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突变型KRAS表位的生化和功能特征验证了该癌蛋白的免疫靶向性

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发表时间:2021-07-22 14:06作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

激活RAS错义突变是在人类癌症中观察到的最普遍的基因组改变之一,并且在三种最致命的肿瘤类型中驱动致癌。新的证据表明,突变型KRAS(MKRAS)可能是免疫靶点,但mKRAS表位的定义仍不明确。本文采用多组学方法对HLAⅠ类限制性mKRAS表位进行了表征.我们通过HLAⅠ类等位基因提供mKRAS表位处理和表达的蛋白质组学证据。选择的表位是免疫原性使mKRAS特异性的TCRαβ分离.TCR转移至原发性CD8+T细胞对mKRAS肿瘤细胞株的杀伤作用与其组织学来源无关,其裂解动力学与mKRAS肽-HLAⅠ类复合物丰度有关。MKRAS-TCR工程CD8的过继转移+在转移性肺癌的异种移植模型中,T细胞可导致肿瘤的根除。本研究验证了mKRAS肽作为真正的抗原表位,促进了针对这种癌蛋白的免疫治疗的发展。

导言

GTPases的RAS家族(KRAS,NRAS,HRAS)在大约20%的人类恶性肿瘤中发生突变。1,2。绝大多数RAS基因组改变是由于g12、g13或q61密码子位点出现错义突变,涉及ras蛋白gtp结合结构域,导致下游效应底物ERK和PI3-K的激活,导致细胞生长和存活失调。3。在以KRAS突变为主的癌症中,包括胰管腺癌(PDA)、肺腺癌(LAC)和结直肠癌(CRC),75%以上的氨基酸替换发生在G12密码子位置。4。G12氨基酸的高频率替换使得这个密码子位置成为理想的药物靶点;然而,除了最近才有临床应用前景的KRAS G12C之外,还没有成功开发出G12变异体的小分子抑制剂。5,6.

癌细胞内的体细胞基因突变可能被转化成多肽,在肿瘤细胞表面被加工和呈现。7,8。这些突变肽可作为外来表位或新抗原,可被宿主免疫系统的αβT细胞识别。新抗原特异性T细胞反应在免疫检查点阻断治疗成功的患者中得到了充分的记录,并被认为是抗肿瘤活性的关键介质。9。新抗原特异性T细胞可以从抗原暴露的癌症患者的外周血或肿瘤组织中分离出来。10肿瘤患者新抗原疫苗接种后外周血中的诱导和扩增11,并利用健康供体的幼稚T细胞受体(Tcr)在体外产生。12。这些观察已经引起了人们对新抗原靶向癌症疫苗和采用T细胞疗法的研究兴趣。

基于新抗原的治疗策略本质上是高度个性化的,因为肿瘤突变很少在患者之间共享。13,14。KRAS的高发病率和保守突变特征为开发具有广泛通用性的新抗原靶向治疗提供了一个独特的机会。突变型kras(Mkras)曾被认为是一种潜在的癌症疫苗靶点,临床研究已经证明了cd4的成功生成。+和CD8+αβT细胞对异基因或自体mKRAS肿瘤细胞的反应性反应15,16,17,18。最近,从mkras上皮癌患者的外周血中分离出mkras特异性T细胞,并对其特征进行了研究。19,20,并在接种HLA转基因小鼠中得到诱导。21。靶向mKRAS作为一种肿瘤新抗原的治疗潜力在一例病例报告中得到了强调,该报告显示了一例KRAS G12D转移性CRC患者在仅限于HLA-C*08:02的KRAS G12D特异性T细胞过继转移后的临床价值。22。然而,mKRAS作为一种免疫靶点还没有得到很好的研究,也缺乏关于肿瘤细胞处理和表达mKRAS衍生表位的证据来指导靶向免疫治疗的发展。

本研究旨在验证mKRAS作为免疫靶点的有效性。利用计算表位预测、生化分析和蛋白质组学分析,预测和鉴定了mKRAS G12肽对HLA-A*03:01、HLA-A*11:01和HLA-B*07:02的高亲和力和高稳定性mKRAS G12肽,并确定这些表位为相应HLAⅠ类配体的组成。选择多肽诱导健康供体mKRAS-反应性T细胞,既证实了mKRAS特异性TCRs的免疫原性,又能分离出针对G12V/HLA-A*03:01、G12V/HLA-A*11:01和G12R/HLA-B*07:02三个表位的mKRAS特异性TCRs。MKRAS特异性tcrαβ对在NFAT诱导的报告T细胞株或tcrαβ中的表达初生CD8+T细胞是肿瘤细胞表达mKRAS G12表位的敏感探针。TCR-重定向T细胞对不同组织结构的mKRAS肿瘤细胞系具有细胞毒作用,对野生型(WT)KRAS多肽无反应性,从而证实mKRAS G12V和G12R肽配体为真正的新抗原。最后,TCR重定向CD8的过继转移+人T细胞特异性表达于G12V/HLA-A*03:01或G12V/HLA-A*11:01可导致转移性肺癌小鼠移植瘤模型中肿瘤的根除和存活时间的延长。这些发现为进一步验证和加强mKRAS作为免疫靶点的提名提供了依据。

