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多态变异体rs 1800734影响mlh 1启动子中甲基化获取和等位基因特异性tfap 4结合,导致mrna表达差异

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发表时间:2019-09-17 17:18作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

多态变异体rs 1800734影响mlh 1启动子中甲基化获取和等位基因特异性tfap 4结合,导致mrna表达差异


摘要

错配修复基因muL同源1(MLH 1)在散发性大肠癌的临床重要亚组中的表达被沉默。这些癌症表现为微卫星不稳定(MSI)的高突变性,在预后和治疗反应上与微卫星稳定(MSS)结直肠癌不同。损失MLH 1通常是由于表观遗传沉默与相关启动子甲基化;编码体细胞突变很少发生。在这里,我们使用了大肠癌(Crc)风险变异体(Rs 1800734)在MLH 1启动子来研究人们不太了解的机制。MLH 1启动子甲基化和表达缺失。我们确认rs 1800734与MSI+有关联,但在我们自己的数据和Meta分析中没有证实MSS的癌症风险。利用敏感等位基因特异性检测方法,我们证明MLH 1是rs1800734介导的癌症风险的靶基因。在正常结肠组织中,只有MLH 1启动子甲基化存在较小的等位基因特异性差异,而不存在基因表达上的差异。相反,等位基因在这两种基因之间的差异MLH 1MSI+癌中存在甲基化和表达。我们证明MLH 1转录抑制依赖于DNA甲基化,可以被甲基化抑制剂逆转。rs1800734等位基因影响甲基化缺失率和再表达量。转录因子TFAP 4与rs1800734区结合,但与保护等位基因的结合比保护等位基因弱得多。当启动子甲基化存在时,这两种等位基因都不存在TFAP 4结合。因此,我们认为TFAP 4结合能更有效地保护MLH 1启动子的rs1800734等位基因,使其不受BRAF诱导的DNA甲基化的影响。

导言

结直肠癌(CRC)是发病率和死亡率的主要原因,在英国,其终生风险约为6%。约15%的散发性CRCs缺乏DNA错配修复(MMR),这一过程通常用于纠正自发DNA复制错误。MMR缺陷型癌症在全基因组范围内表现出较高的突变率,但在短重复序列中最明显,导致这些癌症被称为“微卫星不稳定”(msi+)。大多数散发性MSI+癌的MMR基因-MutL同源1(MLH 1)。这一损失MLH 1很少是由突变引起的。相反,表观遗传沉默会发生,高水平的dna甲基化出现在MLH 1启动子。了解MSI+CRCs是如何发展的在临床上是很重要的。Ⅱ/Ⅲ期MSI+CRCs预后较好,Ⅳ期MSI+肿瘤预后较差。msi+crcs对常用化疗(如5-氟尿嘧啶)反应不佳,但免疫检查点抑制剂由于其大量的新抗原而具有靶向性。1,2.

.的重要性MLH 1在crc中,其超甲基化的倾向已经知道了一段时间了。3,并且有大量关于使用MLH 1甲基化和/或MSI是CRC分类中的一个生物标志物。然而,甲基化的生物学机制直到最近才得到详细的研究。方等人.4已在癌细胞株中证明brf癌基因突变介导cpG岛甲基化表型(Cimp),导致cpG岛甲基化MLH 1和其他CIMP标记基因,通过转录抑制基因MAFG4.

对收购的进一步理解MLH 1启动子甲基化起源于对位于5‘非翻译区的rs 1800734单核苷酸多态性(Ss1800734)的研究。MLH 1..在多项候选研究中,rs 1800734与crc风险之间存在关联。5,6,7,8..然而,这种强烈的关联仅限于MSI+癌症,并且在非分层数据集中是弱的或不存在的。有几个小组调查了这种SNP可能导致CRC风险增加的可能机制,尽管结果并不直接。rs1800734风险(A)等位基因与(I)MLH 1肿瘤启动子9,10(Ii)正常组织中CpG岛岸甲基化11,12..也有证据表明转录因子tfap 4(ap-4)的结合被rs 1800734所修饰。13,14 离体体内..然而,刘等人.13检测到无差异MLH 1等位基因特异性表达是TFAP 4等位基因偏向的结果。相反,他们显示了编码蛋白激酶DCLK 3的基因的表达和rs1800734与DCLK 3启动子之间的长距离染色质相互作用。

