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MmpL3相互作用组揭示了细胞包膜生物合成与细胞伸长和分枝杆菌分裂之间的复杂串扰

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发表时间:2019-09-18 08:22作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

MmpL3相互作用组揭示了细胞包膜生物合成与细胞伸长和分枝杆菌分裂之间的复杂串扰


摘要

积分分枝杆菌膜蛋白的膜转运蛋白(MmpL)大家庭及其interactome扮演重要角色在分枝杆菌外膜脂类的合成和出口。 尽管目前的兴趣霉菌酸,MmpL3,从药物发现的角度,interactome的性质和生物学意义在很大程度上仍未知。 我们在这里报告一个全基因组筛查为MmpL3绑定合作伙伴2台混合动力系统。 虽然出奇地低数量的蛋白质参与霉菌酸生物合成被发现与MmpL3交互,大量的酶和转运蛋白参与肽聚糖的生物起源,阿拉伯半乳聚糖lipoglycans,细胞分裂调控蛋白,CrgA,被确定。 表面等离子体共振和co-immunoprecipitation独立消息来源的证实的物理相互作用三种蛋白质在体外和/或在活的有机体内。 结果符合波兰和鼻中隔的震源定位MmpL3活跃地生长细菌的合成细胞壁的主要成分的核心都是已知的,并且进一步暗示的作用MmpL3协调新的细胞壁沉积在细胞分隔作用和伸长。 这部小说方面的生理MmpL3可能导致极端脆弱,这种运输车的治疗潜力高。

介绍

霉菌酸是所有分枝杆菌的外膜的基本构建块。 药物针对他们的生物合成和出口的重要性如下的治疗效果等anti-mycobacterial代理异烟肼、乙硫异烟胺,thiacetazone isoxyl,以及最近发现的小分子抑制剂据报道,抑制霉菌酸膜转运体的积分,MmpL31,2。 研究从我们组和其他人建立MmpL3,抵抗的一员,有节和分裂(RND)总科,需要的易位霉菌酸海藻糖的形式monomycolates (TMM)从细胞质到周质或外膜这个醣脂类可以作为霉菌酸供体细胞外酶催化酯交换阿拉伯半乳聚糖或TMM的海藻糖dimycolates (TDM)(无花果。1]3.,4,5

图1
figure1

肺结核霉菌酸生物合成途径。 的C48-C54 meromycolate链biosynthesized通过前进的FAS-II添加多个丙二酸酯单元到C16-C26 FAS-I生成的前体。 因此FAS-II中等长度的初始基质keto-acyl-ACP造成的冷凝肺结核FabH蛋白质酰基辅酶产品与malonyl-ACP FAS-I。 β-keto-acyl-ACP还原酶还原后MabA、脱水(3 r)的-hydroxyacyl脱水酶HadAB HadBC,和减少enoyl-CoA还原酶韩国仁荷,要么β-ketoacyl-ACP合成酶KasA或KasB催化缩合生成的产品与malonyl-ACP单位,从而启动下一轮的伸长。 FAS-II可能接受进一步的产品meromycolic酸链的伸长和功能修改,催化部分年代-adenosyl methionine-dependent甲基转移酶(MmaA1 MmaA2、MmaA3 MmaA4, CmaA1, CmaA2, PcaA, UmaA),前Pks13 / FadD32-mediated凝结的激活α-branch meromycolic酸链全尺寸霉菌β-ketoester收益率。 Pks13转移霉菌β-ketoester CmrA之前海藻糖还原的还原酶TMM的成熟。 尸的霉菌酸乙酰化物TMM之前出口MmpL3和其他潜在的易位机械组件生成分枝杆菌细胞信封。 mycolyltransferases编码的fbpA,fbpBfbpC催化转移霉菌酸从TMM阿拉伯半乳聚糖(AG),或另一个TMM分子生成TDM69。 蛋白质用红色字体进行了测试单独供批2台混合动力系统与MmpL3互动。

有趣的是,多个细胞envelope-related生物合成途径(如硫脂质,phthiocerol dimycocerosates, polyacyltrehaloses, glycopeptidolipids,含铁细胞,等等)在分枝杆菌和放线菌依靠相关MmpL(密切相关ycobacterialembraneproteins,l阿尔该)蛋白质产品的易位最后extra-cytoplasmic位置6,7。 MmpL蛋白质通常与其他酶和转运蛋白的生物合成途径和这些物理交互所需的合成和出口的有效耦合6,7,8。 虽然早期研究已经开始阐明物理之间的相互作用的性质和功能相关性霉菌酸生物合成的酶9,10,11,12迄今为止,只专注于已知的胞质酶和易位没有集成方面的机械。 结果,没有什么是目前已知的时空耦合的霉菌酸生物合成和出口。

鉴于这样的挑战所代表的易位高分子量、疏水性,选民的霉菌酸在不同层分枝杆菌细胞信封,一个分子的存在支架提供连续性之间的细胞质中,周质和分枝杆菌的表面也可能。 这种假设是进一步支持我们的单粒子电子显微镜研究表明MmpL3的长度(100年估计35在细胞周质间隙扩展)不兼容直接衬底交付外膜(分枝杆菌细胞被膜的厚度的范围*35 - 40海里)13,14,15。 存在的第一个证据附件所需蛋白质TMM出口获得了最近使用co-purification策略与MmpL3识别蛋白质相互作用分枝杆菌smegmatis。 一个等离子membrane-anchored TMM所需蛋白质,名叫TtfA证明出口而另一个蛋白质co-eluting MmpL3提出了扮演一个角色在MmpL3-TtfA复杂应力条件下的稳定16。 是否额外周质的适配器,外膜蛋白,也许,内膜转运蛋白与MmpL3带来TMM细胞表面,同样的情况与原型HAE1 RND射流泵17还有待确定。

