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人和小鼠DNMT3A过度生长综合征的功能表型和表观表型

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发表时间:2021-07-30 14:06作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

生殖系致病性变异株DNMT3A最近在发育过度、肥胖、行为和学习困难的患者中被描述为(DNMT3A OVergrowthS(同上/监督事务司)。体细胞突变DNMT3A基因也是克隆造血最常见的原因,并可诱发急性髓系白血病(AML)。采用全基因组亚硫酸氢盐测序法,对11例DOS患者外周血细胞DNA甲基化进行了研究,发现一种以显性阴性为主的局灶性典型低甲基化表型。DNMT3AR882H突变。一种表达同源性的生殖细胞小鼠模型DNMT3AR878H突变引起人DOS综合征的多个方面,包括甲基化表型和自发造血恶性肿瘤的发生率增加,提示该综合征的各个方面都是由该突变引起的。

导言

过度生长综合征是一种罕见的异质性疾病,其特征是全身或局部组织肥大;随着更多患者的基因组被分子研究,这些综合症的遗传原因正在出现。第一次报告DNMT3A过度生长综合症(又称tatton-Brown-rahman综合征;tbr;mim 615879)描述了一种生长增加的综合征,其定义为身高和/或头围至少比平均值高出两个标准差,与德诺沃杂合子生殖系突变患者的面部畸形和智力残疾有关。DNMT3A1。在初步报告中,13/152例过度生长的患者在DNMT3A所有的突变都位于蛋白的功能域。随后发表的评估55名病人的出版物2和许多案件报告3,4,5,6,7,8,9,10,11确认了最初的发现,并描述了分散在DNMT3A,包括误解、移码和无意义的突变。对于到目前为止所描述的DOS患者来说,最常见的突变改变了R 882的氨基酸位置,这也是DNMT3AAML患者的突变12。到目前为止,文献中发现的12/100例患者有影响R 882的突变。2,3,4,5,6,13。80%以上的DOS患者发育过度,智力残疾程度参差不齐。肥胖(超过两个标准偏差以上的年龄和性别调整后的平均体重)报告在三分之二的病人。有特征的面部外观,浓重的,水平的,低度的眉毛,突出的和扩大的上中切牙是常见的发现。据报道,一些病人有关节高度移动、低肌张力、脊柱后凸和严重的癫痫发作。2.

尽管DOS出现了表型和分子特征,但关于广泛的DOS表观遗传后果的数据有限。DNMT3A这些病人身上有突变。的确切后果DNMT3A突变还不清楚,基因型也不清楚:这种综合征患者的表型相关性。

体细胞突变DNMT3A是克隆造血最常见的原因14,15,16是正常核型AML患者中最常见的起始突变。17,18,19。尽管在整个DNMT3A在AML患者中,半数以上发生在氨基酸R 882(如R882H、R882C、R882S、R882P等)。12. DNMT3AR 882突变编码的显性阴性蛋白被认为是通过两种机制起作用的:第一,r882突变蛋白不能同源二聚体,使酶活性降低了80%;其次,r882突变蛋白优先与野生型(WT)蛋白相互作用,从而形成一个催化沉,捕捉wt蛋白是不活跃的异二聚体(显性-负效应)。20,21。先前的研究表明,r882突变所致的杂合子细胞甲基转移酶活性的降低与AML细胞基因组中特定区域的局部典型的低甲基化表型有关。17,20,22。此外,我们先前还发现,一名9岁DOS患者的外周血细胞形态正常,带有杂合子的生殖细胞系。DNMT3AR882H突变具有与AML细胞相似的局灶性低甲基化表型。22。这些数据有力地提示低甲基化表型在AML的发生之前(并可能有助于)的发展。到目前为止,非r882突变的DOS患者(由wgbs定义)的全球甲基化表型尚未被描述并与r882突变进行比较,尽管已经有基于数组的甲基化研究报告。5,23。此外,患急性髓细胞白血病的风险DNMT3A突变(特别是R 882)尚不清楚。4.

在本研究中,我们研究了11例DOS患者外周血细胞DNA甲基化表型。DNMT3A突变,包括3个在R 882处的突变和8个具有可选突变的突变(包括1个带有杂合子缺失的DNMT3A基因)。我们还描述了带有细菌系的小鼠的表型。DNMT3AR878H突变(小鼠同系物)DNMT3AR882H),包括人类综合症的许多特征,包括肥胖、过度生长以及行为和运动缺陷。全基因组亚硫酸亚铁和单细胞RNA测序研究揭示了小鼠和人类造血细胞之间重叠的甲基化和基因表达表型。最后,我们展示了DNMT3AR878H小鼠自发发展为B细胞和髓系恶性肿瘤,潜伏期较长,提示DOS患者应前瞻性监测血液癌的发展。

结果

DNMT3A过度生长综合征(DOS)患者在非白血病造血细胞中存在局灶性低甲基化

为了确定DOS患者造血细胞基因组中是否存在DNA甲基化改变,我们采集了11例DOS患儿和成人外周血标本。临床特征见表1。患者在采集样本时年龄从20个月到36岁不等,所有患者都表现出DOS的特征,包括过度生长、智力和发育迟缓、行为障碍(包括自闭症、焦虑和惊恐障碍)、低肌张力和明显的面部特征。1例(UPN 894912)在样本库前4年诊断为AML(法国Amrican英国M4亚型),采集外周血标本后形态完全缓解。3例患者(upn 624400,154605和894912)发生R 882突变,其余8例患者发生独特的突变。DNMT3A基因;6个是错义突变,1个是无意义突变(Upn 228211)。1A),其中一个(Upn 518693)有一个杂合子135 kb的缺失,包含了整个DNMT3A基因(ChR 2:25,228,254-25,363,376;hg 38)(附图)。1A).