在这里,我们确认rs1800734与我们自己的MSI+数据集中的CRC风险相关,确认它在MSS癌症中的缺失,并与其他公开可用的MSI+数据集进行元分析。然后我们描述了一项全面的研究,该研究证实MLH 1作为目的基因,并研究rs1800734等位基因之间的关系,MLH 1启动子甲基化,更重要的是MLH 1正常组织中mRNA的表达与结肠癌发生的途径。为了添加这些相关数据,我们通过动态更改来演示甲基化的因果作用。MLH 1启动子甲基化水平,表明rs1800734等位基因改变了甲基化缺失和增益,并对mRNA表达和TFAP 4结合产生下游效应。

结果

rs 1800734与msi+阳性的crc风险密切相关,但与MSS癌无关。

这个MLH 1在多个MSI+结直肠癌数据集中,启动子rs1800734被认为是CRC易感性的候选基因。我们在Victor和QUASAR 2 CRC临床试验的MSI+数据集中证实了这些结果(n=170,补充表)。1OR=1.95,95%CI 1.50-2.55,p=8.04×10−7)。对这些数据和其他5组数据的Meta分析显示,与CRC风险高度相关(OR=1.50;95%CI 1.34,1.66;Pmeta<10)。−106640个病例和8645名对照者5,6,7,8..如果采用等位基因模型,AG杂合子与GG纯合子相比,MSI+CRC的风险增加了1.3倍,AA纯合子的风险增加了2.6倍。这是所有已知的常见CRC易感性SNP中最大的效应大小。值得注意的是,MSI阴性的CRC病例没有显着性关联(OR=1.03,p=0.133),这有力地表明snp在沉默中起着机制作用。MLH 1在MSI+癌症的发展过程中。

rs 1800734等位基因的危险与正常肠组织中等位基因特异性cpg岛岸甲基化有关,但mlh1mRNA表达无一致偏差。

我们对rs 1800734基因型之间的关系进行了综合分析,MLH 1启动子甲基化MLH 1正常肠组织中mRNA的表达(补充表)2),MSI+CRCs(补充表)3)和无柄锯齿状腺瘤(SSA,补充表)4),MSI+CRCs的前病变(图1)。1A)。图形1B显示跨MLH 1正常结肠组织中CPG岛和海岸的测定采用亚硫酸氢钠处理的DNA扩增产物下一代测序(NGS)。正如预期的那样,几乎没有接近rs 1800734或C区的甲基化(用于临床评估)。MLH 1MSI+癌启动子甲基化研究15)在任何样本中。然而,cpG岛上游的甲基化水平在上升,有趣的是,低风险gg纯合子的甲基化水平高于AG杂合子(n=39,补充表)。2(绿色标记),p=0.011,方差分析;AA样本统计分析不足)。虽然与预期相反,但这与以前的研究是一致的。12..因此,我们希望研究这种差异甲基化对正常组织中mRNA表达的可能影响。由于我们预计任何等位基因特异性效应在这个正常组织中相对较小,而在C区没有明显的甲基化,因此我们开发了一种敏感的技术,能够通过下一代测序来检测cDNA中的小等位基因偏差。我们利用杂合子患者对含有rs 1800734的5‘UTR区进行等位基因特异性表达分析,并进行测序和等位基因计数。这使我们能够测量个体样本中的风险与保护性等位基因的比率。图形1B结果表明,这些患者的mRNA等位基因比率是可变的,但与1:1的差异无显着性(n=41,补充表)。2(标记为黄色)p=0.1495 T-测试)。基因组DNA(1:1)的等位基因比例为1:1,证实没有拷贝数变化或PCR扩增偏差。在我们的样本集(ferndez-rozadilla未发表)或公开可获得的GTEx肠道数据集(GTEx数据门户)中也未发现eQTL,这表明rs1800734对正常结肠组织中的mRNA表达没有任何影响,尽管影响了CpG岛岸的DNA甲基化。