分枝杆菌的生物学的另一个独特的方面和其他细菌放线菌目是顺序插入的新合成肽聚糖伸长期间发生在细胞两极而不是沿横向等其他杆状细菌的细胞壁大肠杆菌枯草芽孢杆菌18,19。 细菌分裂和伸长不影响现有的多层细胞壁的完整性意味着时空协调生物合成和出口活动间隔和极地伸长的网站,一个过程明显促进在分枝杆菌肽聚糖的分布不均,阿拉伯半乳聚糖,霉菌酸和磷(glyco)内膜脂质合成的复合物,以及他们在极地浓缩和亚寒带地区积极延伸的细胞20.,21,22,23,24。 尽管有这些进步,还有许多工作要做在理解的分子机制与细胞分隔作用协调新细胞壁沉积/伸长,并将个人的分子相互作用和动态特性细胞被膜生物合成途径。 中央MmpL3参与霉菌酸易位,运输车的定位杆和活跃地生长细胞的隔膜20.,25霉菌酸转移到他们的外膜受体已被证明发生26,27,28,29,它能直接或间接地与伸长调节器Wag31(又名DivIVA)20.让我们假设MmpL3可能是蛋白质支架的中心协调新的霉菌酸,也许其他细胞被膜成分沉积在细胞伸长和分裂。

目前interactome研究从而进行三个主要目的。 第一个是确定MmpL3充当支架的multiprotein复杂耦合霉菌酸合成和出口。 第二个是识别假定的额外组件的霉菌酸易位机械肺结核。 第三个是开始描述的另一个关键事件在细胞壁生物起源的交集,细胞伸长和MmpL3可能涉及的细胞分裂。 这些研究结果指出了一个复杂的霉菌酸之间的串扰,脂类和多糖生物合成,在分枝杆菌细胞伸长和分裂。

结果

识别MmpL3约束力的合作伙伴使用细菌2台混合动力系统

我们采取E杆菌腺苷酸环化酶2台混合动力(BACTH)系统作为我们主要的识别方法肺结核蛋白质与MmpL3交互。 该系统利用腺苷酸环化酶的催化域的事实(CyaA)百日咳博德特氏菌包括两个互补的片段,T25和T18,不活跃,当身体分离,但其功能互补融合互动时多肽环腺苷酸合成的结果E杆菌自保”突变体30.。 营产生的重组嵌合酶激活β-galactosidase记者允许积极互动琼脂媒体容易识别指标。 重要的是,因为这个系统依赖于信号级联,利用扩散监管分子,它适用于检测胞质之间的相互作用,以及跨膜和膜相关蛋白31,32

MmpL3融合蛋白窝藏c端或氨基端T18 T25域生成作为“鱼饵”,系统地筛选两两相互作用四个主要组类似的融合蛋白。 T18和T25域之间的功能互补效率量化通过测量β-galactosidase活动。 第一个“公正的”,最初筛选池96对MmpL3鱼饵,包含整个肺结核网关®克隆组来自贝资源(nr - 19274)组成的3724独特的肺结核H37Rv CDC1551开放阅读框(orf)。 自肺结核网关®克隆集是失踪的肺结核H37Rv羊痘疮,因为我们也想屏幕的目标蛋白质单独对MmpL3 T18和T25 C - N-terminally-fused蛋白质测试集的生成蛋白质的描述。 其中一个集在图表示。1,由所有已知的蛋白质参与霉菌酸生物合成。 考虑到基因参与脂类的生产和MmpL-dependent出口往往集中在分枝杆菌的基因组6,另一组候选人扶少团团员进一步生成由所有的保守基因聚类mmpL3肺结核和其他分枝杆菌基因组(无花果。2]。 最后,融合是准备候选人蛋白质,要么被提出与MmpL3交互(例如,Wag31)20.或在其他MmpL-dependent通路参与脂质出口(如Sap [Rv3821], Sap-like蛋白质Rv1517,和Rv0585c)6,7

图2
figure2

mmpL3基因组的地区结核分枝杆菌,m . smegmatis麻风杆菌。 守恒的基因是在黄色和所有测试与MmpL3批2台混合动力系统。 Non-conserved基因(灰色)和假基因(粗线)没有测试。mmpL3和直接同源是绿色的。

在托托,这在活的有机体内屏幕产生19支安打,重复性良好互动与MmpL3 BACTH 2台混合动力系统。 这些打击,他们提出的定位在细胞和假定的功能展示在表1。 β-galactosidase活动分析的结果提出了在无花果3.S1。 总体来说,结果是详细的下面突出显示的广泛网络蛋白参与细胞信封生物起源、细胞伸长/部门和作为未知函数MmpL3似乎互动在活的有机体内

表1批分析MmpL3 interactome。
图3
figure3

量化的在活的有机体内全尺寸或c端截断MmpL3和蛋白质之间的相互作用的合作伙伴。 MmpL3(全尺寸)和MmpL31 - 744融合蛋白窝藏c端或氨基端T18 T25域生成作为“鱼饵”,系统地比较两两交互作用表中列出的约束力的合作伙伴1。 成对co-transformants发展一批蓝色的屏幕是生长在磅汤,和文化处理β-galactosidase活动中描述的方法。 给出的值是指活动(相对单位)±标准误差从测量三个独立执行E杆菌转化株。

