f,6 a、b和d,7,8 a和c提供了源数据文件。 所有其他相关数据可从相应的作者在合理的请求。 脚本用于运行16 S分析CMMR GitHub可得:CMMR-16年代rbiom。



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