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IFN-γ选择性地抑制TLR4激活的基因和增强子的子集以加强巨噬细胞活化

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发表时间:2019-09-18 08:05作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

IFN-γ选择性地抑制TLR4激活的基因和增强子的子集以加强巨噬细胞活化


摘要

激活巨噬细胞的促炎和抗菌表型是由IFN-γ和有限合伙人通过协同诱导规范、炎症NF-κB目标基因。 然而,是否IFN-γ有限合伙人的负调节组件响应,以及这如何可能影响巨噬细胞激活,尚不清楚。 这里我们使用结合转录组和外遗传性方法发现IFN-γ选择性地废除LPS-induced反馈和改变巨噬细胞代谢途径通过抑制TLR4-mediated基因激活。 相比超诱导的炎症基因通过增强子结合IRF1 STAT1, IFN-γ压制目标绑定STAT3的增强剂。 TLR4-activated但IFN-γ-suppressed增强剂组成两个子集可辨别的STAT3的微分调节组蛋白乙酰化和招聘,CDK8 cohesin。 因此我们的研究结果表明,IFN-γ抑制反馈抑制和代谢成分的TLR反应增强巨噬细胞的激活; 他们还提供见解IFN-γ-mediated TLR4-induced的选择性抑制转录。 这种抑制作用可以导致严重和持续的炎症反应。

介绍

巨噬细胞是动态的细胞分化成不同国家应对各种各样的刺激1,2,3.。 激活的巨噬细胞炎症信号,如interferon-γ(IFN-γ)和脂多糖(LPS),称为M (IFN-γ)和M(有限合伙人),分别对病原体的宿主防御中发挥重要作用以及慢性炎症性疾病的发病机制4,5,6,7。 虽然通过Jak-STAT1 IFN-γ信号通路可以诱导抗原呈现分子和趋化因子,炎性细胞因子的表达(NF-κB目标基因),等肿瘤坏死因子白细胞介素6,不是仅靠IFN-γ激活。 此外,有限合伙人仅是暂时性的激活炎症基因早期接触有限合伙人而是诱发公差,从而抵抗随后toll样受体(TLR) 4刺激。 加强活化,IFN-γ质数与LPS激活炎性巨噬细胞和加强项目通过一些分子机制包括染色质重塑和代谢重编程的翻译8,9,10

TLR4响应期间,自分泌IFN-β信号通过干扰素刺激基因因子3 (ISGF3)组成的复杂STAT1 / STAT2 IRF9结合干扰素刺激反应元素(isr),诱导一个前馈回路在LPS-induced基因表达促进巨噬细胞激活11。 另一方面,有限合伙人也产生反馈抑制循环包括IL-10-STAT3抗炎通路,防止过度的炎症12。 然而,一切由IFN-γ反馈抑制的重要性和潜在的机制并不清楚。 长时间暴露于不同刺激的回馈都对二次刺激巨噬细胞的响应性。 这个特性的先天免疫细胞,称为先天免疫记忆、内毒素等各种免疫反应中扮演着重要角色公差在脓毒症中,训练免疫接种后,寄生虫感染和抑制抗菌反应13,14,15,16。 启动IFN-γ自有的巨噬细胞相似的训练10。 IFN-γ启动的大多数研究都集中在二级反应的增强炎症的挑战,但IFN-γ-mediated衰减响应后续刺激主要是未知的。

外遗传性的重组macrophage-specific增强剂由多种微环境刺激不仅有助于不同表型的巨噬细胞在不同的组织或疾病状态,但也巨噬细胞的先天免疫记忆17,18。 相互依赖转录因子包括NF-κB AP-1,统计发挥重要作用在巨噬细胞活性增强景观的动态变化19,20.。 我们以前的工作表明,IFN-γ启动调节基因组与IRF1 STAT1绑定独联体监管元素增加组蛋白乙酰化作用提高转录响应后续LPS刺激8。 无偏transcriptome-wide分析显示,环境信号不仅激活基因表达,而且压制不同的基因集21,22,23。 巨噬细胞分化的关键信号分子机制,如IFN-γ或il - 4抑制基因表达研究了使用外遗传性的方法。 例如,IFN-γ可以抑制基底抗炎基因表达程序由两个不同的机制:首先,IFN-γ诱发-组蛋白的沉积马克H3K27me3发起人通过EZH2招聘24,第二,IFN-γ失效和拆卸增强剂抑制绑定的加和lineage-determining转录因子25。 它也被报道,il - 4可以对抗IFN-γ-induced转录反应26,直接抑制LPS-induced STAT6-dependent炎症反应的增强器失活27。 尽管这些努力揭示转录机制由IFN-γ镇压,抑制LPS-inducible IFN-γ基因的转录组和外遗传性水平尚未阐明。

在这项研究中,我们希望了解IFN-γ启动选择性变弱TLR4-induced基因强烈激活巨噬细胞的一个组成部分,通过执行一个全面的使用主要人类巨噬细胞转录组和外遗传性分析。 我们发现IFN-γ紧LPS-induced基因启动至少可以分为两个子集:那些由一个IL-10-STAT3负面反馈循环,那些功能代谢途径和il - 10的独立监管。 镇压涉及失活的机制之一LPS-induced增强剂与压抑的相关基因。 抑制增强剂的一个子集,港口统计主题发生通过抑制STAT3的组蛋白乙酰化和招聘,CDK8-Mediator, cohesin。 这与superactivation TLR4-inducible基因通过招募STAT1港IRF图案的增强剂。 这些发现提供了洞察机制IFN-γ选择性地抑制TLR反应增强剂的抗炎和代谢组件失活来增强巨噬细胞的激活。

结果

选择性抑制LPS-induced IFN-γ转录

的函数IFN-γLPS-induced炎症基因表达的增加,但对整个IFN-γ对TLR4-induced转录的影响反应。 检查IFN-γ如何改变LPS-induced基因表达,我们进行RNA序列(RNA-seq)的分析主要有或没有IFN-γ人类巨噬细胞培养48 h,紧随其后的是一个3 h挑战与有限合伙人(无花果。1和补充图。1 a, b)。 我们专注于3909个差异表达基因(罗斯福< 0.01 > 2倍的差异表达)在任何成对比较四个条件之一。k——聚类划分成6个基因的基因簇,明显受IFN-γ和有限合伙人(无花果。1 b, c)。 尽管许多已知和先前捕获的集群研究基因调控的模式IFN-γ和/或有限合伙人,有一个大的基因子集(集群四世n= 770)诱导的有限合伙人被IFN-γ镇压。 IFN-γTLR的负调控反应的了解甚少,在这项研究中,我们关注第四类基因,和监管以类似的方式增强剂。 作为比较点和控制,我们用类V基因(n= 541)被IFN-γ协同诱导和有限合伙人包括规范炎性基因等白细胞介素6,IL23A,CXCL9

