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太空飞行对小鼠视网膜的基因表达、光感受器完整性和氧化应激相关损伤的影响

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发表时间:2019-09-17 15:32作者:武汉新启迪Xinqidi来源:www.qidibio.com

太空飞行对小鼠视网膜的基因表达、光感受器完整性和氧化应激相关损伤的影响


摘要

延长的空间飞行已被证明对宇航员的视力产生不利影响。本研究的目的是确定太空飞行是否改变视网膜的基因表达谱并导致氧化损伤。10周龄成年C57BL/6雄性小鼠在国际空间站上飞行了35天,并活着返回地球。在相同的环境条件下,地面控制小鼠被维持在地球上。泼落后38(+/−)小时内,取小鼠眼组织进行分析。RNA测序检测到600个差异表达基因(DEGS)在小鼠空间飞行视网膜中,这些差异表达基因丰富了与视觉知觉、光传导途径以及大量视网膜和感光细胞表型相关的基因。12个DEGS与视网膜色素变性有关,其特征是感光层杆和锥的营养不良。差异表达的转录因子指示染色质结构的变化,为观察到的表型变化提供线索。免疫荧光检测显示锥体光感受器降解,视网膜氧化应激增加。太空飞行后视网膜总厚度、视网膜色素上皮、脉络膜厚度明显降低。这些结果表明,随着太空飞行时间的延长,视网膜的表现可能会下降,并导致视力损害。

导言

我们正在进入一个对空间探索重新感兴趣的时代。虽然几十年前正式结束了空间竞赛,但人类正跨入第二个空间时代,其中包括新的全球伙伴关系和私营公司。这一新的基础设施和组织使长期空间任务的概念,如永久月球定居点和载人火星任务,从一个遥远的目标到一个有形的现实。1..然而,空间环境与地球有着根本的不同。微重力和电离辐射构成了一组独特的生理应激源,其影响仍有待充分研究。2,3.

在人类中,对空间环境最明显的生理反应之一是由于微重力而使液体在全身重新分布。这种再分配使流体从身体下部向上移动。4..由这种液体移位引起的颅内压升高被认为是航天相关的神经眼综合征(Sans)的主要原因。5..40%的宇航员经历过SANS。6,包括美国宇航局双胞胎研究的太空飞行课题。7..SANS的生理影响包括视盘水肿、眼球扁平(GF)、脉络膜和视网膜皱褶、远视性屈光错误移位和神经纤维层梗死(即棉毛斑)。5,8..虽然SAN的生理特性已经有了很好的记录,但是驱动SAN的机制仍然是很难理解的。

到目前为止,尽管有证据显示暴露在空间环境下的眼睛功能受损,但很少有研究涉及空间飞行相关的视网膜结构和功能变化的分子机制。我们小组先前的一项研究描述了亚特兰蒂斯号航天飞机(STS-135)上13天的空间环境暴露对小鼠的影响。本研究发现,太空飞行条件引起氧化损伤,导致小鼠视网膜线粒体凋亡。2..随后进行的低剂量质子辐射和模拟微重力小鼠模型的研究表明,模拟空间辐射对氧化应激的增加起着主要作用,在模拟微重力的作用下具有协同作用。9,10..在我们目前的研究中,小鼠在国际空间站(ISS)上被暴露在空间环境中35天,以确定空间环境是否会导致眼睛结构的氧化损伤,并研究空间飞行对小鼠视网膜基因表达谱的影响。

结果

空间环境导致与视觉和RNA调控途径相关的基因表达的变化。

空间环境引起了基因表达的广泛变化,其中最突出的是眼通路和RNA加工的变化。作为NASA第九次啮齿动物研究实验(RR-9)的一部分,20只老鼠在国际空间站呆了35天。另有20只老鼠被安置在地球上,与地面控制组飞行时所用的硬件相同。对16只小鼠(n=8/组)进行RNA测序。利用DESeq 2在航天和地面控制组之间鉴定了600个差异表达基因(Degs)。11调整后的p值阈值为0.01。表1)。根据DEGS的表达值对DEG进行分级聚类,以确定哪些小鼠具有相似的DEG表达谱。小鼠按其纳入地面控制组或太空飞行组进行聚在一起。与地面控制相比,航天组有286个上调基因和314个下调基因。1A).

