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SREBF 1与主转录因子在鳞状细胞癌中的相互作用及相互作用

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发表时间:2021-07-22 15:18作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

鳞状细胞癌(SCCS)是人类最常见的组织学类型之一。SCC细胞的转录调控失调是由肿瘤蛋白p63(TP 63),一个主转录因子(TF)和一个经过充分研究的SCC特异性癌基因。本研究通过对SCC患者标本进行基因集富集分析(GSEA)和体外功能缺失分析,确定脂肪酸代谢是TP 63下游的关键途径。进一步研究甾醇调节元件结合转录因子1(SREBF 1)液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)脂肪组学研究表明,TP 63与调节脂肪酸生物合成的脂肪酸代谢有关,如鞘脂(SL)和甘油磷脂(GPL)。此外,由SREBF 1/tp 63/组成的反馈共调节回路Kruppel样因子5(KLF 5)这将促进所有三个TFs在SCCS中的过度表达。在SREBF 1下游,一种非典型的SCC特异性功能被阐明:SREBF 1与TP 63/KLF 5合作,在SCC表观基因组中调控数百个顺式调节元件,这些调控元件聚集在激活促癌途径上。事实上,SREBF 1对SCC的存活和迁移至关重要,其过表达与SCC患者的生存能力差有关。综上所述,这些数据揭示了癌症转录异常的机制,确定了脂质代谢的特异性表观调控因子,并揭示了SREBF 1作为SCC潜在的治疗靶点和预后指标。

导言

癌症的特点是代谢活动失调,导致细胞生长和增殖增强。1,2。最能被理解的癌症细胞代谢紊乱包括Warburg效应。3(葡萄糖代谢)和谷氨酰胺代谢4。癌症中脂质代谢的改变也越来越被人们所认识。事实上,几十年前,肿瘤被发现合成脂肪酸。5向脂肪酸合成的方向转变6相反,大多数正常人细胞更喜欢外源性脂肪酸来源。事实上,肿瘤表现出新的脂肪酸合成,以维持生长和增殖,因为脂类不仅是生物膜的组成部分,而且在信号传导方面也有重要作用。7。一直以来,通过阻断脂肪酸合成途径(例如通过抑制fasn、acly、ACC和scd等酶)来降低脂肪酸的利用率,已经显示出不同类型癌症的抗肿瘤活性。8,9,10。在调节水平上,癌症中过度活跃的脂肪酸合成和脂肪生成途径往往与甾醇调节元件结合蛋白(SrEBPs)的调节失调有关。11,它控制胆固醇、脂肪酸和磷脂的摄取和合成所涉及的因素的表达。12,13,14。在这两个哺乳动物的SREBP基因中,SREBF 1主要调控脂肪酸合成所需的因子的表达,而SREBF 2则负责胆固醇的稳态。12,15。SREBF 1在前列腺癌、乳腺癌和肝癌等多种癌症类型中具有较强的促癌功能。11。SREBF抑制剂,如Fatostatin和Betulin,能显著抑制肿瘤细胞的生长和存活。16,17,18,19。SREBF 1的水平和活性通过负反馈调节受到内源性甾醇水平的严格控制。在癌细胞中,SREBF 1蛋白也被PI3K/Akt/mTOR信号通路稳定和激活。20,21。然而,SREBF 1的肿瘤特异性表观基因组调控仍不清楚.

鳞状细胞癌(SCCs)是由食管(ESCC)、头颈部(HNSC)、肺(LUSC)、子宫颈(Cesc)和皮肤(SSCC)等多个器官的分层鳞状上皮形成的恶性肿瘤。几种常见的鳞状细胞癌,如ESCC和LUSC,是特别致命的,并且很少有有效的治疗靶点。尽管来源于不同的解剖位置,SCCs具有许多特定于鳞状细胞谱系的基因组特征。例如,鳞状细胞癌最显著的异常之一是针对鳞状细胞分化因子的基因损伤(TP 63、SOX 2、ZNF 750和Notch家族成员)。22,23,24,25,26,27,28。TP 63作为最成熟的主转录因子之一,在正常的鳞状细胞分化和鳞状细胞癌的发生发展中起着重要的作用。事实上,我们和其他人已经证明,在正常发育过程中,tp 63控制着鳞状细胞的识别。29,TP 63的扩增和过表达促进SCC的发生和发展。30,31,32,33。机械地说,TP 63占据和控制着数百到数千个顺式-调控元件(特别是增强子和超增强子),并为细胞类型的特定功能协调基因调控网络。30,31,32,33。然而,绝大多数以前的机械研究都是通过体外细胞模型进行的。为了确定体内TP 63-靶基因和信号通路在泛鳞状细胞癌患者中的作用,在目前的研究中,我们首先对SCC患者标本进行了基因集富集分析(GSEA)。这一无偏分析发现脂肪酸代谢是TP 63下游跨不同类型SCCs最显著的富集途径之一。此外,SREBF 1被认为是TP 63与脂肪酸代谢之间的中心介质。

考虑到脂肪酸代谢失调是癌症的一个代谢特征,这些结果具有很大的潜在价值。7。然而,脂肪酸代谢在鳞状细胞癌中是如何被调控的还不是很清楚。此外,TP 63是否以及如何通过控制脂肪酸代谢来调控SCC细胞生物学仍未探索.此外,TP 63和SREBF 1之间的调控关系尚不清楚,而且SREBF 1在癌症中是如何通过表观基因激活的,目前尚不清楚。