图1
figure1

IFN-γ-mediated TLR4-induced重组的人类巨噬细胞转录组。一个实验设计:人类CD14+monocyte-derived巨噬细胞经历了四种不同组合的启动前48 h和IFN-γ刺激与有限合伙人(或没有)3 h:没有启动或刺激(R); 满怀IFN-γ没有LPS刺激(G); LPS刺激只有没有启动(左); 或影射IFN-γ与LPS刺激(GL)。bK - means聚类(K = 6)的3909个差异表达基因在任何成对比较四个条件之一。 集群在左边表示。c的例子从6个集群中确定选择基因的表达一个。 酒吧图中的每个点代表一个捐赠者和误差代表标准差。d热图显示P去的价值意义词浓缩在每个集群基因。e热图显示代表第四集群基因的相对表达诱导il - 10(左),第四集群不诱导il - 10基因(中间)和集群V基因。 不同的生物功能显示在左边。 IL-10-inducible从GSE43700获得的基因。f火山的转录组变化之间的有限合伙人(左)和IFN-γ-primed LPS-stimulated (GL)巨噬细胞; 彩色点对应基因显著(罗斯福< 0.01)和表情变化大于1/2。 数据来自两个独立实验不同的捐赠者进行描述

基因本体论(去)分析显示,每个集群是丰富与独特的生物功能相关的基因(无花果。1 d和补充数据1)。 集群,其中包含人类巨噬细胞基因表达基底IFN-γ紧和有限合伙人,丰富基因参与伤口愈合及相关修缮的过程; 这扩展了我们以前的工作表明IFN-γ抑制基底由糖皮质激素诱导的基因表达和il - 425。 相比之下,LPS-inducible基因IFN-γ紧集群(IV)与负调节炎症反应有关,新陈代谢,和铁运输(图。1 d)。 更仔细地审查这些基因和一个公共数据集(GSE43700比较28第四)透露,集群包含IL10,大约30%(239/770)的基因在第四集群对应IL-10-inducible基因(无花果。1 e(左)代表基因显示,补充图。1 c)。 这些结果表明,IFN-γ广泛打断了IL-10-mediated LPS-induced负面反馈循环负调节炎症,至少部分通过抑制IL10归纳。 动力学实验表明,IFN-γ抑制IL10表达式在LPS刺激的时间进程(补充图。1 d)。 有趣的是,STAT3的结合IL10轨迹增强剂,这种绑定IFN-γ(见下文)提高监管循环的可能性,衰减STAT3绑定有助于减少IL10表情,和减少IL10表达式的结果减少STAT3激活。 去和路径分析显示第四IL-10-inducible基因集群与抗炎和血红素代谢途径有关,而non-IL-10-inducible基因显示,不同的通路相关的脂质浓缩,嘌呤,色氨酸,和铁代谢; 核糖体rna加工; 和蛋白质的稳定性和展开的蛋白质绑定(图。1 e所示,中间,代表基因,补充图。1 e, f)。 测试IFN-γ是否会影响新陈代谢通过改变糖酵解和氧化磷酸化之间的平衡,我们测量细胞外酸化率(ECAR)反映了糖酵解和耗氧速率(OCR)氧化磷酸化的反映。 IFN-γECAR增加类似于有限合伙人,刺激有多大影响OCR(补充图。1克),支持IFN-γ有助于增加糖酵解过程中巨噬细胞激活。

两个不同的基因子集在第四集群可以通过感应部分杰出由Jak-STAT信号与mTORC1信号在启动子和Myc绑定,这是符合以前的报告9(补充图。1 f、h)。 集群IV还包括AP-1-dependent基因等MMP的年代,这与先前的报道是一致的,IFN-γ抑制AP-1通路6,29。 第四类相比,V类,它包含基因协同诱导IFN-γ和有限合伙人,浓缩在炎性细胞因子和趋化因子基因(无花果。1汉英)。 微分调节的基因在集群IV和V IFN-γ火山情节描述中突出显示在无花果。1 f。 这些结果确定两组LPS-inducible基因调控在相反的方向IFN-γ和具有不同的功能和识别作为一个新的IFN-γLPS-induced代谢基因的负调控功能。

我们下一个测试是否IFN-γ同样监管有限合伙人响应与gm - csf的巨噬细胞培养而不是csf(补充图。2 a, b)。 我们发现在GM-CSF-cultured IFN-γ抑制LPS-induced巨噬细胞IL10表达和添加肿瘤坏死因子表达式(补充图。2摄氏度),类似于M-CSF-cultured巨噬细胞。 然后我们调查了本条例使用RNA-seq全基因组。 应用程序相同的分析策略,因为我们使用M-CSF-cultured巨噬细胞GM-CSF-cultured巨噬细胞识别出6个集群的基因我们学期GM-C1通过GM-C6(补充图。二维)。 基因表达的模式是类似的观察与M-CSF-cultured巨噬细胞在无花果。1 b集群中,除了基因的分布不同,大比例的被压抑的基因(集群比较我在无花果。1 b在集群GM-C1补充图。2 d, e)。 值得注意的是,集群GM-C4重现了监管中观察到集群IV-attenuation IFN-γLPS-induced基因表达的; 此外,类似于集群,集群GM-C4包含il - 10和IL-10-inducible基因(补充图。2氟)。 然而,只有部分重叠的基因簇IV (M-CSF-cultured细胞)和GM-C4(补充图。2克),最有可能因为gm - csf基因表达促进不同分化状态和基底比- csf22

我们希望测试初始与LPS刺激是否会有类似的影响IFN-γ反应,即微分调节isg导致相似的转录组集群模式。 我们与LPS刺激巨噬细胞使用耐受化的协议,然后用3 h IFN-γ挑战细胞刺激和RNA-seq执行和聚类分析(补充图。3 a -)。 类似的模式的基因簇观察与实验设计(补充图。3 b)作为观察与交流实验设计(无花果。1 b),这表明LPS调节巨噬细胞IFN-γ响应在一个复杂的方式。 有趣的是,我们发现了一个集群IFN-γ-inducible基因(称为CL3)的感应被LPS抑制预处理(补充图。3 b)。 集群在基因表达模式集群4 CL3对应图。1 b,其中包含LPS-inducible基因的诱导被IFN-γ预处理抑制。 去分析显示浓缩在集群CL3规范化isg重要的抗病毒反应和抗原表达(补充图。3 j)。 此外,有两个集群和CL5氯协同诱导在本实验系统(补充图。3 b); CL5基因与离子体内平衡和趋化作用有关,而与RNA代谢相关基因氯(补充图。3 j)。

