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纯合子MTAP原发性胶质母细胞瘤缺失与甲基硫代腺苷升高无关

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发表时间:2021-07-20 14:51作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

甲基硫腺苷磷酸化酶纯合缺失MTAP)在像胶质母细胞瘤这样的癌症中,存在潜在的靶向性弱点。纯合子MTAP-缺失的细胞系显示MTAP的底物代谢物甲基硫腺苷(MTA)升高。高水平MTA抑制蛋白精氨酸甲基转移酶5(PRMT 5)的敏感性MTAP-删除细胞对PRMT 5和甲硫氨酸腺苷转移酶2A(MAT2A)的抑制作用。虽然这一概念在体外得到了广泛的证实,但临床相关性依赖于在人类胶质母细胞瘤中表现出明显的MTA积累。在本工作中,我们使用综合代谢组学分析,证明mta分泌的。MTAP-在体外删除的细胞会导致高水平的细胞外MTA。我们进一步证明了纯合子MTAP-缺失的原发性胶质母细胞瘤由于MTA通过表达MTAP的间质代谢,在体内不明显积累MTA。这些发现突出了体外模型与原发性人类肿瘤之间的代谢差异,在制定精确治疗策略时必须考虑到这些差异,这些策略是针对具有纯合性的胶质母细胞瘤的。MTAP删除。

导言

肿瘤抑制基因的基因组缺失是多种肿瘤发展的主要驱动因素,但其治疗途径的不可及性通过精确的肿瘤学手段破坏了其潜在的应用前景。这种缺失事件往往会造成不太明显的遗传漏洞,通过识别其代谢后果,这些弱点可能会被治疗性地利用。1,2。纯合缺失CDKN2A/B在9p21染色体是肿瘤发生的早期克隆事件。3在多形性胶质母细胞瘤(GBM)、胰腺癌和肺癌中分布均匀。4。在GBM中,约有30-50%的病例存在9p21纯合子缺失。5。在开发利用肿瘤代谢异常的治疗方法时,特别感兴趣的是代谢酶甲基硫代腺苷磷酸化酶(编码为甲基硫腺苷磷酸化酶)的侧支缺失。MTAP)。由于邻近的.MTAPCDKN2A抑癌基因6,7,共同删除MTAP80-90%的肿瘤存在纯合性缺失。CDKN2A8(补充图。1)。这一事件的普遍存在,再加上gbm等癌症的不良预后,促使人们开发新的治疗方法,利用以下因素所赋予的下游脆弱性。MTAP删除。

MTAP除了在多胺生物合成中发挥更广泛的作用外,还参与了甲硫氨酸和腺嘌呤的挽救途径,催化甲硫腺苷(MTA)转化为甲基硫腺苷(MTA)。S-甲基-5-硫代-D-核糖-1-磷酸(图1.1A)。维持纯合子的癌症MTAP因此,缺失预计会累积MTA;广泛的体外证据支持这种逻辑。9,10(尽管蛋氨酸和半胱氨酸在培养基中的可用性也影响MTA水平11)。对这种耐人寻味的代谢表型所做的努力已经确定了过量的MTA对蛋白精氨酸甲基转移酶5(PRMT 5)的抑制作用,它是转录的关键调节因子。当与wd重复序列蛋白(Wdr 77)结合时,prm 5发挥其调节作用,产生所谓的甲基体。12,13,14。高水平的MTA是PRMT 5活性的内源性抑制剂,从而阻碍了甲基化物的形成,使细胞对PRMT 5和WDR 77的水平降低产生了敏感作用。PRMT 5在纯合子中的靶向治疗MTAP因此,被删除的癌细胞被认为是一种很有前途的策略,可以防止甲氧类组织,选择性地杀死癌细胞。9,10,15(补充图。1)。另一种方法利用PRMT 5和S-甲硫氨酸(SAM)9,16,17。SAM是PRMT 5的天然底物,MTA是PRMT 5的底物竞争抑制剂。因此,降低SAM水平会加重MTA升高的抑制作用。因此,抑制产生SAM的蛋氨酸腺苷转移酶2A(MAT2A)也被认为是潜在的纯合子治疗靶点。MTAP-删除癌症9,16,17(补充图。1),这一战略已进展到正在进行的第一阶段审判(NCT 03435250)。