在本工作中,我们对SCC进行表观基因组、代谢组学和转录分析,并阐明SREBF 1是连接TP 63与脂肪酸代谢的中心介质。此外,我们发现SREBF 1与TP 63/KLF 5合作,对数百个顺式-跨SCC特异性表观基因组的调控元件,集中于激活促癌途径,揭示SREBF 1作为SCC潜在的治疗靶点和预后指标。

结果

Tp 63通过srEBF 1调节脂肪酸代谢途径

为了探讨TP 63调控的体内信号通路,我们首先使用SCC患者标本进行了GSEA。我们以一种公正的方式,通过分析tcga队列中的rna-seq数据(包括ESCC),确定了在tp 63高表达的SCC样本中富集的信号通路。n=81),HNSC(n436)和LUSC(n=501)样品。宫颈鳞癌与人乳头瘤病毒(HPV)+HNSC样本被排除在外,因为HPV+肿瘤与人乳头瘤病毒有不同的基因表达程序。-SCCS25,34。根据该TF的表达,将每个SCC患者的肿瘤标本分为TP 63-高(前30%)或TP 63-低(30%)。首先确定了TP 63高、TP 63低两组间差异表达的基因.值得注意的是,与TP 63表达呈正相关或负相关的基因在这三种SCCs之间高度重叠(如图所示)。1A和补充数据1)。例如,在ESCC中发现的72.8%(182/250)正相关基因与LUSC(P < 1E-06) or HNSC (P < 1E-06) cohorts. This high degree of overlap supports the notion that TP63 shares biological functions among different types of SCC by directly regulating gene transcription30,31,33,35,36。这些差异表达的基因随后被用于进行带有Hallmark基因集的GSEA。同样,在TP 63高样本中显着丰富的信号通路在三种主要类型的SCCs之间基本上是重叠的(如图所示)。1B),提示TP 63对不同类型SCC基因表达程序的调控作用是一致的。

图1:TP 63通过SREBF 1调节SCCs脂肪酸代谢途径.

a三种SCC基因与TP 63正相关或负相关的Venn图2FC>2,q-数值<0.05)。b左侧面板,金星图显着丰富的标志路径在TP 63-高SCC样本。右侧面板,9条重叠富集路径GSEA结果的热图。c显示NES的条形图(标准化浓缩分数,上)和P-来自TCGA 23种癌症的TP 63高样本脂肪酸代谢途径的GSEA结果值(较低)。d两个独立的ESCC样本(TCGA和GSE 53624)脂肪酸代谢途径的个体GSEA图。eTE5细胞TP 63沉默后RNA-Seq数据中脂肪酸代谢途径的GSEA图。归一化浓缩分数。P-面板中的值C-E经多次比较调整。fTP 63单独敲除后脂质滴染色的共聚焦图像,或联合SREBF 1在TE5和KYSE 150细胞中的高表达。标尺,50μm。底部面板,基于共焦图像的脂滴染色定量分析,平均±扫描电镜。n = 5除KYSE 150-shTP 63-1+OE SREBF 1(n=6),作为显微视力的数目。*P < 0.05; **P < 0.01; P-值是由双边决定的。t-测试。g显示富集图案的热图(q基因启动子区值<0.001)与TP 63呈正相关。hTP 63在TE5、KYSE 150和KYSE 510细胞siRNA敲除后脂肪酸代谢调节因子的相对mRNA水平。平均±扫描电镜显示,n=3(生物复制)。*P < 0.05; P-值是由双边决定的。t-测试。

在9条共有的信号通路中,细胞周期相关(E2F靶点,G2M检查点,有丝分裂纺锤体)。37、MYC38,39,和mTOR40信号通路预期丰富,与先前TP 63的研究结果一致。此外,还观察到雌激素反应晚期途径的富集。有趣的是,发现了两条与脂肪代谢相关的途径(脂肪酸代谢和胆固醇稳态)。1B,右面板)。接下来,我们对所有癌症类型进行了类似的GSEA检查,结果表明,除甲状腺癌外,只有SCC标本中脂肪酸代谢与TP 63呈显著正相关(图一)。1C胆固醇稳态没有显示出这种SCC特异性(补充图)。1A)。如前所述,脂肪酸代谢失调是癌症的代谢标志.然而,对于脂肪酸代谢在SCC中的生物学意义,以及TP 63对脂肪酸代谢的调节作用,还没有进行深入的探讨。因此,我们接下来重点研究TP 63对SCCs脂肪酸代谢的调节作用。

为了验证这些基于TCGA的结果,使用其他独立的、大规模的SCC转录数据集(包括ESCC(GSE 53624)和LUSC(GSE 4573))执行了额外的GSEA。脂肪酸代谢再次富集在TP 63-高样本从任何一个ESCC(图)。1D)或LUSC(附图)。1B)队列。在三种SCC中,ESCC的富集程度最高,最低。P-价值(图1.1C因此,我们选择了这种癌症类型进行进一步的鉴定。值得注意的是,来自体外微扰实验的RNA-Seq数据的GSEA显示,TP 63基因敲除的ESCC细胞中脂肪酸代谢明显下调(如图所示)。1E和补充图。1C)。此外,TP 63的耗竭持续降低了总脂滴水平,表明脂质储存减少(如图所示)。1F).