IFN-γ抑制LPS-activated增强剂的选择子集

我们希望理解机制抑制LPS-inducible基因通过IFN-γ和测试假设IFN-γ抑制LPS-activated增强剂使用一个外遗传性方法的一个子集。 我们定义活性增强剂作为地区开放染色质(ATAC-seq)探测到位于TSS > 1 kb远离,绑定lineage-determining转录因子(TFs) PU.1和/或C / EBP,并表现出27 3组蛋白赖氨酸乙酰化作用(H3K27-Ac)至少四个条件之一(罗斯福< 0.05 > 2倍的变化任何成对比较;n= 20782剂,补充图。4 b)。 增强器调用验证相对DNase-seq和组蛋白3 monomethylated赖氨酸4 (H3K4me1)数据CD14-positive单核细胞从编码项目(补充图。4摄氏度)。 相似的转录组数据,增强不同监管H3K27-Ac级别分为六大集群(补充图。4 d和无花果。2 a - c)。 H3K27-Ac监管的模式在增强器集群通常类似的基因簇的基因表达模式。 值得注意的是,我们发现增强集群的激活(定义为增加H3K27-Ac)有限合伙人要么是阻塞(集群e4,类似模式基因簇IV)或引起并发症(集群e5,类似模式基因簇V) IFN-γ(无花果。2 a, b,代表基因跟踪图所示。2摄氏度)。 观察到的类似的监管模式是e4和e5增强剂的招聘组蛋白乙酰基转移酶CBP(补充图。4 e); 这些增强器集群没有差异化的总体水平PU.1绑定(补充图。4 f)。 也因此,IFN-γ不同调节LPS-mediated增强剂激活。 我们调查是否相似的调控发生在IFN-γ和有限合伙人被添加到巨噬细胞分化与csf好几天,这将增强景观不同最近分离单核细胞,被用于上述实验。 IFN-γ启动压制LPS-inducedIL10表达,而另娶白细胞介素6肿瘤坏死因子在M-CSF-differentiated巨噬细胞表达,(补充图。2 h,我)。 因此,IFN-γ也抑制LPS-induced H3K27-AcIL10轨迹增强剂(补充图。2 j)。 IFN-γ-mediated的因此,这些方面的监管有限合伙人的反应是类似于最近孤立M-CSF-differentiated巨噬细胞和单核细胞。

图2
figure2

选择性的监管LPS-activated IFN-γ增强景观。一个K - means聚类(K = 5)的增强剂如补充图所示。2进一步过滤(罗斯福< 0.05 > 2倍的变化)和细分为六个增强集群。 热图显示H3K27ac ChIP-seq信号在每个集群增强剂。b箱线图表示归一化标签的数量在每个集群增强剂。 * * * *p< 0.0001,成对样品Wilcoxon符号秩检验。 框包含二十五日第七十五百分位的变化。 胡须延伸到第十和nintieth百分位数。 中央单杠表明中值。 数据是代表两个独立的实验。c代表UCSC基因组浏览器追踪显示规范化tag-density概要文件的增强剂IL10IL23A在四个条件。 阴影盒奉集群e4增强器(左)和集群e5增强器(右)。d热图的基因的比例在每个集群(无花果。1)重叠基因与不同监管相关增强器集群中确定面板一个e箱线图显示有限合伙人之间的基因表达变化和IFN-γ-primed LPS-stimulated巨噬细胞的差异表达基因集群e4或最近的(在100 kb) e5增强剂。 * * * *p韦尔奇的< 0.0001t以及。f箱线图显示e4基因表达的四个表示条件或e5-associated基因。 * * * *p< 0.0001的成对样品Wilcoxon符号秩检验。 框包含二十五日第七十五百分位的变化。 胡须延伸到第十和nintieth百分位数。 中央单杠表明中值。 数据是代表两个独立的实验

我们下一个测试IFN-γ-mediated LPS-induced增强剂的变化之间的关系和基因活动。 值得注意的是,与增强器集群e4密切相关的基因与基因集群IV, V和基因与e5增强剂与集群相关基因(图。二维)。 这些enhancer-associated基因表现出预期的基因表达的模式,即衰减(e4-associated基因)或再加(e5-associated基因)有限合伙人反应IFN-γ(无花果。2 e, f)。 总的来说,这些发现表明,IFN-γ选择性地调节LPS-induced增强剂激活减弱或增强不同子集的LPS-inducible基因的表达。

TF表达和绑定主题划分增强器集群

我们推断的TF表达模式四种实验条件下,结合TF结合主题浓缩在不同的增强器集群,将提供洞察微分调节增强活动的有限合伙人,IFN-γ-regulated TFs。 IFN-γ和342 TFs有限合伙人的表达改变,被划分为六个基因簇在图中定义。1 b基于模式的表达(无花果。3 a, b)。 集群IV TFs (IFN-γ变弱LPS-induced表达式)区别于集群V TFs (IFN-γ加强与LPS)的表达STAT3和AP-1家庭成员BATFFOSL2。 平行分析TF结合图案丰富在图中定义的增强剂的山峰。2 b显示增强器集群e4和e5杰出AP-1的浓缩和统计主题在e4增强剂和IRF图案e5增强剂(无花果。3 c,主题分析,无花果。3 d e、新创主题分析和补充图。5 a、b)。 AP-1主题的浓缩e4增强剂IFN-γAP-1抑制信号是一致的6,30.。 鉴于IFN-γ强烈诱导和激活STAT1(无花果。3 b),主要是促炎作用,缺乏统计的图案在e5增强剂可能会出现令人费解。 然而,这可以解释为以前的工作从我们的实验室和其他组织与IFN-γ显示治疗时间越长用于这项研究结果主要STAT1 IRF网站绑定8,20.,26,31,大概在一个复杂和IRF蛋白质; STAT1绑定衡量ChIP-seq下面的实验进行了分析。 已知的主题分析(图。3 c)建议绑定STAT3 e4 LPS-stimulated条件下增强剂,这是符合完善LPS-induced IL-10-STAT3自分泌循环,并进一步支持Factorbook ChIP-seq编码项目的数据显示co-occupancy STAT3与AP-1代表集群e4增强剂(无花果。3 f)。 此外,IFN-γLPS-induced压抑STAT3信使rna表达(无花果。3 b),尽管STAT3蛋白表达没有改变在这些实验的时间表,最有可能因为蛋白质的稳定性(补充图。5度)。 ChIP-qPCR表明IFN-γ阻塞LPS-induced招聘STAT3和AP-1蛋白质c-Jun e4的增强剂IL10轨迹(无花果。3 g h)。 总的来说,这些数据表明STAT3在e4的规定增强剂的作用,和动机的进一步调查的基因组资料如何影响有限合伙人和IFN-γSTAT3绑定。

图3
figure3

TF表达和绑定主题浓缩在不同的增强器的子集。一个热图91基因表达的转录因子在图中定义的集群。1bTF基因表达的例子从集群中确定确定的六个一个c热图显示P在每个集群价值意义的主题浓缩(定义为在无花果。2据TF)和分组家庭(左)。d热图显示P新创的价值意义的主题浓缩在六个增强器集群。e最重要的是丰富了转录因子(TF)图案被新创主题分析集群e4(左)和集群中使用荷马e5(右)增强剂。fUCSC基因组浏览器追踪显示标准化标记密度H3K27ac ChIP-seq ATAC-seq LPS-stimulated巨噬细胞。 累积在每个e4增强剂TF绑定从项目编码基因(Factorbook)如下所示的踪迹。 盒子附上代表e4增强剂IL10(左)和TNIP3(右)轨迹。gChIP-qPCR STAT3的e4增强器(高速钢+ 6)IL10hChIP-qPCR c-Jun的e4增强器(高速钢+ 6)IL10。 数据描述的实验有两个不同的捐助者(一个)或代表两个(b- - - - - -f)或3 (g,h)独立实验