表1患者特征。
图1:DOS患者外周血细胞DNMT3AR 882突变比非R 882突变具有更严重的甲基化表型。
figure1

a种系分布DNMT3A本研究在DOS患者中发现突变。b全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)中CPGS甲基化值的密度图(红色);n=15),DNMT3AR 882(蓝色,n=3),以及DNMT3A非R 882(绿色,n=8)病人。c全球cpgs和dmr相关cpgs在基因组特定、注释区域的平均甲基化值。假设检验通过双向重复测量方差分析和Tukey的多重比较检验在每个基因组区域进行。(NS=不显著,**p0.01,*p0.001)。dDMRs的平均大小(以BP为单位)DNMT3AR 882 (n=2 209)和DNMT3A非R 882 (n=332)外周血样本(P=0.0587,双尾t测试)。e中定义的2209 DMR的平均甲基化值。b每一个健康的捐献者DNMT3AR 882样本。同样的dmr值也被被动地绘制为DNMT3A非R 882样本(年龄和性别见下文)。f热图显示332个DMR的平均CpG甲基化值,该值是通过比较健康献血者和DNMT3A非R 882样本。相同dmr的值是被动绘制的。DNMT3AR 882样本(年龄和性别见下文)。g数据库中的DMRs示例。HOXB簇RASIP 1基因。健康的捐献者用红色标出,DNMT3AR 882蓝色的箱子,和DNMT3A非R 882绿色的箱子。基因轨迹如下所示,DMR在方框中被指定。DMR差异甲基化区,BP碱基对,TSS转录起始位点。

为了评估这些患者血细胞中基因组DNA的甲基化程度,我们进行了全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS),平均覆盖人类基因组18倍。我们比较了11份DOS样本和15份4-43岁健康献血者外周血的甲基化水平。DNMT3A+/+8男7女)。我们将DOS患者细分为两组:DNMT3AR 882 (n=3;一男二女)和DNMT3A非R 882 (n5名男性,3名女性)进行后续分析,因为每个非R 882患者都有一个独特的突变。对照组与对照组在年龄上无显着性差异(P>0.05)。DNMT3AR 882 (p=0.157)或控制与控制之间的关系。DNMT3A非R 882 (p=0.824)组(两个样本)t测试)。在全球范围内,整个基因组的甲基化水平在DNMT3AR 882DNMT3A非R 882病人(如图所示)1C)。利用既定方法24,我们确定了不同的甲基化区域(Dmr)。DNMT3A+/+ (n=15);DNMT3AR 882样本(n=3;补充数据1),以及DNMT3A+/+V.V.DNMT3A非R 882样本(n=8;补充数据2)。DMRs被定义为(\\GE)10个CPGS,平均甲基化差异(\\GE)0.2,错误发现率(FDR)为(乐)的标准差(SD)(乐)0.1在测试样本中。为确保R 882样本中的2,209例DMRs与年龄和(或)性别对CpG甲基化的影响无关,我们在调整性别和年龄的同时,用线性回归方法检验基因型对甲基化水平的影响。在此回归分析中,所有DMRs均保持显着性(FDR<0.05)。在DMRs中,平均甲基化值为DNMT3AR 882样品低于DNMT3A非R 882所有基因注释区的样本,包括基因体和启动子(p≤0.0001,图1.1B,c)。但是,DMR的平均宽度(以碱基对表示)在DNMT3AR 882样本(662.7±441.6)与DNMT3A非R 882(614.5±366.8)p=0.0587;图1。1D)。有趣的是,含有至少一个DMR的基因体的比例(1426/18951,7.52%)显著高于在基因组其他注释区观察到的比例(0.06-2.4%;*)p≤0.0001;附图1B).

甲基化表型的相对严重程度DNMT3AR 882样品比较DNMT3A非R 882(以及一个类别内样本间表型的规范性)在通过比较健康者识别的2209 dmr的热图表示中显示。DNMT3A+/+捐献者与捐献者DNMT3AR 882样本(图)1E)。被动地绘制非R 882样品的甲基化值,显示这些样品中相同区域甲基化程度的差异。相反,直接比较DNMT3A非R 882给健康献血者的样本仅显示332个DMRs(图1)。1F)。在这两项比较中,所有识别的dmr都是低甲基化的,215 dmr(65%)DNMT3A非R 88210%DNMT3AR 882(DMRs)重叠DNMT3AR 882DNMT3A非R 882样本(重叠至少需要1 bp的共享序列)。类中的区域的示例。HOXB如图所示,具有DMR的集群(由黑匣子突出显示)。1g,以及外显子第四和第五外显子中的两个引人注目的dmr。RASIP 1基因,这是特定于R 882样本(图一)。1g)。这些区域的DMR在R 882突变样本中表现得更为明显,表明R 882突变比非R 882突变导致DNA甲基转移酶活性下降更大。

