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NEK 2抑制通过靶向pd-L1触发抗胰腺癌免疫

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发表时间:2021-07-30 12:21作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

尽管翻译后修饰对程序性细胞死亡配体1(PD-L1)有重大影响,但其在胰腺癌治疗耐药中的作用尚不明确。在此,我们证明,永在有丝分裂基因A相关激酶2(NEK 2)磷酸化的PD-L1中保持其稳定性,导致PD-L1靶向胰腺癌免疫治疗效果较差。我们认为NEK 2是免疫“热”胰腺癌的预后因子,以免疫依赖的方式参与胰腺肿瘤的发生和发展。NEK 2缺乏可抑制Pd-L1的表达,增强淋巴细胞浸润。在Pd-L1富含糖基化的区域发现了一个NEK结合基序(F/LXXS/T)。NEK 2与PD-L1相互作用,磷酸化T 194/T 210残基,防止泛素-蛋白酶体途径介导Pd-L1在ER腔内的降解。NEK 2的抑制使PD-L1阻滞敏感,协同增强抗胰腺癌的免疫应答。同时,本研究为提高胰腺癌免疫治疗效果提出了一种有前途的策略。

导言

摘要胰管腺癌是世界上最常见的胰腺外分泌细胞肿瘤,也是全世界第七大恶性肿瘤死亡原因。1,2。尽管在诊断、围手术期管理、放射治疗和系统治疗等方面取得了进展,提高了胰腺癌的生存率,但此类病例和相关死亡病例的数量仍在稳步增加。1,3。免疫治疗被认为是扭转这一趋势的最有希望的策略,尤其是针对程序性细胞死亡1(pd-1)及其配体1(pd-l1,又称b7-h1)的免疫检查点阻断。4,5。Pd-1/pd-ll阻断剂作为治疗黑色素瘤、肺癌和肾癌的多种临床试验已经启动,取得了良好的临床效果。5,6,7。然而,PD-1/PD-L1阻滞在PDAC中的作用有限。例如,罗亚尔等人。报道晚期胰腺癌患者组内无反应,防止了抗pd-l1抗体的有效性评估。8。此外,对65例转移性PDAC患者进行的第二阶段随机临床试验表明,接受药物治疗的患者的客观有效率为0%,而接受联合治疗的患者的客观有效率为3.1%。9。因此,深入了解基于pd-l1的组合疗法的详细机制,有助于开发新的治疗策略。10.

越来越多的证据表明,Pd-L1靶向药物的治疗效果可能会受到翻译后修饰(PTMS)的严重影响,包括泛素化、磷酸化和糖基化。除调节pd-l1的生理和病理功能外,这些ptms还在调节pd-l1的稳定性、内化和定位方面起着关键作用。11。例如,pd-L1的N-糖基化促进其折叠、胞内转运和功能。12,13,14。表皮生长因子(EGF)信号转导上调B3GNT3的表达,促进Pd-L1的N 192、N 200和N 219位N-糖基化。这是通过防止pd-l1在t 180和s 184上的糖原合成酶激酶3β(gsk 3β)的结合和磷酸化来稳定pd-l1的,并随后被含有e3泛素蛋白连接酶(Btrcp)介导的pd-l1多泛素化和降解的β-转导素重复序列所识别。15,16。更重要的是,EGFR抑制和PD-L1阻断的结合能显著提高单药治疗效果.此外,二甲双胍激活的AMP激活蛋白激酶在s 195残基处直接磷酸化pd-l1,诱导pd-l1糖基化异常,通过内质网相关蛋白降解途径导致pd l1降解。16。因此,迫切需要在胰腺癌中发现Pd-L1 PTM的关键调节因子,以提高PD-L1阻断在胰腺癌中的疗效。

