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人干细胞源性视网膜器官性视网膜母细胞瘤

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发表时间:2021-07-30 13:59作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

视网膜母细胞瘤是一种发育中的视网膜的儿童癌症,引起双等位基因失活。Rb1基因。有生殖细胞突变的儿童Rb1有很高的可能性发展成视网膜母细胞瘤和其他恶性肿瘤在以后的生活。基因工程小鼠视网膜母细胞瘤模型与人视网膜母细胞瘤有相似之处,但在细胞分化方面存在差异。为了建立人视网膜母细胞瘤形成的实验室模型,我们用生殖细胞株从15名参与者中制备了诱导性多能干细胞(IPSCs)。Rb1突变。每个干细胞系都经过验证、鉴定,然后利用三维器官培养系统分化为视网膜。培养45天后,将视网膜器官分离并注射到免疫功能低下小鼠的玻璃体内,以支持视网膜母细胞瘤肿瘤的生长。由患者来源的IPSCs制成的视网膜组织形成的视网膜母细胞瘤具有与人视网膜母细胞瘤难以区分的分子、细胞和基因组特征。这种基于患者来源的iscs与生殖细胞癌易感突变的人类癌症模型,为深入了解这种令人衰弱的儿童疾病的细胞起源以及随后的肿瘤发生机制提供了有价值的见解。Rb1基因失活

导言

视网膜母细胞瘤是一种罕见的发育中的视网膜癌,在子宫内开始并在生命的头几年内被诊断出来。1。绝大多数视网膜母细胞瘤发生双等位失活Rb1和一小部分(1-2%)启动MYCN在没有.的情况下进行放大Rb1失活2,3。在所有视网膜母细胞瘤病例中,大约有一半与生殖细胞突变有关。Rb125%的生殖系视网膜母细胞瘤患者从父母那里继承了突变等位基因。4。银屑病患者Rb1突变具有较早的发病年龄,因为它们只需要对剩余的突变进行灭活。Rb1肿瘤起始等位基因1,5。基因组研究表明Rb1失活对肿瘤的发生是足够的。6。因此,视网膜母细胞瘤是单一抑癌基因双等位失活导致肿瘤发生的重要模型。

早期通过突变小鼠视网膜母细胞瘤来建立小鼠视网膜母细胞瘤模型的尝试Rb1基因不能产生视网膜肿瘤RB+/–小鼠7,8,9。的两个副本的后续条件灭活。Rb1在发育中的小鼠视网膜也未能产生视网膜母细胞瘤。10,11,12,13。进一步的分子和遗传学研究表明,Rb家族成员之间的物种特异性固有基因冗余和补偿可以防止小鼠视网膜母细胞瘤的发生。14。条件灭活Rb1P 107Rb1P 130会导致视网膜母细胞瘤10,11,12,13,14在老鼠身上,最近,一种小鼠模型MYCN视网膜母细胞瘤的扩增形式15.

虽然这些基因工程小鼠模型为视网膜母细胞瘤生物学提供了重要的见解,但在不同物种间视网膜母细胞瘤的分子和细胞特征上存在一些差异。11,14,16,17。例如,在最近一项对小鼠和人类视网膜和视网膜母细胞瘤的表观遗传学研究中,人类肿瘤表观基因组被定位到比小鼠肿瘤更晚的发育阶段。18。这些差异可能与视网膜发育过程中的肿瘤发生、肿瘤的细胞起源或两者兼而有之有关。19。人和鼠视网膜母细胞瘤的另一个重要区别是药物敏感性。在对小鼠视网膜母细胞瘤和视网膜母细胞瘤的原位异种移植(O-PDXs)进行并行的临床前研究中,目前用于治疗视网膜母细胞瘤患者的常规全身化疗方案在疗效上存在差异。20。实际上,所有的gemm都有一个完整和持久的反应,而o-pdx的荷瘤小鼠很少有任何反应。20。因此,一种人视网膜母细胞瘤的实验室模型可以帮助我们理解视网膜母细胞瘤的起源,并为临床前的检测提供特定的肿瘤。