为了了解TP 63是如何调节脂肪酸代谢的,利用与TP 63正相关的基因启动子进行了TF结合基序富集分析。1g)。E2F家族(E2F1和E2F4)的TFs与途径富集结果一致。SOX 5的排名也很高,可能是因为它识别了一个相同的序列基序SOX 2,这是scc中著名的tp 63合作伙伴。30,33,41。值得注意的是,SREBF 1是排名最高的TFs之一,这表明SREBF 1参与了与TP 63正相关的一大部分基因的调控。由于SREBF 1是脂肪酸代谢最重要的主调节因子之一,我们推测SREBF 1可能是TP 63与脂肪酸代谢途径之间的主要调节因子。支持这一假说,沉默TP 63下调SREBF 1在ESCC细胞中的表达。)。此外,SREBF 1的异位表达逆转了TP 63-耗竭引起的脂滴含量下降。1F相反,SREBF 1的沉默则消除了TP 63(补充图)过表达的影响。2ASREBF 1在功能上介导TP 63对脂肪酸代谢的影响。TP 63基因敲除可抑制脂肪酸合成关键限速酶mRNA的表达.重要的是,SREBF 1的过度表达挽救了这些基因表达的下降(补充图)。2B)。另一方面,SREBF 1的基因敲除在很大程度上逆转了TP 63过表达对酶mRNA水平的影响(补充图)。2C)。为了探讨是否涉及额外的脂代谢调节因子,我们筛选了8种已知的脂代谢调节因子(SREBF 1、SREBF 2、LXRA、LXRB、PPARA、PPARG、PGC 1和HNF4a)。11,42,43,44,45,46。大多数TFs在ESCC细胞中几乎没有表达,而只有SREBF 1始终受到TP 63的调控。和补充图。二维空间)。此外,只有SREBF 1在肿瘤中相对于相应的正常组织有中度上调(Log)。2FC>0.5)跨越所有三种类型的SCC(附图)。二维空间).

SREBF 1、tp 63和klf 5共同调控彼此的转录。

接下来我们研究了TP 63在SCC中对SREBF 1转录的调控机制,重点研究了ESCC模型,因为与hNSC和LUSC相比,ESCC不仅显示了SREBF 1的最高表达。2E),但肿瘤/正常比率也最高(即肿瘤中最大的增生;补充图)。二维空间)。有趣的是,在1157个超级增强剂中,发现了一种顶级的超级增强剂(排名第二)。SREBF 1TE5细胞的基因座(图1.2A)。事实上,SREBF 1在8/8 ESCC细胞中具有超增强作用(TE5和KYSE 150细胞如图所示)。2B)。为了确定这个超增强子区域是否确实调控srEBF 1的转录,对te5细胞进行了循环染色体构象捕获(4C)检测。SREBF 1启动子作为诱饵(图1.2C)。重要的是,4C分析确定了复杂的、广泛的相互作用SREBF 1启动子和超增强子区域。2C,补充数据2)。此外,这些DNA-DNA接触被严格限制在超增强子区域,突出了染色质相互作用的特异性。值得注意的是,tp 63芯片-seq数据显示来自同一te5细胞的多个结合峰在两个SREBF 1超级增强子和启动子。二维空间),提示TP 63有直接的转录调控作用。因为我们最近证明tp 63在SCC细胞中经常与sox 2和klf 5协同作用,共同调节数以百计的促进剂和超级促进剂。33我们推测TP 63可能还需要SOX 2或KLF 5共同调控SREBF 1的转录。KLF 5-(但不是SOX 2)结合峰在两个SREBF 1超增强子和启动子在TE5细胞中的作用(补充图提供了SOX 2芯片-Seq的阳性对照峰)。3A)。同样,KLF 5(而不是SOX 2)在转录水平和蛋白质水平上都能抑制SREBF 1在ESCC细胞中的表达。2E和补充图。3B)。此外,验证我们最近关于KLF 5和TP 63之间共同调控的发现,沉默这两种TFs中的一种降低了另一种的表达(如图所示)。2E,f).

图2:TP 63和KLF 5共同调控ESCC细胞SREBF 1。

aSREBF 1超增强子在8株ESCC细胞中的排名。b拐点图对TE5和KYSE 150细胞中所有典型的和超增强子进行了排序。c4C分析表明,在TE5细胞中,SREBF 1启动子上存在着长距离的相互作用。较深的红色表示较高的相互作用频率。dIGV图显示SREBF 1基因位点指示因子的芯片-Seq谱。蓝色阴影突出选定的本构增强子(E1,E2和E3),启动子和一个负对照(对照)区域。4C-正区被描述为红条,超增强子(SE)区域被描述为IGV图上的蓝色条。Rpm(每百万映射读取)峰值的值在轨道的左侧。E, fQrt-PCR和westernblotting检测eKLF5或fTP 63在ESCC细胞中的表达平均±扫描电镜显示,n=3(生物复制)。*P < 0.05; **P < 0.01; P-值是由双边决定的。t-测试。全长SREBF 1显示。

为了进一步研究SREBF 1超级增强子的活性,我们将4c、h3k27ac和tp 63/klf 5芯片-seq数据交叉在一起。30,33。鉴定出3个具有4C接触和H3K27Ac、TP 63和KLF 5峰的增强子成分。随后,这三个增强子元素SREBF 1启动子区域被分别克隆到荧光素酶报告载体中:三种组分增强子在TE5细胞中均具有较强的活性(图5)。3A,b)。正如预期的那样,SREBF 1的启动子也有很强的报告活性(如图所示)。3A,b)。此外,TP 63或KLF 5的沉默降低了三个促进剂和启动子的报告活性。3A,b)。为了研究TP 63对其靶向增强子的直接调控作用,我们选择了增强子E3,并对TP 63正则结合基序进行了定点突变。的确,TP 63的过度表达显著提高了野生型增强子的报告活性,但对突变型增强子无明显影响(补充图)。4A-C)。为了进一步验证这种超增强子对SREBF 1的直接转录调节作用,我们使用了一个crispr干扰(Crispri)系统,其中一个单一的引导RNA(Sgrna)将dca 9/krab(核酸酶不活跃的dca 9融合到krüppel相关的盒抑制器)的复合物引导到krüppel相关的盒抑制剂(krüppel),以抑制靶向cis调控元件。47。设计了针对E1、E2、E3或启动子的sgRNAs,并分别与dCas9/KRAB一起转染TE5细胞。3C)。为了排除非目标效应,我们为每个元件设计了两个独立的sgRNAs.重要的是,针对E1、E2、E3或启动子的sgRNAs都能持续有效地降低SREBF 1的表达。三维空间),突出了这些组成性促进剂的显著调节活性。