图1
figure1

等位基因特异性甲基化与rs1800734在5‘UTR中的表达MLH 1在MSI+癌和SSAs中见,但在正常肠中未见。(a)启动子区域的地图MLH 1显示rs 1800734(chr 3:37034946(Hg 19),黑三角和虚线,hg 19)的染色体位置,第1外显子MLH 1,基因EPM2AIP、邓区C区(黄系)、全甲基化区(长绿区)、等位基因特异性甲基化区(短绿区)和等位基因特异性表达区(橙色区)。(b正常肠道:(左面板)散点图显示该地区所有CPGS的总甲基化水平,样本按基因型分组。每种基因型的黄土曲线用灰色阴影表示标准误差;(右面板)框图显示。MLH 1杂合子cDNA与基因组DNA的等位基因mRNA表达率(A/G)比较。(c癌症:(左面板)散点图显示CPGS中等位基因特异性甲基化水平接近rs1800734,样本按等位基因分组。每个等位基因的黄土曲线用灰色阴影表示标准误差;(右面板)方格图显示总数。MLH 1按基因型分组的所有样本的mRNA水平。(d)msi crc中MLH 1蛋白的丢失(补充表中ID号15-i-25344)3):在VENTANA基准超平台上用抗MLH 1单克隆抗体(克隆M1)进行免疫组织化学检测。1例被认为免疫阴性(右面板;200 X,标度为100μm),当所有的肿瘤细胞核或一组明确的肿瘤细胞未能与特异性抗体反应时,混合非肿瘤细胞的完整核染色。同一样本正常残留大肠粘膜MLH 1免疫阳性(左面板,200 X,标度BAR=100 m)。

在MSI+癌中,rs1800734的危险(A)等位基因与甲基化增加和表达水平降低有关。

在MSI+癌症患者(收集自Insubria大学Asst dei Sette Laghi病理系)的肿瘤中进行了类似的分析,发现MLH 1蛋白表达缺失(如图所示)。1D,补充表3)。MS-MLPA测定的甲基化水平在AA和AG患者中仍明显高于CpG岛的GG患者(n=35,p=0.0002,ANOVA,附图)。1)。我们进一步询问这些样本,以确定这些差异是否是由于杂合子患者中A等位基因水平升高所致,再次使用亚硫酸钠处理的DNA进行PCR扩增,然后用250 bp配对末端读和MiSeq NGS(Illumina),使rs1800734等位基因在C区甲基化。尽管患者之间甲基化程度不同,但在12例杂合子患者中,共15例,我们发现A等位基因甲基化程度明显高于G等位基因(Fig)。1C,n=15份补充表3(rs 1800734基因型AG),p=0.0322,方差分析。在所有3种基因型的患者中,mRNA的表达水平也随基因型的不同而有显著差异(见图)。1C,n=35,补充表3,p=0.0001,方差分析(ANOVA)。表达水平与甲基化水平显著相关(p=1.67×10)。−5,提出了一种因果关系。

我们希望对我们的发现进行2的验证。Nd更大的数据集和更广泛的人口统计。因此,我们对结直肠癌进行了一项类似的分析,与癌症基因组图谱(TCGA COADREAD)中的正常数据相匹配,http://cancergenome.nih.gov/)。我们发现C区和rs 1800734区甲基化在AA和AG基因型肿瘤中显著升高(补充图)。2A,n=432,p=0.000133。当按MSI状态分层时,仅MSI+肿瘤在甲基化水平上仍表现出基因型特异性的显着性差异(图一)。2(n=157,p=0.00115),但MSS肿瘤无等位基因特异性差异(附图)。2B,n=275,p=0.627)。有趣的是,在癌症患者的正常组织样本中甲基化也有一些差异(补充图)。2C(n=31,p=0.0071),与正常组织不同。对同一数据集mRNA表达水平的分析表明,在所有肿瘤样本中,这些基因表达水平与基因型也有显著差异(补充图)。二维空间,n=432,p=0.00153,方差分析(ANOVA)。当按MSI状态分层时,单是MSI+肿瘤样本就显示出基因型间的高度显着性差异(图一)。2(n=157,p=0.0006)而MSS肿瘤标本未见基因型对表达的影响(补充图)。2E,n=275,p=0.627)。正常组织完全没有变化(补充图)。2F,n=31,p=0.99)。在msi+癌症数据集中,表达与甲基化呈高度显著相关(p值<10)。−15,皮尔逊(Pearson)。肿瘤途径的早期病变可能代表MLH 1沉默过程中的中间阶段。无柄锯齿状腺瘤是已知的前体细胞。BRAF-突变型MSI+CRCs16..发展为不典型增生的SSAS迅速进展为癌症,其中大约75%已甲基化。MLH 1启动子与沉默17..茴香等人.18已表明rs 1800734风险(A)等位基因与不典型增生的SSAs甲基化的剂量依赖性增加有关。免疫组化检测AA基因型与蛋白质丢失有关。我们假设ssa会在mrna水平上显示等位基因特异性的表达,所以我们研究了等位基因特异性。MLH 1小批新鲜冷冻rs1800734杂合子BRAFV600E突变的mRNA表达及甲基化(n=5,补充表)4,补充图。3)。我们的样本集缺乏显示等位基因特异性甲基化的能力(p=0.120 T-检验,补充图)。3A)。然而,整个区域甲基化的梯度明显可见,C区(chr 3:37034600-37034800)和包括rs 1800734(chr 3:37034900-37035100,p<10)的区域之间差异显著。−5,T检验),可能表明超甲基化正从C区的CpG岛向rs1800734扩散。我们的SSAs中存在的中间甲基化水平已经足以导致等位基因mRNA表达水平的差异(p=0.039,T-检验,补充图)。3B)与茴香的发现相结合等人.18Rs1800734基因型在结直肠癌锯齿状通路的早期影响DNA甲基化和mRNA转录。