图1
figure1

DEG在航天和控制小鼠之间的聚类和功能。(A)利用调整后的p值阈值0.1,对航天和对照小鼠之间的600 DEG进行分级聚类。与地面对照组相比,航天组有286个上调基因和314个下调基因;(B)丰富的基因本体论(GO)生物过程类别的DEGS。将WebGestalt的亲和性传播选项应用于所选择的有代表性的显示类别;(C)从Reactome数据库中丰富DES之间的网络;(D)受哺乳动物表型本体DEGS影响的丰富表型;(B)d)过度表达的类别与眼部功能有关(GO类别:“视觉知觉”、“对光刺激的反应”、“光刺激的感觉知觉”、“照相机式眼的视网膜发育”、“光传导级联的失活、恢复和调节”;表现型:视网膜、棒和锥的电生理学、形态学和变性)、各种RNA加工、剪接和代谢功能(GO分为:‘RNA加工’、‘rRNA加工’、‘mRNA加工’、‘RNA剪接’,通过酯交换反应、‘mRNA剪接’、‘rRNA代谢过程’、‘ncRNA代谢过程’、‘mRNA代谢过程’和‘RNA运输’,以及对空间光的物理压力的直接反应(GO:‘对非生物刺激的反应’,‘对辐射的反应’,‘细胞对压力的反应’)。

利用WebGestalt对DEG进行了基因本体论(GO)、通路和表型范畴的过度表达分析(ORA)。12..从这一分析中,发现46种GO、5种途径和14种表型类型,错误发现率(FDR)小于0.05(图1)。1B-D、Sup.表2)。被过度表达的类别包括与眼部功能相关的类别(GO类别:“视觉知觉”、“对光刺激的反应”、“光刺激的感觉知觉”、“照相机式眼睛中的视网膜发育”、“光转导级联”、“光传导级联”失活、恢复和调节;表现型:视网膜、棒和锥的电生理学、形态学和变性)、各种RNA加工、剪接和代谢功能(GO分为:‘RNA加工’、‘rRNA加工’、‘mRNA加工’、‘RNA剪接’,通过酯交换反应、‘mRNA剪接’、‘rRNA代谢过程’、‘ncRNA代谢过程’、‘mRNA代谢过程’和‘RNA运输’,以及对空间光的物理压力的直接反应(GO:‘对非生物刺激的反应’,‘对辐射的反应’,‘细胞对压力的反应’)。

有些基因有很高的差异表达,但不包括在任何GO类别,途径,或表现型基因清单从Ora(Sup)。无花果。1). DRD 4空间飞行组差异表达基因最显著(调整p值:4.31E-51;对数2倍变化:0.812)。DRD 4是控制哺乳动物视网膜昼夜节律的多巴胺受体13..同样,组织1h2bc在Ora的任何类别中均未发现,但在航天组中被上调(调整后的p值:1.66E-09;对数2倍变化:0.526)。组织1h2bc曾经被证明在老化的视网膜中被上调14..这些基因共同支持先前的研究,表明太空飞行扰乱了昼夜节律,是一种潜在的衰老模型。15,16.

视网膜色素变性相关基因在空间环境中有差异表达。

我们试图确定太空飞行样本中是否有任何DEG在常见视网膜疾病中也有差异表达。我们列出了以下视网膜疾病的相关基因:视网膜色素变性、糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性和视网膜脱离。人类疾病相关基因列表是使用DisGeNET数据库发现的。17..DisGeNET数据库中的基因通过基因-疾病关联评分(GDA)进行筛选.分析中只包括GDA大于0.2的基因。这包括专家管理和动物模型数据库中的疾病相关基因,但将疾病相关基因排除在推理和文本挖掘数据库之外。疾病相关基因使用小鼠基因组信息学数据库转换成小鼠正射体。18..未超过DESeq 2平均计数阈值(即调整后的p值等于‘NA’)的基因被从分析中筛选出来。

DisGeNet数据库中有75个与视网膜色素变性相关的基因,14个与糖尿病视网膜病变相关的基因,8个与年龄相关的黄斑变性相关基因,5个与视网膜脱离相关的基因(Sup)。表3)。大多数疾病相关基因都是单一视网膜疾病所特有的,除了ABCA 4, 恩纳特1, Casp3,和Crb1两种疾病各有一种(图1)。2A)。在多个疾病中共享的疾病相关基因中,没有一个在太空飞行中有差异表达。