DNMT3A R 882改变造血细胞的转录信号

利用10倍基因组铬平台25我们对来自UPN 624400(14岁)和他未受影响的男性同胞(17岁)新鲜外周血样本进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。这两个样本具有很高的相似性(附图)。2A)。基于图的聚类识别出12个与Toppgene功能分类的聚类。26通过输入每个簇前50个识别基因(如图所示)。2A)。然后,这些群体通过对在不同子集中丰富的成熟基因标记的评估来验证(补充图)。2B)。之间的单元格类型分布是不同的。DNMT3AR882H病人和他的兄弟姐妹控制(p < 0.0001, chi-squared), and subtle differences in several individual populations (relative to total cells) were observed (Fig. 2B)。CD4+幼稚T细胞(第5组)减少(13.94%~4.77%),NK细胞(第8组)和NKT(第10组)分数分别增加3.09%~15.88%和3.80%~7.01%。2B)。用15色流式细胞仪对同一样本的T细胞减少和NK-细胞增加进行了正交验证(附图)。2C)。我们确定了在每个簇中差异表达的基因。DNMT3AR882H控件的同级控制示例。p-数值和表达截止值分别为0.05和log 2比±1(补充数据)3)。在12个簇中,有9个有差异表达的基因(degs;图1)。2C);但是,发展中国家的总数相对较少,从5个(组群11)到72个(组组1)不等。有趣的是,有50个基因在两个或多个簇中被确认为失调,它们的调控失调是典型的跨细胞类型,表明它们被非特定于世系或细胞类型的机制所调控(图一)。二维空间)。例如,RASIP 1基因(包含两个DMR;图1。1g)在7/9团簇中被上调,有可检测到的DEGS(图1)。2E)。这是因为表达细胞的数量增加,而不是RASIP 1每个细胞,因为对照样本有一个可以检测到的单细胞RASIP 1表达式中的DNMT3AR882H样本中,15%的细胞有可检测到的读数。相反,HOXB与DMR相关的基因在多个细胞类型中被下调。HOXB 2由于表达细胞数量的减少而被下调,并且每个细胞的平均阅读量显著减少(如图所示)。2E)。然而,DMR的位置与DMR的表达之间并没有直接的相关性。HOXB基因,这意味着集群中可能有额外的局部或长期调控元素影响HOXB基因27。DEGS的基因本体论术语通过聚类确定了许多生物学过程,包括与T细胞激活和增殖(IL-4和IFNG信号)和血管功能(血管生成和内皮细胞迁移)有关的术语(补充图)。二维空间).

图2:一名DOS患者的外周血细胞DNMT3AR 882突变有差异表达的基因。
figure2

aR882突变患者外周血scrna-seq数据的tsne投影(右;upn 624400,收集时14岁)及其匹配DNMT3A+/+同胞对照样本(左;UPN 978897,收集时17岁)。基于图的聚类识别了12个不同的聚类,这些聚类是利用Toppfan对基因表达分析进行功能分类的.b与面板中显示的scrna-seq数据相关联的每个基于图表的集群的贡献百分比。a. c在每个基于图表的聚类中,上调基因(红条)和下调基因(蓝条)的数量。d在多个基于图形的聚类中,50个差异表达基因的热图被确定为失调。e两个差异表达基因的例子(HOXB 2RASIP 1)在多个基于图形的聚类中识别(在Panel中突出显示)d使用红色箭头),并与差异甲基化区域相关联;tSNE投影,每个细胞平均读取数+SEM,以及每个基因表达的细胞百分比(P-价值观t试验或费舍尔精确检验比率的指示,n=每基因型1个生物独立样本)。差异表达基因。

在所有12个簇中,共有242个差异表达基因,其中只有38个在DMR 10 kb以内(补充图)。2E)。这表明,对于大多数DGS来说,与局部DMR没有直接相关性。通过大量的rna测序,我们证实了dgs在这个过程中的存在。DNMT3AR882H病人,以及另外一个DNMT3AR882H病人(1.7岁),包括RASIP 1HOXB 2失调(附图)2F,g)。虽然大量的rna-seq能够识别额外的DEGS(部分原因是测序深度增加),但差异基因表达与DMRs之间缺乏全球相关性,甚至在基因组的特定注释区域也是如此(补充图)。2H和补充数据4).

含菌小鼠DNMT3A R878H/+过度生长和肥胖

若要实现生殖系的表达,请执行以下操作:DNMT3AR878H/+利用Guryanova等人建立的基因座等位基因。插入一个包含编码r878H点突变的外显子23和24的微型基因,取代内源基因。DNMT3A+/+LOX-停止-LOX盒式磁带下游的外显子2328。杂合子DNMT3AR878H/+用B6.C-TG(CMV-cre)1CGN/J缺失小鼠杂交。FLOX创始人系列老鼠DNMT3AR878H/+然后将CMV-cre回交到C57BL/6J小鼠,通过种系传递突变等位基因,并对无CMV-CRE的小鼠进行选择。杂合子DNMT3AR878H/+小鼠按预期的比例出生(对30多个基因类型的仔猪而言,其比例为DNMT3AR878H/+DNMT3A+/+有生存能力,存活2年以上。漂流后R878H等位基因的表达与WT等位基因的表达基本相同。28. DNMT3AR878H/R878H老鼠出生时就严重矮小,一周后不能存活。雌性杂合子DNMT3AR878H/+小鼠在怀孕期间有明显的难产发生率,因此没有被用于生产实验小鼠。所有实验小鼠都是通过杂交雄性杂合子产生的。DNMT3AR878H/+C57BL/6J雌性小鼠生殖系小鼠(CMV-CRE阴性)。芽系DNMT3AR878H/+小鼠出生时体重和大小正常,无明显发育缺陷。

许多DOS患者身高和肥胖都增加了2。因此,我们跟踪了杂合子突变体的体重。DNMT3AR878H/+老鼠(n=120;59名女性,61名男性)和DNMT3A+/+短期控制(n=90;48名女性,42名男性),年龄为21至600天。在100天前,两组的体重没有差别(p基因型*时间=0.5781)。然而,随着年龄的增长,R878H小鼠的体重与幼龄对照组不同,在380日龄时的平均体重分别为37.73和31.2克。p≤0.0001基因型*时间;图。3A)。视力检查显示,突变小鼠在1岁时有明显的尺寸差异(图1)。3B)。对四对210日龄小鼠进行的CT扫描显示股骨长度明显延长(但没有肱骨长度),这代表了身高增加的代用品(图一)。3C-E)。我们还测量了头面部的标志,以确定是否DNMT3AR878H/+小鼠有大额叶,这是DOS儿童常见到的一种表型。1,2。虽然颅骨测量的统计分析没有显示头围(神经颅骨的长度和宽度)的差异,但头骨的一些特征DNMT3AR878H/+老鼠比它们的小白蚁稍大一些,包括下颌骨和颅骨的局部结构(图)。3F)。对身体成分的MRI测量显示,身体脂肪有明显的年龄依赖性的增加(如图所示)。第三代),但不是瘦质量(如图所示)。3H)与DOS患者的肥胖表型平行。肥胖与食物消费的增加无关;DNMT3AR878H/+小鼠进食量明显少于WT年龄匹配对照组(平均=3.51±0.07 vs 4.33±0.17克/天),p=0.0013;图1。3I)。此外,代谢笼分析证实DNMT3AR878H/+老鼠吃得少,这一发现与轻微的(虽然不是显着地)运动和整体运动速度有关(补充图)。3A-c)。代谢笼分析还显示DNMT3AR878H/+6月龄以下小鼠O值无显着性差异(P>0.05)。2消耗或CO2过期(虽然两者都趋向于降低水平;补充图。3D,e)。在6个月以上的小鼠中,O值有所下降(虽然不显著)。2消费和CO大幅度下降2生产(p=0.0313)。综合起来,这表明,儿童的呼吸商(Rq)略有下降。DNMT3AR878H/+小鼠(附图)3F);虽然不明显,但这一变化可能表明这些小鼠的基础代谢率有细微的下降,至少在一定程度上是导致肥胖的原因。

