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B细胞对三阴性乳腺癌免疫检查点的阻断作用

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发表时间:2021-07-21 09:37作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

三重阴性乳腺癌有一个令人沮丧的临床结果,因此,患者通常接受积极的,剧毒的治疗方案。应用免疫检查点阻断联合化疗对TNBC的临床试验显示了较小的预后价值,但对治疗有反应的患者比例较低,患者经常死于复发性疾病。在这里,我们表明,联合应用低剂量化疗(FEC)和肿瘤病毒治疗(oHSV-1)的免疫治疗平台可以增加免疫裸露肿瘤中肿瘤浸润的淋巴细胞,使60%的小鼠在接受免疫检查点阻断治疗后实现持久的肿瘤消退。FEC+oHSV-1处理小鼠的全肿瘤RNA序列显示B细胞受体信号通路的上调和B细胞在治疗开始前的耗竭,导致治疗效果的完全丧失和骨髓源性抑制细胞的扩张。此外,RNA测序数据显示,FEC+oHSV-1能抑制与髓系源性抑制细胞相关的基因,而骨髓源性抑制细胞是驱动免疫逃逸和介导治疗耐药性的关键细胞群。这些发现突出了肿瘤浸润B细胞作为抗肿瘤免疫的驱动因素的重要性,以及它们在骨髓源性抑制细胞调控中的潜在作用。

导言

三阴性乳腺癌(Tnbc)是一种侵袭性疾病,由于治疗选择有限,临床结果黯淡。1,2。免疫检查点阻断(CP),限制CD8的抑制途径+和CD4+肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)在多种癌症类型中表现出无与伦比的临床成功.阻断PD1:PDL 1抑制轴的抗体主要针对T细胞上的PD1和肿瘤细胞上的PDL 1。然而,只有~9%的晚期TNBC患者在肿瘤细胞上表达PDL 1。3。最近批准的治疗tnbc的方法有限(PARPI、atezolizumab和suituzumab-govtecan),仅使10-20%的患者受益。3。因此,需要对TNBC肿瘤的免疫前景有更深入的了解,才能开发出新的、有效的治疗方法,并勾勒出疾病的预后生物标志物。

许多临床试验目前正在进行中,使用CP作为独立的、辅助的或新的辅助治疗各种类型的肿瘤。4。然而,作为一种单一疗法对CP作出反应的患者比例很低,并且通常仅限于具有良好的突变环境和较高的细胞转化率的癌症,如黑色素瘤和非小细胞肺癌。相反,大多数乳腺病变建立了高度抑制性肿瘤微环境(Tme),高水平的髓细胞源性抑制细胞(MdSCs),这已被证明直接相关的疾病分期和整体肿瘤负担。5,6。此外,临床研究表明,乳腺肿瘤的免疫细胞浸润和活化程度是长期生存的关键指标,也是治疗效果的预测指标。7,8,9,10。使用能减少MDSCs、增加TILs和诱发强的免疫原性细胞死亡(ICD)的治疗方法可能会使免疫原性寒冷的乳腺肿瘤对CP有更好的反应。

第三阶段临床试验显示,化疗能提高转移性TNBC患者CP的抗肿瘤活性。3。然而,这种化疗和免疫治疗的结合只会给整体生存带来有限的好处。3。这些结果进一步强调需要额外的战略来治疗TNBC和调解固有的抗药性机制。为此,对CD8以上的TNBC患者的免疫环境进行了更全面的分析。+TIL是必要的。

肿瘤病毒(oncolyticvirus,OVS)作为一种具有广泛临床应用和安全毒性的有趣的治疗方法已经兴起,因为它们比正常健康细胞更倾向于以癌细胞为靶点。我们开发了针对多种肿瘤类型的疱疹病毒OVS。11,12,13,14并确定了OV介导的ICD与抗肿瘤免疫的相关性。14,15,16,17,18,19。此外,肿瘤性HSV-1s,如oHSV-1 dICP 014,协同小剂量化疗以克服免疫耐受。14,16,17,18。我们早期的研究使用米托蒽醌,一种特性良好的免疫原剂。18,20,21,22。然而,米托蒽醌通常不用于乳腺癌治疗,降低了我们发现的翻译价值。使用常规用于TNBC患者的化疗鸡尾酒可以方便地翻译和分析当前的临床应用。

除了需要改进TNBC患者的治疗方法外,同时还需要更好地理解基础生物学,使一些患者能够对治疗作出反应,而他们的表型相同的患者却没有反应。在此,我们重点研究了临床相关疗法的发展,这些疗法可用于诱导肿瘤对CP反应所需的炎症微环境。我们利用我们的治疗平台作为一种机制来研究和更好地理解介导治疗反应的复杂的生物学过程,以及TME内关键免疫细胞群体之间的相互作用。这种方法有助于将研究结果转化到临床,以改善实体肿瘤的免疫治疗反应。