结果

MKRAS新表位的鉴定与鉴定

虽然预测肽-HLA(p-HLA)结合亲和力和稳定性是新抗原提名的重要标准。23,24,25,人类蛋白质组中只有一小部分是由HLA分子呈现的。26。因此,只有一小部分候选新抗原是肿瘤HLA配体的组成部分。27,而预测高亲和力/稳定性的p-HLA复合物并不代表细胞内的处理和表现。28。为了提高对真性mKRAS新表位的识别,我们采用了一种综合的多体方法,包括:(1)计算表位预测,(2)p-HLA结合/稳定性的生化评估,(3)抗原加工和呈递的蛋白质组学验证,以及(4)免疫原性的表征(附图)。1).

我们使用了新抗原预测工具--抗原。24目的:对WT-KRAS蛋白24个氨基酸序列中存在重复氨基酸替换(G12C、G12D、G12R、G12V)的候选HLA I类等位基因-限制性mKRAS G12表位进行综合鉴定。从这些24-聚体氨基酸序列中提取的表位被用来预测与HLA-A、HLA-B和HLA-C非聚合体(9-mer)和/或Decmer(10-mer)mKRAS多肽的结合(补充数据)。1,候选人<500 NM亲和力)。鉴于HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01和HLA-B*07:02表位在美国人群中的高患病率,选择了仅限于HLA-A*02:01、HLA-A*11:01和HLA-B*07:02的预测表位进行进一步研究。1A)。编码这些候选表位的肽是根据它们的KRAS蛋白氨基酸位置来指定的,然后是G12氨基酸的替换(如图所示)。1B)。候选表位的预测HLAⅠ类亲和性和p-HLA复杂稳定性列于补充表中。12.

图1:候选mKRAS表位的识别、表征和验证。
figure1

a热图显示候选WT和mKRAS表位,预测HLAⅠ类结合亲和力(RED)与抗原所确定的等位基因相符。GARGISH,美国人群HLA I类等位基因频率(蓝色)如Allele频率网数据库所报告,mKRAS G12变异频率(绿色)在胰腺癌(PDA)中有报道;n结直肠癌(CRC)=836;n和肺腺癌(LAC);n516)如ICGC数据门户中所报告的那样。b包含候选表位的KRAS 24-mer的图形描述,该表位受以下所示的等位基因限制a)。G12密码子以红色表示。表位由有色系鉴定,氨基酸位置和HLAⅠ类限制性等位基因也被指出。cMKRAS表位与HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01和HLA-B*07:02的肽亲和力测定。用荧光偏振竞争肽结合法检测P-HLA亲缘关系。30。高肽亲和力被归类为原木。10[IC]50]<3.7NM,用虚线表示。dMKRAS表位对HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*11:01和HLA-B*07:02表位的P-HLA复杂稳定性测定。用β2-微球蛋白解离的闪烁接近法测定P-HLA的稳定性。29。对每个HLAI类等位基因检测,β2-微球蛋白与MHC重链在缺乏肽的情况下作为阴性对照。显示的p-HLA亲和力和稳定性值代表两个独立测试的平均值.对于亲和力和稳定性分析,每个等位基因的验证T细胞表位被用作阳性对照(开圈),并列在补充表中。3。面板中的错误条(d)指定阳性对照的平均值±SD。具有较高结合亲和力或稳定性的mKRAS肽为红圈。eMS/MS检测HLAⅠ类限制性mKRAS表位简表位,经TMC-工程单等位基因细胞系(RED)处理和显示。TMC结构编码的经验证的病毒表位(NLV、ILR、IVT和TPR)被用作抗原表位处理和表达的阳性对照,并列于补充表中。3。源数据作为源数据档案。

