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Ta*p63和GTAP 63通过将抑制元件转化为额外的反活化结构域,在质量控制中实现了更严格的转录调控

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发表时间:2019-09-17 16:27作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

Ta*p63和GTAP 63通过将抑制元件转化为额外的反活化结构域,在质量控制中实现了更严格的转录调控


摘要

p53同源基因p63在生殖细胞上皮组织的发育和质量控制中起着重要的作用。这两个函数由p63的两个不同的异构体执行。它们是由不同的启动子产生的,导致具有N端反激活结构域(TAP 63)或截短形式(ΔNp 63)的异构体。除了这两个N端异构体外,还发现了第三个N末端长度更长的异构体,命名为TA*p63。在男性生殖细胞中发现了与TA*p63非常相似的第四个N端异构体GTAP 63,它参与了遗传质量控制。本文对TA*p63α和GTap 63α进行了表征,并证明了它们的N端扩展稳定了较短的TAp63α蛋白所采用的封闭的、只有二聚体的构象。这两种蛋白都可以被两个激酶Chk 2和CK1激活,从而形成开放的四聚体状态。在这种构象中,N端延伸作为增强转录活性的一个额外的反活化结构域.通过这一机制,被抑制蛋白与蛋白活性状态之间的转录活性差异相对于TAp63α增强。最后,我们用质谱法证明TA*p63α在乳腺癌细胞株SUM 159中与突变型p53一起在蛋白水平上表达。阿霉素治疗后,TA*p63α被激活,为抗癌提供了一个潜在的新工具。

导言

人类基因组测序已经确定了大约23,000个开放阅读框,这大大低于最初估计的基因数目,也低于在其他更原始生物体中发现的基因数目,例如,扁蚤,它有31000个基因1..然而,在蛋白质水平上,人类蛋白质组的复杂性是通过剪接事件以及使用替代启动子和翻译起始位点来提高的。这些过程产生具有不同活动的异构体。通过组织特异性异构体的表达,基因组编码的蛋白质功能得到了极大的扩展。组织特异性功能分配给个体的一个例子是抑癌基因p53家族,其三个成员分别为p53、p63和p73。这三种蛋白质中的每一种都以不同的启动子结合在一起,产生不同的N端和C端剪接事件而形成的几个亚型。2,3..p63最能了解个体亚型的组织特异性功能。Δnp 63α亚型在表皮等分层上皮组织的基底层表达,参与角质形成细胞增殖和分化的调控。4,5..它的特点是,由于使用了另一种启动子,Tap 63全长α的前69个氨基酸(Aa)被替换成一个14 aa亚型独特肽。2..这种异构体在小鼠模型中的失活会导致严重的发育缺陷,如肢体截断、缺乏多层皮肤和其他上皮结构。4,5.

第二种p63亚型是TAp63α,它包括全长N端反活化结构域(TAD)。这种异构体在卵母细胞中高表达,作为遗传质量控制因子。6,7..哺乳动物卵母细胞在减数分裂前期就会停止,在减数分裂前期,卵母细胞在原始卵泡中储存很长一段时间。在静止的卵母细胞中,tap 63α采用不活跃的、封闭的、只有二聚体的构象。8,9..一旦检测到dna双链断裂,它就会被激活,采用活跃的、开放的和四聚体的构象,通过表达bh3纯蛋白noxa和puma来触发卵母细胞死亡。10,11..这种激活需要启动激酶chk 2的连续作用。12,磷酸化tap 63α中的单一丝氨酸和再磷酸化4个残基的刽子手激酶CK1。13.

在p63的最初克隆过程中,报告了第三个N端变异,称为TA*p63。2..Ta*p63是由另一个翻译开始站点创建的,该站点最终向TA域添加了39 aa N。在p21启动子构建的Saos 2细胞中,TA*p63α的转录抑制程度甚至超过tap 63α。2..此外,我们还发现,在人类和类人猿的睾丸中,也存在一个N末端延伸的异构体。这种名为GTap 63的异构体是在大约1500万年前通过整合人类内源性逆转录病毒9(ERV 9)的长端重复序列(LTR)而形成的。14..GTAP 63α是男性睾丸中TAP 63α的对应体,负责确保基因组的完整性。在dna损伤后,通过caspase在其C-端的切割来激活该异构体,从而去除反式激活抑制区(TID)。15..然而,在不存在遗传毒性应激的情况下,GTAP 63α是不活跃的,尽管它在未受胁迫的生精前驱物中是高表达的。生精前体的表达确定了GTAP 63α的组织特异性功能,但至今还没有关于TA*亚型的这种生物学功能的报道。然而,最近,在一位显示肢体截短的病人中发现了TA*特异性结构域p63的一个突变,首次提供了这种特殊异构体与其生物学功能之间的联系(将在另一份手稿中报告)。此外,据报道,TA*特异性肽的突变发生在一些癌症患者(https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic, http://www.cbioportal.org/)。在这里,我们描述了调控TA*p63α和GTAp63α转录活性的分子机制,作为理解它们的特殊功能的基础。

结果

TA*p63α和gtap 63α的N端伸长导致了二聚构象的进一步稳定。

确定TA*p63和GTAP 63特异性N-末端的序列可分别分为两个子结构域:两个肽的C-末端18 aa是相同的(在下面的GTA*肽中称为),N端序列分叉(称为TA*和GTA肽)。图形1概述了不同的p63亚型、TA*p63和GTAP 63特异性N端的主要序列以及不同的转录起始位点。