结果

FEC+oHSV-1对TNBC荷瘤小鼠存活的影响

虽然化疗通常是在剂量密集的细胞毒性方案下进行的,但许多研究已经通过低剂量干预来描述各种化疗药物的免疫刺激特性。23,24,25,26。根据目前的临床实践,乳腺癌患者最常用的两种化疗鸡尾酒是FEC(5-氟尿嘧啶、表阿霉素和环磷酰胺)和AC(阿霉素和环磷酰胺)。27。为了将这些方案从临床转化为小鼠模型,我们进行了优化研究,以找出剂量水平和时间表,这些剂量和时间表对小鼠宿主没有急性细胞毒性,这是通过密切监测体重和评分来确定的(补充图1)。为了模拟临床剂量,药物之间的个别比例与临床上常用的处方相同。每种方案的治疗潜力与oHSV--1联合评价(图1)。1A)采用E 0771 TNBC同基因小鼠模型。临床FEC方案(FEC+oHSV-1)中加入oHSV-1对部分小鼠肿瘤生长无明显影响(图一)。1B)和显着延长存活率,与10%的小鼠导致持久的肿瘤退行性变(图一)。1C)。由于表阿霉素和阿霉素是化学类似物,这两种方案的主要区别在于在FEC方案中加入5-氟尿嘧啶。事实上,单用5-氟尿嘧啶就能促进抗肿瘤免疫反应。28.

图1:FEC+oHSV-1延缓肿瘤生长,降低肿瘤动力学,导致10%小鼠肿瘤消退。
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a用生理盐水、化疗(FEC或AC)、肿瘤病毒(oHSV-1dICP 0)或化疗+肿瘤病毒治疗C57/BL6荷瘤小鼠。*使用BioRender.com创建。b从治疗开始到小鼠到达终点,每2~3天测量一次肿瘤体积。每一行表示组内的单个鼠标。c各组Kaplan-Meier生存曲线。*采用Mantel-Cox检验进行统计分析。

FEC+oHSV-1使肿瘤对检查点阻断治疗敏感

虽然tnbc肿瘤以前被认为是免疫寒冷的,但最近的临床研究表明它们确实表达各种免疫原标记物,如pd-l1。29。然而,这些标记物的表达很低,并不是在整个肿瘤中扩散,而是聚集在仅局限于一小部分癌细胞的焦点区域。30。此外,临床试验还报告了联合治疗方式(如免疫治疗和化疗)的有效性和必要性,因为tnbc患者对cp本身的反应往往很低,寿命较短。31。根据我们的初步研究,我们推测FEC+oHSV-1通过将免疫冷肿瘤转化为免疫原性肿瘤,能够使肿瘤对CP敏感。以细胞毒性T淋巴细胞抗原4和程序性死亡配体-1(分别与抗CTLA 4和抗Pd-L1抗体为靶标)为靶点,加入双CP进行生存研究。无论是单用CP,还是联合FEC或oHSV-1,FEC+oHSV-1+CP均能显著提高小鼠的疗效,60%的小鼠达到持久的肿瘤消退(图一)。2A-C)。此外,当再次受到攻击时,显示肿瘤持续消退的小鼠拒绝了亲代肿瘤细胞(E 0771),这表明应答小鼠产生了对肿瘤的免疫记忆(图一)。二维空间)。有趣的是,当单用CP(抗CTLA4单抗或抗PD-L1单抗)尝试这种三联疗法时,没有发现任何治疗效果(补充图2),表明同时靶向这两种途径有助于克服这种侵袭性肿瘤模型中的抵抗机制。

图2:60%的小鼠FEC+oHSV-1+CP降低肿瘤动力学,导致肿瘤持续消退。
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a用生理盐水、抗CTLA 4和抗PD-L1、FEC+CP、oHSV-1+CP、FEC+oHSV-1或FEC+oHSV-1+CP治疗荷E 0771肿瘤的C57/BL6小鼠。*使用BioRender.com创建。b从治疗开始到小鼠到达终点,每2~3天测量一次肿瘤体积。每一行表示组内的单个鼠标。c各组Kaplan-Meier生存曲线。d用FEC+oHSV-1+CP治疗实现肿瘤持续消退的小鼠后,在第63天用E 0771细胞再次攻击。以年龄相近的天真小鼠作为肿瘤种植和生长的对照。*采用Mantel-Cox检验进行统计分析。