图2
figure2

等位基因特异性甲基化与rs1800734在5‘UTR中的表达MLH 1在MSI+大肠癌中,来自癌症基因组图谱(左面板)的散点图显示,CPGS之间甲基化水平差异接近rs 1800734,样本按基因型分组。每种基因型的黄土曲线均用灰色阴影表示标准误差。rs 1800734(chr 3:37034946(Hg 19),由黑色三角形显示;(右面板)框图显示总计。MLH 1按基因型分组的所有样本的mRNA水平。

dna甲基化的去除会导致带有等位基因特异性偏见的mlh 1转录的去抑制。

msi+crc细胞系CO-115(rs1800734杂合子(A/G),BRAFV600E)在MLH 1启动子(如图所示)3A,平均=91%)MLH 1是无法检测到的Q-PCR(图一)。3B)。虽然一些CPGS在G等位基因上的水平较低,但在A和G等位基因上都存在高甲基化现象。我们假设,在启动子甲基化完成后,未经处理的细胞代表端点状态。我们希望采取一种动态的方法来确定DNA甲基化是否是导致MLH 1转录沉默的主要和因果事件,并观察rs1800734等位基因如何影响甲基化丢失和获取率。5-氮胞苷和5-氮杂-2‘-脱氧胞苷是胞嘧啶的化学类似物和DNA甲基化抑制剂.当用于治疗细胞株时,它们会导致整体甲基化的丧失。19..5μM_5-Aza-2‘-脱氧胞苷(AzaC)作用48h后,所有cpgs的甲基化程度降低(平均甲基化=50%,p<1×10)。−15Anova),在11天后逐渐增加(如图所示)。3A)。有趣的是,在实验的所有阶段,我们观察到风险(A)等位基因的甲基化水平明显较高(p=0.0137,双向变异数),而A和A都需要更长的时间才能失去甲基化,并更快地恢复甲基化。损失MLH 1甲基化伴随着MLH 1mrna,在AzaC处理后4天达到峰值(见图)。3Bp=0.007,方差分析(ANOVA),治疗后第11天开始下降.再次,在每个阶段都有等位基因特异性的差异,风险(A)等位基因的表达水平低于保护性等位基因(G)。再表达MLH 1在另一株MSI+CRC细胞系SW 48中,5AzaC引起的甲基化缺失(补充图)也出现了类似的水平。4).

图3
figure3

AzaC处理CO-115细胞后MLH 1去甲基化和去甲基化的等位基因分析。(a)线状图显示rs1800734区按等位基因分组的单个CPGS甲基化水平的百分比。每个面板显示一个控制或时间点后AzaC处理.rs 1800734的位置标记为(chr 3:37034946(Hg 19),黑色三角形)。(b)条形图,显示总数MLH 1在AzaC处理后的对照细胞和时间点中,mRNA表达和这种表达的等位基因成分。误差条表示复制平均值的标准误差。Asterisks在AzaC细胞中的表达显著增加(*p<0.05)或极显著(*p<0.01)。