为了建立人类视网膜母细胞瘤的实验室模型,我们用细菌线从15名参与者中建立了iscs。Rb1突变或缺失。每个IPSC系的多个克隆被证实保留了生殖系突变,进行了分子图谱分析,包括全基因组测序,并通过改进的人视网膜细胞器程序对胚状体形成、神经花环形成和视网膜分化进行了表征。每个参与者的代表克隆然后分化为视网膜器官,分离,并注射到免疫缺陷小鼠的眼睛,以监测肿瘤的形成。平行实验用目标Rb1CRISPR-Cas9基因失活研究。单个来源于细胞器的肿瘤通过眼内注射和冷冻保存传代,就像以前所做的那样。21。完成了完整的分子、细胞和遗传图谱,IPSC线和肿瘤免费提供给生物医学研究界,没有义务通过儿童实体肿瘤网络进行协作。21.

结果

患者源iPSC株的分离与鉴定

总共有11名病人和4名家庭成员参加了圣朱德儿童研究医院的RETCELL(NCT 02193724)协议(补充数据)。1还有无花果。1A,B)。麻醉时经皮肤活检,作为常规护理的一部分,取4例再编程标本,抽吸外周血11例。从15名参与者中的14名获得了生殖系DNA样本。参与者根据临床表现选择代表遗传性视网膜母细胞瘤疾病的广谱外显。4名参与者没有家族史,诊断年龄不到12个月(双边,n=3;异步双边,n=1)两名参与者有13q缺失(表现为单侧和双侧疾病)。四个家庭队列(n=9)同意该协议,包括两个家庭,其中父母以前不知道携带Rb1突变直到儿童被诊断为双侧或三边视网膜母细胞瘤(补充数据)1还有无花果。1A,B)。出现双侧视网膜母细胞瘤的家族子代(n=4)和三边病(n(1)在诊断时,经眼科筛查,父母无肿瘤证据。

图1:来源于生殖细胞株患者的iPSC系的产生Rb1突变。
figure1

A的基因组位点的地图,显示每一个外显子的27个外显子Rb1基因和颜色编码的蛋白质编码结构域。每个病人/家庭的生殖细胞突变在全长蛋白下面显示。B未受影响的携带者(SJRB-iPSC-10)和两名受影响的儿童(SJ-iPSC-8和SJ-IPSC-9)的代表性谱系。C用DAPI(蓝色)染色法对Pou5f1(绿色)和SOX 2(红色)进行典型的SJRB-iPSC-3集落免疫染色。在另一条iPSC线上重复染色,结果相同。DSanger序列分析显示杂合子的无义突变Rb1基因(gaa→uaa)。ESJRB-iPSC-13具有代表性的双色荧光原位杂交(FISH)显示13q缺失(200个细胞)。F神经花环分化实验的绘制。G, H神经花环诱导过程中的差示干扰对比(DIC)和DAPI染色集落。箭头和扩大的盒子表示神经花环。每个株系有3个无性系被分化,每个株系都能产生玫瑰花。I每株iPSC神经源性基因归一化相对折叠的示意图(n神经诱导试验的qRT-PCR中的ESC=15)和H9。JH9ESCs和SJRB-iPSC-15的典型视网膜细胞器显微照片显示视网膜(箭头)。K以H9ESCs为对照,GAPDH将具有代表性的iPSC细胞系的三维视网膜细胞器的相对折叠基因表达归一化。每个点表示单个器官的两个技术复制的平均值。L采前用EDU标记的45天视网膜细胞器冷冻显微镜观察,光感受器和EDU+视网膜前体细胞(RED)的表达均恢复正常。15条线中的每一条都被分割,在神经视网膜区域显示出相似的结果。盒和晶须样地包括中间线为中间线,盒为Q1和Q3,晶须为1.5×四分位数范围。标尺条:C,50μm;E, L,10μm。

成纤维细胞或血液用细胞调谐仙台重编程试剂盒重新编程(补充信息)。共分离到71个ipsc克隆,15人共分离到71个ipsc克隆。Rb1对大多数株系进行Sanger测序,并对Sjrb-ipscc-13进行荧光原位杂交。Rb1位点缺失(补充数据)2、图1.1A-E补充信息)。只有完全重新编程的克隆,具有三重分化潜能和正常的核型被用于后续的研究,以下称为SJRB-iPSC-1-15(补充图1)。1A-H和补充数据2)。对ipsc克隆进行全基因组测序,并对患者生殖细胞dna进行测序,以确保在ipsc生产过程中不会积累额外的有害基因突变(补充数据)。3).

