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CD 19和CD 22双重靶向治疗成人复发性或难治性B细胞恶性肿瘤的CAR T细胞1期试验

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发表时间:2021-07-29 10:26作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

尽管取得了令人印象深刻的进展,但50%以上接受CD 19靶向嵌合抗原受体T细胞(CAR 19)治疗的患者出现了进行性疾病。16例大B细胞淋巴瘤(LBCL)患者经cAR 19治疗后有10例CD 19缺失或降低。低表面CD 19密度预处理与进展性疾病有关。预防CD 19复发或CD 19罗氏我们测试了一种针对CD 19和/或CD 22的双特异性CAR(CD 19-22.BB.z-CAR)。NCT 03233854)成人复发/难治性B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)和LBCL。主要终点是制造的可行性和安全性,并有一个次要的功效终点。主要终点达到,97%的产品达到了规程规定的剂量,在剂量上升过程中没有剂量限制毒性。在B-ALL(n(17)100%的患者有88%的微小残留病完全缓解(CR);在LBCL(n62%的患者有反应,CR率为29%。复发者CD 19−/LO50%(5/10)的B-ALL患者和29%(4/14)的LBCL患者与CD 22无关。−/LO疾病。CD 19/22-CAR产品在CD 22和CD 19刺激下细胞因子的产生减少。我们的结果进一步表明抗原丢失是导致CAR T细胞抗药性的主要原因,强调了构建具有跨靶点等效效力的多特异性CAR T细胞的挑战,并将细胞因子的产生确定为CAR T细胞潜能的重要质量指标。

嵌合抗原受体修饰T细胞的抗肿瘤作用1,2,3,4,5,6,7,8,9,10和自然杀伤(NK)细胞11靶向CD 19(CAR 19)促进了治疗复发或化疗难治(复发/难治性)B细胞恶性肿瘤的范式转变。然而,大多数接受cAR 19治疗的患者都经历了疾病进展。临床因素如CAR前疾病负担和血清乳酸脱氢酶(LDH)5,8与cAR 19治疗的反应有关。CAR 19治疗后,有30-95%的复发患者报告了与细胞表面CD 19丢失相关的疾病进展。12,通过多种机制,包括剪接突变和保留细胞内CD 19。12,13,14,15,16。一些报道也表明,有效的CAR T细胞反应需要高的靶抗原表达密度。17,18,19,20,21经单特异性CD 22-car治疗后,发现与抗原密度降低有关的耐药性。22B细胞成熟抗原CARS23。CD 19在LBCL中以可变水平表达。21,CD 19的出现所起的作用−/LO抗cAR 19中的lbcl还没有得到很好的研究。24,25。工程下一代治疗学,以克服新定义的抵抗机制,是一个重要的未实现的目标。

CD 22是一种唾液酸结合粘附分子,主要局限于B细胞系,在大多数B系恶性肿瘤中表达。26,27,28,29,30。在一项针对CD 19导向治疗的进展性疾病儿童和年轻人的研究中,CD 22 car T细胞诱导的CR率为73%,在CD 19中同样有效。+和CD 19B-全部22,31。然而,复发与CD 22的出现有关。罗氏B-ALL,说明了B-ALL中顺序靶向的局限性.在成人复发/难治性LBCL和B-All的第一阶段试验中,我们测试了针对CD 19和/或CD 22的双特异性CAR T(CD 19-22.BB.z)。22并论证了封闭系统制造的可行性、双专一性CAR T细胞的安全性以及B-all和LBCL的临床活性。CD 19观察复发−/LO维持CD 22的表达可能是由于双特异性受体对CD 22和CD 19的作用减弱所致。