我们实验评估了p-HLA结合亲和力和候选肽的复杂稳定性,因为这两种性质提高了T细胞表位识别的性能。29。此外,p-HLA复合物的稳定性与免疫原性呈正相关。12。为了评估P-HLA结合亲和力,我们采用竞争肽结合试验,利用FITC标记的参考肽和纯化的可溶性HLA I类分子定量测定非标记mKRAS肽候选分子的结合能力。肽亲和力被报道为未标记肽的浓度,导致50%的FITC标记参考肽结合抑制(补充图)。2和补充表1)30。为了评价p-HLA复合物的稳定性,进行了解离试验,将p-HLA复合物的稳定性表示为HLA重链中β-2-微球蛋白解离的半衰期(补充表)。2)29。两项试验均以经验证的HLAⅠ类限制性T细胞表位作为阳性对照(补充表)。3)。在竞争性测试中确定的亲和力结合值报告为log。10[IC]50(Nm)]和IC50(Nm),并根据补充表中详述的先前报告的比额表界定13。对于HLA-A*02:01表位,只有5-14V肽具有较强的Ⅰ类结合亲和力(Log)。10[IC]50]=3.469海里)(图1)。1C)。然而,所有的p-HLA-A*02:01 I类复合物的半衰期都很短(t1/2 < 1 h) compared to control peptides (t1/21.3-10.1 h,图1。1D)。对于HLA-A*03:01表位,多肽7-16R、8-16V和7-16V具有较强的结合亲和力(Log)。10[IC]50[≤3.589 NM](图1.1C),并形成与阳性对照组相当稳定的P-HLA复合物(t1/2>1h)。9-聚体(8-16C-V)和10-聚(7-16C-V)肽与HLA-A*11:01有很强的亲和力。10[IC]50[≤3.121 NM](图1.1C),与9-肽相比,10-肽形成了更稳定的p-HLA-A*11:01复合物。t1/26-12 h vs 0.9-9.2 h)(图1)。1D)。对于HLA-B*07:02表位,多肽10-19C,10-19D和10-19R与高亲和力结合(Log)。10[IC]50[≤3.460 NM](图1.1C),但只有10-19C和10-19R具有与阳性对照肽相当的p-HLA复合物稳定性。t1/2>1h)(图1。1D)。预测和实验测定的p-HLA亲缘关系的比较表明,HLA-A*03:01和HLA-A*11:01限制的8-16C-V和7-16C-V肽具有很强的相关性(R2>0.9)。然而,HLA-A*02:01限制的5-14C-V肽均无相关性。R2=0.1033)或受HLA-B*07:02限制的10-19C-V肽(R2=0.6945)(附图。3和补充表1)。预测和实验确定的p-HLA稳定性的相似分析(补充表)2)所研究的P-HLA复合物之间没有相关性。所有mKRAS/HLA-A*11:01复合物的实验稳定性均高于预期。总之,我们实验鉴定了8个mKRAS G12表位,限制在HLA-A*03:01(n3),HLA-A*11:01(n或HLA-B*07:02(n(2)表现出高亲和力,形成与阳性对照肽相当的高稳定性p-HLA复合物。

MKRAS抗原处理和表达的验证

为了验证抗原表位的处理和表达,我们对单个HLAⅠ类等位基因/串联微基因构建(TMC)表达细胞系的多肽进行了靶向质谱(MS)分析。构建hlaⅠ类阴性细胞株,表达含gfp标记的HLA I/β2-微球蛋白单链二聚体(HLA-SCD)结构和mCherry标记的TMC(补充图)。4A)。使用单等位基因系消除了由多个HLAⅠ类等位基因的共同表达引起的模糊性。31。TMC包括9个编码WT和mKRAS长25-聚肽(G12C、G12D、G12R、G12V)的小基因,以及受HLA-A*02:01(NLV)、HLA-A*03:01(ILR)、HLA-A*11:01(IVT)和HLA-B*07:02(TPR)限制的病毒表位作为阳性对照(附图)。4B和补充表3)。TMC-表达单等位基因的细胞系表现为报告和HLAⅠ类表达(补充图)。4C-E)进行HLAⅠ类免疫沉淀和肽洗脱。利用数据依赖捕获(Dda)和目标平行反应监测(Prm)技术,用四极轨道串联质谱(MS)确定肽序列同源性。32。合成的mKRAS肽作为“信标”,在自然加载到HLAⅠ类分子上的tmc编码肽上为零。洗脱肽和合成肽的MS/MS断裂图谱比较,确保了mKRAS表位AA序列的准确定位(图一)。1E和补充无花果57)。在HLA-A*03:01的背景下,以这种方式洗脱多肽7-16D、8-16V、7-16V和8-16R(补充图1)。58-16D、7-16D、8-16V、7-16V和8-16R肽在HLA-A*11:01背景下洗脱。6)。在这些多肽中,只有8-16V和7-16V与HLA-A*03:01和HLA-A*11:01形成P-HLA复合物,其稳定性与阳性对照组相当。最后,在HLA-B*07:02(补充图)的背景下,还对多肽10-19D和10-19R进行了鉴定。7)。为了进一步支持洗脱肽和合成肽的同源性,我们通过同位素点积(idotp,值>0.9)和点积(dotp,值>0.5)测定了前体离子的相似性。33。未观察到HLA-A*02:01显示的mKRAS G12肽,尽管检测到了已验证的NLV病毒表位(附图)。8)。此外,未检出含半胱氨酸的表位。游离半胱氨酸易发生翻译后修饰,在基于MS的HLA肽数据集中表达不足。34,35。对翻译后修饰的未来分析将进行,以解决mKRAS半胱氨酸肽的加工问题。重要的是,Wang等人在HLA-A*03:01中既没有观察到8-16C,也没有观察到7-16C。36表明这些肽不是HLAⅠ类肽体的一部分。总之,我们鉴定了11个被处理的mKRAS表位,这些表位仅限于HLA-A*03:01(n4),HLA-A*11:01(n或HLA-B*07:02(n=2)I类等位基因。1E).