为了检测单个克隆形成神经元的倾向,我们在神经诱导培养基中产生胚状体(EBS)2天,然后将它们转移到Matrigel涂层板上形成神经花环(见图)。1F-H)。我们用一组引物对早期神经源性基因进行了定量PCR(qRT-PCR)(补充数据)。2还有无花果。1I)。利用这些形态(玫瑰花结形成)和分子(qrt-pcr)标准,我们为每一个具有神经源性潜能的患者识别了多个克隆(补充数据)。2)。为了确定iscs是否能在三维器官培养中制造视网膜,我们使用了sasai开发的程序。22用qRT-PCR和免疫组化方法比较了每个iPSC克隆的视网膜形成情况和H9 ESC细胞系的视网膜形成情况。1J-L和补充数据2)。总之,我们能够从每一个正常的核型和神经源性/视网膜分化能力的供体中分离出多个ipsc克隆,这些克隆保留了它们的生殖细胞系。Rb1改建。

三维器官培养中视网膜规格的优化

利用一株高神经源性H9人ESC细胞系,建立并优化了原Sasai三维视网膜器官生成方法。23而且还没有系统地检测出患者来源的IPSCs。虽然我们的每一条IPSC线都能用Sasai方法产生视网膜器官,但效率从4%(SJRB-iPSC-12为4/96)到27%(SJRB-IPSC-7为26/96)不等(见图)。2A)。为了提高视网膜的规格,我们进行了几轮优化,并对手术进行了六次修改。在我们修改的3D-RET协议中(如图所示)。2A),我们加入bmp信号抑制剂(多索啡素)和岩石抑制剂,以促进神经外胚层的分化。24,25,26。我们将Matrigel增加到2%,以增加视野的规格。23。我们每2天更换一次培养基,而不是每5天一次,在眼场规格的早期阶段,以防止生长因子的耗尽。根据之前的出版物,我们将平滑激动剂(SAG)的添加时间提前到第12天。27。我们用更稳定的合成激动剂EC 23代替维甲酸。我们改进的3D-RET方案在我们所有的iPSC线上实现了22%-30%的视网膜细胞器形成,每条线上的单个细胞器更加均匀(图1)。2B、C和补充图。2)。使用H9 ESC线和从受测者中产生的带有生殖线的iPSC线Rb1改变,我们显示,分子,细胞,功能,和解剖特征的视网膜器官产生的方法,由Sasai方法和三维-RET方法是无法区分的,在并行比较(图一)。二维空间和补充图。2)。虽然每种方法的视网膜组织质量相似,但IPSC线的视网膜细胞器形成效率提高,器官的大小和形状更加均匀一致,这使得我们在随后的所有实验中都使用了3D-RET协议。

图2:视网膜器官形成的3D-RET协议。
figure2

A绘制Sasai和3D-RET视网膜器官协议中的步骤。96井盘产生的视网膜细胞器的数量为每个方案的代表线指示。红色箭头表示媒体更改。B, C使用Sasai和3D-RET程序对SJRB-iPSC-4进行并行比较的典型视网膜器官显微图。对96井盘中的所有有机物进行了分析。箭头表示视网膜细胞器,(*)表示Sasai协议中常见的囊性结构。D视网膜细胞器分离细胞免疫荧光的显微照片和从单个视网膜器官中恢复免疫阳性细胞百分比的点状图(n=8)。Mg Matrigel,SAG平滑激动剂,RMM视网膜成熟培养基,FBS胎牛血清,CHIR GSK 3抑制剂,ec23维甲酸类似物。标尺条:B, C,100μm.D,5μm.