MmpL3与组件的交互的霉菌酸生物合成的机械和syntenic基因的产物

符合我们之前发现的全尺寸MmpL3 homotrimer蛋白质功能15,MmpL3与本身(无花果。3.]。 已知的霉菌酸生物合成的酶可能与MmpL3细胞质或膜本身的酶参与meromycolate前体的合成(如FAS-II酶)、功能化meromycolate链(年代-adenosyl-methionine甲基转移酶)或最后组装的meromycolate alpha-branch (Pks13 FadD32)[无花果。1)被确定为MmpL3约束力的合作伙伴在试验条件下使用本(无花果。S1]。 事实上,唯一的关联标识在这个通路的尸,乙酰化作用的酰基转移酶负责霉菌酸TMM的活动似乎是一个必要的TMM出口,在分枝杆菌细胞生存能力15,33。 尸被认为促进TMM的最后修改之前由MmpL3出口。的尸集群mmpL3在相同的基因组区域,其他一些约束力的合作伙伴确定在这个屏幕(MmpL11; Rv0204c; Rv0207c; Rv0227c; AftD)。Rv0207c,一个分枝杆菌守恒的未知功能的基因、地图毗邻mmpL3Rv0204c编码一个潜在的内膜转运体与同源MprF移位酶。ultiplePeptideResistanceF演员(MprF)代表一个高度保守的蛋白质家族蛋白质的合成和易位负责氨酰基磷脂在各种细菌34。 Rv0204c,然而,是很不寻常的,它是缺乏MprF蛋白质的生物合成领域,只有港口移位酶域。 MmpL11 (Rv0202c)是参与易位的霉菌acid-containing脂质,monomeromycolyl甘油二酯和mycolate蜡酯35MmpL3一起,提出了参与亚铁血红素吸收的能力的基础上,周质的域这两个RND转运蛋白结合血红素36,37。 虽然两个转运蛋白只显示它们之间的弱相互作用(无花果。3.),他们都被确认为约束力的合作伙伴MprF-like移位酶Rv0204c(无花果3.4]暗示某种形式的耦合的两个MmpL-dependent通路。 虽然Rv0204c不需要增长,这种基因的破坏已经报道减弱肺结核毒性38,39。 Rv0227c最近被显示为一个关键,尽管不完全定义,函数的伸长lipomannan (LM)和lipoarabinomannan (LAM)棒状杆菌属glutamicum40,而AftD (Rv0236c)中扮演着重要的角色在arabinosylation LAM和阿拉伯半乳聚糖的分枝杆菌41,42

图4
figure4

量化的在活的有机体内MmpL3约束力的合作伙伴之间的相互作用。 CrgA Wag31,尸,AftD Rv0227c, Rv0204c MmpL11融合蛋白窝藏c端或氨基端T18 T25域生成作为“鱼饵”和测试两两交互与其他MmpL3约束力的合作伙伴。 成对co-transformants发展一批蓝色的屏幕是生长在磅汤,和文化处理β-galactosidase活动如无花果。3.

缺乏周质的MmpL3之间的相互作用和FbpA FbpB和FbpC mycolyltransferases

三个mycolyltransferases肺结核——FbpA (Rv3804c) FbpB (Rv1886c)和FbpC (Rv0129c) -催化,在周质的方面的质膜,霉菌酸从TMM的转移他们的细胞被膜受体(无花果。1]。 因为这些酶的周质的位置杜绝BACTH系统来检测潜在的使用与MmpL3交互,表面等离子体共振(SPR)代替。 为此,MmpL3蛋白肺结核是在一个smegmatis淘汰赛变异缺乏内生的mmpL3基因和纯化使用镍的结合亲和力和离子交换色谱法(无花果。S2]。 纯化MmpL3蛋白被固定到CM5芯片的表面下所描述的方法,并增加浓度的分析物蛋白质在表面注入。 与纯化本机FbpA SPR化验,FbpB和FbpC蛋白质未能透露任何与MmpL3(无花果。S3]。 同样,测试的纯化Pks13蛋白SPR证实MmpL3之间缺乏互动,这酮化合物合酶(无花果。S3].

MmpL3约束力的合作伙伴与其他已知或提出功能在细胞生物起源的信封

有趣的是,BACTH筛选确定了数字以外的其他MmpL3-binding伙伴mmpL3集群的证明或拟议的功能,或与细胞envelope-related基因聚类肺结核基因组,也暗示了他们参与细胞生物起源的信封。 其中最重要的是三个高度保守的蛋白质,或认为是参与,肽聚糖合成和出口:Rv1337, Rv3909 Rv3910 (MviN)(无花果。3.]。 肽聚糖需要MviN前体出口或聚合; 提出了通过类比与革兰氏阴性MviN蛋白质,它作为脂质II flippase43。 Rv3909是生物信息学方法预测的外膜蛋白44尽管实验证明这个假设目前缺乏。 的组织Rv3909mviN位点的肺结核基因组表明这两个基因可能是co-transcribed。 Rv1337的未知函数是一种守恒的rhomboid-like蛋白编码基因集群基本肽聚糖生物合成的基因murI在所有分枝杆菌基因组45。 这个基因的中断smegmatis发现改变细菌形成生物膜的能力和他们对疏水性抗生素暗示细胞表面特性和细胞被膜渗透性的变化46

其他扶少团团员可能参与细胞被膜合成包括Rv0625c、未知函数的编码蛋白质基因簇的阿拉伯半乳聚糖(galTa,galTb)和霉菌酸生物合成的基因(哈达,hadB,hadC)。 Rv1457c,一种内在膜组件的一个ABC-transporter遗传协会mannosyltransferase参与LM /林合成(Rv1459c / MptB)暗示其参与lipoglycans的出口47。 Rv2169c区域的地图肺结核基因组富含最近特征细胞分裂调节器基因(Rv2151,Rv2164)48肽聚糖、LM、林和磷脂生物合成的基因(Rv2163c/pbpB; Rv2174 / mptA,Rv2181,Rv2182c)49Rv3483c相邻细胞壁连接酶基因吗cpsA2(Rv3484)参与阿拉伯半乳聚糖共价连接的肽聚糖50,这种蛋白质的直接同源marinum显然ESX-1分泌的分泌系统51。 所有这些蛋白质和其它扶少团团员的未知函数表中给出1(Rv3271c Rv3064c LprC LppT)预计周质的,积分膜或外膜蛋白可能参与TMM的出口或其他未知细胞被膜成分。 我们注意到,脂蛋白和其他潜在出口蛋白质的发现在我们的屏幕是意想不到的BACTH系统不是为了暴露extra-cytoplasmic交互。 这些结果可能表明阳性。 或者,不出口或插入的一些测试的质膜蛋白质和MmpL3融合中产生E杆菌可能会无意中导致extra-cytoplasmic扶少团团员MmpL3与周质的区域互动的运输机在细胞质中E杆菌

