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一种以三种受体和多种B细胞癌为靶点的BAFF配基CAR-T细胞

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发表时间:2022-01-18 12:09作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

B细胞活化因子(BAFF)结合BAFF-R、BCMA和TACI三种受体,主要在成熟B细胞上表达.几乎所有的B细胞癌都被报道至少表达其中一个受体。在这里,我们开发了一种基于baff配体的嵌合抗原受体(CAR),并利用非病毒基因传递的方法生成BAFF CAR-T细胞。我们发现BAFF CAR-T细胞与三种BAFF受体均有特异性结合,在体外和体内均能有效地杀伤多种B细胞癌,包括外套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤(MM)和急性淋巴细胞白血病(ALL)。BAFF CAR-T细胞与这些肿瘤细胞共培养可诱导活化标记CD 69、脱颗粒标记CD107a和多种促炎细胞因子。总之,我们报告了一种基于配体的baff car-T,能够结合三种不同的受体,使抗原逃逸在治疗B细胞癌中的可能性最小化。

导言

嵌合抗原受体T细胞(car-T)免疫治疗在治疗液体癌症方面取得了巨大的成功,提供了快速和持久的应答。1,2,3,4,5。然而,疾病复发往往发生在这些患者。复发的主要原因是癌细胞上的汽车特异性抗原丢失,或由于耗尽而导致car-T细胞表现不佳或持久性下降。6,7,8,9,10,11,12。抗原逃逸的报道不仅针对CD 19导向的汽车,还报道了bcma的抗原逃逸。13,EGFRvIII14,以及IL13Rα215强调CARS针对单一肿瘤相关抗原的缺点。因此,很有必要确定可供选择的目标定位策略和汽车设计。16。在恶性细胞上靶向多标记物是对抗抗原逃逸的一种很有前途的方法。6。由于天然存在的配体的固有结合性质,由配体或受体外域组成的CARS可能具有结合多种蛋白质的能力。少数基于配体或受体的CARS已经在临床上进行了测试,并显示出令人鼓舞的结果。17,18,提出了一种有趣的设计方法来对抗抗原逃逸。

大多数car-T治疗集中在CD 19或其他有限抗原的单一靶向治疗上。19。这种集中在几个目标上的努力可能会分散未来的创新,因为它会稀释资源和患者参与临床试验,从而迫切需要识别和开发新的汽车目标。其中一个吸引人的靶点是B细胞活化因子(BAFF)受体.Baff配体是一种重要的B细胞存活因子,它与Baff-R、TACI和BCMA三种受体结合。20。这些受体在成熟的B细胞和广泛的B细胞肿瘤中表达。21,22,23,24,25。BAFF与多种受体结合的能力可能通过下调BAFF受体来防止抗原逃逸,从而降低B细胞逃避细胞毒性的能力,因为它们对细胞的存活非常重要。此外,与针对PAN-B细胞标记CD 19的治疗相比,针对BAFF受体的CAR-TS可能被认为是一种更有选择性的方法来消除恶性B细胞,因为它们在B细胞发育过程中表达更有限。目前,car-ts的产生主要是通过病毒途径将基因转化为人的T细胞。26.

尽管病毒转导技术相对成功,但人类CAR-T产品的生产成本高、复杂,并与值得注意的安全因素相关,因此需要采用其他方法。27,28,29。自从转座子介导的基因治疗在近10年前首次应用于人类以来。30,还有十几个临床试验正在进行或已经完成,支持基于转座子的系统作为一种安全稳定的基因转移替代方案,其效率与病毒转导相当或更好。31.

在这里,我们报道了一种基于baff配体的car-T细胞产品的开发和验证,该产品可以利用非病毒成功地生成。TcBuster (TCB转座子系统。我们发现这些BAFF CAR-T细胞对多种B细胞癌所表达的三种BAFF受体(BAFF-R、BCMA和TACI)具有功能和特异性。我们展示了BAFF CAR-T细胞对地幔细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤(MM)和急性淋巴细胞白血病(ALL)异种移植小鼠的细胞毒性。

结果

一种利用非病毒基因传递的baff配体car-T

我们利用细胞内CD 28、OX 40/CD 134共刺激结构域、CD3ζ信号域以及CD 28跨膜结构域设计了基于baff配体的CAR结构。1A)。为了有效地结合BAFF受体,我们使用了一个截短的BAFF序列,该序列包含天然人BAFF配体的大部分胞外结构域。我们还创建了一个缺乏BAFF的构造,但是它与BAFF-CAR结构的其他部分相同,可以作为一个负控制(NO-BAFF控件)(如图所示)。1A)。由于可溶性内源性人BAFF与BAFF-CAR细胞外结构域的同源性,可以合理预测BAFF-CAR-ts与经典的BAFF受体BAFF-R、BCMA和TACI结合,从而赋予多抗原特异性。重要的是,我们还利用非病毒基因工程方法将baff-car稳定地整合到T细胞中。TCB转座子系统后续电穿孔TCB转座酶编码mRNA和转座子质粒进入T细胞,转座酶酶切转座子质粒中的BAFF-car“货”,然后整合到基因组DNA中,使BAFF-car蛋白稳定表达。1B)。对于传统的慢病毒转导,采用了一种改良的pLVX表达载体(附图)。1A)。慢病毒和TCB通过流式细胞仪检测T细胞表面BAFF配体的表达,证明了BAFF-CAR的稳定表达。1C)。表面BAFF的表达与GFP在慢病毒介导的T细胞中的表达直接相关,因为pLVX载体与BAFF-CAR的启动子下游编码GFP。供者T细胞CD4/CD8比值也有特征性(图1)。1C)。转染NO-BAFF控制结构的T细胞表达GFP,而不表达表面BAFF(补充图)。1B)。使用TCB转座子法检测BAFF-CAR的稳定表达.扩增7d后,冷冻不同供体产生的BAFF CAR-T细胞,解冻后培养21d。解冻后21d CAR-T细胞表达的细胞表面BAFF与解冻后5天的细胞表面BAFF表达量相似(补充图5)。1C).