人视网膜细胞器中的视网膜母细胞瘤

在我们的15名参与者中,有4人接受了手术摘除作为治疗的一部分。我们能够从其中两个肿瘤(SJRB-158和SJRB-124)中产生O-PDX(补充数据)。1)。这四个病人样本和两个O-PDX将补充我们收集的大量参考视网膜母细胞瘤样本(Https://www.stjude.org/CSTN/)21。为了确定视网膜母细胞瘤是否能从患者来源的干细胞的三维视网膜器官培养物中形成,我们从每个病人的IPSCs培养视网膜器官到第45天,当该组织被分离并注射到免疫缺陷小鼠的玻璃体中时(见图)。3A)。作为阴性对照,我们用Rb1野生型干细胞(h9 esc和gm 23710 iscs)来源的视网膜器官,并作为阳性对照。Rb1所有15个参与者的IPSC细胞系和H9细胞中带有CRISPR-Cas9的第4外显子突变,以下称为SJRB-iPSC-1CR-15CR(图1)。3B)。CRISPR-Cas9Rb1在起始干细胞群中故意留下马赛克(<10%细胞),以更接近于复制人视网膜母细胞瘤的克隆异质性。3C补充信息)。我们恢复了生殖系Rb1其中两株(sjrb-ipsc-4-rev和sjrb-ipsc-6-rev)使用crispr-ca 9进行突变,并与这些细胞系并行进行相同的肿瘤形成实验(补充数据)。4补充信息)。我们还注射未分化的H9 ESCs在眼睛内形成畸胎瘤作为额外的阴性对照。每个iPSC线路和控件都进行了测试,包括Rb1CRISPR-Cas9由两名不同的技术人员组成,每行三次重复注射,共注射500多只眼(补充信息)。1年后,我们从iPSC细胞系SJRB-iPSC-1,2,4,5,6,8中鉴定出13个独立肿瘤。Rb1SJRB-iPSC-3,8,15细胞系中的7种不含CRISPR-Cas9失活的肿瘤Rb1(无花果)三维空间和补充数据4)。对于H9型ESC视网膜器官,采用CRISPR-Cas9灭活法,形成4个独立的肿瘤。Rb1没有人是没有Rb1灭活(补充数据)4)。有胚芽系的两条线Rb1突变恢复一年多后未形成肿瘤。我们开发了一种自定义Taqman qRT-PCR微流控卡,用于快速区分畸胎瘤、视网膜母细胞瘤和其他恶性肿瘤。3E补充信息)。根据qRT-PCR(补充数据),第45天玻璃体内注射视网膜器官形成的肿瘤中没有一例为畸胎瘤。4)。两个快速出现(37天和100天)的肿瘤(SJ-iPSC-15-T-A/B)具有泛神经元基因表达模式,但根据基因表达情况不属于视网膜母细胞瘤(补充数据)。4)。来自患者源性IPSC视网膜器官(iPSC-RBS)的所有其他肿瘤都是视网膜母细胞瘤,与患者视网膜母细胞瘤或原位患者源性异种移植(O-PDXs)没有区别(图一)。3E和补充数据4).

图3:来自三维视网膜器官的视网膜母细胞瘤。
figure3

A视网膜母细胞瘤工作流程的原理图。分化45天后,将视网膜器官分离并注射到免疫功能低下小鼠的眼中,并将其保存1年,等待肿瘤的形成。B绘制Rb1基因组定位与gRNA定位第4外显子及相应的序列。C剪裁位点(*)两侧插入(红色)和缺失(蓝色)的具有代表性的iPSC基因gRNA-3突变频率图(*)。D老鼠视网膜母细胞瘤来自视网膜器官的照片。E视网膜母细胞瘤基因的qRT-PCR分析SYK,663,HMX 1),人多能干细胞(MYC,SOX 2,FGFR 2),以及畸胎瘤(WLS,BMP 2,COLA 11例畸胎瘤,1例肿瘤(Rb-169),2例PDX肿瘤(RB 116和RB 121),2例自发性视网膜器官源性肿瘤(SJRB-iPSC-4和SJRB-IPSC-8),2例CRISPR修饰的视网膜器官(SJRB-iPSC-4 CR,SJRB-IPSC-8 CR)。每个点是技术复制的平均值,条形图是复制之间的均值和标准差。所有数据都归一化为GAPDH并相对于H9ESCs(虚线)绘制。F, G典型的器官源性视网膜母细胞瘤(SJRB-iPSC-4CR-T-E和SJRB-H9CR-T-C)的Circos图显示了肿瘤中相对于iPSC/ESC的体细胞突变。基因组中拷贝数的变化显示在每个肿瘤下面。H器官源性视网膜母细胞瘤、O-PDX、病人肿瘤、IPSC/ESCs和视网膜器官的RNA-seq主成分分析(PCA)。I, J苏木精和伊红(H&E)染色的细胞器源性肿瘤显示花环和IHC的SYK(棕色),它不存在于正常视网膜,但在视网膜母细胞瘤中被上调。对3例肿瘤进行染色,结果相似。标尺:25μm。