图1:编码N端p63异构体的外显子、结构域以及p63异构体的寡聚构象.
figure1

a睾丸特异性GTAP 63由上游外显子U1编码,该外显子来源于逆转录病毒LTR插入。mRNA剪接将这些外显子直接连接到外显子2,即GTA*肽和TAD的N端部分,从而跳过第1外显子,Ta*p63被编码在第1外显子上。主要剪接事件用实线表示,很少用虚线拼接,起始密码子用箭头表示。b相应外显子、起始密码子N端p63亚型的氨基酸序列用箭头表示。cp63异构体的结构域和寡聚构象。与TAP 63相比,GTAP 63和TA*p63具有N端伸长,分别由TA*-或GTA-肽和共同的GTA*-肽组成,而剩余结构域均为三种异构体所共有。ΔNp 63具有一个截短的反活化结构域。C端β-和γ-异构体是通过交替剪接创建的.只有tap 63α的非活性态具有二聚体寡聚构象,所有其他tap 63和Δnp 63亚型均呈四聚体构象。

在早期的研究中,我们已经证明抑制tap 63α的转录活性是以形成一个封闭的、只有二聚体的状态为基础的,并且对这两个dna的亲和力都降低了。6,8以及像p 300这样的协同激活剂16..为了研究TA*p63α和GTap 63α是否为封闭的二聚体构象,我们在H 1299细胞中同时表达了两种亚型和TAp63α作为对照,并用蓝-自然(BN)-PAGE分析了它们的寡聚状态。图形2A表明这三种形式都以封闭二聚体的形式存在。尺寸排斥色谱(SEC)分析证实了这一发现(补充图)。沙一)。这些结果提示TA*p63α和GTap 63α的转录活性是通过其寡聚状态来调节的,类似于TAP 63α。

图2:TA*p63α和GTAP 63α的寡聚构象和转激活势。
figure2

amyc标记的TAP 63α、TA*p63α和GTAP 63α的BN-PAGE分析。在H1299细胞(12孔板)中瞬时转染携带p63基因的300个纳米表达载体。转染24h后收获细胞。用T(四聚体)、D(二聚体)和M(单体)表征不同寡聚态的迁移。对于所有三种异构体,只有二聚体是可检测的。用抗myc抗体(4A6,Merck)进行免疫印迹。bp21启动子上TAp63α、TA*p63α和GTAp63αwt的反活化(TA)检测。以p53为阳性对照。将每个质粒(pcDNA 3、pGL 3和PRL-CMV)的100毫微克(pcDNA 3、pGL 3和PRL-CMV)瞬时转染Saos-2细胞(12孔板).转染24h后取细胞,进行检测。条表示生物三份的平均值,误差条代表标准差(SD),交叉表示技术复制的平均值(c用免疫印迹法对Saos-2细胞p21启动子进行TAp63α、TA*p63α、GTAP 63α和p53蛋白水平的检测。2B)。以GAPDH为加载对照。d, eTa滴定法测定p21启动子上TA*p63α和GTap 63α与TAp63α的含量。在Saos-2细胞中瞬时转染pGL 3和PRL-CMV 100毫微克,p63 DNA量增加(10 ng、25 ng、50 ng、100 ng、150 ng)。在共350 ng DNA中加入空载体进行转染(12孔板)。转染24h后取细胞,进行检测。蛋白质水平采用Westernblotting法测定。折叠诱导用白色条表示,相对蛋白质水平用蓝色条表示。TAp63α最高含量的蛋白质水平设置为1。点代表每种生物三份的蛋白质水平。f, g对Saos-2细胞中p21启动子进行TAP 63α、TA*p63α和GTAp63α蛋白水平的免疫印迹。2C,d)。使用GAPDH作为装载控制。

对过表达蛋白的Saos-2和H 1299细胞的TA检测表明,TA*p63α和GTap 63α的活性甚至低于TAp63α的活性(参考文献)。2、图1.2B,c和补充图。S2A-f)。作为对照实验,我们证实TA*p63α和GTAp63α均定位于细胞核,排除了转录活性低下是由细胞定位改变引起的假说(补充图1)。S2g)。在此之前,我们已经证明了Tap 63α的高表达水平会导致一小部分四聚体和活性构象的形成,从而产生可测量的转录活性。17..两种N端延长的p63异构体的活性降低,可能是封闭二聚态热力学稳定性较高的结果。为了研究这个问题,我们进行了TA滴定实验,通过增加DNA的数量转染Saos-2细胞。2D-g)。对于TAP 63α,启动子诱导与蛋白水平呈强相关关系,而TA*p63α和GTap 63α活性随蛋白水平的升高而升高。这表明N端扩展有助于二聚体和非活性态的额外稳定.

在p63中,TAD由单个螺旋组成。16这对于稳定二聚体状态至关重要。9..突变TAp63α中的三个AA F16A、W20A和L23A(FWL突变体)破坏了关闭状态,并触发了一个开放的四聚体构象的形成。8..我们假设,在TA*和GTA异构体中,通过N端延伸使二聚体稳定,即使在FWL突变体中,也可能导致更高的稳定性。通过SEC实验分析了tap 63α的fwl突变体,发现了预期的四聚体状态(参考文献)。8还有无花果。3A)。而TA*p63α和GTAp63α的FWL突变体表现出显著的二聚体组分,进一步证实了N端序列的稳定作用。3B,c).