图3:芽系DNMT3AR878H/+老鼠表现出过度生长和肥胖。
figure3

a重量(克)DNMT3A+/+对照小鼠(红色,n=90)和DNMT3AR878H/+老鼠(蓝色,n=120)从断奶(第21天)到575天。用线性回归分析确定基因型间的差异。p≤0.0001)。b具有代表性的年龄和性别匹配的儿童形象DNMT3A+/+(30.9克)与DNMT3AR878H/+(59.45g)小鼠,1岁时有典型的体型差异。c典型的小鼠股骨CT图像。测量股骨长度(毫米)DNMT3A+/+DNMT3AR878H/+显示与年龄匹配的控件(n=4种基因型)。d测量的股骨长度(Mm)的量化b (n=4个生物独立样本/基因型,P=0.0049乘二尾t测试)。e用CT扫描测定同一小鼠肱骨长度(Mm)n=4个与生物无关的样本/基因型,p值为双尾t测试)。f颅骨和下颌骨的CT重建DNMT3A+/+DNMT3AR878H/+显示大小和角度不同的标志的老鼠。g年龄匹配体脂肪组成的MRI定量研究DNMT3A+/+(红色,n=4)和DNMT3AR878H/+(蓝色,n=7)按年龄(小于或大于6个月)分开的配对,以突出体脂随年龄增长的增加(P-由图基多重比较检验的双向方差分析得出的数值)。h年龄匹配时瘦体质量成分的MRI定量研究DNMT3A+/+(红色,n=4)和DNMT3AR878H/+(蓝色,n=7)按年龄(少于或大于6个月)分开的配对。i与年龄匹配的食物消耗量(以每只老鼠每天每克食物计算)的定量DNMT3A+/+(红色,n=8)和DNMT3AR878H/+(蓝色,n=8)小鼠(P=0.0013乘二尾t测试)。j重量跟踪(克)DNMT3A+/+对照小鼠(红色,n=4)和DNMT3AR878H/+老鼠(蓝色,n从100天到300天的高脂饮食。用线性回归分析确定基因型间的差异。p≤0.0001)。D,e,g-I误差条的平均值为±SEM.克,毫米。

高脂肪饮食加剧了肥胖的表型,而高脂饮食并没有导致体重增加。DNMT3A+/+小白蚁(图1.3J)。最后,我们禁食小鼠6h,然后检测血浆中与肥胖增加相关的常见分析物。血浆瘦素、甘油三酯、胆固醇、葡萄糖和游离脂肪酸水平在两组间无显着性差异(P>0.05)。DNMT3AR878H/+DNMT3A+/+对照小鼠(附图)3G-o).

含菌小鼠DNMT3A R878H/+表现出行为异常

评估大鼠的行为和神经表型DNMT3AR878H/+小鼠,我们对WT和R878H小鼠的小白鼠和年龄相配的小鼠进行了一系列试验(所有小鼠在测试时都是100~200天,如图所示。4和补充图。4);度量目标在“方法”一节中有详细说明。一些结果发生了很大的变化DNMT3AR878H/+老鼠,包括在1小时开放的野外试验中减少总行走次数和饲养事件,减少杆状爬下和倒置屏幕(60和90°)爬升次数,增加在上下文、有条件和暗示的恐惧测试中所花的冻结时间,差异足休克反应,以及减少大理石掩埋(如图所示)。4A-K分别)。R878H小鼠的感觉运动电池,包括平衡(Ledge试验和平台试验)、行走起动机、握力(倒置屏幕试验)和运动协调(Rotarod),以及智力残疾、记忆和焦虑测试(包括高升+迷宫、Morris水迷宫试验、探针试验(附图)等)均无统计学差异。4)。这些数据表明DNMT3AR878H/+小鼠表现出意志活动的减少,没有对探索行为进行坦率的改变,暗示着这些小鼠的复杂情绪。总的来说,行为分析表明DNMT3AR878H/+小鼠有一个主要的表现型的意志运动缺陷,伴随着复杂的情绪,和微妙的认知变化。