肿瘤像以前一样被增殖并冷冻保存。6,21,28。接下来,我们对每个独立的iPSC-Rb进行全基因组测序和RNA-seq,在初始繁殖和筛选后有足够的组织。患者衍生的iPSC-rbs显示第二等位基因失活。Rb1基因和已知癌症基因中没有其他突变(图一)。3F,G,补充数据4,以及附图。3)。重要的是,在MDM 4MYCN这在视网膜母细胞瘤中很常见。3F,G,补充数据4,以及附图。3)。此外,在主成分分析中,来自iPSC-RBS的RNA-seq与视网膜母细胞瘤最接近。3H和补充数据4)。O-PDX与器官源性视网膜母细胞瘤的差异主要是由于肿瘤微环境的差异所致。肿瘤中存在的血管内皮细胞、巨噬细胞和其他正常人细胞均为O-PDX和类细胞器肿瘤中的小鼠,因此在RNA序列分析中筛选出来。视网膜母细胞瘤的特征之一是表观遗传学对视网膜母细胞瘤的放松管制。SYK肿瘤发生所需的癌基因6。SYK RNA和蛋白质在IPSC-RBS中被上调,如在患者肿瘤中所发现的(如图所示)。3E,I,J和补充数据4)。综上所述,这些数据表明自发视网膜母细胞瘤可以由分化为视网膜器官的患者来源的ipSCs形成,也可以通过crispr-cas 9靶向Rb1在hESCs和患者来源的IPSCs中的位点。

IPSC-rbs重述视网膜母细胞瘤的表观遗传和克隆特征

高密度dna甲基化阵列(Lllumina Infinium 850 K)被广泛应用于肿瘤的基因组范围甲基化特征和拷贝数变异的分类。29,30,31。即使用少量福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)材料,测定也是稳健的.这对于小儿中枢神经系统肿瘤尤其有用。29。为了建立视网膜母细胞瘤的基线,我们分析了53例视网膜母细胞瘤患者的肿瘤,包括具有分化(玫瑰花结形成)和低分化肿瘤的组织病理学特征的肿瘤(如图所示)。4A,B)。病人肿瘤的无监督分级聚类显示,它们是根据组织病理学和Infinium 850 K阵列DNA拷贝数的变化而分离出来的(如图所示)。4C)。事实上,分化程度较高的肿瘤的拷贝数改变要比那些具有更多侵袭性未分化组织学特征的肿瘤少,并且一些患者肿瘤在分化和未分化肿瘤细胞区域之间存在异质性(图一)。4D-F).

图4:视网膜母细胞瘤DNA甲基化谱。
figure4

A, B分化和未分化视网膜母细胞瘤的苏木精和伊红染色。C视网膜母细胞瘤的无监督分级聚类显示分化和未分化标本的分离。DF分化型视网膜母细胞瘤的拷贝数变异(D)和未分化的视网膜母细胞瘤(F)和H&E染色(E)指的是既具有未分化(区域1)又有分化(区域2)肿瘤区域的患者眼,表明肿瘤细胞内存在异质性。G视网膜器官源性肿瘤的拷贝数变异和聚集。HSt.Jude视网膜母细胞瘤、视网膜器官源性肿瘤、视网膜细胞器和iPSC/ESCs的t分布随机邻居嵌入(TSNE)图与脑区和儿童脑肿瘤的分子神经病理学(MPN)数据库集成。I中框区域的tsne图H)显示器官源性肿瘤与患者视网膜母细胞瘤聚集在一起。J患者的TSNE图,O-PDX,以及含有IPSC/ESCs和正常视网膜细胞器的类细胞器源性视网膜母细胞瘤。KOPDX和类细胞器源性视网膜母细胞瘤伴IPSC/ESCs和正常视网膜细胞器的TSNE图。标尺:25μm。