为了确定治疗效果所必需的途径,对用生理盐水或FEC+oHSV-1+CP治疗小鼠的肿瘤裂解物进行了细胞因子分析。3;补充图3所示的完整数据集)。FEC+oHSV-1+CP处理小鼠后,与髓系细胞分化、趋化、巨噬细胞活化及炎症途径有关的细胞因子表达水平明显改变。

图3:细胞因子分析显示,FEC+oHSV-1+CP治疗可显著改变多种细胞因子的表达。
figure3

用生理盐水或FEC+oHSV-1+CP治疗荷E 0771肿瘤的C57/BL6小鼠。第10天处死小鼠,冷冻肿瘤。制备肿瘤裂解液,进行细胞因子表达分析。所有数值报告为浓度(PG/mL)。双尾配对t进行统计学分析。误差条代表标准差。

免疫原疗法诱导TILs形成免疫裸露肿瘤

为探讨未治疗和治疗的E 0771肿瘤的免疫前景,我们进行了组织学评估。第7天和第10天分别用生理盐水、FEC、oHSV-1、FEC+oHSV-1或FEC+oHSV-1+CP(第7天,图7)摘除肿瘤。4A第10天,补充图4)。用苏木精和伊红(H&E)(补充图5A)染色,对第7天采集的整个肿瘤切片进行分析,结果表明,生理盐水和FEC处理后的小鼠肿瘤体积大,肿瘤密集,细胞分裂活跃。相反,用oHSV-1、FEC+oHSV-1和FEC+oHSV-1+CP处理的小鼠细胞结构萎缩,坏死面积大,这可能是由于肿瘤内直接注射病毒引起的。当这些组在第10天再次进行分析时(补充图5B),很明显,生理盐水和FEC处理的小鼠继续向肿瘤终点前进,肿瘤血管化程度很高,大量新生微血管的出现和浸润性血管的出现显示了这一点。接受HSV-1治疗的小鼠中心仍有坏死区域,但剩余的肿瘤组织已开始向肿瘤终点发展,大型肿瘤中充满了可存活的细胞。有趣的是,FEC+oHSV-1治疗的肿瘤在小鼠体内有两个不同的群体,80%的肿瘤向未治疗的表型转移,增殖和密度增加,外观类似于生理盐水和FEC治疗的肿瘤。其余20%的肿瘤坏死面积增加,肿瘤整体体积缩小。从存活结果来看,用FEC+oHSV-1+CP治疗的小鼠肿瘤坏死增加,肿瘤体积很小(补充图5C)。

图4:免疫组织化学分析表明,oHSV-1、FEC+oHSV--1和FEC+oHSV-1+CP处理可诱导TIL.

用生理盐水、FEC、oHSV-1、FEC+oHSV-1或FEC+oHSV-1+CP治疗荷E 0771肿瘤的C57/BL6小鼠,第7天取肿瘤。n=每组5人)。肿瘤切片,H&E染色进行病理分析。切片进一步用CD3、CD4、CD8α和FOXP 3抗体染色。a代表第7天采集的肿瘤图像。每幅图像显示单个肿瘤的整个部分。b用Halo定量软件对整个肿瘤切片进行扫描和定量。每个符号表示该组中的单个鼠标。双尾配对t进行统计学分析。误差条代表标准差。

肿瘤进一步用CD3、CD4和CD8α抗体染色,以评估治疗组免疫细胞浸润的水平(图一)。4A)。正如预期的那样,生理盐水和FEC处理的小鼠出现免疫裸露肿瘤,几乎没有免疫细胞出现在肿瘤体积或周围结缔组织。用oHSV-1、FEC+oHSV-1或FEC+oHSV-1+CP治疗的肿瘤组织中T细胞浸润增加。这些污迹的量化(图。4B与生理盐水处理的肿瘤相比,oHSV-1、FEC+oHSV-1或FEC+oHSV-1+CP处理的肿瘤具有明显的免疫细胞聚集性。临床研究显示CD8的比率。+T细胞到FOXP 3+调节性T细胞是TNBC患者预后的重要指标32,33。因此,所有的肿瘤切片CD8α染色共染色FOXP 3的表达,并评估两者之间的比例在单个小鼠(图一)。4B)。结果表明,ohsv-1、fec+ohsv-1或fec+ohsv-1+cp处理小鼠CD8α比值有统计学意义。+/FOXP 3+在第7天浸润,但只有联合治疗(FEC+oHSV-1和FEC+oHSV-1+CP)才能持续到第10天。这一观察表明,虽然肿瘤病毒疗法能够改善肿瘤的微环境,但可能需要额外的治疗干预才能对免疫治疗作出持久的反应。