图4:芽系Dnmt 3aR878H/+小鼠表现出行为改变。
figure4

a1小时露天测试的救护车总数,每隔10分钟一班(p=0.0013的基因型效应,F(1,32)=12.5,n=17,17;双向重复测量方差与Šídák的多重比较检验)。b在1小时的露天测试中,饲养事件的数量,分成10分钟的间隔(p=0.0183的基因型效应,F(1,32)=6.183,n=17,17;双向重复测量方差与Šídák的多重比较检验)。DNMT3AR878H/+老鼠花的时间要长得多c爬下一根杆子(p≤0.0001,n=17 17;未配对t(测试),到达d60°斜筛(p=0.0041,n=17 17;未配对t(测试)及e90°斜筛(p=0.0118,n=17 17;未配对t测试)。板fh冻结时间百分比f有条件的恐惧训练(提示:p≤0.0001基因型效应F(1,31)=28.02,n=16,17;双向重复测量方差与Šídák的多重比较检验),g情境恐惧试验(p=0.0002基因型效应,F(1,31)=18.53,n=16,17;双向重复测量方差与Šídák的多重比较检验)h线索恐惧试验(基线:p=0.0009基因型效应,F(1,31)=31.02;提示:p=0.0026基因型效应F(1,31)=10.76,n=16,17;双向重复测量方差与Šídák的多重比较检验)。i在条件性恐惧试验中,小鼠表现出行为反应所需的最低限度休克(逃避:p=0.0064基因型效应F(1,31)=5.094,n=16,17;双向重复测量方差与Šídák的多重比较检验)。方框从25到75百分位数,线表示中位数,晶须显示第10至90百分位数。j埋在30分钟内的弹珠(5分钟的垃圾箱),p=0.0181,基因型效应F(1,28)=6.307,n=15,15;双向重复测量方差与Šídák的多重比较检验)。*p≤0.05,**p≤0.01,*p≤0.001,*p≤0.0001。线条图和条形图显示了每个测试值的平均值和扫描电镜。分钟,秒,毫安。

芽系DNMT3A R878H/+小鼠在非白血病造血细胞中具有局灶性低甲基化表型

了解未操纵的、少相匹配的骨髓细胞甲基化表型。DNMT3A+/+ (n=10;2-52周,5男5女)或DNMT3AR878H/+老鼠(n年龄8~38周,男3例,女3例。对照组与对照组的年龄差异无显着性(P>0.05)。DNMT3AR878H/+团体(p=0.779;双样本t测试)。我们还包括未经处理的生殖细胞的骨髓细胞。DNMT3A-/-老鼠(n=4;2周,2男2女)和DNMT3A+/-老鼠(n=4;12-52周,3名男性,1名女性)作为对照,以校准甲基化表型DNMT3AR878H/+相对于缺乏症或单倍体不足。DNA甲基化表型DNMT3A-/- 29DNMT3A+/- 30模型已经在文献中描述过了。31,32,33,不会在这里进一步讨论。

我们的WGBS序列覆盖率(中位数为18x)评估了98%的单个cpgs在小鼠基因组中。甲基化值与Pearson的相关性r每种基因型的样本中均>0.8,强调了生物复制之间的重复性,尽管在研究中使用的小鼠的年龄范围是不同的。全球范围内,所有CpG位点之间的平均甲基化差异DNMT3AR878H/+骨髓样本与DNMT3A+/+样本(图)5A)。相反,DNMT3A-/-样品显着降低了所有CPGS的平均全局甲基化。接下来,我们定义DMR(使用与人类样本相同的参数)DNMT3A+/+V.V.DNMT3AR878H/+样本(#DMRs=2172,补充数据)5), DNMT3A+/+V.V.DNMT3A-/-样本(#DMRs=20161,补充数据)6),以及DNMT3A+/+V.V.DNMT3A+/-样本(#DMRs=8,补充数据)7)并发现DNmt3aR878H/+表型介于DNMT3A-/-DNMT3A+/+老鼠(图1.5B)。为了确保R878H样品中的2172个DMRs与年龄和性别对CpG甲基化的影响无关,我们采用线性回归方法来检验基因型对甲基化水平的影响,并根据性别和年龄进行调整。在此回归分析中,所有DMRs均保持显着性(FDR<0.05)。2172的比较DNMT3AR878H/+-特定的DMRsDNMT3A-/-样本显示几乎完全重叠,但甲基化降低的程度DNMT3AR878H/+样本都不太严重。在2172个DMRs中,DNMT3AR878H/+平均CpG甲基化值为50.10%,DNMT3A-/-DMRs的平均甲基化值为33.35%,DNMT3A+/-与DNMT3A相比,DMRs的甲基化值平均为85.5%。+/+控件(定义为在同一DMRs中具有100%甲基化)。这一趋势在基因组的所有注释区域都被观察到,表明DNMT3AR878H蛋白质在基因组的所有功能区域都表现为显性阴性(如图所示)。5A)。此外,DMRs的平均大小为890.1+/−552 bp。DNMT3A-/-DNMT3A样品,751.1+/−474.2 bpR878H/+610.3+/−295.7 bpDNMT3A+/-样本(图)5C).

图5:芽系DNMT3AR878H/+小鼠在骨髓细胞中表现出典型的DNA低甲基化。
figure5

a在注释的基因组区域,全球cpgs和包含dmr的cpgs的平均甲基化值被显示出来。假设检验采用双向重复测量方差与Tukey的多重比较检验在每个基因组区域内进行。b通过比较确定的全基因组亚硫酸氢盐测序(WGBS)甲基化值的密度图DNMT3A+/+和胚芽系DNMT3AR878H/+每个骨髓样本DNMT3A+/+(红色,n=10),DNMT3AR878H/+(蓝色,n=6),DNMT3A+/-(黑色,n=4)和DNMT3A-/-老鼠(绿色,n=4)。c中识别的所有DMRs的平均大小(BP)。DNMT3AR878H/+ (n=2,172),DNMT3A+/- (n=8),以及DNMT3A-/-(n=20,161)与独立的骨髓细胞相比DNMT3A+/+管制(P-单因素方差分析值与图基的多重比较检验)。d显示面板中定义的2172 DMR的平均甲基化值的热图b每个人DNMT3A+/+DNMT3AR878H/+样本。相同dmr的值是被动绘制的。DNMT3A+/-DNMT3A-/-样本。e比较中定义的20,161 DMR的平均CpG甲基化值的热图DNMT3A+/+DNMT3A-/-样本。相同dmr的值是被动绘制的。DNMT3AR878H/+DNMT3A+/-. fDNMT3A霍克斯组(左)和Rasip 1吉恩(右)DMRs在每个基因中的位置显示在盒中。DMR差异甲基化区,BP碱基对,TSS转录起始位点。