e4增强子结合STAT3,由IFN-γ镇压

我们下一个执行STAT3 ChIP-seq实验和分析STAT3和STAT1的绑定(GSE43036)8在集群e1-e5增强剂与LPS刺激人类巨噬细胞后,IFN-γ,或两者兼而有之,在相同条件下用在无花果。1- - - - - -3.。 有趣的是,感应STAT3的入住率非常受限制的模式,只有在大幅度增加集群e4增强剂在细胞刺激有限合伙人; 这增加绑定强烈被IFN-γ(无花果。4得了; 代表基因在跑道上IL10,TNIP3,IL4R位点图所示。4 d)。 STAT3的弱很多招聘e5增强剂被IFN-γ没有受到影响,这是符合不同监管的e4和e5增强剂。 STAT3相比,STAT1入住率提高大多数增强器集群在细胞治疗IFN-γ也是LPS诱导的集群e4和e5(无花果。4比)。 正如预期的8,10,STAT1的模式绑定相似IRF1绑定(补充图。6 b, c)。 STAT1绑定到e4增强剂的意义尚不清楚,但增加绑定STAT1 e5增强剂在巨噬细胞治疗IFN-γ+ LPS是符合我们此前提出的模型的协同作用的基因的激活同时绑定STAT1的几个增强剂在这些基因位点8。 总的来说,数据支持的角色IFN-γ-mediated抑制STAT3表达差别绑定在e4增强剂对这些相关的基因。

图4
figure4

微分入住率STAT3和STAT1 e4和e5增强剂。一个热图显示STAT3 ChIP-seq在每个信号增强器集群定义在无花果。2b箱线图描述规范化标签的数量在每个集群增强剂。 * * * *p< 0.0001,成对样品Wilcoxon符号秩检验。c分布的平均信号STAT3 ChIP-seq在每个增强集群LPS-stimulated(上)和IFN-γ-primed LPS-stimulated巨噬细胞(底部)。d代表UCSC基因组浏览器追踪显示规范化tag-density概要文件的增强剂IL10、TNIP3 IL4R,IL23A在四个表示条件。 盒子附上集群e4增强器(蓝色)和集群e5增强器(红色)。e热图显示STAT1 ChIP-seq信号在每个集群增强剂。f箱线图表示归一化标签的数量在每个集群增强剂。g分布的平均信号STAT1 ChIP-seq在每个增强集群LPS-stimulated(上)和IFN-γ-primed LPS-stimulated巨噬细胞(底部)。 数据是代表两个独立的实验,包括至少两个独立的捐助者(一个- - - - - -d)或来自GSE43036 (e- - - - - -g)。 框包含二十五日第七十五百分位的变化。 胡须延伸到第十和第九十百分位数。 中央单杠表明中值

IFN-γ抑制共激活剂和CDK8招聘

统计激活基因表达的转录辅活化因子,如招聘组蛋白乙酰转移酶p300和中介复合物含有丝氨酸激酶CDK8的子集32,33,34。 CDK8反过来强化了转录活动STAT1和STAT3磷酸化的丝氨酸残基transactivation域。 我们希望测试这个想法,IFN-γ抑制共激活剂招募e4增强剂(由IFN-γLPS-activated增强剂抑制)。 我们首先检查共激活剂和CDK8招聘原型e4第四剂与类相关的基因IL10; 对比控制,我们使用e5增强剂与典型的V类协同相关基因的基因白细胞介素6IL23A。 IFN-γ强烈抑制LPS-induced p300的招聘中介的MED1分量,CDK8IL10轨迹e4增强剂而不是IL23A白细胞介素6e5增强剂(无花果。5 a - c和补充图7 a、b)。我们跟进这些结果使用ChIP-seq CDK8绑定获得基因的状况。 引人注目的是,CDK8招聘是最突出的e4 e5增强剂和并行的活动(图。5 d-f和补充图。7 c, d)。 即LPS-inducible招聘CDK8 e4的增强剂被IFN-γ镇压,和e5增强剂被IFN-γ增加。 综上所述,这些数据表明IFN-γ抑制STAT3的招聘和辅活化因子与抑制相关基因的表达增强剂相伴。

图5
figure5

IFN-γ抑制共激活剂和CDK8招聘e4增强剂。一个ChIP-qPCR分析p300入住率在e4增强器(高速钢+ 6)IL10bChIP-qPCR分析MED1入住率在e4增强器(高速钢+ 6)IL10cChIP-qPCR分析CDK8入住率在e4增强剂(高速钢+ 6和HSS-16)IL10和e5增强剂白细胞介素6d热图显示CDK8 ChIP-seq在每个信号增强器集群定义在无花果。2e箱线图(上)表示归一化标签的数量在e4增强器四个表示条件。 * * * *p< 0.0001,成对样品Wilcoxon符号秩检验。 箱线图(底部)表示归一化标签的数量在每个增强集群LPS-stimulated巨噬细胞。 框包含二十五日第七十五百分位的变化。 胡须延伸到第十和第九十百分位数。 中央单杠表明中值。f代表UCSC基因组浏览器追踪显示规范化tag-density概要文件在e4的增强剂IL10TNIP3在四个表示条件(CDK8)和LPS-stimulated条件(STAT3 ChIP-seq和ATAC-seq)。 数据是代表三个独立的实验(一个- - - - - -c),或描绘一个芯片实验使用集中样本独立实验使用四种不同的捐助者(d,e)

STAT3和CDK8绑定定义不同的e4增强器的子集

作为集群划分为IL-10-dependent IV基因和独立的基因,我们想知道e4增强剂是否可以同样细分。 更仔细地审查STAT3绑定到e4增强剂,当rank-ordered根据标签的数量,发现e4增强子分区分成两组,以高(52%,n= 787)或低(48%,n= 739)如果不是缺席STAT3绑定(图。6a)。 我们想知道是否STAT3峰值对应于所激活的增强剂自分泌il - 10,开始解决这个问题通过执行STAT3 ChIP-seq使用巨噬细胞刺激与重组il - 10。 有趣的是,STAT3e4增强剂(在细胞治疗有限合伙人)大致接近增强剂后绑定STAT3与il - 10(图刺激。6 b)。 杰出的STAT3确定哪些额外的特性从STAT3e4增强剂,我们进行主题分析,揭示选择性富集的统计只在STAT3主题e4增强剂(无花果。6摄氏度)。 这个结果的同时,统计主题的选择性富集的倡导者IL-10-inducible集群IV基因(补充图。1克),这表明STAT3入住率高于第四non-IL-10-inducible集群基因的启动子(补充图。8)。 此外,STAT3e4增强剂显示大量的CDK8绑定STAT3相比e4增强剂(无花果。6 d)。 相比之下,在STAT1 CDK8入住率明显更高e5增强剂在IFN-γ-primed LPS-stimulated巨噬细胞(补充图。8 b, c)。 因此,与文献一致,CDK8入住率平行统计招聘在巨噬细胞激活。