在有丝分裂基因A(NIMA)相关激酶2(NEK 2)中从不是Neks的成员,Neks是一个丝氨酸-苏氨酸激酶家族,包括与必要的有丝分裂调节蛋白结构相关的蛋白质。17。NEK 2是一种参与细胞周期调控的多功能蛋白,如中心体复制和分离。17,18,微管稳定19,运动依附20,此外还有纺锤体组装检查点。21,22。NEK 2也被认为是维持B细胞正常发育和功能的关键因素。23。有趣的是,NEK 2和NEK 2介导的下游蛋白的异常表达(如p53在Ser315处)24和GAS2L1在Ser35225)在包括但不限于乳腺癌在内的多种癌症中,常被观察到与肿瘤的发生、进展、转移和预后不良有关。26,27、结直肠癌28,以及PDAC29。然而,NEK 2在肿瘤免疫抵抗中的潜在作用至今仍未明确。

本研究证明PD-L1是NEK 2的底物,NEK 2和PD-L1的联合抑制在很大程度上提高了临床前模型对胰腺癌的治疗效果。

结果

NEK 2是胰腺癌的预后因素

评估NEK家族成员是否NEK 1NEK 11)与胰腺癌预后相关,我们首先利用肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库中的胰腺癌(PAAD)数据集比较了它们在肿瘤和正常组织中的表达水平。多个癌症的生物信息学分析表明,与正常组织相比,NEK 2是PAAD中NEK家族中最显著的上调成员(图1)。1A和补充图。1A)。免疫组化进一步证实NEK 2在成对PDAC组织中的高表达。1B,c)。更重要的是,在肿瘤组织芯片中观察到NEK 2与预后显著负相关(图1)。1D)。TCGA数据分析进一步证实NEK 2的高表达与下位总生存率(OS)有关。1E和补充图。1B)。此外,与TNM分期和其他临床指标相比,NEK 2的高表达也与胰腺癌的血管浸润和肿瘤分级显著相关(表)1和补充图。2A-C)。这些结果表明NEK 2的高表达对PDAC患者是不利的。

图1:NEK 2是免疫“热”胰腺癌的预后因素。
figure1

acNEK 2在胰腺癌中的表达谱相对NEK 2用tcga数据库中PDAC的大规模RNA-Seq数据集分析胰腺癌组织中的表达。n(T)=179,n(N)=171;n病人数目)(a)。用IHC染色法检测成对肿瘤和正常胰腺组织中NEK 2的表达。b)和统计结果(c)所示(n=30;n患者数目(N:正常胰腺组织;T:胰腺肿瘤组织)。标尺:100μm。d胰腺癌NEK 2与预后因素的相关性研究组织芯片分析NEK 2在胰腺癌预后中的作用(英文)n=64弱正;n=50强正)(p < 0.0001). eNEK 2高、低表达胰腺癌患者的总体生存率(OS)n=177)。fCD8高表达胰腺癌患者的总体生存率(OS)+T细胞,NEK 2高表达或低表达n=76)。gCD8降低的胰腺癌患者的总体生存率(OS)+T细胞,NEK 2高表达或低表达n=101)。h利用TCGA数据对NEK 2与免疫效应细胞相关性的生物信息学分析。在……里面a数据表示为中间线为中间线;下铰链和上铰链对应于第一和第三四分位数;上晶须从铰链延伸到最大值不超过1.5×IQR的铰链(其中IQR是四分位数区间);较低的晶须从铰链延伸到铰链至多1.5×IQR的最小值,而晶须末端的数据是单独绘制的外围点。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 using a two-tailed t-测试;ns:不显着。本文给出了Kaplan-Meier方法和Gehan-Breslow-Wilcoxon检验的结果。d。危险比率(HR)和p-通过对数秩(mantel-cox)检验得出的值在eg.