FEC+oHSV-1诱导B细胞信号在肿瘤RNA全序列分析中的应用

免疫组织化学(IHC)清楚地表明,用oHSV-1治疗可使T细胞最初流入TME。然而,IHC无法确定这些T细胞的功能和激活状态,更确切地说,它们是否能够促进抗肿瘤免疫反应。OHSV-1作为单一疗法的疗效(如图所示)。1C)表明它不足以限制肿瘤的进展。为了开始了解FEC的加入如何改变对oHSV-1治疗的疗效,我们进行了RNA测序分析。用生理盐水、FEC、oHSV-1或FEC+oHSV-1治疗肿瘤,第5天收获。主成分分析(PCA)显示,生理盐水组和FEC组间肿瘤聚集紧密,但oHSV-1和FEC+oHSV-1均呈现明显的聚类模式(图1)。5A)。有趣的是,在FEC+oHSV-1组中,我们看到两组小鼠,一组与生理盐水和FEC处理的小鼠有相似的表达谱(被认为是对治疗没有反应),另一组明显聚集(被认为是治疗的应答者),这与先前的数据一致,即FEC+oHSV-1治疗会导致二重反应。

图5:FEC+oHSV-1诱导与免疫过程和途径相关的RNA转录显著上调,更确切地说是B细胞受体信号通路。
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a三维聚类图显示生理盐水组小鼠RNA表达的相关性;n=5),FEC(粉红色;n=10),oHSV-1(teal;n=5)和FEC+oHSV--1(紫色;n=10)。bBAR图显示了FEC+oHSV--1处理的小鼠与单纯生理盐水处理的小鼠进行路径富集分析的结果。c显示所有样本基因标准化表达值的热图。d热图显示与B细胞受体通路相关的基因的规范化表达值。eTNBC患者RFS的Kaplan-Meier生存图(n=220)基于表中前29位可用基因平均mRNA表达水平的微阵列数据沙一. f所有乳腺癌患者RFS的Kaplan-Meier生存图(n=2032)根据表中前29位有效基因的平均mRNA表达水平沙一。*BCR B-细胞受体。

路径富集分析发现许多免疫途径和过程被FEC+oHSV-1治疗上调(与生理盐水相比,图1)。5B)。差异表达基因库的评价5C)显示,FEC处理的小鼠基因组图谱与单纯生理盐水处理的小鼠相似。然而,无论是oHSV-1还是FEC+oHSV-1,都表现出明显不同的基因特征,其中oHSV-1和FEC+oHSV-1均上调了许多与B细胞谱系相关的基因(如图所示)。5D,补充数据1),包括IFitm 1, IL1b, CD24a, CXCL 12, Fgf 7,和NRG 1。这一分析中包含前29位上调基因的特征在一大组可公开获得的乳腺癌患者数据集中进行了调查,以了解预后相关性。34。平均表达在最高层的乳腺癌患者的TNBC无复发生存率(RFS)显著提高[HR=0.47(0.26~0.86);logrank“。p价值=0.015](图1。5E),而所有患者的平均表达高于中位数也与RFS的改善相关[HR=0.58(0.50-0.68);logrank“。p值<0.01]。5F).

B细胞的耗竭导致治疗效果的丧失

虽然B细胞在体内扮演着许多不同的角色,但它们的主要功能是抗体的产生。为了追踪RNA序列分析的结果,并确定B细胞是否对我们的联合治疗的疗效起关键作用,我们进行了B细胞缺失研究。E 0771皮下肿瘤生长在C57/BL6小鼠中,循环B细胞用一种抗CD 20抗体被耗尽(见图)。6A).35对整体存活的分析表明,B细胞的缺失降低了荷瘤小鼠的治疗效果(图一)。6B,c,补充图6)。流式细胞术证实。6d)以同工型抗体为对照。用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠抗体产生水平。第15天取单纯小鼠、荷瘤小鼠和治疗性治疗小鼠血清,用E 0771细胞蛋白裂解物包衣。酶联免疫吸附试验结果表明,FEC对抗体水平没有影响。而OHSV-1、CP、FEC+oHSV-1和FEC+oHSV-1+CP治疗后,抗体生成水平均有统计学意义,但在无循环B细胞的情况下,抗体生成水平明显降低(图一)。6E)。由于单用OHSV-1或CP并不能提供任何治疗效果,这些数据表明,抗体的产生虽然受到我们的治疗的影响,但并不是B细胞与我们的治疗效果有关的最重要的功能。