接下来,我们对我们收集的iPSC/ESC衍生视网膜细胞器、视网膜母细胞瘤O-PDX和上述器官源性视网膜母细胞瘤进行了相同的DNA甲基化阵列分析。我们的四个器官源性肿瘤有足够的dna来进行甲基化阵列分析,并通过了我们的质量控制指标(补充信息)。器官来源的视网膜母细胞瘤与未分化的病人的肿瘤更紧密地聚集在一起,使用同样的无监督的方法(图一)。4G补充信息)。根据拷贝数变异,器官来源的肿瘤介于分化和未分化的视网膜母细胞瘤之间(如图所示)。4G)。在无监督甲基化分析中,O-PDXs和iPSC-rbs与视网膜母细胞瘤/松果体肿瘤重叠。29在TSNE图中,它们与正常的视网膜器官和IPSCs明显分离(见图)。4H-K和补充数据5).

为了进一步验证IPSCs来源的视网膜母细胞瘤的同源性和异质性,我们对11个视网膜母细胞瘤O-PDX进行了生物复制的单细胞RNA测序,共检测到114167个细胞,5个健康成人视网膜(24445个细胞),6个视网膜母细胞瘤(27825个细胞)和2个器官源性肿瘤(13864个细胞)。我们还包括了人类胚胎视网膜上可公开获得的scrna-seq数据集中的人视网膜前体细胞。32。我们将五个健康的成年视网膜和增殖的胚胎视网膜前体细胞组合在一起,并使用seurat(V3)建立了所有视网膜细胞类型(祖细胞、棒、锥、神经节、水平细胞、无长突细胞、双极细胞和Müller胶质细胞)以及非视网膜细胞类型(血管内皮细胞和免疫细胞)的参考数据集。33(无花果)5A)。在视网膜母细胞瘤样本中,根据推断的拷贝数改变,肿瘤细胞与正常细胞是不同的(补充图)。4A补充信息)。对于每个肿瘤样本,在确定了参考数据集和肿瘤数据集(锚)之间的细胞对应关系后,将细胞类型分类投射到每个肿瘤数据集上,以确定是否存在与肿瘤中特定视网膜细胞类型相似的细胞(图1)。5B)。重要的是,细胞周期基因在标签转移之前被移除,以防止偏向于增殖的视网膜前体细胞。尽管排除了细胞周期基因,标签转移中最常见的细胞特征是视网膜祖细胞占52%(81 283/156 244),其次是棒光感受器占31%(48 591/156 244)(补充数据)。6)。事实上,对于每一个病人的肿瘤,O-PDX,和器官来源的肿瘤,最常见的细胞特征是视网膜前体细胞(39-63%),它们在细胞周期基因中富集,即使细胞周期基因本身没有被用于标记转移(图1)。5C,D和补充数据6)。为了确定是否有证据表明肿瘤细胞具有祖细胞信号,从而产生具有光受体基因表达特征的分化程度较高的肿瘤细胞,我们进行了RNA速度分析。补充信息)。一些肿瘤显示出从祖细胞向感光器转变的迹象,而另一些肿瘤则表现出相反的模式(补充图)。4)。需要更明确的克隆分析来确定视网膜母细胞瘤细胞群之间的关系。

图5:视网膜母细胞瘤的细胞异质性。
figure5

A正常人视网膜细胞(包括视网膜前体细胞和所有成年视网膜细胞)scRNA-seq的均匀流形近似投影(UMAP)图。B人视网膜母细胞瘤、O-PDX和器官源性肿瘤的scRNA-seq的UMAP图。显示单元标识的标签传输,整个数字用左上角的分段表示。C一个器官源性肿瘤的典型UMAP图显示细胞具有祖细胞信号和杆状特征,以及促进增殖的基因表达谱的相对分布。D用单细胞RNA序列分析视网膜前体细胞基因表达信号和单个肿瘤的杆状信号(上面板)和增殖细胞的比例(S/G2/M,下面板)。n=19)。E, F正常视网膜和视网膜母细胞瘤代表视网膜前体细胞基因表达的UMAP图HES 6)和一个光感受器基因(AIPL 1). G, H, I祖基因表达分布的小提琴图(HES 6),光感受器基因(AIPL 1)和一个锥基因(PDE6H)跨越视网膜细胞类型和视网膜母细胞瘤。这些颜色与(A, B).