图6
figure6

STAT3的力量绑定e4增强剂分为两个子组。一个热图的STAT3在集群e4 ChIP-seq信号增强的四个表示条件。 增强子是分为两个子集:STAT3e4 (n= 787)和STAT3e4 (n= 739)基于日志的截止2归一化标签的数量= 3)。 箱线图(右)描述了标准化在STAT3标签的数量e4和STAT3e4增强剂。b热图的STAT3 ChIP-seq信号在两个子集的e4增强剂(中定义一个在休息和IL-10-stimulated巨噬细胞。 箱线图(右)表明规范化STAT3标签的数量e4和STAT3e4增强剂。c最重要的是丰富了转录因子(TF)图案被使用荷马在STAT3新创主题分析e4(顶部)和STAT3e4(底部)增强剂。d的热图CDK8 ChIP-seq STAT3信号e4增强剂的四个表示条件。 箱线图(右)表明规范化STAT3标签的数量e4增强剂。e的热图SMC1 ChIP-seq STAT3信号e4增强剂的四个表示条件。 箱线图(右)表明规范化STAT3标签的数量e4增强剂在四个条件。 * * * *p< 0.0001,成对样品Wilcoxon符号秩检验。f代表UCSC基因组浏览器追踪显示规范化tag-density概要文件在e4的增强剂IL10TNIP3在指定的条件。g丰富基因本体论(去)和MSigDB分配给STAT3通路基因类别e4增强剂(上半部分)或STAT3e4增强剂(下图)。h热图IL-10-inducible集群IV对应STAT3基因第四e4-associated基因(左面板)或non-IL-10-inducible集群对应STAT3基因e4-associated基因(右面板)。 数据是代表两个独立的实验,包括至少两个独立的捐助者(一个,c,g,h)或描述一个芯片实验使用混合使用两个独立的实验样本(b)或四个不同的捐助者(d,e)。 框包含二十五日第七十五百分位的变化。 胡须延伸到第十和第九十百分位数。 中央单杠表明中值

CDK8-Mediator复合物和cohesin co-occupy监管元素参与enhancer-promoter循环在基因激活35,36,37。 因此我们希望调查CDK8之间的关系和cohesin STAT3的入住率和STAT3e4增强剂。 类似于CDK8绑定,在STAT3 SMC1入住率较高e4增强剂,这种绑定被LPS诱导和抑制IFN-γ(无花果。6 e, f; 代表基因在跑道上IL10TNIP3)。 我们下一个测试是否e4增强剂(STAT3的两个截然不同的群体CDK8SMC1和STAT3CDK8SMC1第四)相关的不同子集的集群基因,如上定义在无花果。1。 基因组区域浓缩的注释工具(大)的分析与STAT3基因相关e4增强子透露浓缩IL-10-related条款和通路(图。6克上面板和6 h),类似于第四IL-10-inducible集群基因(图。1 e和补充图。1 e, f)。 相比之下,与STAT3基因相关e4增强剂显示不同的功能丰富脂质代谢和MAPK信号通路(图。6克,降低板),这部分类似途径与第四non-IL-10-inducible集群相关基因(补充图。1 d-f)和符合浓缩AP-1图案这些基因的启动子和增强子(补充图。1 f, g6摄氏度)。 事实上,与STAT3基因相关e4增强剂的高度代表第四IL-10-inducible集群基因集(53 101; 无花果。6小时(左),而与STAT3基因相关e4增强剂包括第四non-IL-10-inducible集群基因集(18 36; 无花果。6小时,对吧)。 此外,与STAT3基因相关e4增强剂更高度诱导单核细胞的il - 10(补充图。8 d)。 总的来说,这些数据表明,类似集群IV基因,e4增强子分区分成两组:激活的LPS-induced自分泌il - 10,绑定STAT3和CDK8-Mediator cohesin,和那些可能受AP-1或其他未知IL-10-independent机制。

IFN-γ功能抑制STAT3-bound增强剂

增强活动与招聘相关的RNA聚合酶II (Pol II)和增强器RNA转录(厄纳)38,39,40,41。 以证实这一概念,IFN-γLPS-induced灭活剂,分析所显示的组蛋白乙酰化和CDK8-cohesin招聘上面提到,我们更直接测量增强剂使用ChIP-seq测量波尔II招聘活动。 IFN-γ减毒LPS-induced波尔II STAT3的招聘e4增强剂(无花果。7 a、b; 代表基因在跑道上IL10轨迹; 高速钢+ 6和高速钢-16马克增强剂)。 相比之下,IFN-γ增加波尔II STAT1的招聘e5增强剂(补充图。9 a、b; 代表基因在跑道上IL23A轨迹)。 厄纳RNA-seq不能可靠地测量全基因组,但是IFN-γ-mediated抑制显然是在选择基因的增强子等IL10(无花果。7 b证实了基因跟踪5 - 8)和qPCR(无花果。7 c和补充图。9 c, d)。 锁核酸acid-mediated击倒IL10厄纳在增强剂位于16 kb上游(HSS-16)或6 kb的下游(高速钢+ 6)IL10TSS镇压IL10信使rna表达(无花果。7 d),支持厄纳和IFN-γ-regulated增强器活动功能的作用。

图7
figure7

IFN-γ-mediated STAT3-bound e4增强剂的功能失活。一个波尔二世的热图ChIP-seq STAT3信号e4和STAT3e4增强剂(在图中定义。6a)。 箱线图表示归一化在STAT3标签的数量e4增强剂的四个条件(上)和STAT3表示e4和STAT3e4增强剂在LPS-stimulated巨噬细胞(底部)。 * * * *p< 0.0001,成对样品Wilcoxon符号秩检验。 框包含二十五日第七十五百分位的变化。 胡须延伸到第十和第九十百分位数。 中央单杠表明中值。b代表基因组浏览器追踪显示RNA聚合酶II (Pol II)占用,strand-specific RNA转录,STAT3入住率(有限合伙人条件)的增强剂IL10。 盒子附上高速钢+ 6(左)和HSS-16(右)。cRT-qPCR分析增强器RNA(厄纳)表达在两个e4增强剂(,IL10高速钢+ 6和il - 10-HSS-16)和两个e5增强剂(底部,白细胞介素6IL23A)。 数据是代表三个独立的实验。dRT-qPCR分析IL10信使rna在休息和LPS-stimulated巨噬细胞转染表示恢复(IL10-HSS-16厄纳和IL10高速钢+ 6厄纳)。 数据是代表两个独立的实验

讨论

调查IFN-γ转录反应主要集中在基因活化在M (IFN-γ)巨噬细胞分化,与IFN-γ签名中观察到的自身免疫性疾病,协同激活的炎症基因与炎症因素如TLR配体的合作7,10,42,43。 然而,负TLR-induced调节基因表达,其潜在功能的后果和潜在机制并不清楚。 本研究采用转录组和外遗传性方法相结合,获得一些新的见解- IFN-γTLR-induced基因表达的调节。 首先,IFN-γIL-10-inducible抗炎基因的选择性地压制感应也明显调节代谢基因的一个子集。 抑制IL-10-mediated反馈用来放大炎症基因激活,而抑制代谢基因,例如脂肪酸代谢基因与M (il - 4)激活,可以促进M (IFN-γ+ LPS)分化。 第二,IFN-γ抑制TLR4-induced基因通过瞄准TLR4-activated增强剂抑制组蛋白乙酰化作用有关。 第三,IFN-γ抑制至少两个不同的增强剂的子集,其中一个特点是浓缩的属性绑定图案和TLR-induced STAT3的招聘,CDK8和凝聚力。 明显抑制增强器子集是AP-1图案丰富,可以调节代谢基因。 第四,抑制增强子与增强子与superactivated协同相关基因后者港IRF代替统计图案和绑定STAT1代替STAT3。 然而,TLR-inducible调制的增强剂IFN-γ分享CDK8占用的财产,暗示选择CDK8-containing中介复杂的绑定。 开发机制,我们的研究结果提供见解有选择地调节TLR反应促进炎症基因激活和M (IFN-γ+ LPS)巨噬细胞分化。