MKRAS肽免疫原性及mKRAS特异性TCRs的分离

MKRAS多肽CD8的免疫原性评价+从健康供者分离的T细胞与自体单核细胞来源的成熟树突状细胞(MDC)共培养,其抗原表位为候选表位。经过两次刺激后,对培养物进行CD8检测。+干扰素-γELISPOT法检测T细胞反应。2A)。HLA-A*02:01对多肽5-14C-V无反应。+捐助者。HLA-A*03:01对7-16V肽的反应+ (n=1/4)和HLA-A*11:01+ (n=4/4)捐助者和对7-16C的答复(n=4/4)和7-16 D(n=1/4)在HLA-A*11:01中也有说明+捐助者。对肽10-19R的反应(n=2/5)在HLA-B*07:02中+还观察到捐助者。

图2:mKRAS新抗原免疫原性的评估及mKRAS特异性TCR序列的鉴定。
figure2

a健康供体纯化CD8体外扩增后IFN-γELISPOT检测结果+MKRAS肽脉冲自体MDC刺激T细胞。IFN-γELISPOT点形成细胞(证监会)值是从媒体控制的每一个对象。所提供的数据是由图形图例中所示符号表示的单个捐献者单个实验的汇总结果。红色符号表示有积极反应的捐献者。bP-HLA多计时器分析显示7-16V特异性HLA-A*03:01-限制性CD8+T细胞反应分离自供体D 429。cP-HLA多计时器分析显示7-16V特异性HLA-A*11:01-限制性CD8+T细胞反应从供体D 500中分离出来。dP-HLA多计时器分析显示10-19R特异性HLA-B*07:02-限制性CD8+从供体D 516分离T细胞反应。细胞用P-HLA多聚体和抗CD8抗体染色。供者CD8的P-HLA多聚体染色+以无肽(非特异性)刺激的T细胞作为染色对照。共计1×106在FSC/SSC/CD8上收集现场事件+细胞。以小组形式提出的数据(bd)是两个独立测试的代表。源数据作为源数据档案。

鉴于TCRs对p-HLA复合物的高度敏感性,我们试图分离针对7-16V和10-19R表位的TCRs,以鉴定其在肿瘤细胞中的表达,并验证这些表位为新抗原。分离含CD8细胞的TCRα/β对+T细胞对7-16V/HLA-A*03:01、7-16V/HLA-A*11:01和10-19R/HLA-B*07:02的反应用肽脉冲人工抗原提呈细胞(APC)扩增。抗原特异性经P-HLA多联抗原染色证实(见图)。2B-d),以及多人+流式细胞仪检测细胞纯度>99%。用新一代dna和rna序列测定tcrα/β序列。37。共鉴定出5个tcRα/β对,其中3个为TCRA3V(7-16V/HLA-A*03:01)、TCRA11V(7-16V/HLA-A*11:01)和TCRB7R(10-19R/HLA-B*07:02)(表)。1).

表1 mKRAS-TCRs简表。

我们最初用我们实验室指定的J开发的细胞报告系统来描述这些mKRAS-Tcrs的表达和功能。ASP 90记者细胞。JASP 90报告细胞来源于CD8。+/tcrαβNULL Jurkat E6.1细胞表达NFAT诱导的EGFP作为TCR信号转导的读取器。将mKRAS-TCRα/β链克隆到慢病毒载体中,并在J中表达。ASP 90记者细胞。采用自定义的P-HLA多标染色法检测TCRA3V、TCRA11V和TCRB7R的表达,并证实抗原特异性和HLA限制性(图一)。3A).

图3:mKRAS特异性TCRs的验证和功能表征。
figure3

a流式细胞术(FACS)直方图图显示J慢病毒工程后的p-HLA多倍体染色ASP 90TCRA3V、TCRA11V和TCRB7R结构(红色)与TCRαβ的报告细胞控件(黑色)。b JASP 90报告试验评估抗原识别。JASP 90将表达TCRA3V、TCRA11V或TCRB7R的报告细胞与HLA配型单等位基因K 562细胞共培养。TCR信号是通过EGFP在NFAT激活时的表达来指示的。Tcr亲和力测定为获得tcr工程J 50%nFAT激活所需的平均肽浓度。ASP 90记者细胞。比活度(%)=(%GFP)试验-GFP%)/(%GFP)马克斯-GFP%)x 100。给出了三种独立评价的代表性实验。源数据作为源数据档案。

进一步评估抗原特异性和测定TCR亲和力ASP 90报告细胞用HLAⅠ类配体单等位基因K 562细胞与WT或mKRAS合成肽共同培养。TCRA3V、TCRA11V和TCRB7R-表达JASP 90报告细胞对mKRAS同源表位有特异性反应,对WT、KRAS肽和非单等位基因K 562细胞无反应性。3B)。用滴定肽浓度,根据达到50%NFAT激活所需的平均浓度确定各TCR的功能亲和力。3B)。TCRA3V、TCRA11V和TCRB7R分别为1.64、0.15和3.38NM。此外,TCRA3V和TCRB7R细胞与其他mKRAS G 12表位无交叉反应,而TCRA11V细胞与肽7-16C有交叉反应,但亲和力低于同源肽。这些TCRs构成高亲和力探针,用于人肿瘤细胞自然加工和表达mKRAS表位的研究。