图2
figure2

视网膜疾病相关基因表达。(A)显示DisGeNet上每种疾病的基因数目的打乱图。与每组不同的基因位于前四列。集合间共有的基因位于最后三列;(B)Log2-疾病相关基因的变化值。基因从左到右按调整后的p值排列。条形图的颜色由调整后的p值的大小来表示.调整后的p值将根据其数量级进行进一步注释。根据调整后的p值,视网膜色素变性图显示了前20位最重要的基因。所有其他疾病都显示了它们所有的相关基因。

在与视网膜色素变性相关的75个基因中,12个基因在太空飞行中有差异表达(SAG、BC 027072/Pcare、Guca1b、Rbp 3、Ahi1、Guca1a、Prpf 8、Rp1、Gucy2e、Cacna2d4、Pde6b、DHDDS)检查的四种视网膜疾病中的大多数。糖尿病视网膜病变有一个疾病相关基因,在太空飞行中差异表达。HIF1a)。与年龄相关的黄斑变性和视网膜脱离相关基因在太空飞行中没有差异表达(图一)。2B).

差异表达转录因子提示航天改变染色质组织

在图中有报道。1A对其豹蛋白进行筛选,寻找差异表达的转录因子(DETFs)。19..在600个DEG中,29个是DETF。根据DETF的表达值对其进行层次聚类。根据它们被纳入地面控制或太空飞行组,老鼠聚集在一起(如图所示)。3A)。其中8项DETF是视网膜和眼睛其他结构的发育和维持所必需的:马福, 岛1, 阿特夫5, KDM6B, Hmgb 3, PROX 1, CASZ 1HIF1a20,21,22,23,24,25,26,27..特别感兴趣的是Cazs 1HIF1a. Cazs 1是一种异染色质调节剂,它以剪接变异的特定方式起作用。24HIF1a在慢性缺氧样应激模型中,失活可显著减轻感受器的退化。25.

图3
figure3

转录因子聚类及其在航天和对照小鼠中的作用。(A(2)航天与地面控制小鼠之间29个DETFs的分级聚类;(B)丰富的基因本体论(GO)生物过程类别的DETFs。

对DETF进行了基因本体(GO)术语的过度表示分析(ORA)。47个GO类别,FDR<0.05(Sup)。表4)。应用WebGestalt的亲和传播滤波器,找到了代表所有GO富集结果的GO项的减少数。我们发现与DNA转录相关的GO类(‘正转录调控’,dna模板化,‘负转录调控,dna模板’)的丰富,进一步肯定了这些基因作为转录因子的作用。此外,还有与染色质组织有关的丰富的GO类,包括组蛋白修饰的调控、组蛋白赖氨酸去甲基化、组蛋白H3K9三甲基化的负调控。3B)。这些GO分类中的基因包括KDM4A、Kdm4b和KDM6B,这是已知的赖氨酸甲基化的调节因子。KDM4AKdm4b是H3K9me2/ME3的调节剂吗?28,是本构异染色质的调节因子,是本构异染色质存在的指示剂。KDM6B是H3K27me2/ME3的调整器。28主要负责基因表达的沉默。

空间环境降低视网膜组织厚度,增加氧化应激和锥体光感受器损伤。

微计算机断层扫描(MicroCT)图像的产生,以表征全球的眼睛形态和测量厚度的视网膜和周围组织的地面控制和航天小鼠(图一)。4A)。太空飞行期间,视网膜总厚度、视网膜色素上皮(RPE)和脉络膜层厚度明显减少(P<0.05)。4B)。此外,在太空飞行小鼠中还发现脉络膜变形和皱褶(如图所示)。4C).

图4
figure4

太空飞行减少了眼睛的多层厚度。(A)地面控制鼠标的矢状视图。从上至下,视网膜(0.077 mm),视网膜色素层(0.038 mm),脉络膜(0.041 mm),巩膜(0.059 mm);(B)空间飞行组和对照组视网膜层、RPE层和脉络膜层的平均厚度用MicroCT测量。每组平均5个视网膜计数。数值表示为平均厚度+标准误差(SEM)。扫描电镜的平均值是用误差条标记的。空间飞行组的横截面厚度明显低于地面对照组(p<0.05)。(C)对照组和航天小鼠视网膜横断面。GCL:神经节细胞层;INL:内核层;ONL:外核层;IS:内段;OS:外段;RPE:色素上皮层。