图1:MTA在条件介质中的急剧升高MTAP-删除细胞与WT相比较,细胞内轻度升高。
figure1

a蛋氨酸回收途径(基于KEGG)68)大多数基因在细胞株和组织中广泛表达(DepMap,人类蛋白质图谱)。萨姆S-腺苷甲硫氨酸S-腺苷甲硫氨胺,甲基硫腺苷,亚精胺,PTN腐胺,MTOB 4-甲基硫代-2-氧丁酸酯,DMTP 1,2-二羟基-5-(甲基硫基)pent-1-en-3-酮,mtp 3-(甲基硫代)丙酸酯,MTDO-P-5-(甲基硫基)-2,3-二氧戊基磷酸,MTRi-P-S-甲基-5-硫代-5-硫代磷酸酯D-核酮糖-1-磷酸,5-甲基硫代二糖-1-磷酸.b在纯合子条件培养基(细胞外)和洗涤细胞颗粒(胞内)中测定MTA水平。MTAP-删除(MTAP−)和野生型(MTAP+)细胞培养。颜色编码反映了相同的细胞线的颗粒/介质。c MTAPWesternblot证实的细胞系状态独立重复两次。d, eMTA水平(平均+SD,N=3生物复制)在一组胶质瘤细胞中;洗涤细胞颗粒-细胞内(d)和条件培养基-细胞外(e)。条件培养基中MTA增加200倍以上MTAP-删除的细胞系与完整的细胞系(*)p=0.0005,未配对双尾学生t用不等方差检验),而在细胞颗粒中只看到边缘高度的比较。f, g细胞微丸和条件培养基中MTA水平的时间历程(英文)f)与SAM进行比较(g). x-轴:上次媒介变化后的收获时间;y-轴:每种代谢物的离子计数。每条代表一个生物复制。的MTA有明显的时间依赖性的增加。MTAP-删除细胞,细胞颗粒中MTA略有增加。在微丸和培养基中存在MTA的不平衡,与SAM形成对比,SAM完全是细胞内的。h细胞微丸和条件培养基中MTA的绝对定量(平均值+/−SD,N=3个生物复制体)。从条件培养基中回收的MTA量MTAP-被删除的细胞比从细胞颗粒中恢复的要大200倍。相反,在MTAP-WT细胞,条件培养液中MTA的含量与细胞颗粒中的MTA含量相当。MTA在细胞内的适度积聚(6倍)MTAP与WT细胞相比,缺失细胞被细胞外MTA的增加所掩盖。重要值表示为*p=4×10−8, ***p=0.00006,@@@@p=10−12,和%p=0.02使用倍数t用Bonferroni校正测试。

上述两种治疗方法都取决于是否存在极高的MTA水平。MTAP-与MTAP-完整的组织。虽然这似乎是很自然的纯合子MTAP-删除的原发性人类肿瘤也应显示这一表型,最近有报告指出这种耐人寻味的脆弱性并没有测量原发性人类肿瘤中MTA的水平。9,10,18。我们没有发现任何以前的研究报告MTA测量在实际原发性人类肿瘤中的作用。MTAP基因型

在这项研究中,我们发现高度升高的MTA水平MTAP-已删除的胶质瘤细胞系不能外推法到原代GBMs。我们在细胞培养和原发肿瘤中的代谢组学研究表明,MTA在细胞外积累最为明显,反映了MTA的分泌。MTAP-被删除的细胞。基于对原发性肿瘤的这一发现,我们的数据强烈地表明非恶性肿瘤的丰富程度。MTAP野生型基质细胞代谢纯合子分泌的mtaMTAP-删除GBM细胞。作为对纯合子致命的合成疗法的承诺MTAP-删除的癌症依赖于细胞内MTA的积累,我们的数据告诫我们不要权宜之计地翻译MTAP

结果

MTA分泌MTAP-培养中删除的细胞

通过使用独立代谢组学平台分析多项代谢谱研究,我们观察到报告的纯合子细胞内mta水平存在差异。MTAP-删除细胞9,19,20,21,22,23,24,25,即使在同一细胞系内(附图)。2A,b)。这一差异可归因于这些研究在多大程度上区分了细胞内分布和细胞外分布--这取决于细胞在提取代谢物之前被清洗的范围。例如,在Ortmayr等人的NCI-60特征分析研究中。22,主要集中在细胞内代谢物(用微量残留培养基广泛清洗细胞颗粒),MTA水平在统计学上没有显著提高。MTAP-与WT癌细胞株相比被删除(补充图)。2A)。然而,代谢公司和NCI之间的合作使用NCI-60面板。26没有具体说明细胞颗粒是否被洗涤,并报告MTA增加了三倍。MTAP-与MTAP-WT细胞系(附图)2B)。与细胞内的mta水平相比,一项对条件培养基(分泌代谢物)进行质谱分析的研究表明,mta增加了100倍。MTAP-与完整的细胞系相比,删除的细胞株(补充图)。2C有关乳酸的比较,见附图。二维空间)27。这些研究报告的mta的微摩尔细胞外水平与mta在条件培养基中的典型水平形成了鲜明的对比。MTAP-WT细胞24,28。同时,直接测量MTA的分泌。MTAP-被删除的细胞在培养基中的分泌率明显高于MTAP-删除的细胞系MTAP-WT线19,29.