Mkras-特异性tcrs对人肿瘤细胞具有溶解活性

为探讨pHLA复合物在肿瘤细胞中的作用,采用tcrαβ工程技术对mkras tcrs的抗肿瘤活性进行了评价。初生CD8+T细胞为此,健康供者的原始CD8+用CRISPR/CaS 9和单导RNA(SgRNAs)对T细胞进行基因编辑,敲除内源性TCR、α和β表达(附图)。9A-c)消除TCRαβ错配,增强受体细胞表面表达38,39。用细胞表面CD3和TCRαβ染色法检测基因工程TCR的表达(附图)。9E)。肽脉冲人工血管内皮细胞对mKRAS-TCR T细胞的二次扩增导致抗原特异性CD8的富集+T细胞(附图)9F)、高表达TCRA3V、TCRA11V或TCRB7R的群体。4A)。在4小时内51释放试验、TCRA3V、TCRA11V和TCRB7R-表达CD8+T细胞杀伤HLAⅠ类细胞与外源同源mKRAS肽刺激的K 562细胞相匹配,而不是WT KRAS肽(图1)。4B)。此外,经TCRA3V、TCRA11V和TCRB7R-表达的CD8对mKRAS抗原的识别+以TMC-表达的K 562细胞为靶点,对T细胞进行了鉴定。4B)。利用一株WT KRAS表达细胞株证明了对已加工和呈现的WT KRAS缺乏识别(图1)。4B,c)。总之,肽脉冲实验验证了抗原特异性,而TMC实验则为蛋白质组学结果提供了支持。1E),并验证了细胞表面mKRAS p-HLA复合物的表达.

图4:mKRAS TCRαβ基因转移使人肿瘤细胞具有HLA限制性裂解活性.
figure4

aFACS图显示p-HLA多定时器与TCRA3V-、TCRA11V-和TCRB7R-工程tcRαβ结合初生CD8+活细胞/CD3门控T细胞+人口。用以下的p-HLA多倍体作为染色对照:gp17-25/a3,gp17-25/a11,NY60-72/b7(补充表)。3). b4小时51释放细胞毒性试验显示TCRA3V、TCRA11V和TCRB 7细胞对TMC表达(红色)、mKRAS肽脉冲(蓝色)或WT KRAS肽脉冲(黑色)单等位基因K 562靶细胞具有杀伤活性。对于每个数据点,三叉数的百分比比解是显示的.数据以平均值±SD表示。p < 0.05 or p < 0.01 for all E:T ratios ≥0.3:1 comparing TMC-expressing or mKRAS peptide-pulsed to WT KRAS peptide-pulsed K562 targets, respectively; one-way ANOVA followed by post-hoc pair-wise Student’s t-多次比较调整试验。c, d。4小时51释放细胞毒性试验显示TCRA3V和TCRA11V对含有WT KRAS(BxPC-3)或内源性KRAS G12V突变的癌细胞株具有杀伤活性。每种颜色都表示图图例中标识的不同的细胞系。对HLA配型的BxPC-3细胞株和不匹配的BxPC-3细胞株均无明显的细胞毒性.数据以平均值±sd表示(n=3个生物独立样本)。p < 0.05 for all E:T ratio ≥1:1 comparing HLA matched vs non-matched cell lines harboring endogenous KRAS G12V mutation; one-way ANOVA followed by post-hoc pair-wise Student’s t-多次比较调整试验。源数据作为源数据档案。

为了评价TCRs对肿瘤细胞表面P-HLA复合物的识别作用,我们对不同组织来源的mKRAS G12癌细胞株中HLAⅠ类等位基因的表达进行了表征。已报道的KRAS WT(TPM 23)、G12V(TPM 56-308)和G12R(TPM 16-130)表达的细胞系以及表达HLA I类等位基因的细胞系被选中供进一步研究(补充表)。4)。除G12V/HLA-A*03:01外,未发现表达内源性G12V/HLA-A*11:01或G12R/HLA-B*07:02的细胞株。适用时,KRAS G12V+细胞株经修饰后可表达HLA-A*03:01或HLA-A*11:01和KRAS G12R。+改良系表达HLA-B*07:02。如图所示。4C,d,TCRA3V和TCRA11V-表达CD8+T细胞表现出对所有HLA-A*03:01或HLA-A*11:01-匹配的KRAS G12V的特异性细胞毒性,而不论其来源为何。+癌细胞株。值得注意的是,两种TCR均未赋予与HLA相匹配的BxPC-3肿瘤细胞(KRAS WT胰腺癌细胞系)的细胞毒活性,验证了每种TCR对同源G12V肽的特异性。这些观察结果在使用J时被复制和扩展。ASP 90记者电话系统。与mKRAS/HLA配型细胞系TCRA3V-、TCRA11V-和TCRB7R-J共培养ASP 90细胞表现出NFAT诱导的GFP表达,提示肿瘤细胞表面出现P-HLA复合物的TCR感觉(附图)。10A-c)。在J细胞中未见NFAT诱导的GFP表达。ASP 90用HLA相匹配的KRAS-WT表达的BxPC-3细胞培养的报告细胞。J中NFAT激活的梯度模式ASP 90报告细胞可能提示p-HLA复合物的不同表面表达和/或肿瘤细胞不同的协受体表达模式。总之,这些结果有力地支持了mKRAS表位是由肿瘤细胞在HLA-A*03:01、HLA-A*11:01和HLA-B*07:02背景下进行处理和呈现的假设,其水平足以激活mKRAS-TCR-工程T细胞的识别。