结果

Ciloleucel抗性与CD 19的关系和CD 19罗氏LBCL

评估LBCL对cAR 19治疗的耐药性是否与CD 19相关。−/LO复发时,我们用免疫组织化学(IHC)的半定量H-评分法测定了在本机构使用轴索他汀(axi-celucel)治疗的患者在基线和疾病进展时CD 19的表达情况。我们的队列包括44名连续的患者,使用AXI-CEL和现有的前处理组织活检对IHC进行治疗。中位随访21个月(95%可信区间(CI)11-24),无进展中位生存期(PFS)为6.1个月(95%CI 3.1),23例(52%)有进展。23例进展中有16例有进展后活检。在AXI细胞之前,CD 19 H-评分中位数为285(四分位数范围(IQR)=240-285)(图)。1A和补充图。1)。用150分作为CD 19阳性指标,39例(89%)为CD 19。+治疗前。CD 19阳性与持久反应无关(Fisher‘s精确检验)P=1)。相比之下,在所研究的16个样本中,只有6个(37.5%)是CD 19。+在疾病进展的时候。在治疗前后配对的患者中,有9/15(60%)从CD 19转换而来。+CD 19预处理复发时(McNemar试验)P=0.003)(图1。1B)。一些进展后活检显示CD 19完全缺失,而另一些则显示CD 19表达减弱(如图所示)。1C)。此外,将治疗前的H-评分作为一个连续变量,与那些经历疾病进展的患者相比,有持续性疾病控制的患者之间也没有差异(t-测试P=0.32)。这些数据表明,axi-cel治疗lbcl后的进展与出现的CD 19有关。−/LO疾病在患者中所占的比例很高,但预处理前半定量检测CD 19的表达并不能确定患者是否有复发风险。

图1:IHC显示CD 19−/LOLBCL前置细胞治疗的疾病后细胞和定量流式细胞术与疾病进展有关。
figure1

a,Preaxi-cel H-评分没有区分长期应答者和有进展的后遗症患者(P=0.32t-测试,P=1 Fisher‘s精确检验)。CD19IHCH评分的瀑布图n=44例)。H评分以肿瘤细胞百分率(0~100)×染色强度(1~3)计算。虚线表示150的H分值,这是用来定义抗原阳性的.ND,无法检测。b,成对的CD 19 H-评分与进展前相比有显着性差异(P=0.003。使用的H分截止值为150,CD 19的观察率−/LO进展(16例患者中有10例)CD 19的95%二项CI(Wilson评分)−/LO进展38%-82%。N/A,无数据点。c,代表型IHC患者在进展时CD 19表达下降(A75,复发H-评分=160;A62复发H-评分=120;A30,复发H-评分=100;A53,复发H-评分=0)d,用定量流式细胞术对有持续反应的患者(A 116)与经历进展的患者(A 140)进行比较。e应用定量流式细胞术对15例患者进行定量流式细胞术,从最高(深蓝)到最低(白色)。部位密度较低的患者更有可能在术后发生疾病进展。P用Firth Logistic回归分析=0.03)。在拟合模型的基础上,定义了每个细胞3000个分子作为CD 19阳性的截止点。f,正中位密度在axi-cel进展时(n=8)。4例患者每个细胞的位点密度<3,000分子。g定量流式细胞仪检测结果与抗原位点密度无明显相关性(P>0.05)。n=12)(Spearman)r=0.28,P=0.38)。

源数据

为了评价CD 19细胞表面密度的定量评估是否能预测术后的预后,并试图确定与复发相关的抗原表达的阈值水平,我们用定量流式细胞术测定了细针抽吸获得的活单细胞悬液中CD 19位点密度。如图所示,Preaxi-celLBCL在CD 19位点密度中位数中表现出明显的内、间变异。1D,显示来自两位有代表性的患者的LBCL,他们都是CD 19。+我的H-得分。患者A 116的CD 19位点密度中位数为每细胞6,538个分子,并经历了持久的疾病控制;相比之下,患者A 140的CD 19位点密度中位数为每个细胞952个分子,并在初次CR后3个月出现疾病进展。中位前置细胞CD 19位点密度(n流式细胞仪定量检测为每细胞6,396个分子(IQR=3647~8540),每个细胞在952-46,805个分子之间。1E)。使用惩罚Logistic回归模型,治疗前CD 19位点密度中位数较低的患者在axi-cel后有明显的进展风险(P=0.03),每个细胞有2,934个CD 19分子的患者有50%的进展风险。因此,我们选择每个细胞3000个分子作为一个临界点来定义CD 19阳性(扩展数据图)。1)。在我们的队列中,4例表达≤3,000,CD 19细胞的LBCL患者中有3例发生了进展,而11例LBCL表达>3,000分子的患者中有1例发生了疾病进展。在研究后的8例患者中,有4例显示每个细胞的CD 19位点密度为≤3,000分子(如图所示)。1F以及扩展数据图。2)。H-评分与抗原位点密度相关性不佳(Spearman)。r=0.28,P=0.38;图1。1g以及扩展数据图。2)。这些数据证实了CD 19的出现。−/LOLbcl是cAR 19治疗耐药的主要原因之一,提示Lbcl在治疗前每细胞表达≤3,000分子的风险增加,这增加了定量流式细胞术(而不是ihc)可能预先识别lbcl患者CD 19风险的前景。−/LOCAR 19后复发。