独立调查MTA在条件介质中主要存在的可能性MTAP-删除细胞,我们在细胞颗粒和相应的条件培养基上进行质谱。1B)从经验证的细胞系面板中MTAP状况(图1.1C和补充图。3)。首先,我们比较了三种细胞内和细胞外环境中MTA的水平。MTAP-删除胶质瘤细胞系(U87、Gli56和SW 1088)MTAP-WT细胞株(图1.1D,e)。我们观察到条件介质中MTA水平急剧增加。MTAP-相对于WT细胞株而言,这两种细胞系的细胞颗粒中MTA水平的增加要小得多。两组间细胞外MTA的显着性差异MTAP与同一细胞的细胞内MTA水平的微小差异相比,删除和WT表明:MTAP-缺失的细胞分泌MTA。1D对无花果。1E)。为了证实我们的发现,我们还进行了一个时间过程实验。MTAP-删除和MTAP-WT细胞系。虽然MTA的时间依赖性增加在细胞颗粒和条件培养基中都是明显的,但这种增加在细胞外轮廓中更为明显(见图)。1F)。MTA和SAM细胞内和细胞外水平的比较显示,细胞内保留的代谢物与分泌的代谢物之间存在着紧密的调节(图一)。1F对无花果。1g)。我们进一步测量了细胞颗粒和条件培养基配对样品中MTA的绝对量(纳米粒)。图形指示从条件介质中恢复的MTA量MTAP-删除细胞培养3天,比从细胞颗粒中恢复的MTA大约多200倍。这与MTAP-WT细胞,从培养基(细胞外)和细胞颗粒(细胞内)中恢复出相当数量的MTA。综上所述,我们的研究结果与先前的结论一致。19,29纯合MTAP-缺失细胞分泌MTA,导致MTA细胞外大量积聚。

纯合子MTA无明显升高MTAP-删除人的性别平等措施

虽然体外MTA水平的升高清楚地定义了一种有前途的可操作的代谢脆弱性,但没有一项研究。9,10,15,18报道了是否纯合的关键问题MTAP-删除的原发性肿瘤忠实复制MTA在体外观察到的升高。换句话说,由纯合子介导的代谢脆弱性MTAP包括GBM在内的原发性人类肿瘤中的缺失保留?为了直接回答这个问题,我们利用bidmc平台生成的代谢组分析数据,比较了切除的人GBM肿瘤与经验证的mta水平。MTAP-删除情况30,31,32(无花果)2A,b)。这是第一次研究MTAP缺失对肿瘤MTA水平的影响图形2C结果表明,在17个GBM肿瘤(HF系列)中,MTA水平在纯合子之间没有显着性差异。MTAP-删除和MTAP-完整肿瘤(~1.4倍的中位MTA水平MTAP-删除肿瘤;p=0.20,未配对2尾t用不等方差检验)。校正后,中位MTA水平仅高出1.2倍MTAP-删除MTAP-完整肿瘤(p=0.09;图1。二维空间)。接下来,我们将每个肿瘤的MTA水平归一化为SAM水平,以解释甲硫氨酸补救途径的上调(如图所示)。2E)。因为SAM的水平在MTAP-删除和MTAP-体外培养的WT细胞15(数据重绘于附图。4),SAM是一种适宜的归一化代谢物。当MTA水平在原发性GBM肿瘤中校正为SAM时,两者之间的差异MTAP-删除和MTAP-完整的肿瘤变得毫无意义(MTA中位数升高1.1倍)MTAP-删除肿瘤;p=0.24;图1。2E)。这一结果与纯合子的预期表型相反。MTAP-在培养中删除细胞。这一无意义的mta升高与由特定遗传事件驱动的异常值相比进一步相形见绌,后者完全再现细胞培养中细胞内记录的代谢数据,例如2-羟基戊二酸(2-hg)水平的增加超过100倍,这是由点突变驱动的。IDH 1(无花果)2F).

图2:纯合子中MTA无明显升高,PRMT 5活性无特异性抑制。MTAP-删除原发性切除的GBM肿瘤。
figure2

aGBM肿瘤(转化的胶质瘤细胞和非恶性间质的异质混合)MTAP-缺失状况(Kim等人基因组图谱)。31)用质谱法测定MTA水平,Western印迹法测定SMDA水平。b基因组拷贝数数据(深蓝色:纯合子缺失,暗红色:扩增)围绕9p21位点。中的每一条y轴代表单个肿瘤在特定的染色体位置(x-轴)。c纯合子MTA水平MTAP-删除(MTAP(−)与MTAP-完整(MTAP+)GBM肿瘤,采用BIDMC质谱平台。每条代表每个肿瘤的MTA水平(N=1)。中位MTA水平(绝对离子计数)增加1.4倍MTAP-删除肿瘤与完整肿瘤相比(p=0.20,未配对2尾t用不等方差检验)。d, e相同的数据,但表示为样本加载归一化的总离子计数(d)和SAM水平与蛋氨酸挽救途径活性的比值(e)。无论正常化,MTA在MTAP-肿瘤明显缺失。相反,f肿瘤伴IDH 1突变以其2-羟基戊二酸(2-HG)的显著升高而突出,为基因组/代谢相关性提供了积极的控制。g为评价PRMT 5的活性,对GBM肿瘤裂解物进行SDMA免疫印迹,重复一次。作为阳性对照,我们评估了MTAP-删除的U87胶质瘤细胞,单独或单独使用外源性MTA抗肿瘤药物治疗。MTAP-重组(U87-)MTAP)细胞。SDMA水平在U87低于U87-MTAP细胞,表明部分抑制PRMT 5。MTA治疗后SDMA水平进一步下降。与培养细胞不同的是,在体外培养的细胞中,SDMA水平没有出现特异性下降。MTAP-删除与完整的GBM肿瘤。髓系细胞在肿瘤细胞中的存在是由肿瘤溶解物中的骨髓标记物IBA 1所证实的,而在培养的细胞中则不存在。hMTAP蛋白水平校正后加载GAPDH对照(样品从相同的实验和凝胶并行处理)。由于在整个肿瘤的裂解液中存在非恶性mtapp表达细胞,mtapp蛋白水平对于纯合子来说并不是零。MTAP-删除肿瘤;然而,平均而言,它们的MTAP蛋白水平低于完整肿瘤。