图3:SREBF 1调控ESCC细胞TP 63和KLF 5。
figure3

a, b荧光素酶报告法测定增强子活性aTP 63或bKLF 5基因敲除TE5细胞。平均±扫描电镜显示,n=3(生物复制)。*P < 0.05; **P < 0.01; P-价值是由双边决定的。t-测试。c示意图显示SREBF 1的本构增强子或启动子受催化死dca 9与转录抑制区(Krab)融合的抑制作用。dQRT-PCR检测dCas9/Krab载体(不含sgRNA)转染TE5细胞后SREBF 1、TP 63和KLF 5 mRNA水平,或与siRNAs联合转染TE5细胞E1、E2、E3和启动子后的mRNA水平。平均值显示,n=2(生物复制)。eQRT-PCR和westernblotting分析SREBF 1在ESCC细胞中的敲除作用。平均±扫描电镜显示,n=3(生物复制)。**P < 0.01; P-价值是由双边决定的。t-测试。fIGV在TP 63或KLF 5基因位点上指示因子的芯片-Seq谱图。蓝阴影突出选定的TP 63(T1,T2和T3)的本构增强子和KLF 5(K1)的启动子被SREBF 1占据。4C阳性区域(以TP 63启动子为诱饵)被描述为红条,超增强子(SE)区域被描绘为蓝条。Rpm(每百万映射读取)峰值的值在轨道的左侧。g荧光素酶报告在TE5细胞SREBF 1基因敲除后进行检测。平均±扫描电镜显示,n=3(生物复制)。*P < 0.05; **P < 0.01; P-价值是由双边决定的。t-测试。hTCGAESCC中SREBF 1、TP 63和KLF 5的Pearson相关系数(n=81)和GSE 53624队列(n=118)。iSREBF 1,TP 63和KLF 5的调节关系示意图。

令人惊讶的是,针对E1、E2、E3或启动子的sgRNA也显著降低了SREBF 1上游调控因子TP 63和KLF 5的表达水平(图1)。三维空间)。这种耐人寻味的效应表明SREBF 1也可能调控TP 63和KLF 5的转录,形成反馈共调节回路。事实上,SREBF 1的基因敲除显著降低了TP 63和KLF 5在不同ESCC细胞株的mRNA和蛋白水平上的表达(图一)。3E)。接下来,我们将探讨SREBF 1如何控制TP 63和KLF 5的转录,并在TE5和KYSE 150细胞株中进行SREBF 1芯片-Seq的表达。3F)。正如所料,SREBF 1结合峰在这两个ESCC细胞中有很强的重叠(P=10−8,补充图。4D)。序列基序分析证实SREBF 1基序是最富集的(补充图)。4E),以及典型的SREBF 1靶基因(补充图)。4F)所有的SREBF 1峰均位于其启动子处。这些数据验证了SREBF 1芯片-Seq结果的质量。重要的是,在TP 63,我们在TP 63超增强剂中鉴定了多个SREBF 1结合峰(图3)。3F)。值得注意的是,我们最近的4c结果确认了srbf 1-占领超级增强子与tp 63启动子的直接联系。33。如属KLF5此外,我们还在KLF 5启动子和增强子上观察到SREBF 1的几个峰。接下来,我们选择了TP 63的几个候选增强子元件(T1、T2和T3)和KLF 5的启动子元件(K1)进行荧光素酶报告试验。T3和K1的报告活性较强,SREBF 1沉默后,T3和K1的活性降低(图1)。第三代)。我们进一步进行了定点突变,突变SREBF 1结合基序在T2和T3元素。我们发现SREBF 1的过表达持续提高了野生型T2/T3基因的报告活性,但未能影响突变体T2/T3(补充图)。5A-d),证实SREBF 1对这些促进剂的直接调节作用。此外,来自不同ESCC患者队列的RNA-Seq数据表明,这三种TFs的表达水平之间存在一定的相关性(图一)。3H和补充图。5E)。这些结果表明SREBF 1、TP 63和KLF 5共同激活了彼此的转录,形成了一个共同调节的反馈回路。3I).