图1:用BAFF-CAR结构通过不同的表达方法产生CAR-T细胞.
figure1

aBAFF-CAR结构原理图由细胞外BAFF配体、短间隔区、人IgG 1、CD 28跨膜和信号域、OX 40和CD3ζ组成。以无细胞外BAFF(NO-BAFF)为阴性对照。b非病毒原理图TcBuster(TCB)转座子系统,使CAR蛋白的稳定表达。1.TCB将转座酶mRNA和转座子质粒导入细胞。2.蛋白质TCBMRNA产生。3.转座子酶切割转座子质粒的货物。4.TCB转座酶将转座子粘贴到基因组DNA中。5.从基因组DNA中稳定地表达了Cargo mRNA。cBaff-car结构在人T细胞中通过慢病毒转导或通过慢病毒途径在原代人T细胞中表达。TCB转座酶系统在慢病毒转导5d后,以BAFF的%GFP表达和相关的外源表面表达为基础,检测转染效率。效率TCB转座酶介导的表达完全基于外源BAFF的表达。同时测定CD4+和CD8+T细胞百分比。实验在四种不同的T细胞供体中重复。d将CAR-T细胞、NO-BAFF对照T细胞或未经修饰的T细胞与荧光标记的Jeko-1 MCL细胞按5:1的效应器:靶(E:T)比例共培养16h,然后用流式细胞仪进行流式细胞术。用碘化丙酸丙啶(PI)染色法和门控法测定标记靶细胞的细胞毒性。NS不显著,*P < 0.001. P=0.0002对于未经修改的控件和CAR-T,P=0.0003用于非BAFF控制和CAR-T。图形显示平均值±SD,n=3生物独立的共培养物,单因素方差分析与Tukey的多重比较检验。实验在两种不同的T细胞供体中重复。源数据作为源数据文件提供。

其次,我们对Jeko-1 MCL细胞进行了初步的细胞毒性实验,以确定BAFF-CAR功能.T细胞与荧光标记的Jeko-1细胞按5:1的效应物:靶(E:t)比例共培养16h,然后用碘化丙啶(PI)染色,在癌细胞上进行门控,以确定癌细胞的死亡情况。Baff CAR-T细胞的细胞毒性明显高于未修饰T细胞和NO-BAFF对照T细胞,而NO-BAFF对照T细胞的细胞毒性与未修饰T细胞无显著差异(图1)。1D)。这证实了我们的BAFF-CAR结构是功能性的,而在N-端存在BAFF是细胞毒性功能所必需的。

BAFF-CAR基因整合T细胞的非病毒平台特性研究

在鉴定了car-T细胞的功能之后,我们想要评估转座子整合的位置,以及是否有克隆的生长。TCB介导转座子整合事件。病毒整合的历史数据32,33,以及另外两个转座酶系统34,并将其与转座子整合进行了比较。TCB(无花果)2A)。通过对所有因子的分析,结果表明:TCB转座子插入转录-编码DNA区域的频率低于慢病毒。2A和补充表1)。在评估整合事件与转录起始点之间的距离时,基于转座子的整合方法包括TCB,与慢病毒相比,在远离转录起始点的情况下整合得更远(如图所示)。2B)。本研究中产生的细胞产物与现有的慢病毒数据进行了比较,并没有显示出明显的克隆生长(表)。1).

图2:整合站点分析显示与TCB.
figure2

a分析外显子编码转录位点、非外显子编码转录位点和非转录位点整合事件的频率。从转染的人T细胞中采集样本。TcBuster (TCB)或由Wang等人、Brady等人和Gogol-D ring等人生成的历史数据集。32,33,34。并对硅片控制系统中的随机变量进行了生成和分析。某人睡美人、LV慢病毒数据集。图显示平均值±SD,生物独立样本。n=8对TCB-M,n=9对某人而言,n=9表示piggyBac,n=2表示LV(Wang),n=4表示LV(Brady),n=8表示随机数。b转座子整合位点与最近基因转录起始点之间的中位距离是用于转座子和慢病毒整合的。某人睡美人、LV慢病毒数据集。图显示平均值±SD,生物独立样本。n=8对TCB-M,n=9对某人而言,n=9表示piggyBac,n=2表示LV(Wang),n=4表示LV(Brady),n=8表示随机数。所有图形的源数据都作为源数据文件提供。用于执行集成站点分析的排序数据可在网上获得(登录ID:PRJNA 779430).

表1 T细胞克隆克隆生长频率。

由于载体拷贝数(VCN)是今后任何监管文件中的一个重要考虑因素,我们通过液滴数字PCR(DdPCR)对转座子拷贝数进行了评估。设计了7个独立的T细胞供体来表达BAFF CARTCB。提取基因组DNA并对样品进行分析。没有捐献者获得每个CAR+细胞的拷贝数>10份(表)2).

表2 BAFF-T细胞中的CAR整合拷贝数。

BAFF CAR-T细胞的特性研究

接下来我们对BAFF CAR-T细胞的功能和特异性进行了研究.由于可溶性BAFF通常存在于人体循环中,并可能在B细胞癌患者中升高。24,35我们研究了它是否会通过竞争受体结合来影响BAFF、CAR-T细胞毒性.此外,三种baff受体的可溶性形式已在健康成人的血液中被鉴定出来。36,37。这些水平可能与自身免疫性疾病和癌症,如慢性淋巴细胞白血病(Cll)有关。36。在三种baff受体中,sbaff-R水平在健康成人中最高,尽管baff-R还没有被证明是一个诱饵受体,部分原因是除非它是配体结合,否则它不会从膜上被切割。36,38。考虑到血中存在可溶性baff配体和受体,并考虑到Staci和sBCMA作为诱饵受体的潜在作用,我们对这些可溶性重组蛋白是否能抑制baff car-T介导的杀伤进行了尖峰杀伤实验。每种可溶性蛋白的生理相关浓度被选择,如图中的说明所示。3A36,37。结果表明,BAFF、CAR、T细胞介导的细胞毒性在任何时间点或效应因子家族蛋白的存在下均未减弱,相对于供体匹配的对照T细胞而言,检测的靶标比没有降低(图1)。3A和补充图。2A)。我们进一步检测了重组BAFF存在下BAFF CAR-T细胞在病理生理学(5ng/mL)和非生理(100 ng/mL)浓度下的细胞毒性,在任何一种共培养条件下均未观察到对Jeko-1细胞毒性的变化(附图)。2B).