IFN-γ压制基底休息巨噬细胞基因表达的两种截然不同的表观遗传机制:(1)诱导的负面组蛋白标记H3K27me3招聘EZH2推动者24(2)抑制活性增强剂组蛋白标记H3K27ac通过抑制关键enhancer-occupying转录因子等25。 只有一小部分基因是由IFN-γ-mediated H3K27me3的直接沉积,和我们没有发现这种抑制机制LPS-induced基因表达的抑制。 其他组织表明,转录因子诱导不同的刺激,如IL-4-STAT627和核受体(PPARs和LXRs)可以直接抑制基因转录44。 然而,我们的数据不支持直接压制作用IFN-γ-induced STAT1 LPS-activated绑定独联体监管元素,如启动子和增强子。 虽然我们不能排除STAT1的可能性作为一个转录抑制因子外,更有可能是IFN-γ主要介导基因表达的抑制更多的间接机制STAT1-induced表达抑制剂等信号或转录。 符合这个概念,我们发现一个完整的启动效应需要大于3 h IFN-γ刺激8。 基因表达的模式很可能将随IFN-γ和LPS刺激的相对时间。 未来的工作是需要调查的影响时间地址是否IFN-γ-induced STAT1有任何直接压制功能在其他系统中。

在巨噬细胞,它已经表明,il - 10,通过STAT3在抗炎因子的诱导中起着举足轻重的作用,如BCL3,IL4R,TNIP345,在调节mTORC1-mediated代谢程序包括DDIT446。 因此,失活的LPS-induced IL-10-STAT3-negative IFN-γ监管途径,有助于控制慢性炎症反应。 外遗传性分析已经确定之前无特征LPS-activated增强器区域(集群e4),由IFN-γ选择性地抑制。 值得注意的是,IFN-γ抑制LPS-inducible STAT3绑定在e4增强剂显示失去活性增强剂标志包括组蛋白乙酰化作用,CDK8-cohesin入住率,eRNA-related RNA聚合酶II。 强的e4增强招聘STAT3 (STAT3e4)显示大量的重叠与增强子结合的STAT3的一部分规范IL-10-induced消炎程序; 类似的观察重叠e4-associated和IL-10-inducible基因之间的关系。 鉴于LPS-inducible STAT3绑定IL-10-induced抗炎有关项目,我们的发现可能会提供额外的洞察力自相矛盾的木菠萝抑制剂对LPS响应的影响,即他们抑制STAT3-mediated反馈抑制47。 e4的不同子集增强剂或较低的最小STAT3 LPS刺激(STAT3后绑定e4)与一组不同IL-10-independent基因与不同的功能,如MAPK信号通路和脂质代谢。 我们获得了新的深入了解IFN-γ负调节LPS-induced自分泌il - 10的表达,这是一个主要的直接诱导物STAT3 LPS激活反应。 先前的工作表明,IFN-γ抑制TLR-induced自分泌il - 10生产通过抑制AP-1-related通路,这是有关微分GSK3 MAPK和活动的监管48。 当前的研究扩展了这项工作表明LPS-induced的负面信号导致的监管抑制IL10表达式通过表观遗传失活的增强剂IL10轨迹。

除了抑制LPS-induced IL-10-STAT3自分泌反馈回路,IFN-γ抑制诱导其他组件的有限合伙人响应独立于il - 10。 与以前的工作9,IFN-γ抑制转录的基因参与核糖体RNA加工和蛋白质稳定和下游mTORC1信号和Myc。 最近的一项研究利用co-stimulation IFN-γ的老鼠巨噬细胞il - 4表明,Myc与组件相关联的响应由IFN-γ耐抑制il - 426。 我们的研究表明,长时间暴露于IFN-γ抑制Myc可能克服阻力IFN-γil - 4基因。 mTORC1 Myc基因是细胞代谢的主要监管机构,和IFN-γ压抑基因参与各种代谢过程,如铁运输、嘌呤合成、色氨酸代谢和脂质代谢。 其中,脂质代谢与M (il - 4)函数,色氨酸代谢产物的抗炎反应,在宿主防御和铁运输。 未来的工作将需要决定如何监管这些IL-10-independent TLR4-induced IFN-γ有助于代谢途径的M (IFN-γ+ LPS)表型49,50,51。 总的来说,IFN-γ-mediated抑制抗炎、转化和代谢组件的有限合伙人的反应很可能是协调,使一个完全经典激活巨噬细胞表型。

我们的研究结果强调功能和监管模式的差异之间元素绑定STAT1和STAT3在巨噬细胞激活和有限合伙人的挑战。 以前的工作表明,巨噬细胞IFN-γ-mediated启动期间,基因组从统计网站概要STAT1绑定更改IRF站点,STAT1可以占领的复合物IRF1或(LPS刺激后)ISGF3复杂的一部分8,20.。 符合这些报告,我们发现STAT1结合IRF网站协调与IRF1 e5增强剂,与IFN-γ+有限合伙人共同刺激增加STAT1绑定,这与增强剂增加活动(如组蛋白乙酰化评估),再加相关的集群V基因。 相比之下,STAT3绑定到e4增强剂为统计图案丰富,和关节IFN-γ+ LPS刺激减少STAT3绑定,这与降低增强剂活性和抑制第四集群相关的基因。 这些结果支持模型,即内在的DNA序列(TF绑定图案)在基因组监管元素确定IFN-γ质数或抑制LPS激活的增强剂。 即在IFN-γ-primed巨噬细胞增强剂含有IRF但不是统计网站(例如,e5增强剂)受到监管主要由STAT1和响应表现出增强的有限合伙人,而增强剂,还包含一个统计网站是由STAT3和展览有限合伙人减毒反应。 主题分析还发现,AP-1主题是高纯度STAT3-bound增强剂,由IFN-γ抑制,表明IFN-γ-regulated AP-1转录因子包括BATF和FOSL2可能作为辅助转录因子和配合STAT3调节e4增强剂。 确定额外的辅助转录因子配合STAT1和STAT3的表达不同LPS-regulated基因集可能进一步洞察STATs-dependent转录监管gene-specific的方式。

总之,这项研究提供了见解如何两个刺激可以配合外遗传性层面实现微分调节的基因集不同的甚至相反的功能。 IFN-γ和有限合伙人,微分调节增强剂与不同的序列结构导致抗炎和代谢基因的表达减少,再引起的炎症基因可能会增强炎症反应。 不同的增强剂类可以有针对性的抑制过度炎症。