用花生凝集素(PNA)免疫荧光染色,观察圆锥光感受器的情况。PNA是圆锥光感受器的特异性标记物。锥光感受器在太空飞行中显示出退化的迹象(图一)。5A)。我们的定量评估(图1.5B在太空飞行小鼠中,球果密度呈强烈下降趋势(950计数/毫米)。2)与地面控制组相比,其平均计数为1199次/毫米。2(P=0.06)。

图5
figure5

太空飞行会导致感受器降解和氧化应激。(a)免疫荧光染色PNA,锥体光感受器(绿色)的标志,和HNE,氧化应激的标志(红色),在光感受器层。细胞核用DAPI(蓝色)染色,标度棒=50 mm。(B)PNA阳性锥光感受器的细胞密度;(C)视网膜层HNE(红色)的免疫荧光染色。标尺=50m;(D)杆锥感光层HNE标记的荧光强度(箭头);(E)HNE标记物穿过视网膜的荧光强度;(F)Go类别“氧化应激所致细胞死亡负调控”下DEGS的对数2倍变化;(B,D,E)每组平均5个视网膜计数。数值表示为平均密度±扫描电镜。航天组与地面对照组比较的显着性值分别为‘*’(p<0.05),‘*’(p<0.01),‘T’(空间飞行组与地面对照组之间的强趋势差异,p=0.06)。

用抗4-羟色胺(4-hne)抗体评价脂质过氧化的发生,作为视网膜氧化损伤的指标。与地面对照组相比,空间飞行后视锥光感受器、视网膜内核层(INL)和神经节细胞层(GCL)4-HNE染色增强。5C)。如图所示。5D与地面对照组相比,空间飞行组光感受器锥内反映HNE内源水平的荧光强度剖面也显著增加(p<0.05)。空间飞行组视网膜GCL/INL的HNE标记荧光强度也显著增加(P<0.01)。5E)。我们的rna-seq实验确定了三个步骤-Pde8a,HIF1a,HGF-这是“氧化应激诱导的细胞死亡负调控”的GO生物过程类别的一部分(GO:1903202)(图)。5F). Pde8a是磷酸二酯酶家族的一员。磷酸二酯酶特异性成员抑制已被证明可以减轻不同组织中的氧化应激。29,30,31,32. HIF1a可以保护线粒体免受氧化应激的影响。33,但在活性氧存在的情况下,该基因的作用被证明是高度相关的。34. HGF激活一种抗氧化信号通路,最终导致一氧化氮水平的增加和该分子调节的抗氧化酶的活性。35,36..加在一起,Pde8a以及下调HIF1aHGF与视网膜氧化应激增加有关。

讨论

我们发现,与地面对照相比,太空飞行环境下小鼠视网膜有明显的基因表达特征。这一特征是丰富的相关基因的视觉感知,光传导途径,以及许多视网膜和光受体表型类别。其他研究也显示了模拟微重力作用下视网膜细胞中细胞结构、生长、迁移和粘附过程中基因表达的变化。37,38..较少人预料到的是,与RNA处理、新陈代谢和运输途径有关的基因首次被描述为与哺乳动物的太空飞行相关的基因的过度表达。最近的一项研究拟南芥已经发现了由替代剪接所产生的mrna异构体,而这种剪接对于太空飞行样本来说是独一无二的。39..我们的结果表明,除了拟南芥在空间飞行期间,哺乳动物可能也会发生剪接异构体的变化,这些变化应在今后的工作中加以探讨,并纳入长期空间任务的风险评估。

差异RNA剪接也被认为是视网膜色素变性的潜在致病机制。基因突变Rho它能产生一种蛋白质,这种蛋白质由棒状光感受器组成,在弱光条件下对视力是必不可少的,它可以改变其剪接异构体。这些交替的异构体导致了Rho蛋白的异常构建,引发了视网膜色素变性的病理改变。40..另外,适当的替代剪接Nxnl 1从棒状光感受器和其他眼细胞类型已经与锥状光感受器的维持相关。41,42..这些剪接异构体的破坏可以降低锥体光感受器的密度和视网膜外层核膜的厚度。43..总之,我们的结果表明,空间环境可能创造独特的表观遗传事件和差异RNA剪接,以及改变的基因表达谱报告。未来的研究应该探讨哪些基因是交替拼接的,以了解蛋白质结构的潜在变化,并找到与视网膜疾病的进一步联系。此外,小鼠模型的视网膜色素变性是可用的。确定哪一种小鼠模型与暴露在空间环境中的老鼠最相似,将有助于确定适当的模型来进行地球模拟实验。找到一个合适的基于地球的模拟系统,将加速致力于寻找太空飞行对视网膜损伤的对策的研究速度。