MmpL3与蛋白质的相互作用参与细胞伸长和分隔作用

早期interactome研究发现MmpL3与Wag31 co-immunoprecipitating的蛋白质之一20.,伸长特定的细胞调节因子参与协调信封生源论年长,更快的增长,极分枝杆菌21。 虽然BACTH试验未能透露任何MmpL3之间的直接交互,Wag31(数据未显示),筛选的肺结核基因组“猎物”图书馆从贝资源识别CrgA作为MmpL3关联(无花果。3.]。 CrgA是一种细胞分裂调控蛋白,促进了隔膜形成和确保适当的间隔和极地肽聚糖大会通过影响penicillin-binding蛋白质和Wag31的本地化52,53。 CrgA作为蛋白质的识别与MmpL3揭示一个可信的交互机制MmpL3可以招募到隔膜驱动霉菌酸沉积在细胞分裂期间这个网站25,29。 鉴于CrgA与Wag31(无花果。4),可能CrgA进一步有助于relocalization MmpL3旧波兰人在细胞伸长21,25,29

验证与CrgA MmpL3交互,Rv0207c AftD和表面等离子体共振

我们下变成了一个独立的在体外蛋白质相互作用的方法,即SPR,来验证我们的一些BACTH化验结果与蛋白质的选择一个子集包含多种功能(霉菌酸生物合成,肽聚糖和阿拉伯半乳聚糖lipoarabinomannan合成、细胞伸长和部门)和亚细胞的本地化(内膜,周质,细胞质)发现的2台混合动力系统筛查。 ,为此,MviN AftD LprC, CrgA Rv0207c蛋白质生产的E杆菌和纯化的结合所述的离子交换和金属亲和层析方法(无花果。S2]。 试图生产和净化的尸不幸失败了,都在E杆菌smegmatis。 纯化MmpL3被捕获到表面的CM5芯片和候选蛋白质之间的相互作用分析作为FbpA描述,FbpB, FbpC Pks13,通过注入表面MviN浓度增加,AftD, LprC, CrgA Rv0207c。 结果,它在无花果。5,表明CrgA Rv0207c AftD,但不是LprC或MviN(无花果。S3),结合具体和固定化MmpL3高亲和力。 收集CrgA, AftD Rv0207c sensorgrams是全球融入不同的动力学模型来分析相互作用的机理和亲和力。 获得适合的美好相当不同的模型,并使用一个简单的1:1绑定模型进一步的亲和力比较观察蛋白质-蛋白质之间的关系。 对于所有三种蛋白质,离解常数(KD)与摩尔范围中期MmpL3被发现(无花果。5和表S1]。 因此,MmpL3交互直接与CrgA可比亲和性,AftD Rv0207c。 未能检测LprC之间的交互和MmpL3支持我们的假设可能几个早些时候,如果不是全部,MmpL3和出口之间的交互通过BACTH蛋白质实际上可能是假阳性。 缺乏可检测MviN之间的相互作用和表面等离子体共振分析同样也可能表明MmpL3假阳性或结果的不当折叠或低聚MviN生产的重组形式E杆菌

图5
figure5

量化的在体外MmpL3和约束力的合作伙伴之间的相互作用的表面等离子体共振。 SPR的用于分析动力学与各种蛋白质纯化MmpL3交互。 绑定sensorgrams收集通过注射双重增加浓度从0.6μM 10μM AftD(紫色),Rv0207c(蓝色)和CrgA(绿色)。 全球安装到一个简单的1:1模型绑定曲线(红线)和让常数为每个蛋白质所示。 没有具体的绑定检测Ag85复杂,Pks13, MviN LprC(见图。S3].

MmpL3交互与CrgA完好无损m . smegmatis细胞

以决定是否MmpL3与CrgA互动在活的有机体内的环境中完好无损smegmatis细胞,我们终于采取co-immunoprecipitation。 为此,CrgA重组蛋白与一个标记抗原决定基N-terminally-tagged表示的背景中MsmgΔmmpL3/ pMVGH1 -mmpL3tb-gfp从整合质粒pFAX -crgA。 完整的smegmatis细胞共同表达CrgA-FLAG和MmpL3tb-GFP标记hexahistidine c端一端与交联剂治疗dithiobis[丙酸succinimidyl] (DSP)交联蛋白复合物之前破坏细胞。 MmpL3tb是未来从这些细胞纯化Ni-NTA亲和色谱法,以及存在CrgA-FLAG MmpL3-containing洗脱分数是调查使用国旗表位抗体免疫印迹。 的洗脱分数smegmatis细胞缺失CrgA-FLAG的表达质粒或pMVGH1 -mmpL3tb-gfp被用作消极的控制。 如无花果所示。6,CrgA-FLAG co-eluted MmpL3tb-GFP,收益率预期大小的FLAG-positive信号CrgA-FLAG (~ 12 kDa)在减少与二硫苏糖醇蛋白复合物。 相比之下,CrgA-FLAG失踪了的下拉样品同样的准备smegmatis细胞丢失pFAX -crgA或pMVGH1 -mmpL3tb-gfp(无花果6S4]。 因此,CrgA似乎与MmpL3tb完整分枝杆菌细胞。 由于低丰度或标记抗原决定基的弯曲的暴露在蛋白复合物,CrgA-FLAG并未直接检测到的高分子量MmpL3-GFP复合物,并仅在德勤可见治疗(无花果。6]。 此外,没有发现CrgA洗脱部分交联剂时省略了从细胞制备(数据没有显示)。