方法

细胞培养

外周血单核细胞从血液白细胞准备从纽约血液中心购买通过与聚蔗糖密度梯度离心法(热费希尔科学)使用协议特种外科医院的机构审查委员会批准。 样品是匿名的,调查人员无法获得任何可识别的私人信息。 按照指南在人类受试者研究小灵通SF424 (R&R)应用程序指导和基础文档,使用购买去除了识别信息的血液制品不构成人体研究; 知情同意并没有取得特种外科医院。 主要人类CD14+从外周血单核细胞获得,使用anti-CD14磁珠,作为推荐的制造商(Miltenyi研究)。 单核细胞培养在RPMI 1640中(表达载体)补充10% heat-inactivated定义的边后卫(HyClone Fisher)、青霉素、链霉素(英杰公司)、谷酰胺(表达载体)和10 ng / ml人类巨噬细胞集落刺激因子(csf); Peprotech)或20 ng / ml的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm - csf)的存在与否,人类IFN-γ100 U /毫升(罗氏)表示; IFN-γ添加同时csf或gm - csf发起的文化。 有限合伙人购买从Invivogen (tlrl-3pelps)。 IFN-γ和有限合伙人的顺序颠倒在有限合伙人启动实验(补充图。3.)与有限合伙人启动之后,IFN-γ刺激3 h。 CD14 +单核细胞也可以区分为7天- csf (20 ng / ml)与间歇性的csf (20 ng / ml)每2天(补充图。2 h-j)。 IFN-γ启动在这些长期巨噬细胞分化文化是天6和7 48 h。

核糖核酸的分析

从细胞总RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒),和500 ng总RNA是反向转录使用RevertAid第一链cDNA合成装备(Fermentas)。 实时PCR进行了一式三份与快速SYBR绿色主混合和7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司)。 引物序列提供了补充表1

RNA-seq

RNA提取后,库测序是准备使用Illumina公司TruSeq RNA库准备装备后,制造商的指示。 高通量测序(50个基点,paired-end)进行基因组资源威尔康奈尔医学的核心设备。 平均每样本1亿读了。 人类基因组测序读被映射到参考使用星对准器(hg19组装)52使用默认参数和袖扣2.2.1版本53被用来估计大量的记录。 基因的表达水平在每个样本归一化的每千碱基片段记录每百万映射读取(FPKM)。 复制是很高的(R之间的一致性2范围内,0.943 - -0.964)。

RNA-seq分析

差异表达基因(度)被确定使用磨边机v3.16.554,55。 为磨边机读计数分析得到featureCounts v1.5.156。 消除后没有功能(零计数),磨边机的原始数量规范化,紧随其后的是微分表达式分析。 显著上升或下调基因被定义为表达基因p值调整为多个测试(罗斯福)< 0.01和日志2叠化至少1。 生成的热图K-mean集群,我们使用GENE-E (Broad研究所)设置为全球比较和大众化。 K的值被选中在6因为低价值未能识别所有有意义的集群和高价值细分有意义的集群。 发现在不同监管方面丰富的基因,我们使用了大卫的网络工具57、集群分析器和基因集富集分析(GSEA) MSigDB基因集(标志、KEGG REACTOME)。

人类单核细胞il - 10基因表达分析刺激

微阵列数据集被检索GSE43700。 原始数据被分位数规范化标准化方法使用preprocessCore包r .规范化表达水平均在相同的条件和叠化每个基因的平均计算。

西方墨点法

全细胞提取物CD + 14单核细胞对各种治疗条件准备KalB裂解缓冲(150毫米氯化钠,50 mM Tris-HCl (pH值7.5),1% (v / v)特里同x - 100, 1毫米EDTA, 1 xphosstop EASYPACk, Pefabloc并完成EDTA-free蛋白酶抑制剂鸡尾酒),分离通过sds - page和转移到聚乙二烯二氟化物膜按制造商的协议(Bio-Rad)。 感兴趣的蛋白质和抗体探测STAT3(1:1000、细胞信号技术,猫。 没有:12640),phospho-p38(1:1000、细胞信号技术,猫。 没有:9215)和p38(1:1000、细胞信号技术,猫。 没有:9212)在4°C的过夜后通过检测使用HRP-conjugated羊anti-rabbit IgG抗体和可视化皮尔斯ECL免疫印迹基质(热科学),按照制造商的协议。 原始图像的墨迹提供源数据文件。

海马代谢分析

实时细胞外的酸化速率(ECAR)和耗氧速率(OCR)测量使用XF96细胞外流量分析仪(美国海马生物科学、北Billerica MA)与糖酵解后压力工具包(海马生物科学)制造商的指示。 测量是相对规范化水平的DNA决定通过测量荧光强度的细胞染色SYTO 24绿色荧光核酸染色(分子探针,尤金或)。 简而言之,人类CD14+单核细胞被播种在预处理poly-L-lysine-coated XF96细胞培养微型板块(海马生物科学)播种密度为1.6×105细胞每口井和对待IFN-γ(100 U /毫升)2天,然后用LPS刺激(50 ng / ml)。 在试验之前,细胞被冲洗两次,在预热XF试验介质(pH值7.4)补充了1毫米在37°C non-CO谷氨酰胺2孵化一个小时,然后测量速度在7 - 8 37°C复制(单独的威尔斯)通过使用下列化合物连续:10毫米葡萄糖,1μM寡霉素,2 dg和50毫米。 基底OCR药物暴露前测量。 我们计算糖酵解中的糖酵解作用指标指示压力设备手册(海马生物科学)。 ECAR和OCR测量四个独立的捐助者提供源数据文件中。

芯片和ChIP-seq

5分钟在室温下的细胞被交联的十分之一体积的11%甲醛溶液(11%甲醛、50 mM消息灵通的pH值7.5,100毫米氯化钠,1毫米EDTA pH值8.0,0.5毫米EGTA pH值8.0)增长媒体随后5分钟与100毫米甘氨酸淬火。 在4°C细胞颗粒状,用冰冷的PBS洗。 交联与裂解细胞细胞溶解缓冲区(50毫米HEPES-KOH pH值7.5,140毫米氯化钠,1毫米EDTA、10%甘油、0.5% NP-40,和0.25% Triton x - 100)和蛋白酶抑制剂在冰上10分钟和洗洗涤缓冲(10毫米Tris-HCl, pH值8.0,200毫米氯化钠,EDTA 1毫米,0.5毫米EGTA) 10分钟。 溶解样品resuspended,用声波降解法缓冲区(10毫米Tris-HCl, pH值8.0,100毫米氯化钠,EDTA 1毫米,0.5毫米EGTA, Na-Deoxycholate 0.1%, 0.5% N-lauroylsarcosine)使用Bioruptor (Diagenode)与30年代,30年代在高功率输出18周期。 声波降解法后,样本在14000转离心10分钟在4°C和5%的用细胞提取保存作为输入。 结果全细胞提取孵化了蛋白质芯片(EMD微孔)的琼脂糖1 h在4°C。 事先批准提取被孵化与50μl (50% v / v)的蛋白质芯片(EMD微孔)的琼脂糖5μg一夜之间适当的抗体在4°C。 从2×10片溶解产物生成73×107细胞(C / EBPβ,PU.1 STAT3, c-Jun,芯片和RNA聚合酶II)或10×107细胞(p300、MED1 CDK8, SMC1芯片)。 芯片抗体PU.1 (sc - 352), C / EBPβ(sc - 150), STAT3 (sc - 482), c-Jun (sc - 1694), p300 (sc - 585)和CDK8 (sc - 1521)来自圣克鲁斯生物技术。 抗体RNA聚合酶II (mms - 126 r)来自Covance。 抗体MED1架a300型(- 793 a)和SMC1架a300型(- 055 a)来自Bethyl实验室。 隔夜孵化后,珠与声波降解法洗两次缓冲区,一旦与声波降解法缓冲区500毫米氯化钠,一旦与氯化锂洗缓冲区(10毫米Tris-HCl pH值8.0,1毫米EDTA, 250毫米氯化锂,NP-40 1%),一旦与TE 50 mM氯化钠。 DNA中筛选了刚做好的洗脱缓冲NaHCO (1% SDS, 0.1米3.)。 一夜之间,使交联被逆转的孵化65°C。 RNA和蛋白质被消化利用核糖核酸酶和蛋白酶K,分别和DNA纯化DNA芯片清洁&集中器™(Zymo研究)。 ChIP-qPCR化验,免疫沉淀反应分析了DNA定量实时PCR和归一化相对于输入DNA量。