有几种转录因子被认为是视网膜和其他眼部结构发育和维持所必需的。20..虽然其中8个DETFs因其对地球条件下视网膜发育和维持的重要性而闻名,但其中21个DETFs在文献中没有将它们与眼睛组织联系起来的报道。从DETF过度表达分析中发现,转录因子影响染色质结构。染色质结构的变化表明,在太空飞行中观察到的视网膜结构变化的原因比RNA处理中的改变更为复杂。过量表达分析表明,H3K9去甲基化的转录调控因子富集,是组成性异染色质的标记物。H3K9的去甲基化会导致这种异染色质的解离,进而影响基因和调控元件在基因组中的可及性。44..这可以进一步推动基因表达的改变,或者造成异常和潜在有害的细胞行为,或者作为一种补偿机制来减轻太空飞行对视网膜组织的损害。在太空飞行中,染色质重组作为一种致病或减轻疾病的机制之间的联系还没有被探索。确定染色质重组的位置可以为这些问题提供洞察。此外,文献中没有任何与视网膜色素变性直接相关的DETF,这可能表明这些基因虽然尚未被描述,但可能在视网膜色素变性中发挥作用,或者它们是航天特异性表达网络的一部分,可作为生物标记物和/或药物靶点加以探索。

已观察到减轻细胞损伤的代偿机制是对氧化应激的反应。我们对标记物4-hne的免疫染色显示视网膜内有氧化应激的迹象。在基因表达数据中也观察到了对这种氧化应激的反应的证据。基因Bnip 3差异表达,在航天过程中呈上调(调整p值:2.94E-03;对数2倍变化:0.309)。Bnip 3因为它能从细胞中去除错误折叠的蛋白质而为人所知。45..错折叠的蛋白质可能是氧化应激的结果。太空飞行数据中也有热休克基因。Hsp90a1, Hsp90b1,和Hspa4l它可以帮助正确的蛋白质折叠,并被认为可以防止氧化应激。46,47..从这一点上,我们看到了一种潜在的代偿机制在太空飞行中被激活,以纠正和减轻视网膜组织中积累的细胞损伤。长期空间飞行任务的一个考虑因素是空间环境中启动的补偿机制。就长期任务而言,必须评估这些补偿机制能维持多久,以及如何扩大或扩大其有益影响。此外,我们发现的最近的类似地球疾病,视网膜色素变性,已经知道与氧化应激和线粒体功能障碍有关。虽然目前尚无治愈方法,但补充某些矿物质和维生素,特别是维生素A,已被证明延缓了疾病的进展48并且应该被认为是一种可能的对抗太空飞行引起的视网膜损伤的对策。

我们还发现证据表明,在太空飞行中视网膜的昼夜节律发生了改变。昼夜节律在24小时内调节行为和生理过程,主要由昼夜模式控制。昼夜节律的紊乱会导致睡眠模式、情绪和新陈代谢功能的紊乱,以及癌症的发展。49..具有最小调整p值的差异表达基因,DRD 4(调整p值:4.31E-51;log2倍变化:0.812),是一种与昼夜节律相关的多巴胺受体。特别是,DRD 4下调基因Adcy113(调整p值:1.45E-09;对数2倍变化:−0.427)。Adcy1产生环磷酸腺苷,这是许多视网膜功能的信号机制,如视网膜运动,椎间盘脱落,某些类型的视网膜退化,以及光感受器的凋亡。50,51,52..昼夜节律基因在空间环境中有着特殊的意义,在空间环境中,白天/夜晚的光信号是不规则的。例如,国际空间站上的宇航员每天将经历多达16次日落和日出。53..然而,在我们的实验中,小鼠处于恒定的12小时光/暗周期,这使我们相信,除了光/暗周期本身之外的其他事件正在推动昼夜节律的变化。