CAR结构与临床试验设计

以往的数据表明CD 19丢失是B-ALL中cAR 19失效的重要机制。本研究所提供的数据同样将细胞表面CD 19的缺失或减少作为LBCL中cAR 19后的耐药机制之一,为B-ALL和LBCL的双重抗原靶向性提供了理论依据。如以前报告的那样22,32我们构建了一个CD19-22.BB.z-car,由编码抗CD 19小鼠FMC 63单链可变片段(ScFv)和全人抗CD 22 m971单链片段(ɑCD 19 vh-ɑCD22 VL-ɑCD22 VH-ɑCD 19 VL)组成,其次是人CD8铰链和跨膜结构域、4-1BB共刺激区和CD3ζ激活域。CD 19-22.BB.z-CAR是在小鼠干细胞病毒内部启动子控制下,由自失活慢病毒载体编码的。2A和补充图。2)。我们对复发/难治性B-ALL和LBCL患者进行了CD 19-22.BB.z-CAR的Ⅰ期临床试验,评价了CD 19-22.BB.z-CAR作为主要终点的制造可行性和安全性。符合条件的患者经过两次或两次以上的治疗后,疾病复发或难治性,并有表达CD 19的可测量的疾病。患者接受预处理化疗,然后在2个剂量水平下接受CAR T细胞输注:1×10。6小汽车+细胞公斤−1(DL1)和3×106小汽车+细胞公斤−1(DL2)使用3+3剂量上升阶段,将LBCL和B全部纳入一个队列。虽然未确定最大耐受剂量,但第三个剂量水平为1×107细胞公斤−1由于DL2的疗效和对细胞剂量超过3×10的可能毒性的关注,没有进行研究6细胞公斤−1在其他临床试验中见过。因此,这两个疾病特异性扩展队列接受了推荐的第二阶段剂量为3×10。6CAR T细胞kg−1(DL2)。

图2:汽车产品在整个制造过程中的特征显示了成分和表型的变化。
figure2

aCD 19-22-CD8.BB.z-CAR含有CD 19 FMC 63和CD 22 M971 scFVS、CD8α铰链和跨膜结构域、4-1BB共刺激区和CD3ζ结构域。独特的双专一结构为FMC 63重链近端,其次为M 971轻链、M 971重链和FMC 63轻链远端。b、CAR T制造和临床试验方案。制造模式显示了处理过程从旧到新矩阵的变化。临床试验方案显示筛查、淋巴滤过、CAR T细胞灌注和疾病评估时间点。腰椎穿刺。c,与旧矩阵相比,由于新的矩阵制造工艺而改进的培养扩展(P < 0.0001, two-tailed t-测试)。d,与旧矩阵相比,新矩阵过程的倍增时间显著缩短(P=0.0411,双尾t-测试)。e,新旧矩阵在转导效率上无显着性差异(P=不显著(NS),双尾t-测试)。总平均转导效率为60.1%(n=39件个别产品)。f,CD4/8-富集和CD 19-22.BB.z产物,观察T细胞(CD3)。+CD 56)、B细胞或白血病细胞(CD 20)+),CD4+、CD8+,NKT样(CD3)+CD 56+CD 16+)、NK细胞、单核细胞和中性粒细胞亚群。g,CAR T细胞产物的表型显示向CD4方向倾斜。+细胞(n=39件个别产品)。h,比较从分离到富集到最终产物的折叠增加,揭示了向CD4倾斜的趋势。+在浓缩和最终产物之间的培养过程中发生的细胞(P < 0.0001, two-tailed t-测试)。i,T细胞记忆亚群的表型显示T细胞富集。供应链管理 (P < 0.0001, two-tailed t-测试)和T厘米 (P < 0.0001, two-tailed t-测试)细胞亚群和T的耗竭埃姆拉 (P < 0.0001, two-tailed t-测试)子集。T无明显变化N或T埃姆富集与CD 19~22.BB.z产物之间的细胞亚群。