图6
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在完整的分枝杆菌细胞CrgA与MmpL3交互。:DSP-treated凝固态荧光,detergent-solubilized, MmpL3tb-protein复合物MsmgΔmmpL3/ pMVGH1 -mmpL3tb-gfp+ pFAX -crgA揭示了存在高分子量MmpL3-GFP蛋白复合物的洗脱分数降低在德勤。 的预期大小MmpL3-GFP ~ 126 KDa。正确的:免疫印迹分析DSP-treated detergent-solubilized MmpL3tb-protein复合物的准备Msmg+ pFAX -crgAMsmgΔmmpL3/ pMVGH1 -mmpL3tb-gfp+ pFAX -crgA细胞。 免疫印迹显示存在CrgA-FLAG洗脱的分数MsmgΔmmpL3/ pMVGH1 -mmpL3tb-gfp+ pFAX -crgA细胞而不是来自细胞缺乏mmpL3tb-gfp表达质粒。 的预期大小CrgA-FLAG ~ 12 KDa。 *代表一个非特异性smegmatis蛋白质与anti-FLAG抗体反应。 完整的凝胶和墨迹图所示。 Co-affinity方法进行了净化进行了两次独立文化批次相同的结果。

MmpL3 c端胞质域的影响蛋白质相互作用

MmpL3积累能力的老杆和隔膜的积极增长细胞是依赖于一个地区的运输之间的十跨膜段(TMS)和糖25。 更精确地描述该地区的动态定位所需的MmpL3杆菌增长,smegmatis重组菌株产生内生的mmpL3基因是完全删除,取而代之的是两种不同,ectopically表示,救援的副本mmpL3基因肺结核。 一个救援复制与全尺寸mmpL3基因融合在其3′末端绿色荧光蛋白(屈服MsmgΔmmpL3/ pMVGH1 -mmpL3tb-gfp)。 第二次救援复制与3′截短形式的基因编码的前744个氨基酸残基蛋白c端融合GFP(收益率MsmgΔmmpL3/ pMVGH1 -mmpL3tb1 - 744绿色荧光蛋白)。 相比MmpL3的截短形式研究了卡尔25,MmpL3tb1 - 744gfp港口的最后两个跨膜域运输车(TMS11和TMS12),因此只有缺乏蛋白质的胞质c端域。 符合我们早些时候的发现15,MsmgΔmmpL3应变获救,mmpL3tb1 - 744绿色荧光蛋白是可行的,表明MmpL3tb吗1 - 744gfp是主管在积极出口霉菌酸杆菌复制。 的观察MsmgΔmmpL3/ pMVGH1 -mmpL3tb-gfp杆菌通过荧光显微镜显示优惠标签的波兰人和隔膜(无花果。7、前面板)。 因此,尽管表达肺结核MmpL3直接同源,smegmatis能够成功招募运输车的波兰人。 荧光的MsmgΔmmpL3/ pMVGH1 -mmpL3tb1 - 744绿色荧光蛋白杆菌,相比之下,调光器,更加分散,降低积累MmpL3波兰人和隔膜,和GFP信号更均匀分布的侧壁杆菌(无花果。7、较低的面板)。 符合卡尔的观察25因此,极地的本地化MmpL3是依赖于蛋白质的c端区域,现在可能缩小至最后200细胞质运输车的残留物。

图7
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损失的极地的本地化MmpL3截断的c端域。 代表的荧光图像MsmgΔmmpL3/ pMVGH1 -mmpL3tb-gfp(前面板)和MsmgΔmmpL3/ pMVGH1 -mmpL3tb1 - 744绿色荧光蛋白(较低的面板)显示全尺寸的焦点定位MmpL3tb-GFP在老波兰人和隔膜的积极分杆菌,和灰暗和分散荧光信号对应的截短形式运输车辆。 的荧光强度50杆菌从每个应变(红色线)在一个代表性的实验,±标准差(黑线),是得分和绘制规范化细胞长度(右面板)。

为了阐明开始减少极性的分子机制会计MmpL3tb本地化1 - 744绿色荧光蛋白在smegmatis,所有的MmpL3约束力的合作伙伴确定在我们的2台混合动力系统屏幕测试与MmpL3tb交互1 - 744使用BACTH化验。 结果,描述在无花果。3.透露,根据蛋白质不同的行为模式。 虽然一些交互强度的增加(如Rv0207c, Rv1457c, Rv3064c, Rv3909), Rv0204c, Rv0227c, Rv1337 Rv3483c出现,相反,互动与MmpL3tb那么强烈1 - 744。 变化与其他蛋白质相互作用并不显著。 值得注意的是减少MmpL3tb和MmpL3tb之间的互动1 - 744单体以及MmpL3tb之间1 - 744和MmpL3tb1 - 744单体(无花果。3.]表明c端MmpL3年底在运输机的稳定的低聚过程中发挥作用。 这一发现或许可以解释为什么最近报告了c端截短形式的MmpL3结晶为单体54,55而不是三15。 有趣的是,未发现显著差异绑定之间CrgA MmpL3tb全尺寸,和CrgA MmpL3tb1 - 744(无花果。3.]表明MmpL3 / CrgA交互不是通过c端域运输车。 MmpL3 c端领域以来,其极性定位至关重要,这一结果表明,蛋白质除了CrgA负责招聘运输车的旧波兰人和隔膜。 或者或者此外,减少MmpL3单体之间的相互作用和MmpL3未能妥善oligomerize截断后的c端域可能导致更加分散荧光信号smegmatis表达了截断MmpL3tb1 - 744全尺寸MmpL3-GFP比表达绿色荧光蛋白。