SREBF 1促进SCCs中脂肪酸、鞘脂和甘油磷脂的生物合成

建立了SREBF 1超增强子激活的分子基础,以及SREBF 1/TP 63/KLF 5在SCC细胞中的协同调节反馈环,进一步研究了SREBF 1对早期发现的脂肪酸代谢的功能影响。1F)。SREBF 1在不同的细胞类型中激活新脂肪酸生物合成的限速酶(acly,fasn,ass 2和scd)。12,15,48,49,50。在SCC细胞中,我们证实了siRNAs沉默SREBF 1。4A,b,以及附图。6a,b)这些酶的mRNA和蛋白表达均显著降低。其拮抗剂Fatostatin对SREBF 1活性的抑制作用16,51(这也是针对SREBF 2的),也产生了同样的效果(图二)。4C和补充图。6C)。此外,SREBF 1沉默后,脂滴含量降低。6d,e)。考虑到脂质体具有巨大的结构复杂性,我们进一步全面地描述了SCC细胞中脂类物质的分布情况。具体来说,LC-MS/MS脂质组学是在SREBF 1-抑制作用(Fatostatin)对KYSE 510细胞的抑制作用存在或不存在的情况下进行的.为保证重复性,分别对对照和实验样品进行了三重分析,在各组间均表现出较高的相关性(Pearson相关系数:0.82~0.95,附图)。6f)。结果,共鉴定出1561个脂质离子,属于35类脂类,表明这一系统方法具有较高的脂质体覆盖率(补充数据)。3)。SREBF 1-抑制导致69的下调和65种脂质离子的上调。2FC>2,q-数值<0.1,如图所示。4D,e)。下调的脂质离子主要富集在两类脂质中:(1)鞘脂类(SL),其中包括Cer酰胺(Cer)、鞘氨酸(SO)、葡萄糖基神经酰胺(CerG 1)、二葡萄糖基神经酰胺(CerG 2)、三葡萄糖神经酰胺(CerG 3)和甘油磷脂(GPL)家族,其中包括心磷脂(CL)、脂多糖(LPS)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)和赖氨酸-磷脂酰乙醇胺(LPE)。相反,在升高的脂质离子中没有发现明显的模式(图一)。4D,e)。这些结果表明,SREBF 1除了调节脂肪酸合成外,还能调节脂质代谢。为了进一步了解SREBF 1抑制后脂质体的变化,我们整合了SREBF 1抑制后的rna-seq(补充表)。1)及其芯片-Seq,并鉴定了直接的SREBF 1靶向酶的脂质代谢过程。与脂肪酶组数据一致,SL合成酶SPTLC 1、SPTLC 2、ELOV 4、ELOV 6、ELOV 7和CERS 6是SREBF 1的直接下游靶点。4F)。LIPIN 1是一种GPL合成酶,也由SREBF 1直接控制。4F)。SREBF 1的基因敲除或抑制均下调了所有这些因子的表达。这些发现表明SREBF 1通过直接激活SCC细胞内许多主要酶的转录,促进脂肪酸、SL和GPL的生物合成。

图4:SREBF 1促进SCCs中脂肪酸、SL和GPL的生物合成。
figure4

aQRT-PCR检测ESCC细胞SREBF 1基因敲除后脂肪酸合成中枢酶的mRNA水平。平均±扫描电镜显示,n=3(生物复制)。*P < 0.05; **P < 0.01; P-价值是由双边决定的。t-测试。b, cWESTERNBLOTTING分析显示脂肪酸合成的中央酶的蛋白质水平b击倒SREBF 1或cFatostatin(0,3.25μM,6.5μM,13μM)作用于食管鳞癌细胞。在三个与生物学无关的复制体上进行了Westernblotting实验,并给出了具有代表性的结果。dFatostatin处理KYSE 510细胞后的LC-MS/MS脂肪组学火山图。每个点是一个脂质离子。e脂离子变化的散点图,按脂类分组。每个点是一个脂质离子。SL鞘脂,GPL甘油磷脂,GL甘油脂。f示意图显示SREBF 1通过整合RNA-Seq(SREBF 1基因敲除和置乱)和芯片-Seq在TE5细胞中调节脂质合成途径。脂肪酸、SL鞘脂、GPL甘油磷脂、MUFA单不饱和脂肪酸、PUFA多不饱和脂肪酸、3kSN 3-酮-鞘氨酸、SA鞘氨酸、丝氨酸棕榈酸转移酶、二氢DHCer二氢系神经酰胺、CER神经酰胺、CerG 1葡萄糖神经酰胺、G2基葡萄糖神经酰胺、CerG 3三葡萄糖神经酰胺、SM鞘磷脂、鞘氨酸、S1P鞘氨酸、G3P甘油3-磷酸、甘油酰磷脂酸、磷酸二酰甘油、甘油酰甘油酰甘油、甘油酰甘油、心磷脂酰胆碱。

SREBF 1对SCC细胞的生长和迁移至关重要。

我们下一步试图确定SREBF 1在SCC中的生物学意义,再次使用ESCC作为主要疾病模型。免疫组织化学(IHC)染色显示,SREBF 1蛋白在细胞核中的含量明显高于细胞质(见图)。5A,b)。179例食管癌标本及57例癌旁非恶性食管组织中核SREBF 1蛋白在食管鳞癌组织中均有过表达。5A,右面板)。重要的是,SREBF 1的高表达与ESCC患者的整体生存状况密切相关。5C)。回归分析显示SREBF 1是由临床肿瘤-淋巴结转移(TNM)参数(HR=2.24,95%CI=1.36~3.71)构成的多变量模型中的独立生存预测因子。P=0.002)(补充表2)。鉴于SREBF 1/TP 63/KLF 5具有明显的协同调节反馈环,TP 63和KLF 5的蛋白也用同一组ESCC标本进行染色。一致地,TP 63和KLF 5的显著过度表达被证实(图5)。5A,b).