源数据

病人特征

39名病人参加了两个队列(B-ALL),n=17,LBCL,n38例患者接受CD19-22.BB.z-CAR灌注治疗,1例LBCL患者因进行性疾病和脓毒症而死亡(扩展数据图)。3)。接受输液者的中位年龄为69岁(25至78岁)(表)115例有c-MYC和bcl 2表达的LBCL,3例为高级别B细胞淋巴瘤,c-MYC和BCL 2和/或BCL 6易位(双击),4例曾进行自体干细胞移植。所有LBCL患者均为车内型。在B型ALL患者中,中位年龄为47岁(26至68岁);71%的人在异基因造血干细胞移植(Hct)后有进展,65%的人曾接受过CD 19导向的治疗(包括1名接受car T的患者),29%的人曾接受过CD 22指导的治疗(表)。2)。登记时63%的人有中枢神经系统(CNS)的病史,12%的人有活动性中枢神经系统疾病(CNS)。

表1登记的LBCL患者的特征、反应和预后
表2登记的B型ALL患者的特征、反应和结果

封闭系统制造的可行性

这一临床试验的主要目的是评估在CliniMACS Prodigy(Miltenyi Biotec)中使用封闭系统制造细胞的可行性,该产品被定义为超过80%的符合协议规定的细胞剂量的细胞产品。制造模式如图所示。2B以及扩展数据图。4A...最初,7-9天的制造工艺(旧基质)在第5天使用T细胞激活剂(Transact)的清洗。在DL1,57%(7/7)的产品在第7天内达到规定的细胞剂量,43%(3/7)的产品在9d内达到规定的细胞剂量。为了在增加剂量水平的同时缩短制造时间,我们在第3天(新基质)加入了一项工艺更改,大大缩短了满足剂量所需的培养时间,这体现在第7天细胞总数的增加(P < 0.0001; Fig. 2C)和缩短产品倍增时间(P=0.04;图1。二维空间)。39例患者中,符合规定释放标准的CART产品100%成功生产。97%的产品符合协议规定的剂量;82%(39个产品中有32%)在7d(4个旧矩阵,28个新矩阵)达到协议规定的剂量(扩展数据图)。4B-d)。平均转导效率为60.1%(范围34.6~75.2%)。2E),平均向量拷贝数为2.23(范围1.31-4.0;扩展数据图)。4E).

CD 19-22.BB.z-Car T型输液产品的表征

分离、CD4/CD8后T细胞富集、CAR T产物采集采集标本,进行细胞亚群分析,确定T细胞亚群的富集和白血病细胞的清除。与分离产品相比,制造的产品显示T细胞和CD4增加。+人口,CD8无变化+自然杀伤T(NKT)样亚群和B细胞或白血病细胞的耗竭(由CD 20定义)+)、NK细胞、单核细胞和中性粒细胞。2F).

CD19-22.BB.z产品显示CD4+优势(图1.2G)。为了确定这是由于T细胞富集后的分离还是制造过程,我们评估了CD4的倍增增加。+和CD8+人口超过制造过程(图一。2H)。在从分离到富集的过程中,折叠的增加没有明显的差异,而CD4的增加则有显着性差异。+和CD8+从浓缩到最终产品的T细胞亚群(P < 0.0001), implicating the manufacturing process in enriching the proportion of CD4+制造产品中的细胞。与富集的分离样品相比,产物显示了干细胞记忆T(T)的富集。供应链管理) (P < 0.0001) and central memory T (T厘米) (P < 0.0001) cell subsets, no change in naive T (TN)和效应记忆T(T)埃姆)细胞数量和终末分化效应记忆(T)的减少埃姆拉)单元子集(P < 0.0001; Fig. 2I).

毒性

在剂量上升过程中未出现剂量限制毒性(DLT),在临床试验中出现了一次DLT总毒性(DLT)。任何级别的细胞因子释放综合征(CRS)均发生在输注后1d(0-8范围)中位发病的29例(76%),持续时间中位数为4d(范围1-12)(表)。12以及扩展数据图。5)。≥3级者2例(5%)。发生神经毒性14例(37%,9例LBCL,5例B-ALL),4例≥3级神经毒性。神经毒性发生于输注后5d(3-9范围),持续时间中位数为4d(1-11范围)。CRS和神经毒性均按机构指南进行治疗,15例(39%)接受≥1剂量的托西罗单抗(1-3范围),45%的患者接受糖皮质激素治疗。所有CRS发作和神经毒性消失。2例巨噬细胞活化综合征合并高铁质血症和低纤维蛋白原血症并伴有≥3级神经毒性,并接受了大剂量皮质类固醇和anakinra治疗。31.