为了进一步证实人GBM肿瘤和培养细胞MTA水平的差异,我们采用不同的代谢平台(代谢物,Inc.)测定了不同肿瘤组(MDA系列)中MTA水平。这个MTAP用一种有效的MTAP抗体免疫组织化学方法确认肿瘤的状态。与图中的结果一致。2,我们没有观察到MTAP-删除和完整的人GBM肿瘤(附图)。5),证实了体外模型与人原发性GBM肿瘤的差异。

我们进一步试图通过询问文献中独立的GBM代谢组数据来验证我们的结论,尽管我们无法找到任何可以获得的基因组信息。文献中很少报道原发性人GBM肿瘤的代谢组学分析。少数已经进行的研究倾向于在不同阶段或不同级别的肿瘤群体之间进行比较,而不是考虑单个肿瘤独特的代谢情况。33,34,35,36,37。补充图6A-f根据MTAPmRNA水平对50例GBM肿瘤进行MTA检测(数据来源于Prabhu等人的补充信息)。38)。纯合频率MTAP在GBM中删除可达50%39,40,41。基于肿瘤基因组图谱(TCGA)-GBM肿瘤的分析42,43在mrna和基因组拷贝数都可用的地方,我们发现,尽管有一些例外,大多数纯合子MTAP-删除的肿瘤位于MTAP表达的两个低四分位数(补充图)。6g)。因此,我们假定,对于补充图所示的数据。6A-f,mtapmRNA表达的两个较低的四分位数将包括大多数纯合子。MTAP-删除肿瘤,而第三和第四四分位数中的大多数肿瘤是MTAP-完好无损四分位数之间MTA水平的比较在统计上是微不足道的。p=0.48,单因素方差分析),这与我们的结论是一致的。MTAP-删除的肿瘤不能显示MTA的选择性升高。

接下来,我们询问了另一个人脑胶质瘤代谢组分数据集,数据来源于Chinneyan等人。44(补充图。7),因为没有单个肿瘤的基因组数据,这将使我们能够确定MTAP-删除情况。因此,我们试图将不同胶质瘤级别的代谢组数据与报告的频率相匹配。MTAP删除它们。纯合频率CDK2NA/MTAP2级胶质瘤中缺失率<3%,2/3级胶质瘤中缺失率<10%。30,对纯合子的频率进行了鲜明的对比。MTAP缺失率高达50%的4级胶质瘤(GBM)5,39,41。因此,我们认为MTA的升高与肿瘤分级相对应,GBM的MTA水平较高,2级胶质瘤的MTA水平要低得多。然而,尽管这些不同的频率MTAP缺失,MTA水平在2级、3级和4级(GBM)肿瘤中相似(p=0.15,单因素方差分析,附图.7a,b)。重要的是,在MTA中没有明显的极端异常值。甚至个别GBM患者的MTA最高水平也比低度胶质瘤的MTA水平高出两倍左右。这些数据鲜明地对比了2-HG层的极端海拔,这是由以下因素驱动的。IDH胶质瘤突变;这些升高在2级和3级胶质瘤中很常见,但在GBM中很少发生。7C,d)。除了这些代谢组学研究,核磁共振(NMR)高分辨率魔术角自旋(HR-MAS)代谢组学剖面的GBM大规模。n>100例)MTAP-删除肿瘤,即使HR-MAS通常能检测到代谢物的最低浓度为1mM。45。在这种情况下,MTA仍然不能被检测到,这表明GBM肿瘤中存在<1mmmta,这支持了我们的结论,即不存在胶质瘤肿瘤,无论MTAP删除状态,在MTA中有极高的高度。我们的结论是纯合子MTAP-删除的原发性GBM肿瘤没有选择性地表现出MTA的显著升高,与体外报道的结果相反,这一结论得到了我们自己的结果的支持,并得到了公共领域数据的证实。