图3:对Baff CAR-T细胞的功能和特异性进行了表征和实验验证.
figure3

a用可溶性重组BAFF/BAFF受体(sBAFF=1 ng/mL;sBAFF-R=500 ng/mL;sBCMA=2.5 ng/mL;TACI=20 pg/mL)与荧光素酶表达的Jeko-1细胞共培养24h。车辆起负控制作用。用平板阅读器测量了发光。用单纯靶标对照法计算细胞存活率,并与未修饰T细胞共培养的靶细胞的平均发光进行归一化处理。****P < 0.0001. Mean ± SD, n=3生物独立的共培养物,双向变异数与Šídák的多重比较检验。实验在三种不同的T细胞供体中重复。b将CAR-T细胞或未修饰的T细胞与表达BAFF-R、BCMA或TACI的HEK293T细胞按5:1E:T比例共培养16h,用PI染色和标记靶细胞门控法检测细胞毒性。NS不显著,*P < 0.0001. Mean ± SD, n=3生物独立的共培养物,用Šídák的多重比较检验进行双向方差分析。实验在两种不同的T细胞供体中重复。c将Baff CAR-T细胞或未修饰的T细胞与不同类型的原代人细胞按1:1E:T比例共培养24h,评价其不良反应的可能性。测定靶细胞裂解时乳酸脱氢酶(LDH)的释放量,并与裂解对照组(0.8%TritonX-100)进行比较,计算细胞毒性。细胞毒性百分比=[实验性LDH释放-效应因子(自发LDH释放)-靶点(自发LDH释放)]/[靶(最大LDH释放)-靶点(自发LDH释放)]×100。中枢神经系统、外周神经系统。NS不显著*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. The following p-值对应于未经修改的Controlvs Car-T:P < 0.0001 for airway epithelial cells, P主动脉平滑肌细胞=0.0003,P心肌细胞=0.0377,P中枢神经系统神经元=0.0027,P < 0.0001 for hepatocytes, P卵巢表面上皮细胞=0.0401,PPNS神经元=0.0094,P < 0.0001 for renal epithelial cells, P < 0.0001 for Sertoli cells, P=对滋养层细胞无显著影响。平均±SDn=8种生物独立的共培养物,用Šídák的多重比较检验进行双向方差分析。实验在两种不同的T细胞供体中重复。所有图形的源数据都作为源数据文件提供。

在测试BAFF-CAR结构的功能的同时,我们还想对其特性进行表征.为此,我们使用HEK293T细胞,该细胞通常不表达任何BAFF受体,并通过流式细胞术(附图)将其构建成三种BAFF受体(BAFF-R、TACI或BCMA)中任何一种的外源性表达(BAFF-R、TACI或BCMA)。2C)。Baff、CAR-T或未修饰T细胞与改良或亲本HEK293T细胞按5:1E:T比例共培养16h。我们观察到,与未修饰的T细胞相比,BAFF CAR-T细胞对所有三种表达BAFF受体的HEK 293 T细胞均表现出明显的细胞毒性,但对亲本细胞的杀伤作用不明显。3B).

最后,我们测试了BAFF CAR-T细胞对多种器官系统不同类型的正常细胞是否有不良毒性。Baff car-T细胞或未修饰的对照T细胞与不同的原代细胞共培养,包括气道上皮细胞、主动脉平滑肌细胞、心肌细胞、中枢神经系统神经元、肝细胞、肾上皮细胞、卵巢表面上皮细胞、支持细胞和胎盘滋养细胞。以对Jeko-1细胞的细胞毒性为基准,对每种原代细胞重复毒性。与未修饰的T细胞相比,我们没有观察到对这些细胞类型有任何显著的不良反应(图一)。3C),进一步突出BAFF CAR-T细胞的临床潜力。

BAFF CAR-T细胞对多种B细胞癌的体外杀伤作用

接下来,我们全面测试了BAFF CAR-T细胞对代表不同B细胞恶性肿瘤的几种不同细胞株的体外细胞毒性:Jeko-1(MCL)、RS4;11(ALL)、RPMI-8226(MM)、U 266(MM)和MM.1S(MM)细胞系。从流式细胞仪分析可以看出,这些细胞系表达了三个BAFF受体中的一个或多个。4A)。众所周知,Jeko-1细胞表达高水平的BAFF-R和低水平的BCMA,而MM细胞系则相反。4A)。MCL和MM细胞均表达TACI。RS4;11细胞表达相对较高的BAFF-R,少量TACI,几乎不表达BCMA.MM细胞CD 19染色阴性,可作为BAFF CAR-T检测CD 19阴性的肿瘤模型。