与地面对照相比,航天组视网膜ONL、视网膜INL、RPE和脉络膜层厚度减少,光感受器锥损伤增加。在我们先前的啮齿动物实验中,我们也观察到质子辐射对感光层的损伤。54..值得注意的是,全球眼部结构和视网膜层厚度的变化可能具有临床和/或病理意义。34..ONL含有光感受器细胞核,INL包含双极细胞、水平细胞、无分泌细胞和Müller细胞。我们在航天飞机飞行任务(STS-135)上发表的研究表明,航天小鼠光感受器层的ONL和INL细胞凋亡显著增加。2..在许多视网膜疾病中,光感受器丢失是导致不可逆失明的原因。55光感受器对环境破坏更敏感56..视网膜损伤、视网膜光感受器细胞丢失和内视网膜变薄发生在随后的毛细血管变性之前。57,58..我们的发现强烈地暗示了空间环境导致视网膜损伤和潜在的视网膜退化的发展和进展。

微CT在眼科结构定量评价中的潜在效益是令人鼓舞的.我们的结果显示,太空飞行导致眼部结构退化,尤其是视网膜、视网膜和脉络膜层的退化,这表现在它们的厚度减小。微CT提供了一种简单、无损的成像技术,无需任何修改.此外,它还以数字方式显示整个感兴趣的区域,从而增加了研究结果的可获取性和可重复性。未来的工作应该使用体积数据来进行其他利用微CT成像能力的分析,因为它已经成功地用于研究许多正常组织和病理组织。59.

一个值得关注的领域是,观察到的光感受器退化、视网膜损伤和眼结构改变是否会持续,或者一旦生物体返回地球,它是否会逆转。未来的研究应该研究观察到的视网膜结构变化和可能导致晚期视网膜退化的视网膜感光器功能的长期影响。需要进行更多的研究,以确定空间飞行的哪些方面是光感受器损伤和氧化应激的原因。主要原因包括辐射和颅内压(ICP)或眼压(IOP)的可能改变。60,61微重力诱导的。空间辐射和微重力相互作用,有可能导致比两者隔离的更严重的病理结果。其他可能驱动差异基因表达的因素包括:由于航天器起飞和着陆的生理压力和航天飞行的心理压力而增加的压力、有机体的经验。生物体的身体大小也会影响每克体重的间质液量,这可能会影响视网膜的波动压力的大小。62..利用大型有机体进行的研究可以更好地模拟人类在太空飞行期间所经历的波动压力的程度。

为了了解哺乳动物视网膜对太空飞行的反应,还有许多潜在的途径有待探索。在本研究中,我们描述了视网膜的物理反应,光感受器的降解,以及氧化应激标记物的存在。我们还观察到几个在航天条件下差异表达的基因在视网膜色素变性中也有差异表达。此外,我们怀疑我们在太空飞行期间所观察到的变化受选择性剪接和染色质重组的影响。在理解航天诱导的氧化应激对视网膜损伤的机制方面仍有许多工作要做。需要做更多的工作来区分基因表达中引起疾病的变化和代偿性改变。我们还相信,这些数据将有助于理解其他与航天有关的健康问题,如昼夜节律失调和加速衰老。已经提供了一个完整的DEG列表作为资源(Sup)。表1)进一步了解太空飞行、视网膜功能和哺乳动物整体健康之间的联系。

方法

飞行控制条件

SpaceX公司于2017年8月在肯尼迪航天中心(KSC)成功发射了第12次商业再补给服务(CRS-12)有效载荷,执行了为期35天的任务。10周龄雄性C57BL/6小鼠(n=20)(Jackson实验室,Inc.美国国家航空航天局的第九次啮齿动物研究实验(RR-9)。这些老鼠在NASA的啮齿动物栖息地(RH)上生活了35天,然后通过SpaceX的龙胶囊返回地球。在飞行过程中,所有小鼠都被维持在26~28°C的环境温度下,光/暗周期为12小时。gc小鼠被放置在飞行中使用的相同的外壳中,以及环境参数,如温度和二氧化碳(CO)。2)根据遥测数据,水平尽可能接近匹配。GC小鼠被喂食与太空飞行的老鼠相同的美国宇航局特殊的食物吧饮食。所有老鼠都接受相同的[医]锂获得食物和水。这项研究遵循了“美国国立卫生研究院(NIH)实验室动物护理和使用指南”中的建议,并得到了洛马琳达大学(LLU)和美国国家航空航天局(NASA)的机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。