在人类GBM肿瘤中MTA(绝对MTA水平为1.4倍,校正总负荷和SAM水平时较少)的统计上不显著,这与体外报道的MTA的多重变化不一致。MTA在人体肿瘤中的代谢组学数据是衡量细胞内MTA和细胞外MTA的重要指标。在细胞培养中,经验性观察表明MTA水平在MTAP-删除细胞和WT细胞最明显的是细胞外环境,而不是细胞内环境(图)。1)。虽然我们不能区分细胞内MTA和细胞外MTA在原发肿瘤中的作用,但我们可以研究MTAP原发性肿瘤细胞内PRMT 5活性抑制的缺失。PRMT 5介导对称二甲基精氨酸(SDMA)的形成;因此,PRMT 5的活性可以通过使用抗SDMA抗体测定SDMA水平来评估。首先,我们测量了MTAP-WT和MTAP-Westernblot分析(在同样的条件下,我们测量MTA在培养基中的积累)-删除癌细胞(补充图)。8)。正如预期的那样,SDMA的水平在MTAP-删除的细胞比MTAP-WT,表明部分抑制PRMT 5。同时,MTA治疗后(50和100μM),SDMA水平下降。这两个数据片段重述了文献,支持PRMT 5活性与MTA水平之间的拮抗关系。然后用同样的抗体测定人GBM肿瘤内SDMA的水平。2G)。与细胞培养实验不同,原发肿瘤在纯合子中的sdma水平(代表PRMT 5的活性)没有明显下降。MTAP-与MTAP-完整的人GBM肿瘤。这些数据与细胞内或细胞外MTA的边际升高相一致。MTAP-删除肿瘤虽然我们没有发现SDMA水平和肿瘤之间的相关性MTAP目前,我们注意到肿瘤间SDMA水平的一些变化,而不考虑它们之间的差异。MTAP现状。与培养中的细胞不同,纯合子MTAP-删除的GBM肿瘤在westernblot中表达非零的MTAP水平。2G)。这是因为人类GBM肿瘤是由多种恶性胶质瘤(癌症)细胞组成的,其基因改变类似于纯合子。MTAP-缺失和未转化的非恶性间质细胞(如髓系细胞)。因此,在纯合子中MTAP-删除肿瘤,只有恶性胶质瘤细胞缺乏MTAP,而基质细胞表达正常。这种非恶性mtapp表达的细胞驱动非零mtapp表达(mrna或westernblot)在批量纯合子中表达。MTAP-删除GBM肿瘤。但是,平均而言,MTAP-westernblot显示缺失肿瘤的mtp蛋白水平低于(但非零)。MTAP-完好无损(图1.2H)。骨髓样细胞(小胶质/巨噬细胞)在肿瘤溶解物的Westernblot中被骨髓标记IBA 1所证实,但在培养的细胞中未见(图1)。2G)。所有肿瘤均显示一定水平的IBA 1,可见髓样基质浸润。IBA 1水平MTAP-删除肿瘤与残留MTAP水平密切相关,即纯合子MTAP-与其他纯合子肿瘤相比,缺失的HF3174肿瘤的IBA1最低。MTAP-删除肿瘤,也表达最低但非零的MTAP水平。

基质浸润导致MTA体外/体内不一致

接下来,我们试图找出MTA水平在培养的细胞与人GBM肿瘤之间不一致的原因。桑德森等人以前的工作。11,表明MTAP-在限制性蛋氨酸(3μM)或半胱氨酸(6μM)中培养时,缺失细胞积累的MTA量少于标准制剂中添加10 0μM蛋氨酸和2 0 0μM半胱氨酸(数据重绘于附图中)。9)。在本研究的推动下,我们试图研究在生理培养基中培养细胞对细胞内和细胞外MTA水平的影响。生理培养基的组成较好地反映了人体血浆中代谢物的浓度。46(补充图。10A)。因此,我们培养MTAP-Dulbecco改良的Eagle‘s培养基(DMEM;历史性培养基)和质体培养基中添加2.5%胎牛血清(FBS)的缺失细胞和WT细胞,并比较细胞颗粒和条件培养液中MTA的水平。补充图10b,c的平均MTA水平之间没有显着性差异。MTAP-在DMEM与胞外或细胞内的质体中培养的删除细胞。补充图10d表示,就像在dmem中一样,mta水平在条件培养基中高度升高。MTAP-删除的细胞与完整的细胞相比,最适度的高度在细胞颗粒中很明显。这些数据表明,即使在生理介质中,MTAP-缺失细胞分泌MTA。我们还研究了培养基对SDMA水平的影响。MTAP-删除胶质瘤细胞和WT胶质瘤细胞(附图)。10F)。SDMA水平无显着性差异(P>0.05)。MTAP-在DMEM和生理培养基上培养的删除细胞MTAP-SDMA水平较低的被删除细胞。我们的发现表明MTAP-在类似人血浆的营养环境中生长时,被删除的细胞会积累并挤出MTA,这将更准确地反映人类的情况。然而,我们并没有明确排除以下假设:营养差异(即极低水平的半胱氨酸)。11)可能是导致原发性肿瘤MTA缺乏的原因之一。MTAP-删除。