反应

在输注后3个月对LBCL进行初步疗效评估。LBCL患者按推荐的II期剂量治疗(n3个月的总有效率(ORR)为40%(95%CI 16~68%),CR率为33%(95%CI 12~62%)。对于所有的LBCL患者(n任何时间点的最佳ORR为62%(95%CI 38~82%),CR率为29%(95%CI 11~52%)。13名应答者中有5名在输液后第1至第3个月的反应中有改善(图1)。3A-c)。中位随访期为10个月(95%CI 8.7~21.5),总生存期中位数为22.5个月(95%CI 8.3--不可估计)。三维空间),随着后续时间的延长,情况可能会发生变化。PFS中位数为3.2个月(95%CI 1.2-5.5)。3E)。为了了解CD19-22.BB.z治疗的LBCL患者的反应动力学,我们用无细胞循环肿瘤DNA(CtDNA)评估了16例有诊断性肿瘤标本的淋巴瘤负担随时间的变化(扩展数据图)。6)33。在上一次评估时,4例临床反应持续的患者没有检测到ctDNA。在12例疾病进展中,我们观察到ctDNA在输注后14~21d开始下降,其中9例在临床进展前后出现ctDNA升高。这些发现提示LBCL患者CD19-22.BB.z-CAR后的进展性疾病与较强的早期反应及早期获得性抵抗有关。

图3:CD19-22.BB.z-CAR在LBCL和B-All中都很活跃.
figure3

a,显示淋巴瘤患者缓解时间和持续反应的图(n=21)。5例患者输液后1~3个月反应深度增加。bPET扫描显示患者S2在输液后1个月出现部分缓解,6个月后进展。c,用ctDNA进行淋巴瘤疾病监测。给SL02患者输注CD19-22.BB.z后,疾病负担继续减轻,与CD19-22.BZ的持续时间一致。。丁21例输注LBCL患者的总生存期。e、淋巴瘤队列的PFS。f.=‘class 3’>与B-All(n=17)。两例患者接受了一种巩固的异基因干细胞移植(白星)。gPET扫描SA8患者,大体积疾病输液后6个月改善为CR。h,使用灵敏度为10的基于细胞的NGS对SA8患者进行疾病监测。−6随着时间的推移,疾病控制的增加与PET反应的改善和CD19-22.BB.z的持续存在相吻合。i17例输注B型ALL患者的总生存期。j、Ball队列的PFS。k、流式细胞仪测定外周血CD4、CD8、CD19-22.BB.z、Car T细胞的绝对数。n=38种自体输液产品)。l,循环CD 19-22.BB.z拷贝数每50 ng基因组DNA按qPCR(n=33种自体输注产品),在输注后1、2个月(35~75天)、3个月(76~120天)和6个月(120~200天)测定CD19-22.BB.z的初始扩张和持续时间。

源数据

在输注后28天评估B-ALL的初步反应。全部(n17例B型患者均有反应,CR 14例(82%),部分缓解3例(图1)。3F)。1例患者输注6个月后反应(SA8)改善为CR(图1)。3G,h),总CR率为88%,所有患者在10岁时均为最低残留病(MRD)阴性。−4骨髓敏感性(扩展数据图)。7)或通过正电子发射断层扫描(PET)/计算机断层扫描(CT)治疗髓外疾病。中位随访9.3个月(95%CI 7.2~NE)后,总生存期中位数为11.8个月(95%CI 5.5~NE)。3IPFS为5.8个月(95%CI2.6-NE)。3J)。两例患者在CR中进行异基因干细胞移植,目前正在缓解中。对骨髓免疫球蛋白受体进行的连续MRD序列分析(NGS)显示,在进行中的CR患者中,100%(5/5)有持续的MRD阴性反应,70%(7/10)的患者在形态学复发前后MRD持续或上升(扩展数据图)。7).

CD19-22.BB.z CAR T细胞的体内定量研究

流式细胞术和定量PCR(QPCR)检测血液中CD 19-22.BB.z-CAR细胞,在输注后第10~14天达到高峰。3K,l)。流式细胞仪检测循环CD 19-22.BB.z细胞的中位峰值数为36 cAR l。−1(IQR=13~136),经qPCR检测,每50 ng基因组DNA的CD 19-22.BB.z转基因拷贝为1,794份(IQR=509~4,315)。LBCL与B-All或剂量水平之间的峰值扩张没有显着性差异(扩展数据图)。8a,b)。曲线下面积(AUC)测量的较高扩张与CRS和神经毒性增加有关(扩展数据图)。8C,d)。尽管CD4占优势+CD19-22.BB.z-CAR产品中的细胞,CD8 CD19-22.BB.z细胞在AUC和峰值水平上相对于CD4表现出更大的扩张(扩展数据图)。8E,f如大多数患者CD4:CD8比值<1所示(扩展数据图)。8g)。汽车耗竭标志分析+产品中的细胞显示CD4+细胞表达较高水平的CD 39(参考文献)。34)和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)(扩展数据图)。8H,i),有可能为减少CD4在体内的扩张提供基础。+与CD8相比+汽车T细胞。