图3:与Tap 63α相比,新的异构体在二聚体状态下表现出更高的动力学稳定性。
figure3

ac兔网织红细胞裂解液中TAp63α、TA*p63α和GTAp63αFWL表达的SEC分析。溶菌物用Superose 6 PC 3.2/30柱。采用Westernblot方法收集、分析和定量各组分。所有分数的强度之和等于100%。实验进行了五次,误差条显示SD。d尿素BN-PAGE对myc标记的TAP 63α、TA*p63α和GTAP 63α进行Westernblotting。将两个携带p63基因的纳米表达载体瞬时转染H 1299细胞(10 cm盘)。转染24h后收获细胞。溶菌物用不同浓度的尿素在冰上孵育,然后用在凝胶上。D(二聚体)和M(单体)表征了不同寡聚态的迁移。由于p63四聚结构域的本征不稳定性,凝胶上出现了单体。39

Tap 63α的四聚体态是热力学最稳定的四聚体态,而二聚体态是一种运动俘获态,仅为亚稳构象。9..TID之前序列中的磷酸化15在tap 63的C端,α作为触发器来克服这一动能障碍,并通过弹簧激活机制将p63转化为热力学首选的四聚体。9,12,13..通过自然触发(p63情况下的磷酸化)以及温度、pH或化学变性剂的轻微失稳,运动捕获态可以转化为热力学上更稳定的状态。18,19..在早期的实验中,我们发现相对较低的尿素浓度足以将tap 63α转化为开放的四聚体状态,而不影响单个结构域的折叠。9..我们用不同尿素浓度培养了3个p63α亚型,并在BN-PAGE上进行了分析。图形三维空间(及附图。S3)表明,与TA*p63α和GTAP 63α相比,TAP 63α在较低的尿素浓度下发生了明显的转变。这些数据清楚地揭示了TA*p63α和GTap 63α的不活跃和二聚构象比Tap 63α的相应状态更稳定,这是由于N端长度进一步稳定所致。

TA*p63α和GTAP 63α对化疗药物的激活作用

在卵母细胞中,Tap 63α通过磷酸化依赖机制(包括激酶Chk 2和CK1)在基因毒性应激引起的DNA损伤后被激活。我们想测试更稳定的TA*p63α和GTAp63α二聚体是否也能通过Chk 2和CK1被激活。为了激活转染的U2OS和H 1299细胞的DNA损伤反应通路,我们用10 M阿霉素(Dox)处理表达野生型TA*p63α或gtap 63α的U2OS和H 1299细胞6 h,并以S 582/S583A突变体作为对照,去除Chk 2启动位点以防止四聚。13..图形4A,b(及附图。S4a,b)证明Dox能激活所有三种亚型,使其呈四聚体状态,而S582/583 a突变也能阻止TA*p63α和GTAp63α的激活。用chk2抑制剂(bml-277,merk)或CK1抑制剂(pf 670462,Sigma-aldrich)也可以防止四聚,进一步表明TA*p63α和gtap 63α的激活遵循与tap 63α相同的机制。13(无花果)4C).

图4:激酶Chk 2和CK1能磷酸化和激活TA*p63α和GTA 63α,与Tap 63α相似,但不能达到高四聚体/二聚体比值。
figure4

a, b对wt和Chk 2启动位点突变体(S 582/S583A)进行了BN PAGE和磷移SDS-PAGE分析,对带有myc标记的TA*p63α和GTA 63α进行了Westernblotting分析。在U2OS细胞(12孔板)中瞬时转染携带p63α基因的300株纳米粒表达载体。第二天,用10 mDox处理细胞6h,T(四聚体)、D(二聚体)和M(单体)显示不同寡聚态的迁移。上、下面板b在下面板中显示具有额外对比度增强的相同数据。c稳定表达Myc标记的TApp 63α、TA*p63α或GTAP 63α的H 1299细胞裂解物的BN PAGE和磷移SDS-PAGE分析。采用抗myc抗体(4A6,Merck)进行westernblot分析。细胞预孵育1h后,加入10μm Dox,6 h后再加入10 mDox,再加入CK1抑制剂(PF 670462,Sigma-Aldrich)(5,25,50 M),培养1h。用T(四聚体)、D(二聚体)和M(单体)表征不同寡聚态的迁移。以长春新蛋白作为负载对照。蛋白水平在BN-PAGE上被调整为相同的p63量,通过先前的westernblot分析。用于检测磷光位移的sds-page没有进行输入调整。

尽管对所有三种异构体的激活机制都有这种定性的相似性,但数量上的差异仍然存在。对四聚体/二聚体比值的分析表明,TA*p63α和GTAp63α在Dox处理后表现出明显的二聚体状态,而TAp63α几乎完全转化为四聚体(附图)。S4C)。四聚反应动力学的测定显示出类似的行为。TAp63α经1h后部分变为四聚体,而TA*p63α和GTAp63α在2~4h开始变为四聚体,未达到TAP 63α所见的高四聚体/二聚体比值。S4C).

TA*p63和GTAP 63的转激活势

早期的结果表明,TA*特异性N-末端也可以部分抑制短的γ-C-末端亚型的转录活性。2..由于这些异构体不能形成封闭的二聚体,其抑制机制必须不同于在TA*p63α中观察到的抑制机制。为了解决这个问题,我们研究了N端肽对开放的四聚体β-和γ-异构体转录活性的影响。5A和补充图。S5a-c)。我们无法检测到p21启动子上转录活性的显著差异,但我们注意到TA*p63和GTap 63的蛋白水平低于TAP 63(补充图)。S5a)。为了进一步将启动子活性与蛋白质水平联系起来,我们进行了TA滴定实验(图1)。5B-d)。对于这一分析,重要的是工作低于饱和水平,这是不幸的情况下,TAP 63γ已达到低的dna浓度。实验结果表明,这两种N-末端异构体的活性均不低于Tap 63,因此N-末端肽对p63的构成性四聚体亚型没有抑制作用。而折叠诱导率和蛋白质浓度的比值表明,TAP 63*和GTap 63蛋白的特异性转录活性高于Tap 63的转录活性。