小鼠飞行后评价

回到地球后,老鼠被运送到洛马琳达大学(LLU)在28小时内飞溅下来。在LLU,动物被从动物圈养的硬件中移除,并对其生存和健康进行评估。据报道,所有小鼠在35天的太空任务中幸存下来,情况良好,没有检查人员所描述的明显缺陷/异常。

太空飞行后小鼠眼的解剖与保存

小鼠在100%CO中快速安乐死。2伤后4h内取眼(n=20)。取视网膜解剖,分别放置在无菌冷冻瓶中,冷冻在液氮中,使用前保存在−80°C。将左眼用4%多聚甲醛固定于磷酸盐缓冲液中24小时,用PBS冲洗后进行免疫组织化学(IHC)检测。右眼分为地面对照组和空间飞行组(每组8只),取视网膜。视网膜被快速冷冻,保存在−80°C处进行基因组分析.

免疫染色和组织学

左眼石蜡包埋切片(6m),距左眼约100 mm,每组6例。为了评价视网膜的氧化损伤,采用抗脂质过氧化的4-hne抗体对眼切片进行免疫染色。切片与抗4-hne抗体孵育(目录编号)。HNE11-S,阿尔法诊断国际公司,圣安东尼奥,TX)在4°C持续2小时,然后是驴抗兔IgG荧光结合次级抗体(目录编号。A 21206,Invitrogen Corp.,Waltham,MA),室温下2小时,用DAPI进行染色。用异硫氰酸荧光素(FITC)与花生凝集素(1%BSA:1:100)在室温下双标记HNE和PNA,在室温下标记感光锥。切片在4°C下孵育一夜(18-21小时),加入抗兔抗4-hne(Alpha DiagnoticIntl)单抗。公司圣安东尼奥,德克萨斯州)。在PBS中洗涤三次后,用二级抗体AlexaFluor 568羊抗兔IgG(LifeTechnologies,Eugene,俄勒冈州)进一步处理切片。PNA来源于美国加利福尼亚州Burlingame的载体实验室。细胞核用DAPI染色,用Vectashield硬贴壁培养基(载体实验室)固定。用苏木精和伊红(H&E)染色,观察视网膜各层结构的变化。图像用BZ-X 710全合一倒置荧光显微镜拍摄.在每个样本中,系统地采集了5个区域的图像,放大倍数为20倍,覆盖整个视网膜切片。

免疫染色定量

应用ImageJ计数插件1.41软件对动物组织中PNA阳性细胞数进行定量分析(美国国立卫生研究院,贝塞斯达,MD);http://rsbweb.nih.gov/ij/)。密度分布以PNA细胞/mm的平均数量表示。2,每组平均计数。为确定HNE的免疫反应性,用ImageJ软件对每节随机选取的5个野进行荧光强度测定。提取数据并在组内进行平均。毛描述了一种详细的方法。等人.2.

微CT扫描样品的制备

将6例(n=6)眼标本用4%甲醛固定在PBS中。固定后,用乙醇脱水小鼠眼。为了防止固定样品突然收缩,使用了梯度系列乙醇溶液。然后用10%磷钼酸溶液(PMA)染色6d。样品用无水乙醇清洗,然后将每只眼睛放在2mL的塑料容器中,每只眼睛旋转一次,用无水乙醇进行扫描。

微CT扫描与分析

样品采用高分辨率微型计算机断层扫描系统(SkyScan 1272台式微型CT系统,Bruker,Kontich,比利时),加速源电压为50 keV,源电流为80 mA,集成时间为90 min。在扫描过程中,样品旋转180度,成像体素尺寸为4.5μm,帧平均为4,旋转步长为0.4,无滤波。这些图像被保存用于三维物体的重建。采用描述性分析方法,在显微CT图像上测量视网膜及周围组织的厚度。以视神经为参考,在每个标本矢状位的中间层测量晶状体、视网膜、RPE层、脉络膜和巩膜。对每个结构进行了三次测量,最终得到一个平均值。

RNA/DNA提取

视网膜组织(n=8/组)用Precellys CKM珠(德国希尔登)在600μl的RLT+缓冲液中进行匀浆。总RNA和DNA提取采用QIAGEN AllPrep DNA/RNA/miRNA通用试剂盒。分离后,将RNA和DNA冷冻保存在−80°C处,直至进一步使用。用纳米滴分光度法(Thermo Fisher Science,Chino,CA)对分离的RNA样品进行定量和纯度检测。用Qubit dsDNA高灵敏度试剂盒和RNA广谱试剂盒(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)进一步定量DNA和RNA。用Agilent 2200 TapeStation和RNA Screen磁带对RNA质量进行评价,随机选择1 UL的RNA,72°C变性3分钟,按制造商的指示进行(圣克拉拉,加利福尼亚州)。被测RNA样品的RNA完整性数(RIN)在7.7~8.9之间。