表1 NEK 2在PDAC患者中的临床病理意义。

NEK 2在免疫性“热”胰腺癌中的表达及预后不良

因为肿瘤被归类为免疫“冷”(CD8)+T细胞减少)或“热”(CD8)+T细胞富集),其免疫状态与肿瘤预后密切相关。30,我们进一步研究了NEK 2在CD8升高或下降中的预后作用。+T细胞胰腺癌。有趣的是,NEK 2的表达只在免疫“热”细胞中与OS显著相关,而不是那些“冷”的细胞(图1)。1F,g)。此外,NEK 2的表达与免疫效应细胞的数量之间存在相反的关系(图1)。)。有趣的是,NEK 2也在多种免疫抑制人群中表达,如骨髓源性抑制细胞(MDSCs)、树突状细胞(DC)和巨噬细胞,尽管其表达阳性率低于肿瘤细胞(附图)。3A,b)。此外,GO-富集分析显示NEK 2过表达导致与白细胞增殖、迁移、活化和淋巴细胞活化的正调控相关的蛋白质表达显著增加(补充图)。3C,d)。提示NEK 2可能通过多种途径影响免疫治疗的疗效。此外,鉴于肿瘤突变负担(TMB)在免疫治疗反应中的关键作用,我们接下来研究NEK 2在高或低TMB免疫“热”胰腺癌中的预后相关性。令人惊讶的是,NEK 2与低突变性肿瘤的不良预后显著相关,而非高突变性肿瘤,进一步表明NEK 2在特定患者中的确切预后价值(补充图1)。4A,b)。总之,NEK 2被发现是免疫“热”胰腺癌的一个预后因素。

NEK 2缺乏提高胰腺癌免疫原性

稳定转染kpc-nek 2基因的胰腺癌细胞株kd内克2产生双镍酶质粒,以确定NEK 2是否与抗肿瘤免疫应答有关。与野生型(WT)对照细胞相比,NEK 2 KD-细胞在体外对T细胞介导的肿瘤细胞破坏表现出明显的抗药性(附图)。5A,b)。免疫活性C57BL/6小鼠对NEK2KD细胞源性肿瘤的生长有明显的抑制作用,而在免疫缺陷裸鼠中则无明显抑制作用(图一)。2A-h)。流式细胞术进一步显示CD8的数量和功能显著增加。+T细胞在NEK 2 KD细胞源性肿瘤中的表达(图1)。2i,j)。此外,具有这种肿瘤的免疫活性小鼠的存活率明显延长,而免疫缺陷裸鼠则未见此现象(图一)。2K-m)。结果表明,NEK 2与PDAC的发生、发展呈免疫依赖关系,NEK 2缺失可提高胰腺癌的免疫原性。

图2:NEK 2缺乏可提高胰腺癌的免疫原性。
figure2

a, c示意图协议分别显示WT和NEK 2缺失的胰腺癌细胞和S.C。免疫功能低下小鼠注射(n=7)。b, e具有代表性的肿瘤图像和免疫活性小鼠的生长曲线。在指定的时间点测量肿瘤,然后在端点解剖(n=7)。d, f免疫缺陷小鼠肿瘤的典型图像和肿瘤生长曲线。在指定的时间点测量肿瘤,并在终点解剖(n=7)。g, h免疫活性和免疫缺陷小鼠肿瘤的重量报告在终点(n=7)。i, j肿瘤浸润淋巴细胞的典型图像及统计结果(n=7)。k原理图显示将WT和NEK 2缺失的胰腺癌细胞分别注射到免疫活性和免疫缺陷小鼠体内(n=13)。l, m免疫活性和免疫缺陷小鼠荷瘤细胞NEK 2的存活n=13)。Kaplan-Meier生存曲线的对数秩检验评价WT与NEK2KD免疫活性(l) (p < 0.0001) and immunodeficient (m) (p=0.33)小鼠。结果代表一个有代表性的实验的均值±SD。ej。所有数据都代表了三个独立进行的实验。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 using a two-tailed t-测试;ns:不显着。本文给出了Kaplan-Meier方法和Gehan-Breslow-Wilcoxon检验的结果。ml.