讨论

我们的屏幕蛋白质相互作用MmpL3确定出人意料的低数量的支安打酶参与霉菌酸的生物合成。 的乙酰转移酶的尸实际上是唯一的在这个途径。 我们化验的条件下,无论是Pks13还是mycolyltransferases抗原85复杂,催化顺序关闭MmpL3上游和下游的生物合成步骤,分别(无花果。1),被发现具有约束力的合作伙伴。 MmpL3,然而,被我们的屏幕显示可能蛋白质支架的其他至关重要的细胞envelope-related生物合成的机械包括那些参与肽聚糖的组装和出口(MviN CrgA,可能Rv3909和Rv1337), LM, LAM和阿拉伯半乳聚糖(AftD, Rv0227c Rv1457c) monomeromycolyl甘油二酯和mycolate蜡酯(MmpL11),也许氨酰基磷脂(Rv0204c / MprF)(无花果。8]。 其中CrgA、Rv0207c AftD属于各种独立功能集群在无花果。8被生物物理变化和/或生物化学的方法来验证物理与MmpL3交互。 紧张的生理反应网络的存在细胞envelope-related支持的途径进一步检测MmpL3约束力的合作伙伴之间的相互作用,例如,MmpL11 / Rv0204c; Rv0227c /尸和Rv0227c / AftD(无花果。4]。 重要的是,除了与Wag31间接互动20.MmpL3也发现,与主要的细胞分裂调控蛋白质CrgA CrgA指向一个合理的机制,直接或通过其互动Wag31(无花果。4),可能参与relocalization MmpL3间隔和极地地区的积极增长细胞促进霉菌酸沉积在这些特定的网站21,24,25,29。 CrgA不是唯一的蛋白质有助于积累MmpL3在这些特定的位置,然而,被删除的缺乏影响建议的c端一端转运体在其能力与CrgA BACTH试验,然而,失去清晰的极地截短形式的MmpL3的本地化smegmatis细胞。 集体,因此本文提供的结果不仅暗示一个广泛存在的细胞被膜之间的连接在分枝杆菌生物合成机械,但也表明MmpL3可能作为锚在协调新细胞壁沉积与细胞伸长和部门的老和小叶间隔波兰人。 可能这个额外的函数MmpL3有助于治疗目标的易损性56,57

图8
figure8

的网络肺结核蛋白质的发现与MmpL3交互。 蓝线表示蛋白质相互作用建立在当前的背景下研究。 蛋白质-蛋白质之间的关系建立在先前的研究的背景下通过红线相连20.,52,53。 蛋白质所属官能团或被认为属于不同的颜色加以区分。 蛋白质在黄色圈霉菌酸代谢相关。 蛋白质的橙色圈尚未分配的一个函数。 LAM lipoarabinomannan; LM lipomannan; AG)、阿拉伯半乳聚糖。

先前的研究已经报道了沉默或干扰基因的多效性的表型效应参与重要的分枝杆菌细胞envelope-related通路没有最终确定这些影响是否归因于补偿机制、微扰的其他膜酶和转运蛋白的活性,整体细胞被膜渗透率的变化,或其他机制。 例如ABC转运蛋白编码Rv1458c-Rv1456c最初提出参与易位的短链corynomycolic酸的表型特征的基础上吗棒状杆菌属matruchotii转座子突变体窝藏插入运输车58。 这转运体的转录耦合mannosyltransferase负责LM的伸长和林随后Mishra领导47提出的改变霉菌酸概要文件Cmatruchotii突变体可能是一种间接效应造成的损失lipoglycans成熟的细胞。 最近,高分辨率lipidomics分析的Cglutamicum的尸淘汰赛突变透露一个意想不到的甘油三酯积累内膜的突变,降低phosphatidylglycerol, alanylated-phosphatidylglycerol和alanylated甘油二酯59。 同样的,混乱的mmpL11肺结核引起心磷脂含量减少伴随的甘油三酸酯水平的改变60,61。 最后,mmpL3沉默的肺结核展示了导致的,或下调70个基因中哪些基因编码多种转运蛋白和其他参与霉菌酸和脂质合成57。 interactome研究结果有力地表明,上述观察可能事实上是扰动的结果在蛋白质相互作用引起的基因淘汰赛同时影响多个生物合成的过程。

值得注意的是尽管几个MmpL蛋白质参与的出口(glyco)脂质和含铁细胞分枝杆菌被发现与膜蛋白相关基因和功能促进底物出口(例如,ABC-transporter DrrABC,ycobacteriaembraneProtein年代购物中心(基质金属蛋白酶)和小积分差距的膜蛋白/ Sap的家庭)6,7,没有明显的同源染色体编码这些蛋白的基因区域周围mmpL3和没有这种蛋白被发现在MmpL3 interactome报道。 我们BACTH屏幕,然而,确定积分膜,脂蛋白和其他未知函数的导出的蛋白质(Rv0204c、Rv0227c Rv0625c, Rv1337, Rv2169c, Rv3064c, Rv3271c, Rv3483, LprC, LppT),其中一些可能促进TMM的出口或其他细胞被膜成分。 脂蛋白(除了LprC没有与MmpL3 SPR),如果证实与MmpL3交互,特别感兴趣的是根据前面的参与其中一些周质的易位的甘油三酯,polyketide-derived脂质、糖脂和lipoglycans62,63,64,65。 需要更多的研究来证实这些潜在的转运蛋白作为MmpL3约束力的合作伙伴和确定这些交互的功能意义,从分枝杆菌生理的角度和易感性MmpL3抑制剂。