CD 19~22.BB.z-CAR抗原在进行性疾病患者中的表达

在CD19-22.BB.z-CAR后,我们进一步定量CD 19和CD 22抗原的表达。流式细胞术,如病人SA 24所示。4A10例进展性B型患者中有5例CD 19表达阴性或低表达,保留CD 22,使用90%的阈值(图1)。4B和表2)。4例B患者治疗前后抗原定量均证实CD 19表达降低,3例CD 22表达密度无变化(图1)。4C)。14例进展期LBCL患者中,3例为CD 19。−/LO(扩展数据图。9A)由IHC。试验不需要CD 22的表达,而预处理前CD 22的表达是异质性的(扩展数据图)。9B3例患者CD 22−/LOLBCL和两份尚未确定。6例CD22H评分>150的患者均保持CD 22阳性.11例B-ALL或LBCL患者在进展过程中进行定量流式细胞术,6例CD 19低,每细胞≤3,000分子(见图)。4D),包括1例CD 19 H评分>150的LBCL患者。CD 22在低CD 19患者中的中位表达约为每个细胞6,000个分子。总体而言,14例LBCL患者中有4例(29%)为CD 19。−/LO在治疗后进行CD 19-22.BB.z-CAR(扩展数据图)。9A还有无花果。4D).

图4:CD 19阴性复发,CD19-22.BB.z-CAR后保留CD 22位点密度,CD 22抗CD 22功能减弱。
figure4

a患者S24抗原密度显示CD 19和CD 22同时表达,CD 19-22.BB.z(顶部)缺失,CD 22在进展中保存(下方,绿色箭头)。b用常规流式细胞术检测B-ALL患者CD 19和CD 22的表达,结果显示CD 19随CD 22的保存而丢失。c在B-ALL中,4例CD 19-22-CD前后抗原定量的患者中有3例CD 19表达缺失,与保留的CD 22表达相关。d,CD 19和CD 22抗原密度在进展中(n=11例)CD19-22.BB.z后,患者S24呈绿色突出。6例患者每细胞CD 19分子<1,150,而CD 22中位数约为每个细胞6,000分子。虚线表示每个细胞3,000 CD 19分子的截止值。e,CD19-22.BB.z双专用车原理图,显示回路结构。f的NALM 6细胞上CD 19和CD 22表达的直方图gj. g表达CD 19-22.BB.z输注产物中CD 69、CD107a、TNF-α、IFN-γ和IL-2分泌或表达的热图。n=11种单独的产品),由NALM 6肿瘤细胞株刺激f。热图显示N6-CD 19和N6-CD 19/22细胞因子对N6-CD22细胞因子的激活和分泌增强。h、双特异性CD19-22.BB.z和单种CD22.BB.z的原理图。i、IC刺激CD 19-22.BB.z(n=11)相对于单种CD22.BB.z(n=5)针对CD 22的汽车产品细胞株通过单种CAR22.BB.z(双尾)增加细胞因子IL-2和TNF-α的分泌t-测试)。j,利用单细胞等丛平台,刺激临床产品(n与N6-CD 22相比,N6-CD 19的PSI值高于N6-CD22。双专一CAR上的CD22scFv比单种CAR22.BB.z具有更低的PSI。n=4种单独的产品)当用N6-CD22刺激时(Mann-Whitney)U-测试)。