另一个可能的解释是MTA从肿瘤中挤出进入循环。为了研究这一可能性,我们在GBM和正常脑的脑脊液代谢组分析数据中询问了MTA的水平。47。考虑到纯合子的频率MTAPGBM的缺失率在50%左右,我们希望至少从一些GBM中观察到比正常大脑更高的MTA水平(补充图)。11A,b)。然而,来自GBM的脑脊液与正常脑的MTA水平差异不显著,没有显著的个体异常值。为了证实MTA分泌到循环中的可能性很低,我们比较了胶质瘤下游和上游静脉和动脉血浆之间的MTA水平,以及从同一患者的背足静脉获得的血浆,对照组(补充图1)。11C-E;从熊等人的补充资料中获得的数据。48)。肿瘤分泌的代谢物是由静脉血液携带到下游,与动脉血浆相比,胶质瘤静脉中的代谢物含量较高。在本研究中,由于存在高频率的纯合性,GBM肿瘤很少。MTAP在GBM中,很可能有一两个GBM肿瘤是纯合的。MTAP-在此数据集中删除。GBM肿瘤5p的MTA比值最高。然而,对于同一患者,足背静脉(对照组)与胶质瘤动脉血浆的MTA比值也很高(附图)。第11d),表明病人腿部MTA含量很高。最后,如附图所示。11E无GBM瘤在足背静脉与胶质瘤静脉血浆中MTA的比值明显高于低级别胶质瘤。这些发现表明,MTA分泌出的肿瘤进入循环并不是造成纯合子之间MTA水平差异的重要因素。MTAP-在培养中删除人GBM肿瘤和细胞。

众所周知,GBM肿瘤可能有高达75%(25-75%)的非恶性基质细胞,包括未转化的反应性星形胶质细胞、小胶质细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞、内皮细胞、成纤维细胞以及轴突和神经元残留。30,31,49,50,51...因此,纯合子MTAP-缺失的GBM肿瘤是非恶性MTAP表达的间质细胞和MTAP阴性恶性胶质瘤细胞的混合物.纯合子的诊断MTAP将此状态与非恶性组织中广泛表达的MTAP进行对比,对小鼠颅内移植瘤进行免疫组织化学检测。我们首先在福尔马林固定石蜡包埋(Ffpe)切片中证实了mtp兔单克隆抗体。MTAP-WT肿瘤及染色缺失MTAP-从已知的肿瘤中产生的删除肿瘤MTAP-基因型细胞系(附图)。1214)。每一种异种移植物MTAP-WT(或等基因)MTAPMTAP-缺失细胞株未见染色。同时,小胶质细胞、淋巴细胞、内皮细胞等非恶性间质细胞MTAP染色阳性.这些染色结果共同支持该抗体准确地定量了FFPE玻片中MTAP的水平。在我们的染色玻片中,值得注意的是正常小鼠大脑和基质细胞中的大量阳性染色,特别是考虑到异种移植物的侵袭性通常要小得多,而且与人的GBMs相比,基质细胞的数量要少得多(附图)。15)。因此,真正的人类GBMs更有可能包含更高比例的基质成分,如星形胶质细胞和髓样细胞。

接下来,我们将该抗体应用于FFPE初级GBM切片。在分析的60例病例中,我们发现大约40%的病例显示癌细胞中完全缺乏mtp染色,这与预期的结果基本一致。MTAP-GBM中删除的频率41值得注意的是,在非恶性间质细胞中观察到强烈的染色。MTAP-完整的脑胶质瘤和间质细胞均呈强而均匀的染色(见图)。3,补充图。17)。组织学MTAP-删除的主要性别暴力案件似乎类似于MTAP-删除颅内异种移植病例,除MTAP-在原发性人GBM肿瘤中,阳性间质浸润比异种移植更显着(附图)。15)。补充图16A-cMTAP残留染色与髓系含量的相关性较强。MTAP-删除GBM肿瘤。纯合MTAP-删除肿瘤后,残留的MTAP染色仅限于基质细胞(恶性胶质瘤细胞中未见MTAP染色),主要为髓系来源(IBA 1-阳性)。我们还询问了一个独立的数据集(TCGA)。41)MTAP mRNA水平与已知GBM肿瘤IBA 1官方基因标志--小胶质细胞/巨噬细胞标志--AIF 1的相关性MTAP现状。补充图16D表明MTAP和AIF 1 mRNA水平呈显著正相关。MTAP-删除的肿瘤和完整的肿瘤。然而,MTAP与AIF之间并无明显的正相关关系。MTAP-完整的肿瘤,因为胶质瘤和基质细胞都表达MTAP。MTAP-完整的肿瘤这个数字也表明纯合子MTAP-平均而言,被删除的GBM肿瘤mtp mRNA水平低于mtp mRNA水平,但非零水平。MTAP-完整的肿瘤,支持我们在图中的西部印迹数据。2G,h并验证了iba 1阳性髓系细胞在非零mtapp中的大量表达。MTAP-删除GBM肿瘤。