图5:组成型四聚体TA*p63和GTAp63异构体的反激活势及其与p 300 Taz2结构域相互作用的相关性。
figure5

ap21启动子上C端TA*p63和GTApp 63亚型与TAp63C末端亚型的Ta测定。p53wt为阳性,p53R175H突变为阴性对照。将每个质粒(pcDNA 3、pGL 3和PRL-CMV)的100毫微克(pcDNA 3、pGL 3和PRL-CMV)瞬时转染Saos-2细胞(12孔板).转染24h后取细胞,进行检测。b, cTA*p63γ和GTAP 63γ的TA滴定法测定p21启动子上的TAP 63γ。在Saos-2细胞中瞬时转染pGL 3和PRL-CMV 100毫微克,p63 DNA量增加(10 ng、25 ng、50 ng、100 ng、150 ng)。在共350 ng DNA中加入空载体进行转染(12孔板)。转染24h后取细胞,进行检测。蛋白质水平通过Westernblotting测定。折叠诱导用白色条表示,相对蛋白质水平用蓝色条表示。TAp63α最高含量的蛋白质水平设置为1。点代表每种生物三份的蛋白质水平。(d对Saos-2细胞p21启动子进行TAp63γ、TA*p63γ和GTAp63γ蛋白水平的免疫印迹。以GAPDH为加载对照。用p63抗体ab124762(ABCAM)检测p63亚型,其敏感性较高。eTA*/GTAp63亚型(TA*p63:Y18*F22*,W31*Y35*;GTAP 63:.W9‘F12’V15‘,W29’Y33‘)N-端丙氨酸突变体的TA分析。以p53为阳性对照,P53 R175H突变为阴性对照。将每个质粒(pcDNA 3、pGL 3和PRL-CMV)的100毫微克(pcDNA 3、pGL 3和PRL-CMV)瞬时转染Saos-2细胞(12孔板).转染24h后取细胞,进行检测。条形代表生物三份的平均值,误差条代表SD,交叉代表技术复制的平均值。f用p 300的Taz2结构域和N端荧光标记的TA*-GTA*-(1*-39*)或GTA-GTA*-(1‘-37’)肽进行荧光各向异性实验。随着p 300 taz2结构域浓度的增加,每个测点的肽浓度为100 nm。

基于这一结果,我们推测,在开放的四聚体状态下,TA*和GTA序列实际上可能通过作为附加的跨激活域来增强转录活性。使用Phyre 2服务器进行二级结构预测20确实显示TA*,GTA和GTA*肽的螺旋构象(补充图)。S6a)。在相应区域的螺旋轮投影中,大量疏水残基位于与TAD(补充图)中FWL基序相似的预测螺旋的同一位置。S6B)。对于TA*肽,这些残基为Y18*和F22*,对于GTA-肽W9‘,F12’,V15‘,以及共同的GTA*序列W31*和Y35*(TA*编号)。

利用“9 aa-反激活域”预测工具对序列进行进一步分析。http://www.med.muni.cz/9aaTAD/)21显示符合大多数标准的所有三个序列的匹配(补充图)。S6c)。为了对这些预测进行实验研究,我们突变了最可能对转活化丙氨酸最重要的残基,并研究了它们对携带FWL突变的TAp63γ、TA*p63γ和GTap 63γ的转激活潜力的影响。正如预期的那样,由于这三个AA在与p 300的交互中的重要性,TAp63γFWL是不活动的。16,而另外两个FWL突变体仍表现出明显的启动子诱导作用。只有TA*/GTA和GTA*肽中预测的两个附加基序同时发生突变,才能产生一个完全不起作用的蛋白质(如图所示)。5E和补充图。S6d,e).

TAD中的fwl基序与辅激活剂p 300的taz2结构域有一个子mk结合。D(0.196±0.022)16..我们用荧光各向异性的方法研究了Taz2结构域与N端肽的相互作用。Taz2结构域与TA*-GTA*和GTA-GTA*肽相互作用。D分别为13.18±0.93M和4.79±0.24M。5F)。这些肽的亲和力比TA结构域的亲和力低75倍和25倍;然而,这些额外相互作用序列的存在将增强四聚体p63到p 300的整体亲和力。

TA*p63α在乳腺癌细胞株SUM 159中的表达

p63在肿瘤中很少发生突变,但Δnp 63α在头颈部鳞状细胞癌中有过表达的报道。22它的高表达水平似乎是一种推动力。据报道,癌细胞中偶尔也存在TAP 63α。在最近对三重阴性乳腺癌组织的研究中,发现Δnp 63和tap 63都与不同的肿瘤特征有关。23..TAP 63α表达与雄激素受体和BRCA 1/2野生型状态相关,可预测患者生存率。同样,Tap 63α在宫颈鳞状细胞癌中的表达与患者的生存期呈正相关。24..目前还没有能够区分TAP 63和TA*p63的抗体。为了观察癌细胞是否也表达TA*p63,我们用间充质三阴性乳腺癌细胞系SUM 159的裂解液进行了免疫共沉淀(IP)实验。用两种不同的p63特异性抗体(ab124762,Abcamm;AHP 1815,BioRad)用于IP,在westernblot上检测到分子量为75 kDa的一条带。6A)。为进一步分析,采用液相色谱-串联质谱联用技术(LC-MS/MS)对样品进行凝胶溶出.利用两种不同类型的质谱仪,根据不同的碎裂和探测方法进行了两个独立的实验。在这两项分析中,我们可以清楚地识别TA*p63的两个N端胰蛋白酶肽(MNFETSR和CATLQYCPDPYIQR),其后验错误概率(PEP)非常低,且几乎完全碎裂。6B,补充图。S7)表明TA*p63α确实存在于SUM 159细胞中。