以往的视网膜母细胞瘤单细胞基因表达阵列分析表明肿瘤细胞可能具有多种细胞类型的混合基因表达特征。14。与这些数据一致,我们发现正常视网膜中通常以相互排斥的方式表达的基因,如HES 6AIPL 1在视网膜母细胞瘤肿瘤细胞中共同表达。5E-H)。这也适用于圆锥,杆和无腺嘌呤基因(图一)。5I和补充图。4E、F)。因此,单个视网膜母细胞瘤细胞表达一种正常情况下在视网膜发育过程中不发生的杂合基因表达特征。综合来看,我们的scRNA-seq分析表明,我们的器官来源的肿瘤在细胞特性和增殖方面与O-PDX和病人肿瘤没有区别(图1)。5G和补充数据6)并且所有数据都可以在基于云的查看器中获得(Https://pecan.stjude.cloud/static/rbsinglecell).

讨论

我们已经从15个有生殖线的参与者中开发了iscs。Rb1我们已经优化了一个三维视网膜器官培养系统,用于在实验室中产生人视网膜母细胞瘤。我们还开发了一些工具Rb1突变的野生型人干细胞,并产生视网膜母细胞瘤,无法区别于患者来源的IPSCs。器官源性视网膜母细胞瘤具有分子、细胞、组织病理学、遗传学、表观遗传学和克隆性特征,与患者肿瘤和O-PDX模型无法区分。与O-PDX相比,这种模型不依赖于患者的肿瘤组织,而在视网膜母细胞瘤的情况下,通常只有在去核后才能获得。此外,我们的模型可以从同一患者中提取多个肿瘤,也可以用于从从未发生视网膜母细胞瘤的携带者中产生肿瘤。在我们的系统中产生视网膜母细胞瘤的过程效率低(<5%),耗时(每个肿瘤植入和繁殖12~18个月)。尽管如此,这只是稍长的时间植入视网膜母细胞瘤O-PDX.随后的几轮分化和注射后,筛选出较高比例的视网膜组织器官,大大提高了效率,包括形成至少一个肿瘤从所有的CRISPR突变的SJRB-IPSC系被选择注射。引入额外的扰动,如MDM 2/4、MYCN或SYK的异位表达,可能加速肿瘤的发生。以前从基因改造的H9 ESCs中产生视网膜母细胞瘤的尝试可能失败了,因为他们没有足够的时间让肿瘤生长(60-90天),或者没有正常的视网膜发育。Rb134。我们的方法使用马赛克方法与相同的H9 ESC产生多个独立的肿瘤在200-300天。我们的肿瘤中没有一个是畸胎瘤,说明玻璃体内注射前的视网膜器官分化足以消除任何残留的干细胞。然而,我们确实用这种方法鉴定了两种具有神经元特征但不是视网膜母细胞瘤的肿瘤。因此,必须对视网膜细胞瘤进行强有力的诊断,包括分子、细胞、遗传和表观遗传学特征。这项研究还提供了对视网膜母细胞瘤内细胞同一性的新见解,显示了对视网膜前体细胞和视网膜棒的偏见。具有视网膜祖细胞特征的高增殖肿瘤细胞有可能产生分化程度更高的肿瘤细胞,这些肿瘤细胞具有特征性的棒状细胞和其他神经元,但要验证这一假说,还需要进行谱系追踪。这种复杂的肿瘤细胞通过视网膜发生的某些方面的进展过程可能已经混淆了以往从大量肿瘤基因表达分析中鉴定视网膜母细胞瘤细胞的尝试。事实上,scRNA-seq显示了一种混合细胞表型,这可能只是反映视网膜前体细胞的多能性。我们的视网膜器官系统将是一个重要的工具,以确定这些肿瘤细胞群体是否是不同的克隆,或者它们是否代表单个克隆的基因表达随时间的动态变化。这里描述的肿瘤模型也可能有助于测试针对个别患者的新的治疗组合。


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