在小鼠基因组中标注的22,026个基因体中,1375个(6.24%)至少包含一个DMR(补充图)。1C),相对于基因组中的其他注释区域(p≤0.0001)。在人外周血中,7.52%的基因体含有DMR(补充图)。1B)。与DMRs相关的其他带注释区域的分数在人和小鼠样本中也是相似的,这表明人类R 882和小鼠R878H突变的功能后果是重叠的。

中确定的2172和20 161 DMR的焦点和规范性质DNMT3AR878H/+DNMT3A-/-骨髓样本,分别在图中突出显示。5D,e。一个基因型内所有样品的甲基化模式都是高度可复制的。从这些热图上也可以清楚地看到,基本上所有的dmr都在DNMT3AR878H/+样品同样也是低甲基化的。DNMT3A-/-样本。交叉分析显示81.4%的DNMT3AR878H/+DMRs也被检测到DNMT3A-/-样本;相反,DNMT3A+/-样品中DMRs很少,而且最相似。DNMT3A+/+样本(图)5D)。DMRs甲基化缺失DNMT3A-/-骨髓不太严重DNMT3AR878H/+样本(图)5E)。在特定的、同源的位点上,甲基化变化的焦点性和可控性的例子为霍克斯集群和Rasip 1基因(图1.5F),在人类R 882样品中检测到类似位置的DMRs。为了比较不同物种的DMR,我们使用了UCSC提升工具(Http://genome.ucsc.edu将人R 882 DMR坐标转化为小鼠基因组,发现101个人DMR(4.6%)直接对应于小鼠R878HDMR,1713(77.5%)与小鼠DMR在10 kb以内。相反,当我们将鼠标坐标提升到人类基因组时,95只(4.37%)小鼠DMR与人类DMR直接相交,1889只(87%)与人R 882 DMR相交在10 kb以内。

芽系DNMT3A R878H/+小鼠在特定造血细胞类型中有差异表达基因

我们对两对骨髓细胞进行scrna-seq。DNMT3A+/+DNMT3AR878H/+使用10倍基因组铬平台的小鼠30。在1月龄时对一对小样本进行评估,另一对在9个月时进行评估,用tSNE(补充图)显示配对样本具有显著的相似性。5A)。在使用Partek Flow软件处理对齐数据后,我们进行了基于图的聚类和Toppgene分析,根据每个簇的前50位定义基因来识别功能细胞类型(见图)。6a,b)。使用k-最近邻算法在血象数据库上的训练34(补充图。5B),所有家系均存在于两种基因型中(图1)。6a,b,补充图。5A-C)。DNMT3A中的前B细胞、单核细胞、巨噬细胞和MPPs有细微的差异,但有显著的差异。R878H/+骨髓相对于对照组(通过Fisher的精确比率测试)表明,生殖系R878H的表达不会导致正常造血群体的大干扰。基于图的聚类确定了在9个月DNMT3A中扩展的一个种群。R878H/+由于具有B细胞和髓系基因表达特征而不适合于单个谱系的样本(第14组;混合谱系)。

图6:芽系DNMT3AR878H/+小鼠在造血细胞中有差异表达的基因。
figure6

a年全骨髓scrna-seq数据的tsne投影DNMT3A+/+(左)n=2)DNMT3AR878H/+(右),n2)1月龄和9月龄的小鼠,以图为基础的聚类和Toppgene定义的已知种群。b与面板中显示的scRNA-seq数据相关的人口分数a按基因型和年龄。cd在人类和小鼠以及多个基于图表的聚类中发现的差异表达基因的例子,这些基因与不同的甲基化区域相关;tsne投影,所有细胞中每个细胞的读取计数,以及髓系细胞表达的百分比。HOXB 4(C小组)T细胞表达Rasip 1(d小组)数据以+/-SEM表示。P-双尾值t测试或费舍尔的准确比率测试是指示的,n=每基因型2个生物学独立样本)。PMN多形核白细胞、GMP粒细胞-单核细胞前体。

接下来,我们评估了1个月和9个月样本之间有多少差异表达的基因重叠(分别为6047和5573个独特的dgs,分别分布在24个集群中),并发现两个年龄组共有2,775个dgs(补充数据)。8)。的scRNA-seq数据中差异表达基因的比较DNMT3AR 882人类外周血(242个唯一的DEG跨越12个簇,图。2)和老鼠DNMT3AR878H/+骨髓(8,845个基因跨越1个月和9个月的时间点)显示,仅根据基因名称,121个基因(占人类基因的50%)的调控失调是一致的。我们展示了保守调控失调的例子。霍克斯基因簇(HOXB 4;无花果。6C)和Rasip 1(无花果)6d).

进一步验证Hoxb基因表达在DNMT3AR878H细胞,我们在先前发表的一篇文章中评估了它的表达。DNMT3A-/-Scrna-seq数据集,该数据集还使用了强力霉素诱导的wt。DNMT3A转基因恢复DNA甲基化29。通过给小鼠喂食DNMT3A诱导DnMT3A活性,引起dmr的时间依赖性再甲基化,使dnmt3A部分甲基化。霍克斯位点发生在大约24周(补充图)。6A)29。在……里面DNMT3A-/-这些老鼠的造血细胞,HOXB 4表达也同样下降,主要在髓系细胞(PMNs;补充图)。6B,单核细胞;补充图。6C,以及GMPS;附图。6d);恢复DNMT3A多西环素在体内的表达导致平均时间依赖性增加。HOXB 4每个细胞表达,髓系细胞表达率增加HOXB 4(补充图。6B-d)。这些数据表明,霍克斯聚类可能直接影响霍克斯基因。

生殖细胞株的造血表型与自发白血病DNMT3A R878H/+小鼠

Scrna-seq数据中所定义的细胞种群的大小表明,稳态造血相对来说是不受干扰的。DNMT3AR878H/+老鼠。利用21色流式细胞仪,我们在一组更大的小鼠中验证了这一数据,同时评估了来自小鼠的外周血和骨髓细胞。DNMT3A+/+DNMT3AR878H/+小鼠年龄从1个月到2岁不等(附图)。7)。成熟细胞群体(B-、T-、红血球和髓系细胞)、干细胞群或祖细胞群体中的扰动很少,尽管两种基因型的年龄相关改变。