NEK 2抑制激活抗胰腺癌免疫应答

为探讨NEK 2抑制对胰腺肿瘤发生和生长的影响,分别用NEK 2抑制剂和未用NEK 2抑制剂预处理胰腺癌细胞。分别分为C57BL/6和裸鼠。3A)。NEK 2抑制剂预处理可降低肿瘤的发生率,延缓肿瘤的发生。3B),而在裸鼠身上没有观察到这种趋势(见图)。3C,d)。此外,C57BL/6荷瘤小鼠和裸鼠分别给予NEK 2抑制剂,对C57BL/6小鼠的肿瘤生长有明显的抑制作用(图一)。3E-g)但不是在裸鼠身上(如图所示)。3H-j)。此外,NEK 2抑制剂对小鼠体重的影响与对照组相比无显着性差异(图二)。3K,l)。免疫组化染色显示pd-l1表达明显下降,CD8升高。+在NEK 2抑制剂治疗的肿瘤中T细胞浸润,提示NEK 2的抑制可能导致PD-L1的下调和T细胞功能的增强(图一)。3M-O)。为了支持这一点,特异性NEK 2抑制剂在体外显著增强了T细胞介导的肿瘤细胞破坏(附图)。5C,d)。结果表明,NEK 2抑制胰腺癌的发生和发展,可能与Pd-L1表达降低有关。

图3:NEK 2的抑制增强了抗胰腺癌的免疫应答。
figure3

a, c胰腺癌细胞分别用激酶特异性抑制剂NEK 2(10μM,24 h)和S.C预处理的方案。注射免疫活性和免疫缺陷小鼠(n=7)。b, d同时记录免疫功能低下和免疫缺陷小鼠的肿瘤发生率。肿瘤进一步使用NEK 2抑制剂(100μg/鼠,2周)。e, f免疫活性小鼠治疗方案及肿瘤生长曲线n=5)。在指定时间点测量肿瘤,并在终点切除肿瘤。(h, i免疫缺陷小鼠的治疗方案和肿瘤生长曲线(n=5)。在指定的时间点测量肿瘤,并在终点解剖。肿瘤和小鼠免疫能力的重量(g, k) (n=5)和免疫缺陷小鼠(j, l) (n=5)在端点处报告。mo肿瘤浸润淋巴细胞的代表图像和进一步定量。标尺:100×:50μm;200×:100μm。bd。结果代表一个有代表性的实验的均值±SD。f, g, i, j, k, l, m,和n。所有数据都代表了三个独立进行的实验。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 using a two-tailed t-测试;ns:不显着。

胰腺癌中NEK 2与pd-L1的正相关及相互作用

由于pd-L1是肿瘤免疫抵抗的重要调节因子,我们进一步研究了NEK 2对pd-L1表达的调节作用。NEK 2与Pd-L1之间的关系首次通过相互排他性分析在基因组变化水平上被确定为共现(补充图)。6A)。进一步证实,在多种检测中,包括但不限于TCGA数据库中转录水平的阳性关联(补充图)。6B)和蛋白质水平的配对临床组织样本(图)。4A),除了肿瘤组织微阵列(如图所示)。4B-d)。此外,在KPC(Kras)中观察到了显著的相关性。LSL-G12D;Trp53LSL-R172H;Pdx1-CRE)和KTC(Kras)LSL-G12D/+;TGF-BR 2浮球/重量Ptf1a-CRE基因工程小鼠模型(GEMM)中的自体胰腺肿瘤(附图)。6C-E)。Pd-l1表达水平显著降低。NEK 2KD肿瘤与WT对照小鼠移植瘤模型(附图)。7a,b)。此外,还观察到NEK 2和PD-L1在多个胰腺细胞系中的内源性相互作用。4F,g)。谷胱甘肽S-转移酶(GST)-下拉试验显示NEK 2与Pd-L1直接结合。4H)。双链分析一致地证明了NEK 2和PD-L1在细胞中的真正结合(图)。4I)。在进一步研究NEK2-PD-L1相互作用的定位过程中,胰蛋白酶作用后未检测到胞浆蛋白和腔内蛋白抗体的信号,相反,IRE 1α的胞浆结构域信号在胰蛋白酶作用后迅速减弱,而NEK 2和HSP 90B1的信号则保持在不通透性部分(补充图)。8A)。结果表明,NEK 2与ER腔内Pd-L1之间存在正相关和直接相互作用。

图4:胰腺癌中NEK 2与PD-L1呈正相关和相互作用.
figure4

a临床胰腺组织NEK 2和PD-L1的westernblot分析(英文)n(N:正常胰腺组织;T:胰腺肿瘤组织)。bd组织芯片NEK 2和Pd-L1 IHC染色的代表性图像和统计结果(n=156)。egSW 1990、KPC和CFPAC-1的细胞裂解物分别用IP和Westernblotting分析。有代表性的图像n=3项独立实验。hGST-下调NEK2-His和GST-Pd-L1蛋白。有代表性的图像n=3项独立实验。i多链连接法检测KPC细胞NEK 2和Pd-L1相互作用的单个免疫荧光染色的代表性图像。红点(NEK 2/Pd-L1相互作用)表示它们的相互作用。有代表性的图像n=3项独立实验。Spearman关联式和p-Spearman测试的数值显示在d.