10 ng ChIP-seq实验,每个样品的纯化DNA芯片与适配器的结扎和100 - 300个基点DNA片段DNA纯化准备库使用Illumina公司TruSeq芯片库后准备装备制造商的指示。 芯片库测序(50个基点单头读)使用一个Illumina公司HiSeq 2500音序器外遗传性威尔康奈尔医学核心设施/制造商推荐的协议。 因为限制细胞的数量和减少变化与差异个人捐赠者,染色质免疫沉淀反应进行使用池超过两个样本(STAT3)、四(CDK8和SMC1)不同的捐赠者。 STAT3,第二个实验集中几个样本捐赠者进行复制之间的一致性是评估通过生成散点图和估计皮尔逊相关系数(无花果。S4A)。 确定密切关联复制后,我们进行了生物信息学分析使用复制1和确认关键结果使用复制2。 H3K27ac STAT1和IRF1数据GSE43036

ATAC-seq

ATAC-seq进行描述58。 离心机在500×五万细胞g5分钟在4°C。 细胞球洗一次1 x PBS和细胞颗粒状通过离心使用前面的设置。 细胞颗粒在25μl resuspended裂解缓冲(10毫米Tris-HCl pH值7.4,10毫米氯化钠,MgCl 3毫米2立即,0.1% IGEPAL ca - 630)和离心机500×g10分钟在4°C。 转座酶反应的细胞颗粒resuspended混合(25μL 2×TD缓冲区(Nextera DNA样品制备设备),2.5μL Illumina公司Tn5转座酶和22.5μL nuclease-free水)。 换位的反应进行了30分钟的37°C。 直接换位后,样本使用试剂盒纯化MinElute净化设备。 然后,我们使用NEBNext 2 x放大图书馆片段PCR掌握混合和1.25米的Nextera PCR引物,使用以下PCR条件:5分钟72°C; 30年代98°C; 和热循环在98°C 10年代,30年代63°C, 1分钟72°C。 库是使用试剂盒纯化PCR净化设备产生最终库20 ~ 30 nMμL浓度。 图书馆是放大总共10 - 13周期和使用Illumina公司受到高通量测序HiSeq 2500音序器。

ChIP-seq和ATAC-seq分析

ChIP-seq和ATAC-seq实验,人类基因组测序读被对齐参考(GRCh37 / hg19组装)2.2.6使用Bowtie2版本。(Langmead和扎尔茨贝格,2012),默认参数,和克隆读取从进一步分析。 最少2000万独特的映射读取每个条件得到。 我们使用了从荷马makeTagDirectory其次是findPeaks命令版本4.9.1 (Heinz et al ., 2010)来识别山峰ChIP-seq浓缩的背景。 错误发现率(罗斯福)阈值0.001是用于所有的数据集。 区域重叠与黑名单编码确定的项目被过滤掉。 映射读取的总数在一千万年每个样本归一化映射读取。 ChIP-seq数据被准备自定义可视化跟踪UCSC基因组浏览器。 识别增强区域不同乙酰化在至少四个条件之一(罗斯福< 0.05 > 2倍改变在任何成对比较),我们使用了getDifferentialPeaksReplicates。 pl与参数基因组hg19它- t H3K27ac_L1 H3K27ac_L2 / - b H3K27ac_R1 / H3K27ac_R2 / p增强剂。 从荷马包床,然后合并使用mergePeaks-size。 增强剂的聚类中,我们使用GENE-E (Broad研究所)将全球比较和大众化。 5 K的值被选中,因为较低的价值未能识别所有有意义的集群和高价值细分现有集群。 第三增强器集群(C3)补充图。2摄氏度进一步分为两个集群(e2和e3)在无花果。2基于H3K27ac IFN-γ-stimulated之间的变化(G)和IFN-γ-primed LPS-stimulated (GL)巨噬细胞。 在无花果ChIP-seq信号的分布。4摄氏度g,我们使用了annotatePeaks。 pl命令与参数造2000嘘生成直方图归一化平均分布的标记密度。 为增强剂的功能注释,丰富生物过程和MSigDB通路从大3.0.0版本编译(麦克莱恩et al ., 2010)的每个子集enhancer-associated基因。 去MSigDB通路则排在了名单的基础上p值。 归一化标签的数量用于绘制ChIP-seq和ATAC-seq数据可用的箱线图Excel格式的源数据。

主题富集分析

新创和已知的主题分析进行±100个基点的ATAC-seq高峰集中在重叠PU.1或C / EBPβfindMotifsGenome使用命令。 pl从荷马包。 峰值序列比较随机的基因片段的大小和规范化G + C含量来确定主题丰富的目标序列。

采用多次转染

恢复(LNATMlongRNA GapmeR)被Exiqon设计和合成。 击倒的恢复实验进行使用人类单核细胞Nucleofector缓冲区(Lonza科隆)和AMAXA Nucleofector系统程序Y001人类单核细胞根据制造商的指示。 两个不同的放大器TMlongRNA GapmeRs(负控制A和B)被用作控制。 细胞收获RNA分析转染后24小时。 以下的恢复被用于可拆卸的研究IL10厄纳。 定制放大器IL10厄纳(HSS-16): ATAGAGAGGAGATGCA GCAGTCTAGCTTGGTG。 定制放大器IL10厄纳(高速钢+ 6):GGATTTGGCGGGAGTT TCCTAGTGCCAGAAGC。

统计分析

选择统计测试是基于适当的假设对数据分布和变化特征。 Wilcoxon符号秩检验或双尾配对t以及用于两个配对样本的统计分析。 韦尔奇的t以及或未配对的学生的t以及用于两个不成对的统计分析样本。 被定义为统计意义p< 0.05。 箱线图的胡须代表数据的10 - 90百分位数。 统计分析使用GraphPad棱镜7。


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