图5:SREBF 1对SCC细胞的生长和迁移至关重要。
figure5

a食管鳞癌及癌旁非恶性食管组织中SREBF 1、TP 63和KLF 5蛋白的核和胞浆染色的IHC评分。方格表示中间线(中线)、25百分位数、75百分位数(方框)和第5百分位数和第95百分位数(须)。IHC染色标本57例(非恶性),179例(ESCC)肿瘤。**P < 0.01; P-值是由双边决定的。t-两组IHC评分之间的测试。b典型的ESCC肿瘤标本SREBF 1、TP 63和KLF 5蛋白的IHC图像。原始放大倍数为×400,标度棒为50μm。cSREBF 1蛋白表达对ESCC患者生存的Kaplan-Meier分析。对Kaplan-Meier曲线进行了对数秩检验,P-值为双尾,显着性水平为0.05。d个体siRNAs和SREBF 1基因敲除SREBF 1的研究e在集落形成实验中,Fatostatin对细胞增殖有抑制作用。结果表明,qRT-PCR检测有3个生物重复,菌落分析有2个生物重复.f迁移试验和gSREBF 1基因敲除后在ESCC细胞中的伤口愈合实验。平均±扫描电镜显示,n=3(生物复制)。*P < 0.05; **P < 0.01; P-价值是由双边决定的。t-测试。hSREBF 1在KYSE 150细胞中经shRNA稳定沉默。i小鼠异种移植对SREBF 1基因敲除的影响jFatostatin(30 mg/kg/d)腹腔注射治疗。平均±扫描电镜显示,n=8(一组肿瘤数目)。*P < 0.05; **P < 0.01; P-值是由一个片面的值决定的。t-测试。

进一步研究了SREBF 1对ESCC细胞增殖和迁移的生物学效应。独立siRNAs沉默内源性SREBF 1的表达,显著抑制集落生长。5D)跨越不同的ESCC细胞。同样,Fatostatin对SREBF 1活性的抑制也显著抑制了集落形成。5E)。此外,SREBF 1的敲除明显抑制了ESCC细胞在伤口愈合和跨孔迁移试验中的短期迁移能力。5F-g)。在异种移植模型中,通过shRNA或其抑制剂Fatostatin靶向SREBF 1可有效抑制异种移植物在体内的生长。5H-j,补充图。7a,b用shRNA或Fatostatin靶向SREBF 1可以有效地降低Ki 67(补充图)的表达。7C,d)。此外,我们还验证了(I)SREBF 1/TP63/KLF 5之间的共调节反馈环,以及(2)SREBF 1在脂肪酸代谢(例如ACLY、FASN和SCD)中的典型靶基因(如ACLY、FASN和SCD)。7a,b(右面板)。这些数据共同表明SREBF 1是一个很强的SCC促进因子。

SREBF 1、TP 63和KLF 5协同调控SCC细胞转录体

SREBF 1作为一种强有力的SCC促进因子,其与TP 63/KLF 5的共调节反馈环的发现强烈提示SREBF 1在SCC中具有细胞类型特异性功能,并在脂代谢途径中具有典型作用。为了探讨这一假说,我们分析了SREBF 1在SCC(TE5和KYSE 150细胞株)、肝癌(HepG 2细胞株)和乳腺癌(MCF 7细胞株)三种细胞类型中的全基因组占用率。从ENCODE项目中检索HepG 2和MCF 7细胞的SREBF 1芯片-Seq数据,并使用相同的计算管道与我们来自ESCC细胞的内部数据一起进行再处理。值得注意的是,特定于细胞类型的SREBF 1结合峰的数量超过了共享(定义为两种细胞类型中的峰值)或无处不在的峰值(定义为所有三种细胞类型中的峰值)(如图所示)。6A,补充图。8)。具有普遍存在或细胞类型特异性峰的代表性基因如图所示.6C。为了确定可能的结合TFs,对每一组峰进行了序列基序富集分析(图1)。6B)。考虑到启动子和远端区域之间不同的dna序列含量(例如,启动子通常是CG丰富的,而远端增强子区域则缺少cpG岛)。52),在这两种基因组背景下分别进行了主题分析,重点关注了前15位最丰富的主题(补充数据)4)。正如预期的那样,无论是普遍存在的还是特定的峰值集,SREBF或NFY(已知的SREBF 1辅助因素)主题几乎总是排在第一位。值得注意的是,已知的细胞型特异性TF基序在细胞型特异性峰集中富集.尤其是TP 63和HNF4a基序在ESCC-和HepG 2-特异性峰中分别有显著和独特的富集(图1)。6B),与其明确定义的单元格类型特定函数一致。Klf 5也在ESCC和HepG 2的特异性峰中富集,这与其在鳞状细胞癌和胃肠道癌中的重要作用相一致。53,54,55。相反,我们并没有在无处不在的峰值中识别出这种细胞类型的TF基序.

图6:SREBF 1、TP 63和KLF 5协同调节SCC细胞转录组。

aSREBF 1峰区(峰值中心±3KB)的芯片-Seq信号热图,分为普遍存在的、共享的或细胞类型的特定峰值集,并根据每百万次映射读取(RPM)的读取量,按SREBF 1峰值的强度排序。线,峰;颜色标度的峰值强度显示在底部。b代表顶部共享或特定于细胞类型的TF主题(由*表示)在每个峰值集合中。注意,在ESCC和HepG 2启动子区域(由**表示)都发现了KLF5基序。P-对数值进行了调整,以便进行多次比较。cIGV在代表基因位点的H3K27Ac和SREBF 1芯片-Seq谱。d由SREBF 1/TP 63/KLF 5(±5 KB的峰心)所组成的ESCC特异性SREBF 1峰的热图按SREBF 1峰的强度排序。e类似于d,在ESCC特异性SREBF 1峰区显示指示芯片-Seq信号分布的线状图。f在TE5细胞SREBF 1、TP 63或KLF 5沉默后,GSEA绘制了相应转录本的变化图,这些转录本被分配给来自RNA-Seq的274个ESCC特异性峰。归一化浓缩分数。P-对数值进行了调整,以便进行多次比较。