图3:原发性GBM肿瘤广泛浸润于MTAP表达的非恶性间质细胞.
figure3

a免疫组织化学(IHC)在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)切片上检测GBM肿瘤的MTAP和IBA 1。b, cIHC用单克隆抗MTAP进行。用EnzMet(黑色染色显示MTAP的表达)和苏木精(蓝色、细胞核)和伊红(粉红色、胞浆和胞外间隙)对至少50例MTAP和IBA 1染色,并显示3例独立病例的代表。代表部门MTAP-阳性(b)和MTAP-阴性GBM肿瘤(c);x20目标。注意在其他不染色的背景下,广泛的mtp阳性染色区域。MTAP-阴性胶质瘤细胞;病理形态学分析表明:MTAP-阳性细胞与基质成分相对应,包括小胶质细胞、内皮细胞和活化星形胶质细胞。d高放大率c黄金广场。任何由MTAP-缺失的胶质瘤细胞(蓝色虚线轮廓)将被MTAP(产生5-mm-P)磷酸化,或释放或被表达MTAP的基质细胞(白色虚线)所吸收。e一个具有代表性的部分MTAP-阴性的GBM肿瘤对IBA 1抗体(髓系标记物)染色,表明在GBM肿瘤内广泛存在髓样细胞(小胶质/巨噬细胞)。f高倍视角e.

找出MTAP-WT细胞的存在(即基质细胞,主要是GBM中的髓样细胞)MTAP-删除肿瘤,我们假设过量的MTA分泌自纯合子MTAP-肿瘤内存在的非恶性MTAP表达细胞可能代谢被删除的癌细胞.为了检验这个假设,我们培养了MTAP-WT巨噬细胞与外源MTA和条件培养基中MTA水平的测定1(核磁共振)在附图中。18a,b的条件培养基中未检测到MTA峰。MTAP-wt巨噬细胞(raw-264.7和mv-4-11)与来自对照板或条件培养基的mtA比较。MTAP-删除白血病细胞(CCRF-CEM)在相同的实验条件下。这个结果表明MTAP-WT细胞向培养基中释放功能性MTAP酶,或从培养基中摄取MTA并进行代谢。首先,我们试图观察功能性MTAP酶的释放是否MTAP-WT细胞负责从条件培养基中消除外源性MTA。我们成长MTAP-WT RAW-264.7(巨噬细胞)细胞,3天后收集条件培养液,将其剥离去除任何细胞,然后用20μM外源性细胞培养液孵育3天。补充图19A表明外源性MTA不能从巨噬细胞的无细胞条件培养基中消除。这一结果表明,MTAP功能酶的释放并不导致外源MTA从条件培养基中消失。MTAP-WT细胞。接下来,我们试图研究外源mta是否被摄取和代谢。MTAP-WT细胞。因此,我们培养MTAP-WT巨噬细胞(RAW-264.7)或胶质瘤细胞(D 423),标记为甲基三氘化-MTA(D3-MTA)(图1).4A)。我们观察到从条件培养基中快速消除标记的D3-MTA。MTAP-WT细胞伴随着细胞内MTA、蛋氨酸和SAM的氘富集(图1)。4B,c,以及附图。19C,d)。图形4D显示了氘从标记的D3-MTA到蛋氨酸(蛋氨酸挽救途径)和SAM(多胺生物合成)的命运。这一结果表明,细胞外MTA可被细胞外MTA吸收和代谢。MTAP-WT细胞。

图4:外源mta被MTAP-完整的细胞通过蛋氨酸回收途径。
figure4

a MTAP-WT巨噬细胞(RAW-264.7)与100 M-甲基三氘化-MTA(D3-MTA)共同培养.提取细胞和条件培养基,分别进行LC-MS和NMR测定.b外源D3-MTA在巨噬细胞培养液中迅速消失,在细胞内的蛋氨酸和SAM中出现氘标记(质量+3;M+3)。c),符合MTAP-依赖于甲硫氨酸回收途径的代谢(d)。面板中的数据c表示为平均+SD,N=3个生物复制体。e MTAP-被删除的癌细胞在条件培养基中积累MTA(核磁共振检测),而分泌的MTA则被MTAP-完整的巨噬细胞,消除MTA在细胞外环境中的积聚。f共文化MTAP-删除癌细胞株MTAP-完整的髓样细胞可防止SDMA的丢失,表明PRMT 5活性保持不变,重复一次。MTAP-删除和重组胶质瘤细胞与髓系白血病细胞(MV-4-11)共同培养.在制备溶出液之前,去除悬浮的MV-4-11髓系细胞,并广泛清洗癌细胞.对于每个独立的MTAP-缺失细胞株SDMA水平随骨髓细胞共培养而升高,提示PRMT 5活性恢复。