图4:Baff CAR-T细胞对MCL、ALL和MM细胞表现出明显的体外细胞毒性.
figure4

a对不同B细胞恶性肿瘤细胞系进行BAFF-R、BCMA、TACI和CD 19的染色。红色=Jeko-1(MCL);蓝色=RS4;11(ALL);Cyan=RPMI-8226(MM);橙色=U 266(MM);紫色=MM.1S(MM);黑色=未染色细胞。bCAR-T细胞或未修饰的T细胞与荧光标记的癌细胞按E:T比例共培养16h(Jeko-1,RS4;11,MM.1s)或40h(RPMI-8226,U 266)。用PI染色法和门控法检测靶细胞的细胞毒性。圆=未修改的控制,三角形=CAR-T。**P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Jeko-1: P=3.34e-4(10:1),P=1.92E-4(5:1),P=6.72E-4(1:1)。RS4;11:P=9E-6(10:1),P=3E-6(5:1),P=8.8E-5(1:1)。RPMI-8226:P=2.1E-5(1:5),P=2.85E-4(1:10),P=2.919e-3(1:20)。U 266:P=7.2E-5(1:5),P=3E-6(1:10),P=2.179E-3(1:20)。嗯1:P=6.6E-5(5:1),P=3E-6(3:1),P=1.29E-4(1:1)。平均±SDn=3生物独立的共培养物,多个未配对的双尾t-用Holm-Šídák校正进行多次比较。c应用CRISPR技术,阻断BAFF-R、TACI或BAFF-R和TACI在Jeko-1细胞中的表达.用荧光标记的癌细胞与BAFF、CAR-T细胞或未经修饰的T细胞按3:1E:T比例共培养16h。亲本Jeko-1细胞作为阴性对照。细胞毒性测定如下。NS不显著,*P < 0.0001. Mean ± SD, n=3生物独立的共培养物,双向方差分析与Tukey的多重比较检验。d用CRISPR方法阻断BCMA、TACI或BCMA和TACI在RPMI-8226细胞中的表达。用荧光标记的癌细胞与BAFF、CAR-T细胞或未经修饰的T细胞按1:10E:T比例共培养36h。亲本RPMI-8226细胞为阴性对照。细胞毒性测定如下。NS不显著*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. P=0.0015(父母对TACI KO),P < 0.0001 (Parental vs BCMA/TACI Dual KO), P=0.0006(BCMA KO Vs TACI KO),P < 0.0001 (BCMA KO vs BCMA/TACI Dual KO), P=0.0137(TACI KO对BCMA/TACI双KO)。平均±SDn=3生物独立的共培养物,双向方差分析与Tukey的多重比较检验。所有图形的源数据都作为源数据文件提供。所有细胞毒性实验均在两种不同的T细胞供体中重复。

用荧光标记的癌细胞与不同E:T比的BAFF CAR-T细胞共培养16h(Jeko-1,RS4;11,MM.1s)或40h(RPMI-8226和U 266),用流式细胞仪检测细胞死亡情况。与未修饰的T细胞相比,Baff CAR-T细胞对所有这些B细胞恶性肿瘤的细胞毒性明显增强(图1)。4B)。这对所有被测的细胞系和所有测试的E:T比率都是正确的。在5:1E:T比下,Jeko-1细胞(69%)和RS4细胞(57%)在BAFF CAR-T细胞介导下表现出明显的细胞死亡。在3:1E:T比下,BAFF CAR-T细胞对MM.1S细胞的杀伤作用最大(63%)。对RPMI-8226细胞(57%)和U 266细胞(37%)的杀伤率为1:5E/t。4B)。在相同的比例下,未经修饰的T细胞对靶细胞的杀伤率要低得多。因此,我们已经证明用非病毒基因工程产生的BAFF CAR-T细胞对多种B细胞癌具有细胞毒性。

为了证实BAFF/BAFF受体结合在介导细胞毒性中的作用,并模拟患者的抗原逃逸情况,我们构建了Jeko-1细胞,其中BAFF-R、TACI或BAFF-R和TACI受体的表达均被CRISPR/Cas9阻断。其次,我们测定了BAFF CAR-T细胞对这些细胞的杀伤作用.Jeko-1细胞表达较高水平的BAFF-R和中等水平的TACI,尽管它们在表面几乎不表达BCMA(如图所示)。4A)。因此,通过敲除BAFF-R和TACI,我们获得了不能检测到BAFF受体表达的Jeko-1细胞,作为证实BAFF-CAR结构特异性的工具。通过荧光激活细胞分选(FACS)技术,从未转染细胞中筛选出成功的基因敲除细胞(附图)。3A)。与亲代Jeko-1细胞相比,BAFF-R/TACI受体双基因敲除的BAFF CAR-T细胞对Jeko-1细胞的杀伤作用明显降低。4C)。有趣的是,BAFF CAR-T细胞能够有效地杀伤TACI或BAFF-R单基因敲除细胞,表明TACI或BAFF-R的表达对BAFF-CAR介导的杀伤是足够的。双BAFF-R/TACI受体基因敲除与单纯TACI基因敲除相比,细胞毒性明显降低。这表明这两种受体的靶向性对BAFF-CAR功能有显著影响,而单纯TACI的Jeko-1细胞表达并不影响BAFF-CAR-T的活性。此外,BAFF-R或TACI的丢失仍使BAFF-CAR-T细胞具有明显的细胞毒能力.

同样,我们使用CRISPR/Cas9在RPMI-8226细胞中敲除BCMA、TACI或BCMA和TACI,因为它们同时表达BCMA和TACI,但没有检测到BAFF-R。通过流式细胞仪(FACS)从未转染细胞中分离出敲除细胞。3B)。Baff CAR-T细胞对双BCMA/TACI基因敲除细胞的杀伤作用显著降低(图1)。4D)。单个TACI基因敲除RPMI-8226细胞对细胞毒性也有一定抑制作用,而BCMA基因敲除细胞与亲本细胞相似。因此,我们已经证明,我们能够成功地产生BAFF CAR-T细胞,这些细胞对表达三种BAFF受体中任何一种的靶细胞都具有功能和特异性,即使在实验上消除了其中一种天然受体的表达。

与癌细胞共培养后baff car-T细胞活化

接下来,我们通过CD 69染色来表征T细胞的活化,CD 69是抗原结合后表面表达的一种T细胞活化标记物。Baff car-T细胞与所有靶细胞共培养时,CD 69的表达水平明显高于未修饰的细胞(图1)。5A)。这可与基线时的CD 69表达相比较,而不存在靶细胞,其中BAFF CAR-T细胞表达表面CD 69的比例要小得多(~16%),但仍略高于未经修饰的T细胞(~4%)(补充图)。4A)。我们还检测了细胞毒性免疫细胞释放穿孔素和颗粒酶B过程中表达的脱颗粒标记CD107a。BAFFCAR-T细胞表面CD107a水平明显升高,而未经修饰的细胞表面CD107a水平不明显(图一)。5B)。在没有靶细胞存在的情况下,BAFF CAR-T细胞和未修饰的T细胞表面CD107a(补充图)均未显示出明显的表面表达。4B).