人肿瘤细胞mKRAS肽的定量与识别

为了进一步了解8-16 V和7-16 V肽在癌细胞表面的加工和表达,我们进行了靶向MS和绝对肽定量,以计数corl 23肺癌细胞表面的p-HLA复合物,其目的是表达HLA-A*03:01(CORL 23-A3)或HLA-A*11:01(CORL 23-A11)。40。CORL 23被选择用于进一步的研究,因为它有能力重新描述转移性肺癌的模型(见下文)。41。在HLA-A*03:01的背景下,我们检测到8种8~16 V的配合物和27种7~16V的复合物,而在HLA-A*11:01背景下,每细胞8~16 V的复合物有43种,每细胞7~16 V的复合物有78种(如图1所示)。5A和补充图。11)。这一结果证实了用tmc工程HLAⅠ类单等位基因细胞系(补充图)获得的处理和呈现数据。56),并建议KRAS G12V+肿瘤在HLA-A*03:01和HLA-A*11:01中同时存在9-聚体(8-16V)和10-聚体(7-16V)表位.虽然这些细胞是通过基因工程来表达限制性HLAⅠ类等位基因,但HLA-A*03:01和HLA-A*11:01细胞表面水平与其他非工程HLA-A*03:01的表达水平相当。+和HLA-A*11:01+MKRAS肿瘤细胞株(附图)12A,b)。重要的是,枚举的p-HLA复合物在报告的范围内,其他mkras/hla复合物由非工程癌细胞株表达。36.

图5:人肿瘤细胞系KRAS G12V肽配体的定量和识别。
figure5

aCOL23-A3和CORL23-A11细胞表面表达8-16V/HLA和7-16V/HLA复合物的绝对定量。数据是两个独立实验的代表。b细胞阻抗测定TCRA3V裂解识别CORL23-A3vsTCRCtrl(TCRA11V)的肿瘤细胞死亡动力学。E:T比值为10:1、3:1和1:1的标准化细胞指数随时间的变化与单独培养的肿瘤细胞相比较。显示了暴露在Triton-X中以表示最大阻抗损失的电池的数据。数据以平均值±SD表示。p < 0.001 at 150 h for all E:T ratios for the TCRA3V group compared to media; one-way ANOVA followed by post-hoc pair-wise Student’s t-多次比较调整试验。数据是两个独立实验的代表。cTCRA11V溶解识别CORL23-A11与TCR Ctrl(TCRA3V)后的细胞阻抗数据。数据以平均值±SD表示。p < 0.0001 at 150 h for all E:T ratios for the TCRA11V group compared to media; one-way ANOVA followed by post-hoc pair-wise Student’s t-多次比较调整试验。数据是两个独立实验的代表。dCOL23-A3和CORL23-A11细胞在TCRA3V和TCRA11V识别上达到50%细胞死亡时间(KT 50)的比较动力学,E:t比分别为10:1、3:1和1:1。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; multiple t-测试分析。数据是两个独立实验的代表。e4小时51释放细胞毒性试验显示TCRA3V对NCI-H 441细胞(G12V)具有杀伤作用+/HLA-A*03:01+)与TCRCtrl(TCRA11V)细胞比较。数据以平均值±SD表示。p < 0.01 for all E:T ratio ≥ 1:1; one-tailed Student’s t-测试。数据是两个独立实验的代表。fTCRA3V裂解识别NCI-H441 vs TCR Ctrl(TCRA11V)后的细胞阻抗数据。数据以平均值±SD表示。p < 0.0001 at 130 h for all E:T ratios for the TCRA3V group compared to media; one-way ANOVA followed by post-hoc pair-wise Student’s t-多次比较调整试验。数据是两个独立实验的代表。源数据作为源数据档案。