方法

菌株和生长条件

大肠杆菌DH5αXL1-Blue,菌株用于克隆目的,是生长在磅肉汤和磅琼脂。smegmatismc2155年是生长在麦德布鲁克7 h9-adc中补充0.2%甘油和0.05%渐变h11-adc琼脂补充7日80或0.2%甘油。 为E杆菌、卡那霉素、氨苄青霉素、壮观霉素和阿泊拉霉素使用50岁,100年,分别为50 - 50μg /毫升。 为smegmatis卡那霉素,潮霉素和阿泊拉霉素在25日分别为50分和25μg /毫升。

2台混合动力系统

细菌2台混合动力系统实验使用BACTH(细菌腺苷酸环化酶2台混合动力)系统工具包(Euromedex、法国)。肺结核mmpL3利益和目标基因扩增和菌进行基因克隆到质粒pKT25, pKNT25, pUT18 pUT18C。 基因编码膜蛋白与已知或预测周质的n端结束(aftD,mviN)也被克隆在pUTM18C T18域重定向到细胞质中66。 目标基因中结核分枝杆菌网关®克隆组(贝资源)直接subcloned到网关®兼容质粒pST25-DEST, pSNT25-DEST或pUT18C-DEST66使用网关®LR Clonase®酶(ThermoFisher)推荐的制造商。 大约10 ng的质粒对不同组合用于co-transform BTH101细胞和转化株上选择磅琼脂包含适当的抗生素,0.5毫米IPTG 40μg /毫升半乳糖苷。 盘子在30°C孵化前48小时目视检查蓝色菌落的蛋白质相互作用的说明。

基因组文库的筛选肺结核开放阅读框架对mmpL3,我们使用了肺结核网关®克隆组来自贝资源(nr - 19274)组成的3724独特的肺结核H37Rv和CDC1551 orf克隆在向量pDONR™221年E杆菌DH10B-T1细胞。 携带这些克隆42 96孔板在LB-kanamycin媒介之后成长吗96 -威尔斯从每个盘子和质粒提取相结合,从而产生42 96质粒的池。 的肺结核子从每个质粒池然后subcloned pST25-DEST并使用网关®pSNT25-DEST LR Clonase®酶如上所述。 LR Clonase反应是下一个用于转换BTH101主管细胞窝藏pUT18: mmpL3或pUT18C:: mmpL3,镀和转换混合物在5到10磅板块含有氨苄青霉素、壮观霉素、IPTG和半乳糖苷为了选择蓝色菌落的蛋白质相互作用的说明。 质粒纯化从蓝色的殖民地被证实为良性互动通过共转化空pUT18或pUT18C质粒(负控制)或质粒窝藏mmpL3-T18融合(积极的控制),最后识别的基因测序产生积极的相互作用mmpL3

所有成对co-transformants发展一批蓝色的屏幕是生长在磅汤,和文化处理β-galactosidase活动如前所述67。 短暂3每两两互相转化了,一夜之间长大独立的殖民地在96 -孔板包含磅中等用抗生素和0.5毫米IPTG补充。 50μl每种文化被用来确定OD600海里而另一个200年μl转入96 -丙烯块包含800μl Z缓冲(60毫米Na2HPO440毫米,不2阿宝4MgSO氯化钾,10毫米,1毫米4和50 mMβ-mercaptoethanol)。 添加20μl之后刚做好的0.1% SDS和40μl氯仿permeabilize细胞,50μl整除的上部水层转移到96 - 150的平底微型板块包含μl Z缓冲和预平衡28°C标。 0.4%的40μl ONPG终于摒弃和β-galactosidase反应在28°C与测量的OD 40分钟420海里每2分钟。 相对β-galactosidase活动[(OD的公式计算出420海里在时间T2−OD420海里在时间T1) / (T2−T1)] / OD600海里。 T2和T1选择时间点的线性运动的一部分。

建设m . smegmatis菌株表达全尺寸和c端截短形式的MmpL3 GFP融合

MsmgΔmmpL3/ pMVGH1 -mmpL3tb-gfpMsmgΔmmpL3/ pMVGH1 -mmpL3tb1 - 744绿色荧光蛋白如前所述生成15。 简单地说,pMVGH14结构表达mmpL3基因肺结核全尺寸或截断在其3′端,只有表达前744个氨基酸残基的蛋白质,和融合绿色荧光蛋白和一个c端hexahistidine标签被用于转换smegmatis事件的应变在经历了一个交叉mmpL3轨迹4MsmgΔmmpL3等位基因交换突变体表达mmpL3tb1 - 744绿色荧光蛋白mmpL3tb-gfp然后选择镀h11-adc琼脂包含7日菅直人Hyg和蔗糖作为描述15

荧光显微镜

MsmgΔmmpL3/ pMVGH1 -mmpL3tb-gfpMsmgΔmmpL3/ pMVGH1 -mmpL3tb1 - 744绿色荧光蛋白收集文化生长对数期,洗两次在80年磷酸盐含0.05%渐变,并固定在刚做好的2%多聚甲醛在室温下30分钟。 大约106细胞被Cytospin下转移到载玻片,安装与Fluoro-Gel(电子显微镜科学)和可视化使用日本基恩士BZ-X700荧光显微镜。 两株荧光图像得到相同的曝光时间。 多个独立的实验和数据从一个代表性的实验被用于统计分析。