RNA-Seq文库的构建

OOWATE小鼠RNA-Seq系统1-16(NuGen Technologies,#0348)是按照制造商的指令构建搁浅的RNA-seq库的。以100 ng总RNA作为输入。从总RNA(100 Ng)中加入1:500稀释的ERCC ExFold RNA SPIke-in Mix 2(Life Technologies,Carlsbad,CA),以适当的比例合成第1和第2条cDNA。经过引物退火和cDNA合成,用Covaris S 220聚焦超声仪(Covaris Inc.,Woburn,MA)对产物进行剪切。每个样本的130分之一是按照制造商的指示剪切的。实验参数为:占空比10%,峰值功率175次,在4°C下200次/次,200 s,获得150~200 bp的碎片大小。然后是末端修复,适配器指数连接和链选择。用自定义的Inda-C引物混合物SS5 Version5对细胞质和线粒体核糖体RNA缺失小鼠进行链选择。最后,使用17个循环(Mastercycler)进行了库的扩增。®PRO,Eppendorf,汉堡,德国),用RNAleanXPAgencourt珠子净化。

图书馆量化与质量控制(QC)检验

最后的扩增文库用Agencourt RNA清洁XP珠(贝克曼库尔特,印第安纳波利斯,IN)进行纯化,在Qubit 3.0荧光计上用Qubit dsDNA HS试剂盒(LifeTechnologies,Carlsbad,CA)进行定量。在Agilent 2200 TapeStation(加利福尼亚州圣克拉拉,Agilent Technologies)上使用D 1000屏幕磁带确定了质量和峰值大小。

测序

最后的库被稀释为4 NM,并进一步量化,以确保高精度的量化,以一致地汇集条形码库和最大限度地在伊利明纳细胞内的簇数。将不同指标的文库按等摩尔数汇集在一起测序。在测序前,用Qubit对集合库进行量化。在CBOT上用HiSeq 3000/4000 PE集群试剂盒(Illumina,Inc.,San Diego,CA)从2 NM最终库池的5 ul(CBOT加载时200 pm)生成簇进行序列分析。对Illumina HiSeq 4000(Loma Linda大学基因组学中心)使用75个周期SBS试剂(Illumina,Inc.,San Diego,CA)进行测序。产生了75个核苷酸长度(1×75 bp)的单指数型和单端读码.从序列运行生成的FASTQ文件被解聚(Loma Linda大学基因组中心),质量检查(质量分数>38),从Trimmonatic适配器(版本0.01)中剪裁,用TOPHAT 2(版本2)映射到小鼠参考基因组(NCBI_Build_37.2)。总体定位率为85%。表达的转录本用MultiHTSeq(0.02版)计数。

计算管道/RNA-Seq分析工具

差异表达式分析使用原始计数从输入到R包DEseq 2版本1.22.2使用RVersion3.5.1。一个基因被认为差异表达(DE),如果低于错误发现率(Fdr)调整后的p-值为0.1。63..热量图是用万维网工具莫斐斯生成的,来自博德研究所(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)。使用一减Pearson相关对行和列执行分层聚类。使用Panther数据库版本14.1对转录因子DEGS进行了注释。19.

Go、基因网络分析和表型图是通过使用WebGestalt进行过度表示富集分析而创建的。12..利用生物工艺数据库进行GO分析。利用Reactome数据库进行基因网络分析。64..用哺乳动物表型本体论进行表型分析。FDR的计算采用本雅明-霍奇伯格程序。

人类疾病相关基因用于视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变和视网膜脱离,使用DisGeNET6.0版数据库,GDA评分大于0.2。17..人类基因通过小鼠基因组信息学数据库转换成小鼠同源基因。18..这些基因KIZ、PCARE、RP2和RP9没有在小鼠基因组信息学数据库中列出它们的同源基因,而是使用GeneCards数据库(v4.10.0 Build 4)进行手动注释。65.

数据可用性

在本研究期间生成和/或分析的数据集,可在GEO数据库GSE 131954加入标识符下查阅。


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