NEK 2抑制泛素化介导的PD-L1蛋白酶体降解

为了进一步研究NEK 2调控PD-L1的方式,我们检测了PD-L1在NEK 2抑制剂中的表达水平,NEK 2KD,或过表达细胞。NEK 2抑制或耗竭降低胰腺癌细胞Pd-L1的表达(图一)。5A,b而NEK 2的过表达则引起PD-L1的上调(如图1所示)。5C)。有趣的是,由NEK 2缺失或抑制引起的PD-L1表达下调可通过蛋白酶体抑制剂MG 132恢复,提示NEK 2可防止蛋白酶体介导的PD-L1降解(图1)。5D,e)。事实上,两者中的pd-l1NEK 2KD组和抑制组的半衰期比对照组短,MG 132也能挽救这种减少。5F-I)。此外,在NEK 2缺乏的情况下,观察到泛素化水平增加(如图所示)。5J,k)。这些结果表明NEK 2以一种依赖激酶的方式控制PD-L1的稳定性。如洪氏组所示,糖原合成酶激酶3β(gsk 3β)是一种额外的关键蛋白,它与pd-l1相互作用,并诱导pd-l1磷酸化依赖性蛋白酶体降解。15。因此,进一步探讨NEK 2和GSK 3β在调节PD-L1表达水平中的作用。有趣的是,NEK 2抑制剂降低了GSK 3β的磷酸化,但逆转了p-GSK 3β下调对pd-L1的上调作用,并影响了pd-L1-GSK 3β的相互作用(附图)。9A-d)。相比之下,GSK 3β抑制剂对胰腺癌细胞NEK 2和Pd-L1表达的影响并不是非常稳定和显著(附图)。9E,f)。这些结果提示NEK 2在Pd-L1的调控中起着比GSK 3β更重要的作用,至少在胰腺癌中是如此。

图5:NEK 2抑制Pd-L1泛素化介导的蛋白酶体降解.
figure5

a, bNEK 2抑制剂(10μM,24 h)对胰腺癌细胞pd-L1表达的Westernblot分析及流式细胞术研究NEK 2击倒。有代表性的图像n=3项独立实验。c胰腺癌细胞高表达的LC-MS蛋白质组学定量分析NEK 2. dMG 132(100μM,24 h)对NEK 2抑制剂(10μM,24 h)作用后KPC细胞PD-L1表达的Westernblot分析。有代表性的图像n=3项独立实验。eMG 132(100μM,24h)处理WT和NEK 2 KD KPC细胞PD-L1表达的Westernblot分析。有代表性的图像n=3项独立实验。f环己酰亚胺(CHX)(20μg/mL)对NEK 2抑制剂(10μM,24 h)处理的KPC细胞Pd-L1稳定性分析。有代表性的图像n=3项独立实验。gPd-L1在CHX(20μg/mL)处理的WT和NEK 2 KD KPC细胞中的稳定性分析。有代表性的图像n=3项独立实验。h, i对三个独立实验进行了统计分析。用密度计定量pd-L1蛋白的表达强度。jNEK 2抑制剂(10μM,24 h)作用于KPC细胞中Pd-L1泛素化试验,用MG 132(50μM,24h)进行抗PD-L1 IP和抗泛素Westernblot分析。kMG 132作用于WT和NEK 2 KD KPC细胞中PD-L1的泛素化实验。结果代表一个有代表性的实验的均值±SD。hi。所有数据都代表了三个独立进行的实验。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 using a two-tailed t-test; ns: not significant.