以473个ESCC特异性SREBF 1结合峰为研究对象,由于TP 63和KLF 5基序强烈富集,我们进一步分析了在同一株TE5细胞中产生的SREBF 1、TP 63和KLF 5的芯片-Seq数据。经验证,SREBF 1/TP 63/KLF 5在57.8%(274/473)峰中有三次占据,SREBF 1/TP 63或SREBF 1/KLF 5的双占据率分别为14.0%(66/473)或14.8%(70/473),而SREBF 1仅占较小部分(63/473,13.4%)。6d,e)。这些峰的两侧是强烈的H3K27Ac信号,表明转录促进活性。Meta-基因分析表明,这三个TFs的结合峰高度一致(图1)。6E)。为了了解SREBF 1/TP 63/KLF 5在这些ESCC特异性峰中的共结合对转录的影响,我们询问了TE5细胞中每个TF被击倒后的RNA-Seq数据。重要的是,GSEA显示,这274个被三人占据的ESCC特异性峰的相应转录本在这三个TFs中的任何一个沉默后,在下调的基因中都显着地富集(见图)。6f)。综上所述,这些发现表明SREBF 1/TP 63/KLF 5在数百个ESCC特异性峰中具有显著的协同结合模式,这意味着三个TFs对基因表达的共同调控。

SREBF 1、TP 63和KLF 5协同激活ESCC细胞转录ErbB/mTOR信号通路

为了探讨普遍存在的SREBF 1结合峰和细胞型特异性SREBF 1结合峰的生物学功能,对KEGG通路进行了分析.在与无处不在的峰值集相关的基因中(n7条信号通路显著丰富。如所料,脂肪代谢过程有四条途径,包括脂肪酸代谢、类固醇生物合成、脂肪酸生物合成和不饱和脂肪酸生物合成(图一)。7A)。这些数据证实了SREBF 1在调节脂肪和脂肪酸合成方面的共同作用,而不管细胞类型如何。与之形成鲜明对比的是,在与ESCC特异性三峰相关的13条信号通路中,没有一条与脂质代谢有关。相反,这13条途径中大部分与癌症相关,包括ErbB信号通路、mTOR信号通路、胶质瘤、HIF-1信号通路、非小细胞肺癌、乳腺癌、肿瘤中胆碱代谢以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂抵抗(图一)。7b)。由于ErbB和mTOR信号通路高度排列,因此选择这两种致癌级联进行进一步的研究。与SREBF 1/TP 63/KLF 5在这些ESCC特异性峰上的三次占用相一致(图1)。6dSREBF 1/TP 63/KLF 5对这两条途径富集的13个基因进行了三次整合。7C)。启动子处的三结合峰WNT9A基因显示为例,预期在HepG 2和MCF 7细胞中缺失。7D)。重要的是,SREBF 1、TP 63和KLF 5的基因敲除使不同ESCC细胞株间mTOR信号通路的5个成分减少(图1)。7C,补充图。9)。同样,在ErbB信号通路中,SREBF 1、TP 63和KLF 5的沉默导致7个基因的减少(图1)。7C,补充图。9)。此外,SREBF 1基因敲除SCC细胞后,磷酸化mTOR、磷p70S6K和磷MEK 1/2水平明显降低,证实SREBF 1对ErbB/mTOR信号通路的调控作用(图一)。7E)。这些结果表明SREBF 1/TP 63/KLF 5协同激活SCC细胞的ErbB/mTOR信号通路。7F).

图7:SREBF 1、TP 63和KLF 5协同转录激活ESCC细胞ERbB/mTOR信号通路。
figure7

a显著丰富了相应转录本的KEGG通路,这些转录本被分配到无处不在的高峰或bSREBF 1、TP 63和KLF 5所占据的274个ESCC特异性峰。在括号中显示了每个途径中丰富的基因数量/基因总数。c左面板显示ERbB/mTOR通路富集的基因,SREBF 1/TP 63/KLF 5基于芯片-Seq数据占据。黑人被占领了。右板:在三个细胞系中,SREBF 1、TP 63或KLF 5沉默后,所指示基因mRNA水平的折叠变化(击倒vs.扰码控制)。每组转染30 nM siRNA,48h后提取总RNA,用qRT-PCR法检测mRNA的表达。d不同细胞株WNT9A基因位点指示因子的IGV谱片-Seq谱。eSREBF 1在ESCC细胞siRNA敲除后的Westernblotting分析。水垢的定量如下所示。fSREBF 1在SCC细胞中的调节和功能的模型图。

讨论

在这项工作中,我们重点研究了最成熟的SCC癌基因TP 63,我们在三种不同类型的SCC患者标本上进行了GSEA,并无偏倚地确定脂肪酸代谢是由这个主TF调控的关键途径之一。1B)。这种强富集作用不仅通过体外微扰试验得到验证(图1)。1E),但在泛癌分析中也具有高度的SCC特异性(如图所示)。1C)。在分子水平上,序列基序富集分析发现SREBF 1是SCC中连接TP 63和脂肪酸代谢的关键介质。1g).