图6:B细胞的耗竭导致用FEC+oHSV-1治疗的小鼠失去疗效。
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aC57/BL6荷瘤小鼠用抗CD 20抗体或同型抗体治疗,然后用生理盐水、FEC、oHSV-1、CP、FEC+oHSV-1或FEC+oHSV-1+CP治疗。*使用BioRender.com创建。b从治疗开始到小鼠到达终点,每2~3天测量一次肿瘤体积。每一行代表组内的单个老鼠。c联合治疗的Kaplan-Meier生存曲线,有耗竭型抗体和同型抗体。d流式细胞仪证实单剂量的抗CD 20抗体足以在24小时内耗尽B细胞。e棒状图显示了从天真的小鼠,荷瘤小鼠和治疗治疗的小鼠的IgG产生水平。*使用Mantel-Cox检验进行统计分析c,双尾配对t测试用于统计分析d,两尾未配对t测试用于统计分析e。误差条代表标准差。

为了进一步评估B细胞在我们的治疗中所起的作用,我们给小鼠注射了抗CD 20抗体或同类型抗体,用生理盐水或fc+oHSV-1治疗,并于第7天切除肿瘤。IHC图像的定量显示,B细胞耗竭导致肿瘤浸润性T细胞减少,Ly6G水平升高。+髓系细胞(补充图7A)。免疫荧光(IF)染色,CD3、CD8、Pnad、Pax5、CD11b染色。多重图像分析进一步证实了ihc的定量数据,并表明fc+ohsv-1在同型抗体存在的情况下,小鼠存在未成熟的三级淋巴结构(pnad的存在就证明了这一点)。+高内皮静脉)(补充图7b)。相反,在抗CD 20抗体存在的情况下,用FEC+oHSV-1处理的小鼠没有Pnad存在,也没有有组织的淋巴聚集(补充图7C)。

B细胞是控制MDSCs及其治疗效果所必需的。

在FEC+oHSV-1治疗的小鼠中,循环B细胞的耗竭导致治疗效果完全丧失,免疫细胞组织被破坏。目前尚不清楚的是,FEC的加入如何机械地改变oHSV-1治疗的治疗结果,以及肿瘤浸润的B细胞(TIL-BS)正在调节哪些效应细胞功能。我们从RNA测序数据中对差异表达的基因库进行了更深入的评估,特别注意了oHSV-1和FEC+oHSV-1治疗之间的差异。在这个比较中,我们看到了许多与免疫抑制MDSCs有关的基因。有趣的是,其中一些基因(S100A8, CXCL 2, CXCL 1, Ly6G, 斯皮, Fpr2)在oHSV-1与生理盐水中上调,而在fec+oHSV-1 vs oHSV-1中表达下调(表)。1、图1.7A提示FEC+oHSV-1治疗不仅能上调B细胞受体信号通路,而且能调节MDSCs的成熟和迁移。文献中明确指出,一些化疗药物(特别是5-氟尿嘧啶)在动物模型和患者中都会直接消耗mdSCs。36,37,38。然而,在这样的研究中,化疗是以剂量密集的细胞毒性方案进行的.在我们的手中,化疗被用作一种低剂量的免疫刺激干预,并且没有单独的治疗效果,这表明如果不加入oHSV-1,它是无法抑制MDSCs的。

表1 MDSC基因在FEC+oHSV--1和oHSV--1处理中差异表达.
图7:缺乏循环的B细胞会导致粒细胞MDSCs的快速扩张。
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用抗CD 20单抗或同型单克隆抗体治疗C57/BL6荷瘤小鼠,然后用生理盐水、FEC、oHSV-1、CP、FEC+oHSV--1或FEC+oHSV-1+CP治疗。第6、10、15天采血,流式细胞仪分析。a热图显示选定的MDSC相关基因及其在所有oHSV-1和FEC+oHSV-1中的表达。b显示B细胞门控策略的典型流程图(CD 19)+B 220+细胞)在小鼠中的同型MAb(左)和抗CD 20单克隆抗体(右)。c显示MDSCs选通策略的代表性流程图(Ly6G)Ly6CINT细胞)在小鼠中的同型MAb(左)和抗CD 20单克隆抗体(右)。d条形图显示B细胞在所有时间点循环的频率。e条形图显示MDSCs在所有时间点循环的频率。fTNBC患者操作系统Kaplan-Meier生存图(n=144)根据表中所有可用基因组成的签名的平均表达水平1。高表达或低表达定义为中位表达以上或以下。罗格朗克p显示值和危险度(95%置信区间)。g乳腺癌患者的Kaplan-Meier生存图(n=943)基于表中所有可用基因组成的签名的平均表达水平1。高表达或低表达定义为中位表达以上或以下。罗格朗克p显示值和危险度(95%置信区间)。*双尾未配对t进行统计学分析。误差条代表标准差。