图6:Ta*p63α在三阴性乳腺癌细胞系SUM 159中表达,经Dox处理后激活。
figure6

a质谱分析前,用SDS-PAGE和免疫共沉淀TA*p63α的免疫印迹法对159份苏门氏菌进行免疫印迹。用两种不同的p63特异性抗体AHP 1815(BioRad)和ab124267(ABCAM)进行免疫沉淀。在WB上检测采用p63αXP(D2K8X,细胞信号传导)抗体。b在SIM 159细胞免疫沉淀p63的两种独立的IP-MS分析中发现了特异性的TA*-肽。用p63抗体ab124267(ABCAM)进行免疫沉淀。实验采用了两种不同类型的质谱计(IT:离子阱,CID:碰撞诱导离解,FT:Fourier变换,HCD:高能碰撞离解)。c159个溶酶体中,BN页(3-12%),TA*p63α的Westernblotting(3-12%)。10 mDox作用不同时间的Sum159细胞。用T(四聚体)、D(二聚体)和M(单体)表征不同寡聚态的迁移。dSUM 159细胞的存活分析。用1.5M Dox或DMSO处理细胞24 h(6孔板),培养24~30 h,用戊二醛固定(6%),结晶紫染色(0.5%)。

为了检测化疗药物是否能激活SIM 159细胞中TA*p63α并诱导细胞凋亡,我们用10 mDox处理细胞。Ta*p63α的寡聚态由不活跃的二聚体转变为由BN-PAGE所监测的活性四聚体形式。6C)。此外,细胞凋亡标记物PARP和Caspase 3在治疗后4h就可检测到(附图)。S8)。我们还调查了细胞存活情况。Dox(1.5M)或DMSO作用24h后,细胞密度明显降低。6d)。以上结果提示,肿瘤细胞中TA*p63α可作为一种对抗肿瘤细胞的工具。

讨论

P53蛋白家族在进化过程中的最初功能可能是保护生殖细胞的遗传质量。更原始的生物,如线虫25,26矢量美线虫27,在它们的细菌细胞中表达p5 3同系物,而sam结构域与p63的关系比p5 3更密切。28..在哺乳动物中,p63作为同源重组过程的一部分,当细胞修复了Spo11造成的DNA双链断裂时,p63在前期Ⅰ期的卵母细胞中得到表达。没有修复这些DNA双链断裂的卵母细胞将在p63依赖的机制中被消除。对于所有已成功修复的剩余卵母细胞来说,DNA双链断裂,在接下来的切分阻滞阶段,持续高水平的p63构成一个持续的威胁。因此,p63的转录活性在生殖细胞中受到很强的调控。抑制的基础是阻断td的四聚界面,td在p5 3蛋白家族中由二聚体组成。29,30,31,32..这是通过一个六股反平行的β片,它是由两个单体的工业ID和一个片段N端,增加了两个β链每单体。9..由单个螺旋组成的tap 63α的TAD也通过与td结合来稳定闭合构象。8..tad和td之间的这种相互作用是抑制复合物中最薄弱的结构元素,因为tad的运动速率相对较快。9..进一步稳定整个复合物,这将导致更严格的调节转录活动,因此,只有通过修改N-末端元素才能达到。这种抑制性复合物的稳定性是通过TA*和GTA异构体的N端延伸来实现的。N-末端肽稳定二聚体构象有两种可能的模型.在第一种情况下,N端扩展充当附加的“安全锁”函数,绑定到td中与tad相同的站点。8(无花果)7A)。当TAD与其结合位点分离时,第二肽将与TD上现有的空位结合,以防止四聚,从而使原来的TA肽接近,以便重新结合。在第二个模型中,N-末端肽结合到附加的结合位点,形成“双锁”的二聚体构象(如图所示)。7b)并将蛋白质保持在更紧密的包装状态。

图7:TA*p63α中N端特异性肽调节功能的模型。模型为TA*p63α显式显示,但也表示GTAP 63α。
figure7

a在第一种模型中,TA*p63α‘s和GTAp63α的特异性N-末端与TD(青色)上的TAD(红色)结合在同一个相互作用位点上。因此,二聚体构象有一个额外的“安全锁”。在TAD解离的情况下,TA*-GTA*肽(蓝-橙)能够使蛋白质处于二聚体状态,而TAD则在很近的距离内重新结合。b在第二个模型中,TA*p63α‘s和GTAp63α的特异性肽在不活跃的二聚体状态下与另一个与TAD无关的相互作用位点结合,通过建立“双锁”安全机制使p63处于更紧密的拥挤状态。cTA*p63α(GTAP 63α)和TAP 63α两种寡聚态活性差异的图式表征。TA*p63α的二聚体构象与TAp63α相比具有更高的稳定性。然而,TA*p63α的开放、四聚体状态至少还有四个与共激活剂p 300的结合位点,从而产生了更大的跨激活潜能。因此,TA*p63α(Δ的活性状态与非活性状态之间的活性差异。Ta*p63α,黑色)高于tap 63α(Δ。TAP 63α、灰色)

GTAP 63α和TA*p63α都能被Tap 63α的两个激酶转化为开放的四聚体形式。然而,这一过程似乎较慢,并没有达到与TAP 63α相同水平的活化四聚体。可以想象,GTAp63α和TA*p63α亚型的有效激活需要另一激酶的作用,因为这两种亚型的N端都存在一些潜在的磷酸化位点。另外,这两种亚型的N-末端也可能(部分)阻断激酶的相互作用位点。此外,转录活性更强的TA*和GTA形式的更快降解也可能导致与TAp63α相比二聚体/四聚体比值的差异。在gtap 63α的情况下,激活与caspase依赖的sam和tid的切割有关。14..caspase对p63 C-末端也有类似的处理,包括tap 63α和Δnp 63α。33.