TCRA3V-和TCRA11V工程CD8的细胞毒活性+然后用活细胞成像和细胞阻抗对抗CORL 23肿瘤细胞的T细胞进行了鉴定。这些对细胞死亡的补充测量可以显示GFP标记的肿瘤细胞的丢失和AnnexinV-CF594染料的积累(补充图)。13和补充电影1),以及在6天内细胞收缩和碎裂的测量。TCRA3V细胞在10:1E:T比下促进CORL 23-A3肿瘤细胞的快速凋亡,在较低的E:T比(3:1和1:1)时杀伤动力学较慢。5B)。TCRA11V细胞在不同的E:T比下,均能促进CORL23-A11细胞的快速死亡。5C)。TCRA11V细胞达到50%细胞溶解的动力学(KT 50)明显快于TCRA3V细胞在所有E:T比下的动力学(图1)。5D),这一发现与TCRA11V的更高亲和力相一致。3B在HLA-A*11:01背景下检测到的7-16V复合物在CORL 23-A11细胞表面有较高的表达量。

我们接下来评估了mKRAS TCRs在非工程细胞系中识别P-HLA复合物的敏感性。我们鉴定lc细胞株nci-h441均为kras g12v。+和HLA-A*03:01+(补充表)4),强调它是TCRA3V的潜在目标。我们证实该细胞系保持HLAⅠ类表达,并表达低水平的HLA-A*03:01(附图)。12A)。在4小时内51TCRA3V细胞对亲本(非工程)NCI-H 441细胞表现出特异性杀伤作用,TCRA11V细胞识别相同的7-16V表位,但受HLA-A*11:01的限制,对NCI-H441细胞无杀伤活性。5E,f)。我们共同认为,TCRA3V和TCRA11V可以“感知”每个细胞的低数量p-HLA复合物,是免疫靶向mKRAS的有价值的试剂。

MKRAS特异性TCR+CD8+T细胞体内抗肿瘤活性的研究

将表达点击甲虫红(CBR)荧光素酶基因工程的CORL 23-A3和CORL 23-A11肿瘤细胞注入NOD/SCID/γcnull小鼠尾静脉注射,经生物发光成像证实为肺肿瘤的建立。肿瘤接种后4天,用TCRA3V或TCRA11V工程CD8处理小鼠。+T细胞作为对照组,荷瘤小鼠要么不接受治疗,要么接受tcrαβ治疗。(TCR KO)CD8+T细胞TCRA3V或TCRA11V工程CD8处理小鼠+T完全根除了CORL23-A3(图3)。6A,c)或CORL23-A11(图1)。6B,d)肿瘤,相对于对照组(p < 0.01). The treatment effect was long-lasting with no evidence of tumor outgrowth by day 39 in mice treated with mKRAS-TCR therapy, while control mice experienced persistent tumor growth. Consequently, mice treated with mKRAS-TCR therapy experienced prolonged survival relative to control groups (p < 0.0002, Fig. 6E,f)。这些结果表明,高亲和力的mKRAS TCRs介导的T细胞转移促进了肿瘤的排斥反应,延长了肿瘤的存活时间。

图6:mKRAS-TCR T细胞过继转移导致体内根除KRAS G12V+转移性肺癌异种移植模型中的肿瘤细胞。
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采用尾静脉注射法将表达CBR荧光素酶的COL23-A3或CORL23-A11肿瘤移植到NSG小鼠体内。小鼠未予治疗(Mok)或tcrαβNULL(Tcrko)或mkras-tcr基因工程CD8治疗。+T细胞移植后4天。治疗前后用生物发光显像评估肿瘤负荷,并对治疗前后的总生存期进行监测。NSG荷瘤小鼠治疗前后的典型生物发光显像aTCRA3V T细胞和TCRA3V T细胞治疗CORL23-A3肺肿瘤b用TCRA11V细胞治疗肺肿瘤与对照组比较,有显着性差异(P<0.01)。总通量随时间的变化cCORL23-A3和dCORL23-A11荷瘤小鼠如(a)和(b)。彩色线条表示随时间推移的平均总通量值,各个数据点对应于处理组,如图图所示。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; one-way ANOVA followed by Tukey’s HSD post-test comparing Mock and TCRA3V or TCRA11V treated mice. No statistical difference was observed between Mock and TCR KO treated mice. Kaplan–Meier analysis of overall survival of eCORL23-A3和fCOL23-A11荷瘤小鼠。彩色线条对应于处理组,如图中所示。p测值;对数秩试验比较Mock和TCRA3V或TCRA11V处理的小鼠。Mock组与TCRKO组间差异无统计学意义(P>0.05)。有代表性实验的小鼠数量如下:CORL23-A3队列-模拟(n=6),TCR KO(n=6),TCRA3V(n=10)。CORL23-A11队列-Mock(n=6),TCR KO(n=6),TCRA11V(n=12)。源数据作为源数据档案。