为了进一步研究这些不同细胞类型之间的关系,我们进行了免疫分析研究。在C57/BL6小鼠体内生长E 0771肿瘤,用生理盐水、FEC、oHSV-1、CP、FEC+oHSV-1或FEC+oHSV-1+CP处理循环B细胞存在(同型单抗)和缺失(抗CD 20 mAb)。第6、10、15天采血,流式细胞仪分析外周血单个核细胞(PBMCs)。虽然这一分析证实了我们的抗CD 20单克隆抗体治疗的小鼠循环B细胞的减少(如图所示)。7b),它还揭示了MDSCs(Ly6G)数量的显著和一致的差异。Ly6CINT用同型抗体和抗CD 20抗体治疗小鼠之间的细胞(如图所示)。7C)。这些群体的频率分析表明,除用FEC+oHSV-1+CP治疗的小鼠外,各治疗组的循环B细胞均随时间的延长而减少。7D)。相反,用三联疗法治疗的小鼠在第15天就能看到循环中的B细胞重新出现。MDSCs在血液中的频率(如图1所示)。7E)证实粒细胞MDSC的数量迅速增加,用三联疗法治疗的B细胞耗竭小鼠的频率增加了一倍以上。血液中其他免疫细胞(CD4s、CD8s、单核细胞和DC)的水平与预期结果一致,在没有B细胞的情况下,它们的频率没有明显的紊乱(补充图8)。

进一步强调这些发现的临床影响,我们评估了fec+ohsv-1治疗下调mdc基因信号的预后意义(表)。1)在一组公开提供的临床微阵列数据中34。在TNBC受限患者数据中,这种特征的平均表达高于中位数与总体生存率(OS)相关[HR=2.08(1.05~4.10);LOGRAK“p价值=0.031](图1。7F),一般所有乳腺癌患者合并[HR=1.73(1.32-2.27);logrank“。p值<0.01]。7g)。提示FEC+oHSV-1对MDSC信号的衰减对预后有积极意义。

为了排除克隆效应,评估B细胞与MDSCs之间的相关性是否适用于多个TNBC肿瘤模型,我们还利用PY 230小鼠乳腺癌细胞系(补充图9)进行了免疫分析。在此,我们还发现,当FEC+oHSV-1+CP治疗小鼠,循环B细胞减少时,MDSCs在血液中有明显的扩张。这些数据表明,B细胞与MDSCs之间的相关性不是肿瘤克隆性的结果,而是在不同模型之间传递的结果。

B细胞是缓解肿瘤免疫抑制机制的必要条件

为了评估外周血中所见的变化是否一致并代表肿瘤发生的情况,对TILs进行了免疫分析。在C57/BL6小鼠体内生长E 0771肿瘤,用生理盐水、FEC、oHSV-1、CP、FEC+oHSV-1或FEC+oHSV-1+CP处理循环B细胞存在(同型单抗)和缺失(抗CD 20 mAb)。第10天处死小鼠,用流式细胞仪对TILs进行染色。FEC+oHSV-1或FEC+oHSV-1+CP治疗后,TIL-B水平升高(图1)。8A),尤其是记忆表型(CD 19)。+CD 27+)。有趣的是,小鼠循环中的B细胞是否被耗尽并不能显着地影响TIL-B的水平。然而,根据外周血的研究结果,循环B细胞的减少确实导致了MDSCs的快速扩张(图一)。8B,c)。无论小鼠是否接受了耗竭抗体治疗,三联疗法也能显著减少肿瘤中的免疫抑制群,如CD 244.2。+免疫调节受体PDL 1+免疫检查点和F4/80+肿瘤相关巨噬细胞。B细胞与髓系细胞的关系在两种脾细胞中均有进一步显示。8E,f)和肿瘤引流淋巴结(TDLNs)。8g-i)。肿瘤、脾脏和TDLN(CD4s、CD8s和DC)中其他免疫细胞的水平与预期结果一致,在没有B细胞的情况下,它们的频率没有明显的紊乱(补充图10)。

图8:用抗CD 20单抗或同型单克隆抗体治疗E 0771肿瘤C57/BL6小鼠,FEC+oHSV-1+CP可增加TIL-B,减少免疫抑制细胞数量,然后用生理盐水、FEC+oHSV-1或FEC+oHSV-1+CP治疗。
figure8