除了它们在稳定二聚体构象方面的作用外,TA*p63和GTAP 63的N端也支持转录活性。这两个N-末端至少有一个与联合激活剂p 300的taz2结构域相结合的位点,后者通常绑定到TA结构域。16..因此,在活性的四聚体构象中,每个分子至少有8个相互作用位点,而在TAP 63中则有4个,从而增加了与p 300的亲和力(图3)。7C).

为什么GTAp63α和TA*p63α的生物学功能需要与卵母细胞TAP 63α相比,更严格地控制其转录活性。Gtap 63α在有丝分裂精原细胞中表达,在基上、减数分裂精母细胞中呈下降趋势,而单倍体精子则全部失去p63亚型的表达。14..精原细胞位于血-睾丸屏障之下,包括生殖细胞室.监测这些雄性生殖细胞的遗传质量对于保持生殖细胞系的完整性和确保物种的进化生存至关重要。雄性生殖细胞中复制活性极高,与任何其他细胞类型相比(每天产生500-2亿个精子),再加上类人猿的生殖周期很长,这可能是这种特殊的遗传质量控制的原因。据推测,将逆转录病毒LTR整合到p63编码序列中是一个关键事件,使人类能够延长生殖周期。14.

然而,Tap 63α在雌性生殖细胞中的功能与GTAP 63α在雄性生殖细胞中的功能有明显的差异。TAP 63α在同源重组结束后表达,并在整个细胞周期阻滞期处于较高水平,而GTap 63α主要在有丝分裂的干细胞和祖细胞中表达。它似乎也存在于减数分裂前进行同源重组的细胞中。目前尚不清楚这些细胞如何抑制由DNA双链断裂引起的GTAP 63α的激活。附加的N端结构域可能使GTAP 63α对磷酸化触发的激活具有更强的抗性。然而,我们的实验表明GTAp63α可以通过Chk 2和CK1激酶的联合作用而被激活,这与TAp63α在卵母细胞中的作用机制类似。缺乏必需的激酶或磷酸酶的存在可能使GTAp63α失活。雌雄生殖细胞在减数分裂阶段所花的时间也有明显的不同。当卵母细胞在减数分裂前期停滞时,Ⅰ期长达50年,精母细胞停留在同一阶段仅数小时。这些巨大不同的时间框架如何影响遗传质量监测机制仍有待研究。

我们的MS分析表明,TA*p63α在间充质三阴性乳腺癌细胞系SUM 159中表达,同时还含有不稳定突变型p53。原则上,不稳定的p5 3突变体(如p53r175h)可以与p63异构体共同聚集,并具有可访问的ti结构域。17这种相互作用可使四聚体TA*p63α失活。然而,在初步的实验中,我们还不能看到这两种蛋白质在Sum159细胞中的相互作用。其他一些研究表明tap 63α在不同的癌症类型中表达。34..为什么癌细胞表达p53蛋白家族中一个促进凋亡的野生型成员尚不清楚。然而,在所有可能的异构体中,N端伸长的TA*p63α是基础转录活性最低的亚型,但可能被用作诱导凋亡的工具。如果其他癌细胞在现实中表达tap 63α,则必须检测TA*p63α的表达。

材料和方法

细胞培养

人骨肉瘤细胞系Saos-2、U2OS和乳腺癌细胞系Sum159分别在含谷氨酰胺、吉布科的DMEM培养基中培养,非小细胞肺癌细胞株H 1299分别在rpmi培养基1640(吉布co)中加入10%fbs(Capricorn Science)和100 mg/ml青霉素/Streptomycin(吉布co),分别在37°C和5%CO条件下培养。2..从ATCC中获得SAOS-2、U2OS和H 1299。Sum159细胞系是美国CT法明顿杰克逊基因组医学实验室(FrankD.McKeon)的礼物。所有细胞系定期检测阴性的支原体污染使用PCR检测。

克隆

所有瞬时转染哺乳动物细胞的载体都克隆在pcDNA 3载体上,不含N端Myc标记或带有N端myc标签。p63基因突变为:FWL(F16A,W20A,L23A;5‘GAA TTC Cac AGT CCA gag GTT GCC CAG CAT ATC GCC GAT TTT GCT ATATTCA GTT CAG 3’),YF(Y18*A,F22*A;5‘CAG TAC TGC CCT GAC CCT),5’CAG TAC CCT CGT GTA GCCA GCT 3‘,WY(W31*A,Y35*A/W29’A,Y33‘A;5‘GAA、CCA、GCT、CAT、TTC、TCT、AAA、AGT、TAC、CGA、TCC、ACC3’)、YF WY(5‘CAG TAC、CCT、GAC、ATC、CAG、CGT、GTA、GAA、CCA、GCT)、AGT TAC、CGA TCC ACC、ACC TCC 3’、WFV(W9‘A、F12’A、V15‘A);5‘GTT、GGG、AGC、GGG、ATG、CAG、AGC、GCT、GTT、TTG、AG 3’)、WFV WY(5‘GTT GGG、AGC、GGG、ATG、CCA、CAG、CCG、GTG、AGA、CACT、CCG、TTG、AGC、AAG、CAG、CCG、CCG C_3’)、S 582/S583A(5‘CTCT、CGG、CCG、GTG、AGC、CCG、在p53的情况下,产生DNA接触突变体R175H(5‘-CAT GAC、GGT、GggG、CAC、TGC、CCC、CAC、Cag、CG3’)。