图5:不同B细胞癌刺激Baff CAR-T细胞活化、脱颗粒和释放细胞因子.
figure5

a用标记的Jeko-1或RS4联合培养T细胞,以5:1E:t比例培养24 h的11细胞,1:5E:t比的RPMI-8226细胞共培养5h,U 266细胞以5:1的E:T比例培养5h,然后进行活化标记CD 69的染色。用流式细胞术测定活细胞和不含标记癌细胞后CD 69+T细胞的百分比,对CAR-T细胞采用GFP+细胞加门控法排除未修饰细胞。***P < 0.001, ****P < 0.0001. Mean±SD, n=3相互独立的共培养物,对每个细胞系进行未配对的双尾t检验。用2种不同的T细胞供体重复实验。bT细胞与Jeko-1、RS4、11、RPMI-8226、U 266细胞按5:1E:t比例共培养6h,同时进行脱颗粒标记CD107a染色。用流式细胞术测定CD3+细胞门控后CD107a+T细胞的百分比,对CAR-T细胞采用GFP+细胞加门控法排除未修饰细胞。****P < 0.0001. Mean±SD, n=3相互独立的共培养物,对每个细胞系进行未配对的双尾t检验。用两种不同的T细胞供体重复实验。c收集T细胞和Jeko-1,RS4;11或RPMI-8226共培养上清液,采用多重细胞因子释放试验测定T细胞释放各种促炎细胞因子和裂解酶。**P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. For Jeko-1, Unmodified Control vs CAR-T: TNF-α: P=1e-6;IFN-γ:P=7E-6;sFasL:P=3E-6;颗粒酶A:P=2.751e-3;颗粒酶B:P=2.9e-4;穿孔素:P=3.834e-3;颗粒素:P=2.9e-4。对于RS4;11,未经修改的Controlvs CAR-T:TNF-α:P=9e-6;IFN-γ:P=5.9E-5;sFasL:P=2.2e-5;颗粒酶A:P=2.19e-4;颗粒酶B:P=2.9e-5;穿孔素:P=2.19e-4;颗粒素:P=9e-6。对于rpmi-8226:TNF-α:P < 1e-6; IFN-γ: P < 1e-6; sFasL: P=1.1e-5;颗粒酶A:P < 1e-6; Granzyme B: P < 1e-6; Perforin: P=7e-6;颗粒素:P=7e-6。平均±SDn=3个生物独立的共培养样本,采用Holm-Šídák校正的多个未配对双尾t检验进行多重比较。用两种不同的T细胞供体重复实验。所有图形的源数据都作为源数据文件提供。

其次,我们采用基于珠的多重流式细胞术测定T细胞与靶细胞共培养后各种促炎细胞因子和溶解酶的释放。BAFF CAR-T细胞释放的促炎症细胞因子TNF-α和IFN-γ、溶酶体A、B和穿孔素、可溶性Fas配体(SFasL)和粒细胞素(图1)均明显升高。5C)。为了检测这些细胞因子和裂解酶的基线释放,我们将BAFF CAR-T细胞与未经修饰的对照T细胞与Jeko-1细胞共培养。多重分析表明,与对照T细胞相比,baff car-T细胞不表达TNF-α、IFN-γ、sFasL或颗粒酶A,但与Jeko-1细胞共培养时,这些细胞因子的释放明显增加(补充图)。4C)。为了检测这些T细胞的IL-2分泌,我们将BAFF CAR-T细胞和未经修饰的对照T细胞与Jeko-1细胞在无IL-2培养基中共同培养,观察到BAFF CAR-T细胞分泌的IL-2水平明显高于对照组(附图)。4D).

BAFF CAR-T细胞对MCL液癌的体内杀伤作用

我们利用改良表达萤火虫荧光素酶基因(Jeko1-Luc)的Jeko-1细胞,分析了BAFFCAR-T对MCL液体移植模型的影响。雄性或雌性NSG小鼠静脉注射(i.v.)用JEKA-1-Luc细胞(1.5e6)和肿瘤接种后第9天,小鼠腹腔注射。与BAFF CAR-T(10e6)或未经修饰的对照T细胞(10e6)(补充图6)。5A)。生物发光成像每周进行一次,直到第36天(图6)。6A和补充图。5B)。第36天,接受控制T细胞治疗的小鼠要么因肿瘤负担而死亡,要么生病,而baff car-T处理的小鼠则全部存活,没有出现任何疾病症状(图一)。6A)。在实验过程中,BAFF、CAR-T小鼠的生物发光信号强度仍明显低于对照组(附图)。5B)。我们观察了这些小鼠,直到第60天,并绘制了一条生存曲线。与对照组小鼠相比,Baff CAR-T处理小鼠的存活时间明显延长(图1).6B)。我们想要评估这些小鼠的T细胞持久性。因此,我们在第23、37、51和58天采集各组小鼠外周血,用流式细胞仪测定循环中人CD3+/CD 45+T细胞的数量。6C)。在对T细胞进行门控后,我们还测量了细胞毒性CD8+T细胞的百分比。6d).