源数据

CD 19-22.BB.z-car T通过CD 22 scFv刺激时分泌较少的细胞因子

CD 19型−/LOCD 22保存后的复发提示表达CD 19-22.BB.BB.Car的T细胞对CD 19有明显的免疫压力,而对CD 22则无明显的免疫压力。体外模型显示CD19-22.BB.z-CAR对CD 19/CD 22有活性+细胞系(扩展数据图)10A)。为了解决这个问题,我们比较了CD19 scFv与CD19-22.BB.z-CAR内CD 22 scFv传递信号的相对效力。4E)采用单细胞分析法。我们用11种制造的细胞产品样品,测定了CD19-22.BB.z-car T细胞与双阳性NALM 6(N6-CD 19/22,每个细胞约20,000个CD 19分子和约50,000个CD 22分子)共培养后细胞内细胞因子分泌(ICS),通过CRISPR-Cas9(N6-CD 19,每个细胞约20,000 CD 19分子,每个细胞约有0,000个CD 22分子)检测了CD 22被敲除的NALM 6,其中CD 19通过CRISPR-Cas9(N6-CD 22,约40,000)个分子被敲除,每个细胞中有0个CD 19分子)或NALM 6,同时存在CD 19和CD 22基因缺失(N6-双敲除)(如图所示)。4F)。这些位点密度比在病人样本中看到的要高。21,28,35在体外模型中与高水平的细胞因子分泌有关。21.

用ICS,CD 19-22.BB.z-Car制品经与N6-CD 19共培养后,CD 69的表达显示活化,与N6-CD 22的激活较少(P < 0.0001). Higher expression with N6-CD19 compared with N6-CD22 was seen with CD107 (P < 0.0001), tumor necrosis factor-α (TNFα) (P < 0.0001), interleukin-2 (IL-2) (P < 0.0001) and interferon-γ (IFN-γ) (P < 0.0001) (Fig. 4G).

CD 22而非CD 19刺激引起的PSI和ICS降低提示CD 22 ScFv的效力降低。接下来,我们比较了CD 19-22.BB.z-car的CD 22 scFv的活性与单种CD22.BB.z-car中相同的scFv的活性。4H)22,31,36。我们测试了良好的制造实践(GMP)制造的CD22.BB.z-汽车T细胞产品(n=5)来自复发/难治性LBCL或B的患者-均在正在进行的临床试验中登记(NCT 04088890)对抗N6-双基因敲除和N6-CD 22。单特异性CAR对T细胞的平均荧光强度高于双特异性CAR(扩展数据图)。10b,c)。我们发现CD19-22.BB.z-CAR和CD22.BB.z-CAR T细胞的活化水平与CD 69的表达、IFN-γ和CD 107分泌的水平相似。4I)。然而,CD22.BB.z-CAR T细胞的肿瘤坏死因子-α水平明显升高(P=0.0063)和IL-2(P与CD 19-22.BB.z-CAR T细胞相比,分泌为0.0002)。同样,在N6-CD22存在时,利用等丛平台分泌的单细胞细胞因子对CD22.BB.z-car T细胞的PSI值高于CD 19-22.BB.z-car(n=4;图1。4J)。单细胞细胞因子分泌用32层人眼板进行检测。27CD4和CD8 CAR刺激后+N6-CD19/22、N6-双基因敲除、N6-CD19或N6-CD22N6细胞系n=7)。总体而言,用n6-cd19刺激CD 19可产生更高的多功能强度指数(Psi),测试cd8car。+产品(P与N6-CD22刺激相比,=0.04。4J)。这些数据表明CD 19/22.BB.z-CAR中包含的CD 19和CD 22 scFv均能对靶标识别产生信号,但双特异性CAR中CD 22 scFv连接后诱导的细胞因子水平低于CD 19 scFv结扎术。与此形成对照的是,单种CAR中CD 22 scFv的连接导致细胞因子水平高于双特异性CD22scFv。CD 22 scFv的效价降低为CD 19复发提供了一种机制。−/LO本研究人群中保留CD 22表达的疾病。

讨论

CD 19缺失经常在cAR 19之后在B中被发现-所有的研究都包含了可变的scFVS和共刺激结构域。5,6,7,15,16,37,38。在lbcl中,病例报告还描述了car 19之后的cd 19损失。35,39,40,41但尚未系统分析cAR 19后CD 19在LBCL中的表达情况。在本研究中,我们检测了44例LBCL患者中CD 19的表达,发现前处理的定量流式细胞术比传统的IHC更敏感地识别与未来进展相关的低抗原水平。定量流式细胞术可作为一种预测生物标志物,将抗原调节作为CAR治疗耐药机制之一。