稳定表达p63α亚型的H 1299细胞的构建

为获得稳定表达的H 1299细胞,我们采用了系统生物科学系统-piggyBac转座子系统(SystemBioscience)。H 1299细胞被转染在一个六孔板上,根据制造商手册,使用奇根埃菲替内试剂盒。采用pBQM812A(PB-CuO-MCS-IRES-GFP-EF1α-Cymr-Puro诱导型cDNA克隆和表达载体),pBQM812A为载体,p63α为载体,pB200A为载体(piggyBac转座酶表达载体)。转染后1d,细胞再接种于10 cm培养皿中。转染2d后,用普罗霉素(5g/mL)筛选H 1299细胞,直至出现单个集落(10-14天)。分离、扩增和检测p63在WB上的稳定诱导表达和BN-PAGE上的寡聚状态。在≥99.8%乙醇(CarlRothGmbH)条件下,用自制的10,000倍Cumate(Sigma-Aldrich)溶液进行诱导.对于进一步的实验,选择了每个结构的一个克隆。

转活化试验

将细胞转染到12孔板中,每质粒pcDNA 3、pGL 3和PRL-CMV,用琼脂高效试剂盒按制造商手册进行转染,培养24h,用Promega双Glo荧光素酶报告试剂盒进行转活化试验。用PBS(吉布科)洗涤细胞,在96孔板四倍体中采集并测定萤火虫和肾的活性。测定萤火虫与肾信号的比值,并将其归一化为空向量。剩下的样品用BioRad系统通过westernblot检测表达水平。三个独立的实验已经完成了每一个反式激活试验。为了进行统计分析,P-数值是以未配对的方式计算的t-使用GraphPad t测试计算器进行测试(https:/www.Graphpad.com/Quickcalcs/ttest1/?Format=sd).

WESTERNBLOTTING

4–15 or 7.5%SDS–PAGE Mini-PROTEAN TGX gels(BioRad)were blotted using the semidry Trans-Blot Turbo Transfer system(BioRad).The following antibodies were prepared in 5%milk in TBS-T and incubated overnight at 4°C:anti-Myc(1:1000,clone 4A6,Millipore),anti-p63(1:2500,ab124762,Abcam),anti-p63αXP(1:1000,D2K8X,Cell Signaling),anti-GAPDH(1:20,000,clone 6C5,Merck),anti-p53(1:500,DO-1,Santa Cruz),抗PARP(1:1000,9542,细胞信号转导),抗裂解caspase 3(1:1000,5A1E,细胞信号传导)和抗神经营养蛋白(1:1000,克隆7F9,Santa Cruz)。在TBS-T的5%牛奶中制备次级抗体,在RT下孵育1h(山羊抗小鼠HRP,1:5000,A 9917,Sigma-Aldrich;山羊抗兔HRP,1:2000,Jackson免疫研究欧洲有限公司,111-035-144)。用ImageJ对免疫印迹信号进行定量。

蓝本页

H 1299细胞在12孔板上按制造商手册使用奇根高效减数试剂盒转染,或用稳定表达p63亚型的H 1299细胞转染。细胞在NP裂解缓冲液(20 mm Tris,150 mm NaCl,2mm MgCl)中提取和溶解。2、20 mm CHAP、1mm DTT、完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche)、PhosSTOP(Roche)pH 7.4或pH8.0。加入benzonase(默克),样品在冰上溶解1小时,进行了bn-page(3-12%,Thermo Fisher Science)实验,并按前面的描述对样品进行了擦拭。17,35..蛋白水平在BN-PAGE上被调整为相同的p63量,通过先前的westernblot分析。SDS-PAGE检测磷移不作输入调整。

尿素试验

H 1299细胞按制造商手册用奇根高效减毒试剂盒转染10厘米培养皿,培养约24小时,在无洗涤剂的NP裂解缓冲液(20 mm Tris,150 mm NaCl,2 mm MgCl)中收获和收集。2、1mm DTT、完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche)、PhosSTOP(Roche)pH 7.4)。样品经三次冻融循环溶解。离心后加入苯那酶(默克米利波),在冰上孵育1h。分离样品,用不同浓度的尿素在冰上孵育1h。加入等量的np裂解缓冲液,加入两倍浓度的chap(20 mm Tris,150 mm NaCl,2mm mgCl)。2、40 mm CHAP、1mm DTT、完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche)、PhosSTOP(pH7.4)、孵育10 min左右。然后加入3×NP缓冲液(60%甘油,15 mm Coomassie G 250),将样品装入凝胶上。BN页(3%-12%,Thermo Fisher Science)按先前的描述进行并涂上。13,35.

尺寸排斥色谱(SEC)

用原核表达系统(Promega)在体外表达p63基因的p63基因。8..溶出液在4℃,16,100×g离心15 min,在Kta净化器系统(50 mm磷酸钠pH 7.8,100 mm NaCl)4°C下,采用Superose 6 3.2/300(GE Healthcare)柱(注射体积50μL,流速50μL/min,分数50μL)进行分析。采用Westernblotting对SEC组分进行收集和分析。

染色

根据制造商的手册,H 1299细胞在玻璃玻片上播种的12孔板中,使用奇根-艾芬妮试剂盒进行转染。转染后24h,用PBS冲洗3次,用3.7%甲醛固定10 min,再用PBS冲洗3次。细胞经0.1%TritonX-100渗透缓冲液(0.1%TritonX-100)渗透15 min,阻断30 min(1%BSA,0.1%吐温-20)。将抗Myc(1:500,A190-104 A,B乙基)和抗β-actin(1:100,克隆C4,圣克鲁斯)抗体在4℃封闭缓冲液中孵育一夜。用含0.1%吐温-20的PBST(含0.1%吐温-20)冲洗3次,用二次抗体(阻断缓冲液1:1000,驴抗小鼠Alexa 488,驴抗山羊Alexa 568,热费雪科学)在RT黑暗中冲洗1h,冲洗3次。使用Mowiol(Carl Roth GmbH)安装介质,包括DAPI(Thermo Fisher Science),并干燥1-2天。安装介质按CSH协议(http:/cshprotocol s.cshlp.org/content/2006/1/pdb.rec10255)。用共聚焦显微镜LeicaTCSSP5拍摄。