NEK 2通过T 194/T 210磷酸化来维持pd-L1的稳定性。

除上调PD-L1的表达外,N192/N 200/N 219残基的糖基化也受NEK 2过表达的刺激(补充图1)。10A-c)。激酶介导的磷酸化可调节糖基化对PD-L1稳定性的影响,提示NEK 2以这种方式调控PD-L1的蛋白水平。以富含糖基化区(N 192/N 200/N 219)的M_(194)和T_(210)残基(Mus musculus:T 193和T 209)为中心,在多种植物中鉴定了两个进化保守的NEK磷酸化基序(F/LXXS/T)。6A)。专为识别在T 194和T 210磷酸化的PD-L1(小鼠T 193/T 209)而设计的特异性抗体被专门产生,以检测NEK 2在PD-L1上的潜在修饰(如图1所示)。6B)。当存在NEK 2抑制剂和NEK 2 KD细胞时,PD-L1的T 193/T 209磷酸化水平显著降低(图1)。6C)。体外激酶分析表明NEK 2直接磷酸化PD-L1。6d)。为进一步研究NEK 2介导的磷酸化对PD-L1表达水平的影响,分别构建了一个NEK 2的非磷酸化(T 193/209 A)和磷酸化(T 193/209 D)突变体,以及一个激酶死亡突变体(K37R)。结果表明,PD-L1的T 193/209 A突变降低了Pd-L1的表达,而T 193/209 D突变增加了其在胰腺癌细胞中的表达,而NEK 2的K37R突变使其失去了对PD-L1表达和磷酸化的调节作用。6e-g)。此外,用T 193/209 A和T 193/209 D突变体观察到PD-L1的半衰期缩短或延长(附图)。11A-dNEK2K37R突变体对PD-L1半衰期无明显影响(附图)。11E,f)。此外,在PD-L1 T193/209 A和T193/209 D突变体中,Pd-L1的泛素化程度也有增加和降低的趋势(图1)。六小时NEK2K37R突变体对PD-L1泛素化无明显影响(图二)。6I)。结果表明,NEK 2通过在T 193/T 209残基上的磷酸化来维持PD-L1的稳定性。

图6:NEK 2在T 194/T 210处磷酸化PD-L1以保持蛋白质稳定性。
figure6

a在富含糖基化区的NEK结合基序(F/LXXS/T)的示意图和Pd-L1潜在结合位点周围的氨基酸序列在进化发散物种中排列。F/LXXS/T主题以蓝色突出显示。b抗T 194和T 210位点特异性抗体的产生(Mus musculus:T 193和T 209)-磷酸化的PD-L1。cNEK 2抑制剂(10μM,24 h)和NEK 2 KD KPC对KPC细胞T 193和T 209磷酸化PD-L1的Westernblot分析。有代表性的图像n=3项独立实验。dPT193-PD-L1和pT209-PD-L1重组蛋白pT-L1和NEK 2(活性)蛋白的体外激酶分析和Westernblot分析。有代表性的图像显示,n=3项独立实验。e, f转染MG 132和T193/209A或T 193/209D转染的KPC细胞Pd-L1表达的westernblot分析。有代表性的图像n=3项独立实验。gPT 193-PD-L1、pT 209-PD-L1和PD-L1在WT和K37R转染的NEK 2 KD KPC细胞中的Westernblot分析。有代表性的图像n=3项独立实验。h转染Pd-L1或T 193/209D转染的KPC细胞经MG 132(50μM,24 h)处理后,经抗PD-L1 IP和抗泛素Westernblot分析,Pd-L1泛素化试验。有代表性的图像n=3项独立实验。i转染PD-L1和K37R转染的NEK2KD-KPC细胞经MG 132(50μM,24 h)处理后,Pd-L1泛素化试验和Westernblot分析。有代表性的图像n=3项独立实验。