第10天处死小鼠,进行肿瘤处理,TIL染色,流式细胞仪分析。a显示B细胞频率的条形图(CD 19)+)和记忆B细胞(CD 19)+CD 27+)在肿瘤中。b显示MDSCs选通策略的代表性流程图(Ly6G)Ly6CINT)同型MAb(左)和抗CD 20 MAb(右)。cBAR图显示肿瘤中MDSCs的频率。d显示巨噬细胞频率的条形图(F4/80)+),CD 244.2+细胞和PDL 1+细胞。e显示单核细胞门控策略的代表性流程图(Ly6C))和脾细胞中的MDSCs。f显示B细胞频率的条形图(CD 19)+B 220+)脾细胞中的单核细胞和MDSCs。g有代表性的流程图显示了在TDLNs中MDSCs的选通策略。h条形图显示TDLNs中单核细胞和MDSCs的频率。i条形图显示B细胞和记忆B细胞在TDLN中的频率。*双尾未配对t进行统计学分析。误差条代表标准差。

FEC+oHSV-1应答者存在B细胞基因标记及对MDSCs的控制

与临床结果一致的是,用FEC+oHSV-1治疗的小鼠对治疗有双重反应,如存活结果所示(如图所示)。1),IHC量化(图1.4),以及基因表达谱。5)。为了进一步确定影响治疗结果的基因组特征,我们将这些小鼠分组为我们认为是治疗的应答者和非应答者,根据它们与生理盐水处理小鼠基因表达谱的相似性(图一)。9A)。对差异表达基因列表的评估表明,应答者上调了许多与B细胞受体信号通路相关的基因(如图所示)。9B),与以前的调查结果一致。除了这一点,也许更值得注意的是,响应者也下调了监管。Siglec 15,一种关键的免疫抑制因子,通常被上调到人癌细胞和肿瘤浸润的髓系细胞上。39.

图9:FEC+oHSV-1诱导了双重反应,应答者B细胞受体信号通路上调,与免疫抑制表型相关的基因下调。
figure9

a三维聚类图显示FEC+oHSV-1处理小鼠RNA表达的相关性(无应答者=粉红色;应答者=紫色)。b热图显示与B细胞受体信号通路相关的基因在所有FEC+oHSV--1样本中的归一化表达值。c比较应答者CD 19 mRNA的表达。n=23)相对于无反应者(n对HER 2(-)ER(-)乳腺癌患者进行FEC治疗[auc=0.657 mann-Whitney]p价值=0.054]。d比较应答者CD 19 mRNA的表达。n=84)对无反应者(n对所有乳腺癌患者进行fc治疗[auc=0.729,mann-Whitney]p值<0.001]。反应定义为完全的病理反应与治疗结束后的残留疾病。*BCR B细胞受体。

我们使用了一组公开可用的联合临床微阵列数据,其中包含了对各种疗法的应答率。40。虽然目前尚无大量数据可用于接受肿瘤性病毒治疗的乳腺癌患者,但对接受肿瘤病毒治疗的乳腺癌患者CD 19 mRNA表达的评估表明,在HER2(-)ER(-)受限患者组中,CD 19有可能成为完全病理反应的预测因子[aUC=0.657,rc]。p值=0.02,Mann-Whitneyp值=0.054],是联合治疗乳腺癌患者的病理反应的预测因子[aUC=0.729,rc]。p值<0.01,Mann-Whitneyp值<0.01]。

讨论

免疫检查点阻断已成为癌症治疗的前沿,临床成功率惊人,毒性状况也很低。然而,这种高效的治疗只适用于一小部分患者,我们还没有完全阐明让一些患者对治疗有反应的潜在生物学,而其他的则没有。Helmink和他的同事们雄辩地证明了B细胞在促进黑色素瘤和肾癌患者对免疫检查点阻滞的有效反应中起着重要的作用。41。根据这些发现,我们的数据表明,促进B细胞信号在肿瘤内可以成功地治疗联合免疫治疗平台。使用临床化疗鸡尾酒FEC,结合oHSV-1,我们能够诱导B细胞受体信号通路的上调,从而使我们原本没有反应的TNBC肿瘤对CP有反应。特别是,经三联疗法治疗的小鼠,随着时间的推移,循环B细胞数量增加,而肿瘤内的记忆B细胞数量增加,这表明B细胞的持续存在可能是实现持久反应和改善预后的必要条件。