SREBF 1作为脂类和脂肪酸代谢的主调节因子,其活性受到精确而复杂的调节。除了甾醇的反馈调节外,SREBF 1还被PI3K/AKT/mTOR信号级联稳定和激活。具体来说,AKT通过下调fbxw 7(e3泛素连接酶)来稳定SREBF 1的核形式,而fbxw 7是介导srbf 1 N端降解的一种连接酶。56,57,58。另外,mTORC 1调节磷脂酸磷酸酶LIPIN 1,以控制SREBF 1的核定位及其转录活性。59,60。综上所述,以往关于SREBF 1调控的研究主要集中在SREBF 1的蛋白水平或翻译后水平,而SREBF 1的表观调控还没有得到广泛的研究。在这里,我们首先注意到一个显著的(高排名)超级增强子区域SREBF 1在SCC细胞(图)。2A,b)。4C和芯片-Seq进一步证实TP 63和KLF 5通过结合其启动子和超增强子在SCC中调控SREBF 1的转录。此外,CRISPRI和荧光素酶报告试验还鉴定了三个具有较强活性的增强子成分,可促进SREBF 1的转录。这些发现为SREBF 1的复杂调控机制增添了另一层。SREBF 1在SCC细胞中的表观激活确实导致其过度表达,这一点已被我们对SCC患者标本的IHC染色所证实。此外,我们还发现SREBF 1是SCC的独立预后指标,与以前报道的前列腺癌、乳腺癌和肝细胞癌的结果一致。11.

在功能上,我们的工作首先证实了SREBF 1在调节脂质和脂肪酸代谢中的典型作用。具体来说,基于LC-MS/MS的脂肪组学、RNA-Seq和SREBF 1芯片-Seq共同证实SREBF 1直接针对多种限制脂肪酸合成的限速酶。这一综合方法进一步揭示,SREBF 1除了脂肪酸代谢外,还通过调节这些过程中的关键酶来控制SCCs中SL和GPL的生物合成。值得注意的是,一些SREBF 1调节的脂质,如神经酰胺,已被证明在某些癌细胞中具有促进存活或抗凋亡的作用。61,62。重要的是,除了其在脂类代谢过程中的规范功能外,我们的研究还进一步建立了两种更有趣的SCC--SREBF 1、TP 63和KLF 5的协同作用:(I)SREBF 1、TP 63和KLF 5协同激活彼此的转录,形成反馈共调节回路;(Ii)SREBF 1、TP 63和KLF 5协同调控SCC细胞中数百个基因的转录,激活ERbB和mTOR信号级联等与肿瘤相关的信号通路。

CRISPRi实验初步发现SREBF 1/TP 63/KLF 5的反馈共调节环,表明SREBF 1超增强子的抑制使TP 63和KLF 5的表达减少(图5)。三维空间)。进一步的深入研究发现,在TP 63和KLF 5位点上都有多个SREBF 1结合峰。3F),荧光素酶报告试验证实了它们对这两种TFs的调节作用。SREBF 1与TP 63/KLF 5在mRNA水平上也有较强的相关性,而在核蛋白水平上的相关性较弱。考虑到SREBF 1蛋白的复杂激活和调控,这种弱的亚细胞蛋白相关性并不完全令人惊讶,SREBF 1蛋白涉及三个不同的亚细胞区:内质网、高尔基和细胞核。重要的是,这三种蛋白在SCC原发标本中均有过表达,并与SCC患者的生存不良有关。这些结果类似于在许多不同的细胞类型中发现的“核心转录调节回路(Crc)”范式。63,64,65,包括正常细胞和癌细胞。有趣的是,我们最近证明SOX 2/TP 63/KLF 5构成了ESCC细胞中的这种CRC机制。33。然而,在这里我们发现sox 2和sreb 1没有相互调节,这表明在同一种细胞类型中可能存在不同的crc模型,这已被越来越多的人所认识到。65,66.

本工作中发现的SREBF 1的另一个SCC特异性功能是它在SCC细胞中与~500个基因组位点的唯一结合。的确,基因组范围的占用率分析显示srEBF 1结合峰具有明显的细胞类型特异性(如图所示)。6A)。序列基序分析确定TP 63/KLF 5可能与SREBF 1结合在这500个ESCC特异性峰上,并用芯片-Seq数据进行了验证。RNA-Seq结果证实SREBF 1/TP 63/KLF 5对这些ESCC特异性峰相关基因的转录具有协同调节作用。更重要的是,与普遍存在的结合相比,这种细胞类型的特异性占位与不同的生物学功能有关.例如,被分配到无处不在的高峰的基因负责SREBF 1在脂质代谢中的典型作用,而分配给ESCC特异性峰的转录本则在许多与癌症相关的信号通路中富集,包括ErbB和mTOR通路。事实上,深入研究发现了SREBF 1/TP 63/KLF 5对这些信号通路的13个基因进行了三次占据(图5)。7C)。这些基因包括众所周知的促癌因子,如EGFR、WNT9A和MAP2K2。

总之,本研究确定了SREBF 1/TP 63/KLF 5在SCC细胞中的重要反馈共调节环。SREBF 1作为脂代谢的主要调节因子,控制着SCCs中脂肪酸、SL和GPL的生物合成。此外,SREBF 1通过与TP 63/KLF 5协同调节数百种非典型的SCC特异性功能。顺式-跨SCC表观基因组的调控元件,它聚集在激活促进癌症的途径上。SREBF 1的规范功能和非正则功能是其在SCC中重要生物学意义的基础。事实上,SREBF 1对于SCC的生存能力和迁移至关重要。这些结果为研究肿瘤转录异常提供了重要的机制,并发现SREBF 1是SCC潜在的治疗靶点和预后指标。


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