rs 1800734处的tfap 4结合是等位基因特异性的。

刘某等人.13在无细胞系统中显示转录因子tfap 4结合。离体rs1800734的保护(G)等位基因的亲和力高于危险等位基因(A)。我们推测,在G等位基因上优先结合的TFAP 4可能具有一定的保护作用。德雷沃DNA甲基化机制。因此,我们证实,在杂合子MSS细胞株COLOO 320中,TFAP 4与含有rs 1800734的区域紧密结合。4A)。此外,我们还发现了与G等位基因结合的高度显著的等位基因特异性偏差(图1)。4Bp=0.00295,t检验)。我们还显示了TFAP 4在第二杂合子MSS细胞系CACO 2中的结合位置和等位基因偏向。5A,bp=0.0145,t检验)。然而,MSI+CO-115细胞在甲基化状态下并无TFAP 4结合(如图所示)。4C(左面板)1800734卢比。值得注意的是,经过AzaC处理以消除甲基化后,我们观察到在所有治疗后的时间点,在rs 1800734处CO-115中存在着较强的TFAP 4结合(如图所示)。4C(中、右面板),反映甲基化和MLH 1表达变化见图。3..此外,我们还不考虑rs1800734基因型对rs1800734基因表达的影响。DCLK 3的上游280 kbMLH 1与以前的报告相反13(补充图。6).

图4
figure4

COLO320(MSS)细胞rs1800734区TFAP 4等位基因特异性结合及AzaC处理后诱导TFAP 4结合。(a与TFAP 4在COL 320细胞上的染色质免疫共沉淀(芯片)显示rs1800734(chr 3:37034946(Hg 19),黑三角形)富集。(b)芯片输入和TFAP 4缺失等位基因分析图,输入A/G等位基因率为无偏,TFAP等位基因下移,对G等位基因有较强的倾向性。星号表示等位基因间差异极显著(p<0.01)。(c)光镜显示,未处理的CO-115细胞中未见TFAP 4结合,在AzaC处理后第4天和第11天可见TFAP 4的富集。(d)动画片显示了rs1800734影响MLH 1表达的机制。(上面板)保护等位基因(G,绿色三角形,上面板)结合TFAP 4(黄色),保护启动子(黑色箭头)不受BRAF和MAFG(蓝色)定向甲基化和/或甲基化从CpG岛岸扩散。灰色阴影区域代表整个区域的甲基化水平。(下小组)。危险等位基因(A,红色倒三角形)不结合TFAP 4,允许MAFG和辅助因子介导启动子区域Dnmt3b甲基化,导致转录抑制。

讨论

我们已经证实,snp rs 1800734的启动子MLH 1与散发性MSI+CRC的风险有关,但对MSS风险无影响。这种对错配修复通路的强烈影响和rs1800734危险等位基因对错配修复途径蛋白MLH 1转录的抑制作用证实了这是一个靶基因。我们的结果表明,风险(A)rs1800734等位基因对正常肠组织MLH 1没有明显的抑制作用,即使使用高度敏感的技术,而且实际上与CpG岛上游的DNA甲基化降低有关,这与以前的观察一致。12..然而,在我们自己和TCGA数据集中,对MSI+癌的甲基化和mRNA表达都有明显的等位基因特异性效应。正如预期的那样,风险(A)等位基因会导致更高的甲基化水平,这与mRNA表达降低密切相关。芬内尔等人.18我们的一小部分SSA表明,等位基因甲基化和表达偏差很可能是在锯齿状通路中非常接近地出现的。

我们也清楚地证明了dna甲基化对于MLH 1用AzaC处理转录沉默,消除甲基化,并显示MLH 1在MSI+细胞中。这个结果意味着甲基化确实是导致MLH 1在散发性MSI+癌症中沉默。有趣的是,即使在这种情况下,风险(A)等位基因更容易获得甲基化,其mRNA在较低水平上重新表达。因此,rs1800734介导癌症风险的机制很可能是通过甲基化获取。A等位基因更容易甲基化的原因可能是由于缺乏TFAP 4转录因子的结合,刘指出等人.13..我们证实了他们的结果,即在非甲基化的CRC细胞中,TFAP 4的结合确实存在强烈的偏见,这种结合依赖于MSI+细胞AzaC处理后的启动子去甲基化。

TFAP 4不太可能是唯一的转录因子结合在rs 1800734和公开可用的基因组宽芯片-seq实验显示,多个蛋白质结合在该区域(ENCODE,UCSC)。事实上,tfap 4已被证明属于一类增强子结合因子,对于辅助因子的补充和激活非常重要。20..这表明它可能是决定整个区域蛋白质结合和潜在染色质景观的一个主要因素。TFAP 4也与另一种与SNP相关的疾病(rs 12722522,1型糖尿病)特异结合等位基因。21)提示它可能在SNP性状关联的子集中发挥更广泛的作用,以等位基因特有的方式招募激活因子。因此,正如我们的数据所表明的,TFAP 4对德雷沃MLH 1启动子的甲基化不太可能是直接的,因此可能只提供部分保护,使rs1800734保护性(G)等位基因仍能获得甲基化,但速度较慢或低于风险(A)等位基因。