接下来我们问是否DNMT3AR878H/+衍生造血细胞在受到阿霉素和阿糖胞苷的细胞毒性刺激后会出现缺陷;然而,在细胞计数恢复方面没有明显的差异。DNMT3AR878H/+老鼠(图1.7A)。不管怎么说,在80例未经手术的患者中,有6例是自发的致命性造血恶性肿瘤。DNMT3AR878H/+1岁后小鼠与0/65 WT小鼠比较(p=0.0296;图1。7b)。应用贝塞斯达标准的流式细胞术和形态学检查35,36一名经委员会认证的血液病理学家将两份样本分为成熟MDS(mLeuk1和mLeuk2)、骨髓和脾脏浆细胞广泛的B细胞恶性肿瘤(mLeuk3和mLeuk4)、无分化AML(MLeuk5)和CMML样(MLeuk6)(图6)。7C和d).

图7:芽系DNMT3A R878H/+小鼠产生造血恶性肿瘤。
figure7

a DNMT3A+/+ (n=11)和DNMT3AR878H/+ (n(11)小鼠尾静脉注射阿霉素3mg/kg,第1~3天和100 mg/kg阿糖胞苷第1~5天,化疗前和化疗后24天测定外周血白细胞总数。给出了各个数据点,并给出了平均值+/-SEM。P-数值采用双向方差分析(ANOVA)和Šídák多重比较法计算.b无白血病生存期随时间变化的Kaplan-Meier曲线DNMT3A+/+ (n=65)和DNMT3AR878H/+老鼠(n=79)。c)6例自发性造血恶性肿瘤的临床特点DNMT3AR878H/+老鼠。d5-Grünwald Giemsa染色的脾或骨髓标本细胞座DNMT3AR878H/+中概述的小鼠c。白细胞(K/UL)白细胞(x 1000/mL)、化疗前、化疗后1年、年血红蛋白(g/dL)、血小板(x 1000/mL)、血小板(x 1000/mL)、骨髓增生异常综合征(MDS)、急性髓细胞白血病(AML)、慢性粒细胞白血病(CMML)。

讨论

在本报告中,我们描述了dna甲基化的改变及其对人类患者的影响,并建立了小鼠模型。DNMT3A过度生长综合症(DOS)DOS患者外周血中存在典型的DNA低甲基化,而氨基酸R 882发生突变的患者则更为严重,而所有非R882突变的患者均存在这种低甲基化现象。在有生殖细胞的老鼠身上DNMT3AR878H/+突变,我们发现类似于人类病人的甲基化和基因表达模式,以及类似的生长和行为改变,强烈地表明这种突变可能导致综合症。这一模型支持了以下观察:克隆性造血患者是由基因突变引起的。DNMT3A可以在没有临床进展的情况下存活很多年。14,15,16,37。与克隆性造血患者相似,一些小鼠DNMT3AR878H/+长期潜伏后发展为自发性血液病。

所有的细菌系DNMT3A本研究中检测的突变导致DOS患者造血细胞局部甲基化表型,提示DOS相关。DNMT3A突变必然导致DNA甲基转移酶活性的丧失。然而,r882突变患者的低甲基化表型要比非r882突变严重得多,这与观察到r882突变导致造血细胞中的显性阴性效应是一致的。20,22。病人DNMT3AR 882在他们的外周血细胞中共发现了2209个DMRs,而非R882突变的患者有十分之一的突变。巧合的是,一名患者由于一个杂合子~135 kb的缺失而出现了真正的单倍不足状态(Upn 518693),该缺失包含了整个基因。DNMT3A基因(表)1,补充图。1)。这个病人的甲基化表型定义了由基因缺失导致的单倍体功能不全的后果。因为所有其他非R 882错义突变都有类似程度的甲基化缺失(图一)。1),我们认为,本研究中的非R 882突变都可能导致模拟受影响等位基因失活的功能缺陷。然而,几乎可以肯定的是,灭活的机制是多种多样的。非R882患者的标准低甲基化DMR与R 882中的许多区域相一致,215/332 DMRs(65%)一致,提示这些区域可能与改变造血干细胞状态的表观遗传学改变高度相关,使其更易发生转化。

正如类似的研究所指出的22,29在DOS患者造血细胞中,DMRs与基因表达改变之间的整体相关性相对较弱。然而,本研究中强调的两个基因示例(HOXB 2(RASIP 1)与局部DMR相关的基因表达模式有可复制但相反的改变。HOXB 4表达和甲基化相关性以前曾在DNMT3A缺陷串行移植模型32。然而,在全球范围内,即使局限于基因组中特定的功能区域,也无法建立与DMR密切相关的基因在外周血细胞中表达的强有力的相关规则(附图)。2)。类似的发现在一个并行但独特的完整模型中得到了报道。DNMT3A损失29。显然,DMRs附近基因的表达受到其他因素的强烈影响,包括基因组背景(外显子与内含子、早期外显子与晚期外显子等)、转录因子和蛋白质网络、染色质修饰以及长期DNA相互作用,这些因素尚未在综合分析中得到充分探讨。

芽系DNMT3AR878H/+小鼠模型出现了许多人体证候的关键方面。与年龄有关的体重增加与身体脂肪含量增加有关(瘦肉质量没有变化),表明这些小鼠确实肥胖;高脂肪饮食使肥胖恶化,但与饮食过量无关,标准代谢研究未揭示其生理基础。表观遗传变异与人类肥胖有关,可以通过遗传、饮食、衰老和宫内环境来改变。38。行为测试显示DNMT3AR878H/+小鼠有减少探索行为,意志运动缺陷,学习和记忆的复杂变化,或类似焦虑的行为,经常观察到在DOS患者。虽然运动、协调、记忆、学习和焦虑是交织在一起的,但在未来的研究中理清这些关系对于理解个体突变对DOS患者表型的具体贡献非常重要。与单倍型小鼠相比,该模型显示出更多的运动缺陷和较少的孤独症行为。39,提示可能的特定基因型:不同基因型间的表型关系DNMT3A突变。此外,运动缺陷可能是行为的结果,可能导致体重表型(反之亦然),因此可能对DOS患者肥胖的发展产生重要影响。进一步研究大脑甲基化表型将需要充分阐明表观基因组:表型相关性在这两种模式的DOS。