NEK 2抑制对pd-L1靶向胰腺癌的免疫治疗作用

由于NEK 2调节PD-L1的稳定性,我们推测NEK 2的抑制可能会增强PD-L1靶向药物的疗效。事实上,NEK 2抑制剂和抗Pd-L1抗体与单抗NEK 2抑制剂或单抗Pd-L1抗体相比,在体外明显改善了T细胞介导的细胞毒效应(补充图)。12A,b)。鉴于此,我们还添加了NEK 2抑制剂和/或抗KPC荷瘤小鼠的抗PD-L1抗体(如图所示)。7A),之后两个肿瘤体积(图1)。7b,c)和肿瘤重量。7D)在接受联合治疗的小鼠中明显减少。此外,NEK 2抑制剂和抗PD-L1抗体的联合使用对小鼠体重没有影响(图1)。7E)。另外的流式细胞术分析显示,在两种治疗方法中,浸润到肿瘤中的T细胞的数量和活性都有明显的提高(图一)。7F,g)。此外,组合策略也被评价为一个原位模型(补充图)。13A),观察到类似的结果(附图)。13B-d)。此外,还证实NEK 2抑制剂在一定程度上抑制了小鼠NEK 2的活性(附图)。13E)。结果表明,NEK 2抑制剂在体外和体内均增强了PD-L1的阻断作用,减轻了胰腺癌的免疫耐药性。

图7:NEK 2抑制对PD-L1靶向胰腺癌免疫治疗的敏感性。
figure7

a抗PD-L1抗体联合NEK 2抑制剂治疗方案。b抗pd-L1抗体(200μg/鼠)、NEK 2抑制剂(100μg/鼠)或二者联合作用小鼠的肿瘤生长曲线。n=5)。c有代表性的图像显示从携带抗pd-L1抗体、NEK 2抑制剂或两者联合作用的KPC细胞中获得的肿瘤。n=5)。d, e肿瘤重量和小鼠体重(n=5)。f, g浸润肿瘤的淋巴细胞流式细胞术分析和统计结果(n=5)。的一个有代表性的实验的结果作为均值±sd。b, d, e,和g。所有数据都代表了三个独立进行的实验。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 using a two-tailed t-测试;ns:不显着。

讨论

越来越多的证据表明,细胞周期的传统介质也参与了癌症免疫调节。例如,细胞周期蛋白依赖性激酶4、5和6(cdk 4/5/6)是在真核生物中保守的三种丝氨酸/苏氨酸激酶,是细胞周期进程的基本驱动力,在多种恶性肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。31,32。有趣的是,CDK 4/6抑制剂不仅通过诱导细胞周期阻滞来抑制肿瘤细胞的生长,还通过抑制cdk 3-spop e3连接酶介导的pd-l1蛋白的降解而引发肿瘤免疫逃逸,从而增加了pd-l1的丰度。33。此外,CDK 4/6抑制剂与pd-1/pd-L1阻断抗体联合应用可提高多种肿瘤类型的免疫治疗效果。32,33,34,35。Cdk 5通过干扰素调节因子IRF 2和IRF2BP2调控髓母细胞瘤中pd-L1的表达36。NEK 2是一种多功能蛋白,参与细胞周期调节、微管稳定、运动附着、纺锤体组装检查点、下游蛋白磷酸化、维持B细胞正常发育和功能,与肿瘤的进展和临床预后密切相关。在本研究中,NEK 2被认为是肿瘤免疫耐药性的另一个重要调节因子。总之,这些发现为细胞周期相关激酶抑制剂与pd-1/pd-L1靶向免疫治疗相结合的抗癌治疗策略的制定提供了理论基础。

Pd-l1在多种细胞中表达,尤其是癌细胞和巨噬细胞,是肿瘤逃避免疫监视的关键。37。迄今为止,pd-1/pd-l1阻滞已成为肿瘤免疫治疗中最成功的治疗方法。38。然而,pd-1或pd-l1阻滞的总有效率很少超过40%。39。造成这一现象的原因之一是Pd-L1的PTM,它可能影响PD-L1阻滞的治疗效果。Pd-l1ptm的作用机制得到了广泛的研究,并发现了多种调节因子通过ptms影响pd-l1的稳定性,为提高pd-l1阻断的有效性提供了方法。15,40,41,42。例如,EGF信号通路诱导pd-ll糖基化,而geifinib(一种EGFR抑制剂)则在同基因小鼠模型中增加pd-l1的阻断治疗。15。基于这些发现,本研究进一步证明NEK 2是PD-L1磷酸化的关键调节因子,参与了胰腺癌的发生发展。NEK 2与Pd-L1直接相互作用和磷酸化,以保持其稳定性。NEK 2抑制剂与抗Pd-L1抗体协同抑制肿瘤的体内外生长,为胰腺癌的靶向治疗提供了可能。