生产和净化CrgA、Rv0207c LprC, Pks13, MviN AftD

CrgA重组形式,Rv0207c和Pks13蛋白质肺结核H37Rv窝藏c端hexahistidine标签生产E杆菌罗塞塔(DE3)使用pET29a (CrgA Rv0207c)或pET26b (Pks13)表达系统(EMD生物科学)。 AftD从脓肿分枝杆菌(1410个氨基酸; 63%的身份,74%相似AftD肺结核1397氨基酸重叠)表示E杆菌BL21 (DE3) pLysS细胞使用pNYCOMPS-N23质粒与氨基端10-histidine标签。 一种重组LprC缺乏首次21个氨基酸(以去除蛋白的信号肽,包括残留Cys21预测acylated),怀著一个氨基端hexahistidine标签生产E杆菌CR43 (DE3)使用pET14b表达系统(EMD生物科学)。 同样的,E杆菌C43 (DE3)细胞窝藏pET29a: MviN被用于净化His-tagged MviN。 一夜之间种植细胞文化1:10 0的新磅加药物,和成长为OD6000.6 - -0.8,然后用0.1毫米IPTG诱导四小时37°C (CrgA, Pks13和MviN),一夜之间在16°C (LprC和Rv0207c)或隔夜22°C (AftD)。 细胞被离心收获4000 g×20分钟,然后resuspended裂解缓冲(50毫米三pH值8.0,5毫米EDTA, 1毫米PMSF)由声波降解法和破碎。 AftD,裂解缓冲使用20毫米消息灵通的pH值7.5,200毫米氯化钠,MgSO 20毫米4,10μg /毫升DNase我(罗氏),8μg /毫升核糖核酸酶(罗氏),1毫米三羟甲基氨基甲烷(2-carboxyethyl)液磷化氢盐酸盐(TCEP), 1毫米PMSF, 1片/ 1.5 L缓冲EDTA-free完成蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)。 完整的细胞被离心4000×g,然后膜被超速离心法收集在4°C 40000×g 1小时。 膜与HS可溶性缓冲区(20毫米消息灵通的pH值7.4,150毫米氯化钠,2% Triton x - 100)在一夜之间与搅拌4°C。 不溶性材料被超速离心法在4°C 40000×g 1小时。 可溶性样本通过SP-HP柱阳离子交换柱(通用电气医疗集团)产物在HS缓冲区,和主要材料调整到20毫米咪唑和200毫米氯化钠最终浓度在装货前到HIS-bind列。 列被广泛HW缓冲区(20毫米消息灵通的pH值7.4,150毫米氯化钠,0.2% Triton x - 100补充20毫米和50毫米咪唑; 60毫米AftD咪唑),在洗脱(HW补充500毫米咪唑; 300毫米AftD咪唑)。 洗脱分数是透析对SPR检测缓冲区(20毫米消息灵通的pH值7.4,150毫米氯化钠,和0.2% Triton x - 100)和集中了超滤前SPR。0.03%n-Dodecyl-β-D-maltoside (DDM),而不是之前的0.2% Triton x - 100,是用于在AftD SPR检测缓冲区。

净化MmpL3和SPR实验

MsmgΔmmpL3/ pMVGH1 -mmpL3tb细胞(表达c端hexahistidine-tagged形式的mmpL3肺结核缺乏绿色荧光蛋白融合)生长在四升7 h9-adc中补充0.2%的甘油,渐变- 80 0.05%,25μg /毫升卡那霉素和50μg /毫升潮霉素B 48小时30°C用颤抖的。 MmpL3蛋白质纯化,SPR实验进行了如前所述68。 蛋白质分析物在SPR检测缓冲区被注入在固定化MmpL3μL /分钟10点30秒,然后允许电离为180秒。 数据收集10赫兹和25°C。 类似的结果使用Bio-layer干涉法(数据没有显示)。

Co-immunoprecipitation

crgA肺结核H37Rv被克隆到pFAX,分枝杆菌整合质粒带有一个阿泊拉霉素抗性盒式工程内部允许重组蛋白的表达N-terminally-fused标记的抗原决定基hsp60启动子。smegmatisΔmmpL3细胞共同表达mmpL3tb-gfp从pMVGH1 -mmpL3tb-gfpcrgA-FLAG从pFAX -crgA增长的OD ~ 0.8 1.25毫米的交联剂治疗dithiobis[丙酸succinimidyl] (DSP; 热科学)在37°C在PBS 30分钟。 孵化与交联后,细菌是收获,细胞溶解的bead-beating裂解缓冲组成的50 mM Tris-HCl pH值7.5,150毫米氯化钠,10μg /毫升DNAse我和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich)和超速离心法收集的膜和resuspended缓冲区包含50 mM Tris-HCl pH值7.5,150毫米生理盐水、10%甘油和1% DDM (GoldBio)。 在增溶膜的颗粒在冰,不溶性物质被离心27000×移除g30分钟在4°C,可溶性MmpL3tb及其约束力的合作伙伴纯化Ni-NTA琼脂糖树脂(ThermoFisher)。 在丰富的洗涤的树脂洗涤缓冲(50毫米Tris-HCl pH值8.0,400毫米氯化钠,5%的甘油,20毫米咪唑)去除游离蛋白质,交联蛋白复合物从列筛选了与洗脱缓冲(50毫米Tris-HCl pH值8.0,400毫米氯化钠,5%的甘油,250毫米咪唑,0.1% DDM)。 洗脱分数是运行在4 - 12% NuPAGE Bis-Tris凝胶,凝胶分析凝固态荧光(检测MmpL3tb-GFP)其次是Coomassie蓝染色。 DSP-induced复合物被孵化与二硫苏糖醇逆转之前加载在sds - page。 免疫印迹分析使用anti-FLAG M2抗体(Sigma-Aldrich)作为主要的抗体,和一个anti-mouse IgG抗体与辣根过氧化物酶(合)(Sigma-Aldrich)作为二级抗体。 光辉合衬底(Azure生物系统)其次是化学发光检测用于检测FLAG-tagged CrgA蛋白质。


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