图6:体内静脉MCL移植模型中Baff CAR-T细胞控制癌细胞的进展。
figure6

aNSG小鼠腹腔注射。第0天经尾静脉注射1.5e6Jeko-1-Luc细胞。第9天,注射10e6 BAFF CAR-T细胞或对照T细胞。每周进行一次生物发光成像,直到第36天,实验持续到第58天。n=9只小鼠。b以接种后第58天为实验终点,建立雄性和雌性小鼠Kaplan-Meier生存曲线。实线=控制-T,虚线=汽车-T。采用对数秩(Mantel-Cox)检验,对各组间的生存情况进行统计分析。****P < 0.0001 for the pairwise comparison between Control-T and BAFF CAR-T treatment groups, for both male and female mice. c分别于接种肿瘤后23、37、51和58天,每组4只小鼠尾静脉采血,用流式细胞术、抗hCD3、抗hCD 45抗体计数及计数珠计数。图表显示单个值和平均值。黑色=控制-T,橙色=汽车-T。d随着时间的推移,人类CD8+T细胞百分比被绘制为门控T细胞上的个体值和平均值。黑色=控制-T,橙色=汽车-T。e在安乐死时采集复发小鼠的脾脏和骨髓,以评估CAR-T治疗后BAFF受体抗原丢失的可能性。红细胞溶解后,细胞同时进行CD 19、BCMA、TACI和BAFF-R染色,然后用流式细胞术对CD 19进行门控。黑=对照-T处理小鼠白细胞;蓝色/红色=两种不同的车-T处理小鼠的白细胞,检测到Jeko-1复发;灰色=未染色的WBC样本。所有图形的源数据都作为源数据文件提供。实验在两种不同的T细胞供体中重复。

CAR-T治疗组中有2只小鼠复发,我们想确定它们的复发疾病是否是由于Jeko-1细胞表面的BAFF受体抗原丢失所致。我们在安乐死时处理了这些小鼠的脾脏和骨髓样本。应用流式细胞术和人CD 19门控技术,我们观察到2只复发的CAR-T小鼠脾中Jeko-1细胞的受体表达谱与对照组小鼠的Jeko-1细胞相比没有明显变化(图1)。6E)。除了评估抗原丢失的可能性外,在实验终点,从baff car-T处理的小鼠中采集脾脏和骨髓样本,比较这些区域中Jeko-1细胞和人T细胞的百分比,并与以前从对照组-T处理小鼠中收集的样本进行比较。BAFF CAR-T处理小鼠的典型样本显示,在脾脏和骨髓中几乎检测不到Jeko-1细胞,这是通过人CD 19染色确定的,而对照组T-T小鼠脾脏和骨髓的细胞群则以Jeko-1细胞为主(附图)。6)。类似地,baff car-T处理的小鼠脾脏和一些骨髓样本中的T细胞百分比较高,而对照T处理小鼠则有较低或无法检测到的T细胞。

我们用同样的i.v进行了另一个实验。Jeko-1异种移植模型,以确定低剂量的CAR-T细胞是否会显示出类似的效果.注射雄性或雌性NSG小鼠。用JEKA-1-Luc细胞(1.5e6),1周后腹腔注射。BAFF CAR-T细胞(3e6)或对照T细胞(3e6)或PBS(补充图6)。7A)。每周进行一次生物发光成像,直到第70天。PBS和Control-T治疗组表现出这种疾病的侵袭性进展;雌性小鼠在第28天被杀死,大多数雄性小鼠在第35天被杀死(补充图5)。7b)。然而,接受BAFF CAR-T细胞的小鼠在第70天前明显减轻了肿瘤负担.与PBS-和对照组相比,Baff CAR-T处理小鼠的存活时间明显延长(补充图).7C)。不出所料,BAFF CAR-T小鼠的平均脾脏重量低于PBS或对照T细胞(补充图)。7D)。此外,BAFF CAR-T小鼠保持了相对稳定和健康的体重(补充图).7E),他们没有表现出任何明显的痛苦或发病迹象。我们还包括一组未接种肿瘤并只注射BAFF CAR-T细胞的小鼠,以评估BAFF、CAR-T的相关毒性。NSG小鼠腹腔注射。对于BAFF CAR-T细胞(3e6),在70天的时间内,他们并没有显示任何仅来自BAFF CAR-T细胞的发病迹象,也没有经历任何有关体重变化的迹象(补充图)。7F)。70天后,检测肝脏毒性血清标志物,并收集肾、肝、肺、脾等器官进行组织学分析。测定正常NSG小鼠和BAFF CAR-T细胞注射小鼠血清中常见肝损伤标志物丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)活性。两组间ALT、AST活性无显着性差异(补充图)。7g)。BAFF CAR-T注射小鼠无明显损伤、组织损伤或组织结构明显改变(附图)。8).

BAFF CAR-T细胞对MCL固体、MM液和全液癌的体内杀伤作用

接下来,我们要用B细胞癌异种移植模型来评估BAFF CAR-T细胞的体内有效性。我们采用实体MCL模型,将Jeko-1细胞皮下注射(S.C.)免疫缺陷的NSG小鼠。在可见的肿瘤发生后,小鼠接受瘤内注射BAFF CAR-T细胞、未经修饰的对照T细胞或单纯PBS(补充图)。9A)。我们观察到,当PBS或对照T细胞治疗小鼠肿瘤体积继续增加时,BAFF CAR-T细胞治疗后肿瘤体积迅速下降(见图)。7A)。与对照组相比,BAFF CAR-T细胞治疗小鼠的存活时间也明显延长。7b).