鉴于肿瘤免疫微环境对免疫检查点阻断(ICB)治疗的影响,我们研究了NEK 2在不同免疫状态胰腺癌中的预后作用。NEK 2与免疫“热”状态患者的预后显著相关,而在免疫“冷”型PDAC中无显著相关性。肿瘤杀伤T细胞的存在证明了免疫系统对肿瘤的杀伤能力及其对icb的敏感性。43。PDAC具有明显的免疫异质性和不同程度的T细胞浸润。44,45,46。“热”肿瘤通常对检查点治疗有很好的反应。47,48,49。因此,NEK 2可能被认为是ICB的治疗性生物标志物,NEK 2的干预可以提高PD-L1阻断治疗“热”性胰腺肿瘤的疗效。除T细胞外,PDAC中还存在大量免疫抑制人群,对检查点治疗的疗效也有很大影响。有趣的是,除肿瘤细胞外,巨噬细胞、dc和mdSCs中均有nek 2和pd-l1的表达。37。鉴于此,我们推测NEK 2也可能调控Pd-L1在这些抑制性人群中的表达。TMB是肿瘤体细胞突变数量的衡量指标,可以作为一个生物标志物来反映免疫治疗的潜在治疗效果,从而识别出可能受益的患者。50。高突变负荷与肿瘤抗原数量增加有关,从而导致T细胞免疫反应和对ICB治疗的敏感性。51,52。有趣的是,NEK 2的表达水平可以预测低TMB患者的预后,提示抑制NEK可能是提高低TMB肿瘤免疫治疗效果的有效策略。

磷酸化对pd-L1稳定性的调节作用复杂、间接,有时甚至相互矛盾,但最终与糖基化修饰密切相关。最近,洪氏集团发现,IL-6激活的JAK 1磷酸化pd-l1在Tyr 112处,通过内质网相关N-糖基转移酶STT3A的加入,催化pd-l1糖基化,从而维持其稳定性。53。PD-L1在N 192、N 200和N 219的糖基化作用增强了PD-L1的稳定性,对其免疫抑制功能起着重要的作用。因此,可以产生一种特异性识别pd-l1糖基化位点的治疗性抗体(stm 108-adc)。15,42。然而,在另一项研究中发现,pd-l1s195磷酸化可诱导糖基化异常,防止pd-l1转运至细胞膜,进而抑制pd-1结合,增加ctl的活性。16。在本研究中,我们发现PD-L1的T 194/T 210残基是NEK 2介导磷酸化的靶向位点。由于新发现的T 194位点接近S 195,它的磷酸化可能会中断S 195的修饰,可能促进正常的PD-L1糖基化,从而提高其稳定性。尽管如此,针对PD-L1 T 194/T 210位点的特异性药物及其特异性和临床安全性的分析仍有待于进一步确定。

结论:NEK 2是免疫“热”低突变性胰腺癌的预后因素。NEK 2在T 194/T 210残基上与PD-L1相互作用,磷酸化PD-L1,维持其稳定性,从而抑制NEK 2的产生,加速Pd-L1的降解,激活细胞毒性T细胞,使胰腺癌细胞消失(图一)。8)。因此,虽然需要进一步的临床前研究和临床试验,但NEK 2仍然是胰腺癌治疗的一个很有前途的靶点,NEK 2和PD-L1的联合抑制将协同作用于胰腺癌患者。

图8:胰腺癌NEK2-PD-L1信号通路的预测模型。
figure8

本文提出了一个模型来说明NEK 2对胰腺癌中PD-L1蛋白稳定性的调节作用。NEK 2在胰腺癌ER中主要通过PD-L1在T 194/T 210残基上的磷酸化而与PD-L1积极调节和相互作用。因此,NEK 2抑制剂可抑制PD-L1蛋白的表达,主要是通过抑制Pd-L1的磷酸化来促进其降解。

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