讨论

抗原表位的发现是设计癌症疫苗、双特异性受体和tcr治疗等免疫疗法的重要步骤。MKRAS的普遍存在及其作为一种重复克隆驱动因子的作用使该癌蛋白成为理想的靶点。42,43,44。为了鉴定mKRAS表位,我们采取了一种综合的多组学方法(如生物信息学、生化、蛋白质组学和免疫学)来处理产生免疫原肽的复杂过程。通过对每一个候选肽进行一系列的试验,以询问抗原处理和呈递的关键性质,我们已经确定了一组具有策略性的,尽管是部分的mKRAS肽,它们代表候选表位。应用此方法,我们鉴定出3个表位(7-16V/HLA-A*03:01、7-16V/HLA-A*11:01和10-19R/HLA-B*07:02),这些表位满足强的P-HLA结合亲和力、高复杂稳定性和蛋白质验证的抗原处理和呈递标准。此外,我们还确定这些表位具有免疫原性,可用于鉴定mKRAS TCR序列,并以此作为敏感探针,验证人癌细胞株的表位表达。直接定量mKRAS p-HLA复合物在CORL 23细胞上的表达,突出了mKRAS TCRs识别低丰度p-HLA复合物的敏感性,以及在异种移植小鼠转移癌模型中消除mKRAS肿瘤细胞的敏感性。

在此描述的大多数mKRAS表位以前还没有作为HLA肽体的成分被报道。这些表位包括:HLA-A*03:01-8-16V,8-16R和7-16V,HLA-A*11:01-8-16D,8-16R,8-16V,7-16V,HLA-B*07:02-10-19D和10-19D。这些表位对限制HLAⅠ类等位基因具有很高的亲和力,并且具有较高的复杂稳定性,因为每种类型的pHLA复合物都有。t1/2>0.5h.根据我们的数据,Wang等人最近也报道了HLA-A*03:01背景下7-16D肽的处理和表达。36尽管表现出低的测量亲和力和复杂的稳定性。我们和其他人的研究36用表达mKRAS的细胞系未能鉴定出5-14个mKRAS肽作为HLA-A*02:01肽体的组成成分。此外,对5-14C-V肽结合的生化分析和HLA-A*02:01的稳定性分析表明,这些配体不能形成稳定的p-HLA复合物,只有5-14V肽在竞争性结合试验中表现出较高的HLAⅠ类亲和力。相比之下,Mishto等人。45报道了mKRAS线性(5-14V)和剪接(5-6/8-14V,在标准肽第7位缺失V)多肽作为体外蛋白酶体消化产物,并证明这些肽对HLA-A*02:01具有很高的亲和力。鉴于HLA-A*02:01在人群中的高流行率,需要进一步研究细胞株对5-14V mKRAS肽的加工与体外蛋白酶体消化试验的结果不一致。

为了研究mKRAS表位的免疫原性,免疫应答从健康供者那里“外包”,因为幼稚的tcr表位可以识别肿瘤新抗原。12。除了所描述的7-16 V和10-19R表位外,我们还鉴定了CD8。+HLA-A*11:01中T细胞对7-16C和7-16D的反应+捐助者。在这些表位中,只有7-16 D-和7-16 V特异性TCRs是从免疫转HLA-A*11:01小鼠中分离出来的。21。我们没有观察到HLA-A*02:01中针对5-14C-V的免疫反应。+尽管此前有研究报告HLA-A2-限制性5-14D和5-14V CD8+T细胞反应17,46。鉴于这些研究是在15年前报道的,很可能没有进行高分辨率HLA分型,有可能有反应的患者表达的HLA-A2亚等位基因(如HLA-A*02:03或HLA-A*02:06)可能与5-14V和5-14D肽的结合能力较高,相对于HLA-A*02:01。显然,与HLA-A*02:01限制的mKRAS表位有关的问题需要进一步研究。

针对7-16V/HLA-A*03:01(TCRA3V)、7-16V/HLA-A*11:01(TCRA11V)和10-19R/HLA-B*07:02(TCRB7R)的TCRS的可用性,使其作为敏感探针使用,证明这些p-HLA复合物存在于多种组织学癌细胞株的细胞表面。我们观察到nci-h 441可以被tcra 3v工程CD8识别。+考虑到KRAS G12V突变株自然表达HLA-A*03:01限制性等位基因,人T细胞值得注意。通过对CORL 23细胞上P-HLA复合物的定量研究,进一步揭示了在HLA-A*03:01和HLA-A*11:01背景下9-聚体和10-聚体肽的表达。由于TCRA3V和TCRA11V能识别相同的7-16V肽,我们推测CORL 23株在TCR亲和力和p-HLA丰度上的差异可能有助于体外杀伤的不同动力学。事实上,7-16V/A*11:01复合物(78个复合物/细胞)相对于7-16V/A*03:01(27个复合物/细胞)的高表达与相对于CORL23-A3肿瘤细胞更快地消除CORL23-A11有关。重要的是,TCRA3V或TCRA11V工程CD8的过继性T细胞转移+人类细胞在体内有效地消除了CORL 23肿瘤细胞,并证明对大多数治疗的小鼠有效。

总之,基于现代生物信息学、生化、基因组和免疫学分析工具箱的表位识别和验证策略最近被几个小组用于开发针对乘客突变的个性化黑色素瘤疫苗。11,47,48。在这里,我们使用了类似的策略来表征高流行HLA I类等位基因针对复发克隆驱动器mKRAS提出的表位。我们的发现提供了进一步的证据,强调这种致癌蛋白作为免疫治疗的临床目标。


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