图7:Baff CAR-T细胞在体内对MCL、MM和所有异种移植模型表现出明显的细胞毒性.
figure7

a10e6Jeko-1细胞注射到NSG小鼠皮下第0天(D0)。肿瘤形成后,4e6个CAR-T细胞、未经修饰的对照T细胞或PBS单独注入瘤内D14。肿瘤体积(毫米)3)=(长度×宽度)2)/2.黑色=PBS,橙色=控制-T,绿色=汽车-T。*P < 0.05, **P < 0.01. D18: P=0.0467 pbs/car-T;D20:P=0.0068 pbs/car-T,P=0.0246控制-T/CAR-T;D22:P=0.0017 pbs/car-T,P=0.0306控制-T/CAR-T;D25:P=0.0168 pbs/car-T,P=0.0421 Control-T/Car-T.平均±SDn=5只小鼠,经TUKEY校正后进行多次比较。b小鼠接种后存活。实线=pbs,虚线=Control-T,虚线=Car-T。**P < 0.01. P=0.0054 Control-T/car-T和pbs/car-T。采用对数级(Mantel-Cox)检验,然后用Holm-Šídák校正进行多次比较.cNSG小鼠腹腔注射5e6MM.1S-Luc细胞。D02e6注射CAR-T或对照T细胞。D8和D16。成像一直持续到接种后的D29。发光强度测量为辐射度(光子/秒/厘米)。2(高级专员)。d每只老鼠的平均辐射是用一条线连接装置绘制的。橙色=控制-T,绿色=汽车-T。*P < 0.05, ****P < 0.0001. D26: P=0.0128;D29:P < 0.0001. n=5只小鼠,经Šídák校正后进行多次比较。e1e6RS4;11细胞注入NSG小鼠腹腔注射。D01e6单独注射CAR-T细胞或PBS(对照组)。D6.接种后处死小鼠。流式细胞术和人抗CD 19染色检测RS4;****P < 0.0001. Blood: P=1.7e-5;脾脏:P < 1e-6; Bone Marrow: P=1.7e-5。平均±SDn=5只老鼠,多只未配对的双尾老鼠t-Holm-Šídák校正测试。f小鼠脾脏重量从RS4;11异种移植模型安乐死后。****P < 0.0001. Mean±SD, n=5只小鼠,未配对双尾t检验。g2e6例ALL(Pt2)细胞注入NSG小鼠腹腔注射。D02e6腹腔注射CAR-T细胞或单纯PBS(对照组)。D6.小鼠接种后处死D31。测定Pt2细胞残留百分率。****P < 0.0001. Blood: P=2e-6;脾脏:P < 1e-6; Bone Marrow: P < 1e-6. Mean±SD, n=4只小鼠,经Holm-Šídák校正多次未配对双尾t检验。h小鼠脾重来源于Pt2异种移植模型。****P < 0.0001. Mean±SD, n=4只老鼠,未配对双尾t-测试。所有图形的源数据都作为源数据文件提供。实验在两种不同的T细胞供体中重复。

接下来,我们用一种生物发光的MM.1s骨髓瘤细胞系(MM.1s-Luc)来建立静脉注射的MM异种移植模型。腹腔注射MM.1S-Luc细胞(5e6)。经尾静脉注入NSG小鼠,8d和16d后分别用CAR-T细胞(2e6)或对照T细胞(2e6)治疗。7C和补充图。9B)。每隔3~5天进行一次成像,直到第29天,在大多数对照组小鼠中肿瘤负担明显可见(如图所示)。7C)。对BAFF CAR-T小鼠的生物发光强度进行了量化和绘制,结果表明,与对照组相比,BAFF CAR-T小鼠的肿瘤负荷有明显的抑制作用(图一)。7D)。Baff car-T处理小鼠的肿瘤进展比对照组小鼠慢得多.

接下来,我们针对两种不同的异种移植模型测试了BAFF CAR-T细胞。在一种模型中,注射RS4;11细胞。6天后,在对照组小鼠体内注入CAR-T细胞或PBS(补充图)。9C)。肿瘤接种后45天处死小鼠,流式细胞术测定CD 19+肿瘤在血液、脾脏和骨髓中的载量。BAFF CAR-T细胞诱导的小鼠CD 19+RS4;11细胞百分率显著降低(图1)。7E)与对照小鼠比较。此外,从这些小鼠收获的脾脏的平均重量明显低于单独使用PBS的小鼠(见图)。7F)。此外,我们开发了一个病人衍生异种移植(PDX)模型,使用从耐药的所有患者(pt2细胞)收集的所有细胞。腹腔注射pt2细胞。进入NSG小鼠,6天后进行治疗(附图)。9d)。肿瘤接种后31天处死小鼠。与RS4;11模型的结果相似,BAFF CAR-T细胞处理的小鼠与用PBS治疗的小鼠相比,CD 19+Pt2细胞的残存数几乎可以忽略不计。7g)。与单用PBS治疗的小鼠相比,CAR-T处理小鼠的平均脾脏重量也明显降低(图1)。7H).

讨论

在临床开发的car-T细胞疗法中,有三分之一的目标仍然是CD 19,与目前批准的cd19-car T疗法相同。19。除CD 19外,临床研究的car-T疗法中有70%是针对10种抗原的,反映出靶点的显著重复。19。我们开发了一种基于BAFF配体的CAR结构,并利用非病毒转座子系统成功地将其导入T细胞。BAFF-R、BCMA和TACI在几乎所有B细胞癌的表面均有BAFF-R、BCMA和TACI表达.CD 19 CAR-T细胞治疗的不良反应包括严重的B细胞发育不全,这是由于CD 19标记物的泛B细胞表达所致.与CD 19 CAR-T细胞不同,设计针对BAFF受体的BAFF CAR-T细胞可能产生较轻的B细胞发育不全,因为早期B细胞不表达BAFF受体。未受影响的早期B细胞可以很容易地补充成熟的B细胞群。