DOS患者与生殖细胞株小鼠的表观遗传相似性DNMT3AR878H/+突变。我们鉴定了2172个DMRs在骨髓细胞中DNMT3AR878H/+小鼠,而2209在血细胞中被鉴定为DNMT3AR 882DoS病人。由于这两个物种的年龄和性别是完全匹配的,所以这些DMR不太可能受到任何一个协变量的显著影响。此外,用线性回归的方法对定义的DMR进行后特别敏感性分析,发现基因型仍然是甲基化表型最重要的预测因子。DMRs在两种突变体中的频率相似,如R882突变体中DMRs的检出率为7.52%,而R878H突变小鼠的DMRs频率为6.24%(补充图)。1)。虽然直接从人到鼠的基因体外的同步映射在信息上是有挑战性的,但我们发现在特定基因中的许多DMR在人类和老鼠之间是相似的。为了说明起见,我们在HOXB基因簇和RASIP 1这两个物种的基因。虽然我们并不认为这些特定基因的失调与DOS表型直接相关,但值得注意的是HOXB聚类基因在自闭症谱系障碍儿童中被发现被下调。40,而且RASIP 1在患有浮港综合症的儿童的血液中,基因座被发现是低甲基化的。41,它是由致病变种引起的。SRCAP,并与面部畸形和学习障碍有关(MIM#136140)。表型、DMRs和DEGS之间的相似性表明,该模型将有助于研究不同器官的表观遗传表型,以及它们与这种疾病患者观察到的复杂表型之间的关系。

DOS是白血病易感性综合征吗?这项研究和其他研究的证据表明2,4,6,13。由于最近发现的许多DOS患者还很年轻,因此发生恶性血液病的终生风险还不清楚。儿童ALL发病率为35%,儿童AML发病率为7%;42虽属DNMT3A突变在成人AML中很常见,在患有AML的儿童中非常罕见。43。目前,全世界确诊的DOS患者的数量为200人(J.Kiernan,个人通讯)。这些患者中有几个在很小的时候就患上了恶性血液病。在迄今报告的最大系列DOS患者中2,55人中有1人在12岁时就患上了AML(DNMT3AY735S)。在这一系列的11例患者中,1例在12岁时就出现了急性髓细胞白血病(DNMT3AR882C);另一个DOS病人DNMT3AR882C突变在15岁时发展为AML4。在TBRs社区的帮助下(一组关心TBRs的家庭,为这种综合症的研究提供便利;Https://tbrsyndrome.org),我们已经确定了其他几个患有DOS和恶性血液病史的儿童和年轻人(费里斯、史密斯和莱伊,手稿正在编写中),包括一名20岁的AML患者(DNMT3AI310F),一个9岁的预科学生(DNMT3AR882H),一个7岁的孩子患有继发性T细胞白血病/淋巴瘤(DNMT3AR882H),一位34岁的原发性血小板增多症患者(DNMT3AR882H)和一个27岁的霍奇金淋巴瘤DNMT3AY735C)。重要的是,DOS急性髓细胞白血病患者中发现的基因协同突变与成年人发现的基因突变相似。DNMT3A突变型AML,包括FLT 3-ITD,NPMc,和PTPN 11(UPN 894912)4。小鼠模型进一步证实了发生造血恶性肿瘤的风险:DNMT3A缺乏症与髓系、红血球、B-和T细胞恶性肿瘤的发生有关。32,44,45,46,47,48,49,50DNMT3A生殖细胞单倍体功能不全与长潜伏期后髓系恶性肿瘤的发生有关。30。在这份报告中,DNMT3AR878H/+生殖细胞突变与自发髓系和B细胞肿瘤的发生有关.需要对人类进行自然史研究,以确定不同突变类型(如单倍体样突变与R 882突变)白血病发展的相对风险,以及引发进展的遗传和表观遗传事件的性质。无论如何,这些数据表明,患有这种疾病的儿童将需要前瞻性地监测造血(可能还有其他)恶性肿瘤的发展。事实上,年轻的DOS患者被描述为垂体大腺瘤51,髓母细胞瘤521例皮肤纤维肉瘤(UPN 228211)。

本研究中在白血病前血细胞中定义的DEGS可能为易化易化的表观遗传状态提供一些线索。例如,几个HOXB簇基因在表达细胞中被下调DNMT3AR882H。然而,在AML细胞中,同样的基因经常在高水平上持续表达。53类之间的DERARE元素甲基化通常会抑制该集群中的基因。HOXB 4HOXB 5基因54. 霍萨B聚类基因在AML中也可能被调控。NUP 9855,56,57,58,59,60,61,调节失调与MLL易位有关。62NPM 1突变63。这些观察结果说明了……的复杂性。霍克斯在AML中基因调控异常的模式,并强调了在我们的知识方面的巨大差距,这些事件控制了白血病前期向显性转化的进程。

总之,本报告中提供的数据表明DNMT3A与DOS相关的突变降低了DNMT3A的甲基转移酶活性,导致局灶性、典型的低甲基化表型。这种表型在R 882处的突变更为明显,可能是由于这些突变的显性阴性效应。种系R878H突变导致小鼠表型的改变,这种表型概括了人类相同突变患者的许多特征,强烈表明这种突变足以引起该综合征。该模型的可用性将使人们能够更精确地描述导致这种综合征的各种特征的表观遗传状态,并应为旨在纠正这一现象的方法提供临床前模型。


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