刘某等人.13提示rs1800734等位基因特异性TFAP 4可能通过与DCLK 3基因启动子的长距离相互作用而影响肿瘤通路,从而促进上皮间质转换相关基因的表达。然而,我们无法证实这一发现。我们未能检测到DCLK 3在MSS或MSI+细胞系中的显著表达。我们已经清楚地证明,rs 1800734只与MSI+癌症的风险增加有关,即那些存在功能失调的MMR通路的癌症,并且只改变这些癌症中的甲基化,而不是在MSS癌症中。因此,在MMR中没有已知作用的基因不太可能在rs 1800734相关的癌症风险中起主要或致病作用。

我们的数据,结合上述其他研究,支持普遍的假设,即MLH 1抑制是rs1800734导致癌症风险的主要机制。由于我们的大多数MSI+癌(23/35)和我们所有的SSA样本也带有BRAFV600E突变,我们认为rs1800734很可能通过冯描述的BRAF/MAFG途径影响甲基化的获得。等人.4..图形4D代表我们建议的模型,其中TFAP 4,与辅助因素结合在G保护等位基因启动子区域内。这限制了BRAF激活的MAFG复合物的进入,从而减少了DNA甲基化从CpG岛岸的扩散。在A等位基因上,TFAP 4结合频率较低或亲和力较低,允许MAFG进入和甲基化扩散。

虽然rs1800734在CRC发展过程中的作用越来越明显,但也值得注意的是,MLH 1启动子甲基化的积累是如何容易逆转,从而导致MLH 1的重新表达。MLH 1启动子甲基化在其他癌症类型中的重要性还不太清楚,但它经常出现在子宫内膜中。22、胃23)癌症和肺癌24膀胱25,以及一些血液病性恶性肿瘤26..抑制DNA甲基化的药物,如氮胞苷,已经被批准用于治疗某些癌症。然而,随着crispr技术的出现,更精确的去甲基化已经成为可能。27可以在设计未来的治疗方法时加以利用。

方法

病人样本

在补充图中给出了本研究中使用的所有患者样本集的摘要。7..用于基因研究的病人样本在艾伦有报道。等人坎贝尔等人.Raptis等人惠芬等人.5,6,7,8,28加上我们使用临床试验样本的数据集(QUASAR 2)29维克多30,31)。所有患者都进行了Illumina tagSNP或定制阵列的基因分型,并按前面所述进行了质量控制。

在牛津大学接受结肠镜检查的317名英国白种人的正常结直肠活检,如前所述。32,进行等位基因特异性甲基化分析和MLH 1 mRNA表达。福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)CRC MSI+肿瘤,用于甲基化、表达和rs 1800734的分析,收集于Insubria大学病理系。选择了35个连续的散发性CRCs,显示MSI和MLH 1/PMS 2免疫组织化学缺失。33..根据世界卫生组织(世卫组织)消化系统肿瘤的分类,对所有CRCs进行了组织学检查。34和TNM分期系统35这些患者为20名女性和15名男性,平均年龄为77岁(范围:55-88岁)。32例发生在右结肠,1例发生在降结肠,其余2例发生在乙状结肠。无柄锯齿状腺瘤在内镜下切除后采集新鲜和冷冻。

伦理审查

根据“赫尔辛基宣言”的原则,在知情同意和道德审查委员会的批准下,收集患者和对照组的血液和组织样本以及克林科-病理资料。

维克托和类星体研究的伦理批准来自西米德兰研究伦理委员会(Edgbason,伯明翰,英国;REC参考:04/MRE/11/18)。Victor试验由癌症研究运动、多中心研究伦理委员会和参与中心的研究伦理委员会进行了审查。从牛津郡研究伦理委员会A(REC 10/H 0604/72)获得正常患者样本的伦理批准。福尔马林固定石蜡包埋CRC、MSI+肿瘤样本研究已获Ospedale di Circolo di Varese伦理委员会(No.0037028)批准。无柄锯齿状腺瘤经牛津拉德克利夫生物伦理委员会批准(09/H 0606/5+5 ORB生物基底瘤,13/SL/前体病变)。

SNP基因分型

用KASP对rs1800734进行了基因分型。TM技术根据制造商的指示(LGC)。引物列在补充表中4.