荧光各向异性

如前面所述,p300taz2结构域得到了表达和纯化。16..N-末端荧光素标记肽TA*-GTA*和GTA-GTA*在Peps4LS(德国海德堡)上被测序。随着Taz2浓度的增加,用100纳摩尔肽进行了测定。实验在22°C下进行,使用FP-6500谱仪(Jasco,Gross-Umstadt,德国)和115 F-QS小杯(Hellma,Müllheim)。结果与GraphPad棱镜5配合使用两个位点特异的结合配合。

免疫沉淀

对每个MS样品,采集20×15 cm的80%融合乳腺癌细胞株进行混合培养。细胞再悬浮于溶解缓冲液(50 mm Tris,150 mm NaCl,1 mm DTT,2 mm MgCl)中。2,0.5%NP-40,完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche),PhosSTOP(Roche),pH8.0。加入Benzonase(Merck),在4°C下裂解约1h,离心(16,100×g,15 min,4°C),用IP洗涤缓冲液(50 mm Tris,150 mm NaCl,0.1%吐温-20,pH 7.8)稀释上清液。用Dynabeads蛋白G(Thermo Fisher Science)预清1 h,再将稀释后的裂解液裂解,加入6 g抗p63抗体(ab124762,Abcamm)或兔γ球蛋白/IgG(Thermo Fisher Science),于第二天在4°C下孵育一夜,在4°C下加入Dynabeads蛋白G(Thermo Fisher Science)2~3h,8次洗涤,转至新管,用1×NuLDS样品缓冲液(热Fisher科学)加50 mm DTT,在70℃下孵育10 min。上清液被转移到一个新的试管里。

细胞存活试验

苏姆159细胞接种在一个六孔板中。接种后2d,分别用1.5MDox或DMSO处理细胞24h,改变培养基,加培养24~30h,用PBS洗涤细胞3次,固定染色液(0.5%结晶紫,6%戊二醛)在RT下孵育1~2h。溶液吸出,固定细胞用H清洗5次左右。2在RT下干燥1-2天。

MS样品制备

将Sum159乳腺癌细胞系的免疫沉淀p63应用于SDS-PAGE微蛋白凝胶(BioRad)和银染(SilverQuest银染试剂盒,热Fisher科学)上进行MS分析。染色条带分离并脱色。用10 mm DTT在56°C下还原45 min,在RT下用55 mm碘乙酰胺进行烷基化反应30 min。用胰蛋白酶在37°C消化一夜,用含3%三氟乙酸(TFA)的30%乙腈(ACN)连续提取胰蛋白酶,然后用含0.1%TFA的80%ACN和最后100%的ACN各提取30 min。萃取液经真空离心干燥后,在0.1%甲酸溶液中进行LC-MS/MS分析。

LC-MS分析

在第一次MS实验中,利用一个20厘米长,75米ID的熔融石英柱,在轨道饶舌精英质谱仪上对多肽进行了分析,该质谱使用一个20厘米长、75米ID的熔融石英柱,并与3 mC18粒子(ReproSil-PUR,Maisch博士)耦合在45°C上,并使用集成柱烤箱(Sonation)将其保存在45°C。肽经8-40%乙腈的非线性梯度洗脱19 min后,在2.3kV的喷雾电压下,通过纳米荧光离子源(热Fisher科学)直接喷射到质谱仪中。获得全扫描质谱(300-2000 m/z),分辨率为12万。M/z200,最大注入时间为100 ms,AGC目标值为1×10。6指控。用2 Th窗口在离子阱中分离到20条最强烈的肽,用碰撞诱导离解(CID,归一化碰撞能35)进行碎裂。在快速模式下,最大注入时间为25 ms,AGC靶值为5×10,获得了MS/MS光谱。3..电荷态为1和>6的离子以及未指定电荷态的离子不考虑碎裂。动态排除设定为1次重复计数和30次重复持续时间,排除时间为90 s,以尽量减少已获得前体的重复测序。

第二个实验是在QExactiveHF与简易NLC 1200(热Fisher科学)耦合的基础上,使用一个20厘米长,75米ID熔融石英柱,装有1.9 mC18颗粒(Reprosil Pur,Dr.Maisch),用集成柱烤箱(Sonation)将其保持在50°C。用4-24%乙腈的非线性梯度洗脱24 min,直接喷入装有纳米离子源的质谱仪(热Fisher科学)。全扫描质谱(350-1650)M/z)以60,000美元的决议获得M/z200,最大注入时间为20 ms,AGC目标值为3×10。6指控。每次扫描最多可分离10个最强烈的肽,用1.4Th窗口分离,用高能碰撞离解(正规化碰撞能为27)碎裂。获得了分辨率为30,000,最大注入时间为110 ms,AGC目标值为1×10的MS/MS光谱。5..不考虑单个荷电离子、电荷态大于5的离子和未指定电荷态的离子进行碎裂,动态排斥设置为20s。

质谱数据处理

MS原始数据处理由MaxQuant(v1.6.5.0)使用默认参数执行。根据从uniprot下载的人类参考蛋白质组(分类学ID 9606)(21-11-2018年;94731序列,包括异构体)和使用MaxQuant集成的仙女座搜索引擎收集的常见污染物(244个条目)检索获得的光谱。36,37..利用目标诱饵策略对多肽谱匹配(psm;最小长度为7 aa)和蛋白质进行筛选,以获得1%以下的错误发现率(Fdr)。38.

预测.螺旋轮和二级结构

对于N-端的二级结构预测,Phyre(蛋白质同源/类比识别引擎V2.0),http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)20服务器被使用了。基于这一结果,Net轮公司创建了一个螺旋轮投影(http://lbqp.unb.br/NetWheels).


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