一些研究已经证明了在临床前模型中同时靶向多个抗原的有效性,使用了多种CAR配置来赋予多特异性抗原识别。22,42,43,44,45,46。早期临床试验结果涉及针对CD 19和CD 20的串联CAR T细胞,结果显示在进展过程中CD 19丢失率较低。47,48。本试验中使用的CD19-22.BB.z型轿车是一个由两个单链抗体组成的单分子,在循环方向上被设计成单链抗体。22,在体外和异种移植模型中显示出活性。32。临床数据显示,CD19-22.BB.z-car T细胞在两种B-ALL中均具有临床活性,其中82%的细胞达到MRD。CR,在LBCL中,ORR为62%。毒性低:分别有5%和11%经历≥3级CRS或神经毒性。虽然我们观察到有CD 19缺失或低表达的复发,但鉴于有关抗原的现有数据有限,无法在这一单臂试验中确定这些比率是否比单特异性cAR 19治疗药物降低。−/LO复发和广泛变异的抗原损失报告的研究。

但B-ALL患者复发时所观察到的抗原表达模式与CD 19-22.BB.z-CAR对CD 19抗原有明显的免疫压力相一致,而CD 22表达的减少或缺失则意味着CD 22靶点的免疫压力更有限。单个特异性CD 22-car T细胞明确显示与CD 22相关的耐药性的经验罗氏B-ALL,这在这次审判中没有被观察到22。在LBCL中,CD 22罗氏复发时可见疾病,但治疗前CD 22表达不均匀,部分患者不表达CD 22。我们的数据表明,在双特异性CAR中连接CD 22 scFv提供的细胞因子分泌比CD 19 scFv少。这些结果表明,细胞因子的产生可能是一个具有临床意义的产品质量属性,可以预测体内的CAR效价,并说明在多特异性嵌合抗原受体的背景下跨靶点传递等效效力的挑战。

目前,许多汽车工程都是经验性的,目前正在研究多种同时靶向CD 19和CD 22的方法。32,49,50,51,52。一种最佳的单专用车的设计取决于许多因素,包括补药信号的预防,53优化铰链长度,54,55铰链/跨膜域21并优化靶表位与肿瘤细胞膜的距离27,56,57。在人类试验中,许多针对CD 22的嵌合抗原受体已经证明,结构的微小改变会导致丧失活性。49,58。在串联汽车(链接scfv)的背景下,优化工程还需要工程上的一个最佳双专一受体。59,60,这对CD 22目标来说可能特别具有挑战性。CD 19-22.BB.z-CAR与单纯性Car相比,CD19-22.BB.z-CAR能降低肿瘤坏死因子-α和IL-2的分泌。Car T细胞IL-2分泌的阈值已被证实高于IFN-γ。20并能更好地鉴别汽车的功效。我们的结果表明,工程迭代应该以对单细胞CAR多功能的仔细研究为指导,将细胞因子的生产作为一个关键的质量属性。

我们还观察到CD 19的显著发病率。+复发,正如以前cAR 19对B-all和lbcl的许多试验中所报告的那样。61提示在某些患者中,CD 19靶点的效力可能也是不够的。改进汽车制造可以防止抗原+抵抗,这很可能是由于T细胞的失败。CD4:CD8 CAR细胞的组成和T细胞亚群(如T)的优先使用厘米62,63,假设可以调节最佳的汽车活动。1。我们发现我们的制造工艺有选择性地丰富了T。厘米和T供应链管理低T埃姆拉但最终产品偏向CD4优势。此外,我们的过程产生的CD4细胞表达了更高水平的CD 39和PD-1,这与精疲力竭有关,这表明制造过程可能无法产生最佳的最终产品组合。由于这些发现,我们暂停了试验注册,以修改我们的制造过程,以获得更平衡的CD4:CD8比率,这也可能使CD4 CAR细胞保持一个较少耗竭的表型。

总之,这项工作为抗原提供了证据。−/LO逃逸是cAR 19治疗LBCL后的主要耐药途径,LBCL中的定量抗原密度与CAR T细胞治疗后的结果密切相关。使用一种能够同时识别CD 22和CD 19的双特异性CAR,我们在B-All中证明了安全性和令人印象深刻的临床活动。Lbcl的6个月PFS(29%,95%CI 12-48%)与组织学亮氨酸(Tisagagenlecleucel)相似。64。因此,在本研究中,淋巴瘤手臂被关闭,B型ALL患者的登记仍在进行中.对双特异性CAR的抗性与CD 19有关。+CD 22+复发,可能反映了CAR T细胞的内在局限性,以及CD 19−/LO但CD 22+复发,意味着免疫压力不足的CD 22目标。我们的数据还说明了细胞因子生产作为认证汽车T细胞效力的关键产品质量属性的价值。需要进一步的工作来优化CAR T细胞的多特异性靶向,以提高这类治疗药物在B细胞恶性肿瘤和其他固体和液体癌症中的疗效。


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