甲基化分析

用DNeasekit(QIAGEN)从新鲜细胞或组织中提取DNA,用高纯度FPET DNA分离试剂盒(ROCHE)从FFPE组织中提取DNA。根据制造商的指示,使用EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo Research)进行了亚硫铁矿DNA的转化。用Pyromark PCR试剂盒(Chiagen)扩增转化DNA,用带有Illumina特异性序列标签的CpG游离引物进行扩增,以确保甲基化和非甲基化模板的无偏扩增(补充表)4)。每个病人的放大器都用一组自定义的索引标签和引物编码在一起。36..在MiSeq(Illumina)上,使用250 bp的配对末端测序,根据制造商的指示,对多达96个样本进行了测序。MiSeq输出被分解并生成FASTQ文件(Basesspace,Illumina)。对序列进行质量评估和微调(FastQC和TrimGalore,Babraham生物信息学),然后对甲基化进行比对(Bismark,Babraham生物信息学)。

采用SALSAMS-MLPAME011错配修复基因试剂盒(B3版)对每个样品进行MLH 1甲基化分析。MS-MLPA按照制造商的指示执行,数据分析用Coffalyser软件v.8(MRC-荷兰)进行。

mRNA分析

用RNeasekit(QIAGEN)从新鲜细胞或组织中提取RNA,用高纯度FPET RNA分离试剂盒(ROCHE)从FFPE组织中提取RNA,并根据生产厂家的指示,生成cDNA(大容量cDNA逆转录试剂盒,应用生物系统)。基因表达用Taqman基因表达现成混合试验(应用生物系统、热裂变)进行量化和归一化。用Illumina标记引物扩增cDNA,检测等位基因特异性MLH 1的表达(补充表)4)在MiSeq(Illumina)上进行NGS测序。修剪后的fastq序列使用bwa-mem和rs 1800734变体对齐。37.

细胞培养

在Dulbecco改良的Eagles培养基或RPMI-1640培养基中添加10%的胎牛血清和1%的青霉素链霉素(Sigma),在5%CO的37℃下培养细胞系。2.

染色质免疫沉淀

大约108细胞用1%甲醛交联10 min,用125 mm甘氨酸中和,用冰凉的pbs洗涤,刮除。经2次进一步PBS洗涤后,用Bioruptor(Diagenode)处理细胞,以最大速度离心10 min,4°C离心10 min,IP稀释缓冲液(1%Triton-100,2mm EDTA,150 mm NaCl,20 mm Tris),再用1%SDS、10 mm EDTA、50 mm Tris-HCl、蛋白酶抑制剂对细胞进行再悬浮。免疫共沉淀约5μg抗体(抗TFAP 4圣克鲁斯生物技术,sc-18593x)在4°C下过夜,然后与50μl蛋白G Dynabeads(Invitrogen)孵育4小时。用TSEI(0.1%SDS,1%TritonX-100,2mm EDTA,20 mm Tris,150 mm NaCl),TSEII(0.1%SDS,1%TritonX-100,2mm EDTA,20 mm Tris,500 mm NaCl),LiCl缓冲液(0.25 LiCl,1%np-40,1%去氧胆酸盐,1 mm EDTA,10 mm Tris-HCl)和TSEII(1%SDS,0.1 M NaHCO)洗脱。3..用PowerUp SYBR™绿色主混合物和覆盖MLH 1启动子区域的引物对1 ul DNA进行一式或三份的SYBR绿色qPCR分析(补充表)5).

5-α-2‘-脱氧胞苷治疗

贴壁半流MSI+细胞在标准培养基(AzaC,Sigma A 3656)中用5μm 5-Aza-2‘-脱氧胞苷(5μm-5-Aza-2’-脱氧胞苷)处理48h(24小时后补充AzaC)。去除AzaC,用PBS冲洗细胞,然后在标准培养基中培养0、4、7和11天。RNA和DNA同时提取采用AllPrep试剂盒(Chiagen)和MLH1mRNA表达和启动子甲基化评估。芯片是在AzaC处理后进行的,如前所述。

统计分析

用plink进行SNP关联研究。所有其他统计分析均使用R进行,除非另有说明。用核心R函数、ggplot 2或EXCEL绘制图形。


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