以HEK293T细胞为靶细胞的实验证实,BAFF CAR-T诱导的细胞毒性确实是由BAFF/BAFF受体相互作用介导的。亲代HEK 293 T细胞不表达BAFF受体,BAFF CAR-T细胞无细胞毒作用。一旦我们转导这些HEK293T细胞来过表达每一个BAFF受体,这些细胞就会被BAFF CAR-T细胞有效地杀死。这些数据表明,BAFF-CAR的构建专门针对三个BAFF受体,其中一个受体在靶细胞中的表达也足以被BAFF-CAR-T所杀死。这也支持了我们的假设,即患者由于抗原逃逸而导致的治疗失败的可能性要小得多。另一水平的确认来自于在Jeko-1细胞中BAFF-R和TACI的双重敲除。Jeko-1亲代细胞同时表达BAFF-R和TACI,用CRISPR敲除这两种受体可显著降低BAFF CAR-T细胞介导的细胞毒性。同样,BCMA和TACI在RPMI-8226细胞中的双重敲除也显著降低了BAFF CAR-T细胞的杀伤作用.在双基因敲除RPMI-8226细胞中观察到一些残留的细胞毒性,我们认为这是由于这些细胞中BAFF-R表达水平较低所致。三种BAFF受体在癌细胞中的任何一种表达均足以引起BAFF CAR-T细胞的细胞毒性反应。据报道,一些原发性癌细胞可全部表达三种baff受体。5,39,40在这些罕见的情况下,BAFFCAR-T将能够针对所有三种受体.大多数B细胞癌至少表达三种BAFF受体中的两种41,42,43,44在这种情况下,这将是双重目标。即使一个受体丢失,另一个也足以引起BAFF CAR-T细胞的细胞毒性反应。

我们还观察到不同的E:T比值对表达三种BAFF受体水平的不同癌细胞株的不同程度的细胞毒性。了解BAFF与其每个受体的结合亲缘关系也有助于估计BAFF-CAR与这些内源性受体的结合亲和力,尽管CAR主干的融合可能在一定程度上改变了BAFF-CAR的结合亲和力。据报道,baff结合其受体具有不同的亲和力,与baff-R的亲和力最高,其次是TACI,然后是bcma。35。因此,即使我们针对baff-car-T细胞的多抗原可能受益于baff与baff-R之间更强的结合作用,但它们也利用baff与taci或bcma之间的亲和力稍低的相互作用,这可能会增强对同时表达两个或多个baff受体的许多不同B细胞癌的疗效和持久性。41,42,43,44.

我们用异种移植模型证明了BAFF CAR-T细胞对MCL、ALL和MM细胞的体外和体内杀伤作用。每一种模型均采用从不同供体中分离的T细胞产生的BAFF CAR-T细胞,从而验证了多个供体产生的BAFF CAR-T细胞的有效性。BAFF、CAR-T的细胞毒性很可能不仅仅限于这些癌细胞,它也将作为其他B细胞癌的潜在治疗手段,包括那些使用CD 19 CAR-T治疗无效的B细胞癌。MM细胞不表达CD 19,但表达TACI和BCMA;这是一个很好的例子,表明BAFF CAR-T细胞对不表达CD 19的癌细胞具有明显的细胞毒性。虽然我们发现BAFF CAR-T细胞与正常细胞共培养后LDH的释放略有增加,但即使在注射BAFF CAR-T细胞70天后也没有发现毒性迹象,从体重、AST/ALT水平和不同器官的组织学分析都可以看出。

以baff/baff-R信号为靶点的生物制品对自身免疫性疾病的治疗也是有效的。45,46,但仍在癌症临床试验中进行研究(例如NCT 03400176)。据我们所知,使用baff配体作为基于配体的CAR,正如我们在这里所描述的,以前还没有报道过。相对于一种基于scFv的BAFF受体CAR47我们的初步数据支持我们的非病毒工程BAFF-CAR T细胞具有多标记靶向和降低制造复杂度的额外好处。除了这些baff-R-cars,相关的基于配体的CAR方法已经被报道使用“增殖诱导配体”(4月份)作为bcma靶向的car-T细胞治疗MM的替代手段,而MM传统上一直受到抗原逃逸和低持久性的困扰。48。我们研究的局限性之一是,我们没有使用我们现有的基于配体的BAFF、CAR-Tv/s或scFv汽车,如BCMA、CAR-T和BAFF-R的CAR-T细胞进行比较研究。因此,我们无法评论这些CAR-T细胞对B细胞癌的疗效比较。

在一些文献中,有证据表明可溶性靶抗原的存在可能会降低car的药效。49,50,51对于staci和sbcma来说尤其如此,它们可以作为baff的诱饵受体。52。在这里,我们的数据表明,这不是一个关注,因为可溶性BAFF或BAFF受体没有影响BAFF CAR-T细胞的细胞毒活性。在我们的体内实验中,BAFF-CAR-T治疗后MCL细胞复发并不是由于抗原逃逸所致,因为MCL细胞仍然表达三种BAFF受体。我们假设这可能是由于这些小鼠体内CAR-T细胞数量减少所致。我们没有观察到性别对BAFF、CAR-T疗效的影响,因为BAFFCAR-T处理的雄性和雌性小鼠的存活时间都明显延长。

利用病毒转导产生CAR-T细胞是一种非常常见的方法,但也存在许多缺点,包括劳动密集型生产和昂贵的临床应用。使用病毒载体的另一个严重缺点是其安全性的不确定性挥之不去。虽然病毒已经通过基因工程来降低其安全风险,但仍然存在插入突变和可变转基因表达的问题。我们对TCB转座子系统与慢病毒载体和其他转座子系统都有值得注意的比较。总的来说,TCB在非转录区插入转座子的频率比慢病毒高得多,但比慢病毒的插入频率要低一些。猪Bac ()或睡美人 (某人转座子系统。TCB一般情况下,转座子插入外显子的频率低于慢病毒,但比慢病毒的频率要高一些。某人。比较时TCB, 某人, 某人转录区外插入的次数最多。最后,在评估插入位置时,发现TCB与慢病毒相比,插入DNA比转录起始位点更远,但与转录起始点相比,插入DNA更接近转录起始位点。某人。此外,BAFF car-T细胞由TCB表现出比用慢病毒产生的CAR-T细胞更低的克隆生长,,或某人方法。因此,TCB似乎显示了一个插入剖面,可与现有转座子系统相媲美,并具有潜在优势的慢病毒转导。

总之,我们已经证明了BAFF配体为基础的CAR-T细胞在体外和体内杀死ALL、MCL和MM细胞的有效性。我们相信这些BAFF CAR-T细胞有可能很快进入临床试验来治疗多种B细胞癌。


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