用抗CD 20抗体耗尽小鼠循环B细胞的体内耗竭研究表明,如果不使用抗CD 20抗体的小鼠群本来能对治疗产生完全的反应,那么它们的治疗效果就会完全丧失。对这一现象的深入研究表明,B细胞的存在与免疫抑制性MDSCs的控制密切相关。这些数据表明,B细胞必须抑制TME中免疫抑制性髓系细胞的快速扩张。事实上,RNA测序数据表明,FEC+oHSV-1不仅能够上调与B细胞系相关的基因,而且还能下调已知在肿瘤免疫抑制中起关键作用的基因。当进一步观察具有最独特的rna谱的小鼠群体(被认为是治疗的应答者)时,我们发现在下调的mdc基因中Siglec 15,一种已知的免疫抑制因子,广泛表达于人癌细胞和浸润髓系细胞的肿瘤上。39。正如陈和他的同事所证明的,siglec 15在许多人类癌症中都有过表达,其表达与pd-l1是相互排斥的,这表明它可能是屈光于抗pd-1/pd-l1检查点阻断治疗的潜在的治疗靶点。42。有趣的是,我们的治疗下调了这一关键的免疫调节剂,提示了一种治疗平台,可用于靶向肿瘤免疫逃逸的这一途径。随着siglc 15的下调,免疫分析研究显示,我们的三联疗法显著降低了CD 244.2的水平,这是在多种免疫细胞上发现的一种免疫调节受体,包括精疲力竭的CD8。+T细胞和MDSCs43.

目前的免疫疗法并不是针对或考虑B细胞,尽管它们在TME中占主导地位,并且在适应性免疫反应中起着关键作用。在tnbc中,有证据表明ty-bs产生了一种强有力的体液反应来增强抗肿瘤免疫。44影响免疫治疗效果45。TIL-B与提高整体生存率相关。46,但文献中的发现表明,TIL-B既具有促肿瘤作用,又具有抗肿瘤作用,两者的作用相互矛盾。在几种癌症类型中,TIL-B被确认为恶性肿瘤的中介体,而TIL-B的缺失则产生了积极的结果。47。相反,在癌症患者中已记录到协同抗体和T细胞反应,而TIL-B与预后改善相关。41,45,48,49,50。此外,临床研究报告TIL-BS受TME和免疫治疗的影响,这一发现与我们的发现一致。事实上,我们的B细胞基因标记与TNBC患者以及所有乳腺癌亚型合并后的RFS改善相关,突出了这些发现对临床的影响。

MDSCs是一种异种的未成熟髓样细胞,聚集在荷瘤宿主的肿瘤床和淋巴器官(如脾脏)中。长期以来,MDSCs被认为是肿瘤免疫抑制,最常见的原因是它们抑制T细胞介导的免疫反应的能力。然而,研究也表明粒细胞型MDSCs可以抑制抗肿瘤B细胞反应,主要通过分泌一氧化氮(NO)、精氨酸酶(Arg)和白细胞介素1(IL1)。51,52,53。虽然目前还没有文献记载的研究可以观察到这一现象的反向调控,但我们的数据表明,虽然MDSCs可以通过分泌NO、Arg和IL1来抑制T1-Bs,但情况正好相反。我们已经证明,我们的治疗平台提高了B细胞受体信号通路,抑制了关键基因,如NOS 2, Arg 2,和IL1R1(表)1),我们认为这对管理和控制MDSCs至关重要。事实上,我们从RNA测序数据中发现的MDSC基因特征与临床数据有很强的相关性,这些基因的低表达与TNBC患者以及所有乳腺癌亚型合并后的OS改善有关。

我们采用多管齐下的治疗方法来治疗三重阴性乳腺肿瘤(图一)。10)。在这种方法中,我们结合低剂量化疗来增强肿瘤的免疫原性和抗原表达,有助于对TAA的bcr识别。这再加上我们的抗肿瘤病毒疗法,引发了DC和B细胞的复生,最终导致了B细胞的克隆扩张。B细胞和T细胞启动导致抗肿瘤趋化因子释放,驱动效应细胞功能,同时抑制细胞因子在TME中积累MDSCs。这种免疫激活级联的事件导致免疫景观有利于成功的治疗与CP。

图10:治疗诱导免疫激活原理图。
figure10

*使用BioRender.com创建。

我们的研究受到老鼠宿主的性质和它们无法完全再现人类生物学的限制。临床表现相似的癌症患者对治疗有不同的反应水平,这是很常见的。这一现象在我们的研究中也可以看到,在我们的研究中,基因组成相同的小鼠对同样的治疗有双重反应。这种小鼠间的异质性可能是由于每只小鼠的个体代谢活性和免疫特性所致。我们的数据是从皮下肿瘤产生的,应该在转移性和自发产生的肿瘤模型中进一步分析,以便在更自然发生的情况下评估这些核心免疫相互作用。我们的目标是进一步评估这些迷人的发现,因为我们继续表现出我们的B细胞群体,并评估他们与不同的骨髓细胞群体的相互作用,在荷瘤宿主。我们认为,临床研究不仅要关注T细胞的水平及其对预后的相关影响,还应将B细胞作为预测免疫治疗反应的关键生物标志物。


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