接下来,我们共同培养MTAP-巨噬细胞缺失胶质瘤细胞(RAW-264.7),永生化正常人星形胶质细胞,等基因MTAP-获救的牢房(U87-)MTAP)和测量条件介质中的MTA水平。1核磁共振。我们观察到MTA在条件培养基中的稳健积累。MTAP-已删除的单元格,但未删除MTAP-WT或MTAP-获救的细胞(如图所示)。4E)。什么时候MTAP-U87、SW 1080、HT 1080和SKMEL 5细胞共培养MTAP-WT巨噬细胞(图1.4E)或正常人星形胶质细胞(补充图。18C),在条件培养基中未检测到MTA峰。1核磁共振。此外,U87父母的共同文化MTAP-U87缺失胶质瘤细胞MTAP-获救的细胞导致MTA峰消失1条件介质的H-NMR谱(附图)。20)。这些结果表明,分泌MTA的MTAP-被删除的细胞被消耗(代谢)MTAP-WT细胞;因此,共培养MTAP-删除与MTAP-WT细胞株可消除MTA在条件培养基中的积累。我们还证实了MTA的分泌和消耗MTAP-删除的细胞与巨噬细胞在生理培养基中共同培养(质体,附图)。18D)。我们的发现表明MTAP-附近的WT细胞MTAP-被删除的癌细胞可防止MTA细胞外积聚。

我们还研究了共培养的效果。MTAP-删除和MTAP-PRMT 5活性的完整细胞-细胞内MTA水平MTAP-删除的细胞。我们早些时候讨论了报告的MTA值在以下几个方面的差异:MTAP-删除和MTAP-WT癌细胞株。为了避免这些问题,我们使用了一种不同的方法间接地评估细胞内的MTA水平。由于细胞内MTA抑制PRMT 5活性,进而降低SDMA水平,因此采用westernblot检测SDMA水平是对细胞内MTA的间接测定。MTAP-删除和MTAP将获救细胞与悬浮白血病MV-4-11(单核细胞白血病,巨噬细胞样)细胞在DMEM中共培养.3天后,取悬浮白血病细胞,在溶解前用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗两次贴壁细胞。关于西方污点(图1.4F),单一栽培MTAP-缺失细胞的SDMA水平较低,表明PRMT 5活性较低,细胞内MTA水平高于共培养。MTAP-被删除的细胞。这些发现强调了MTAP-删除带有MTAP-完整的细胞可以消除MTAP删除,从而表明MTAP异质性人GBM肿瘤的缺失敏感性可能因肿瘤微环境中基质的存在而减弱。

讨论

针对纯合子的出现,我们进行了这项研究。MTAP-尽管缺乏对原发肿瘤代谢状态的探索,但删除的精确治疗仍在努力。作为治疗之窗MTAP缺失依赖于大量细胞内MTA的积累。9,10,15,52,53,54确保这种体外表型在人类肿瘤中是一致的,这是一个自然而紧迫的研究领域。也许令人惊讶的是,最近的任何一篇论文都没有记载MTAP-依赖脆弱性报告的MTA测量在原发性人类肿瘤,甚至是已定义的异种移植瘤中。MTAP-缺失状况,尽管在假设MTA体外观察到的升高将反映在原发肿瘤上的假设基础上作出了重大努力9,10,15,52,53,54.

我们开始研究文献??热衷于寻找描述mta水平的不同的、基因定义的纯合子的研究。MTAP-切除原发肿瘤-但几乎没有成功。我们找不到任何文献报道直接测量基因识别的MTA水平。MTAP-删除MTAP-完整的原发性人类肿瘤,无论是GBM还是其他肿瘤。这是相当令人惊讶的,因为MTA是许多代谢组学研究中经常检测到的代谢物。

为了填补这一空白,我们使用两个独立的代谢平台(BIDMC和Metabolon,Inc.)询问了我们从不同的GBM肿瘤中生成的代谢组数据集。我们的数据表明,纯合子之间的MTA水平在统计学上没有明显的增加。MTAP-删除和MTAP-完整的肿瘤MTA水平的这一边际升高与MTA报告中报告的巨大海拔不一致。MTAP-体外缺失细胞系9,10,15。研究体外代谢易损性是否由MTAP缺失保留在人类GBM肿瘤中,我们通过检测SDMA水平来评估PRMT 5的活性,我们在同一组人类肿瘤中进行了代谢组学研究。与细胞培养实验不同,我们没有观察到纯合子中较低的sdma水平。MTAP-删除的肿瘤与完整的肿瘤相比。作为对我们发现的独立验证,我们询问了对人类GBM肿瘤进行代谢组学研究的公共领域数据集。33,44。我们没有观察到MTAP低表达的GBM肿瘤与高MTAP表达的GBM肿瘤和频繁表达的GBM肿瘤相比MTA升高没有统计学意义。MTAP缺失及2、3级胶质瘤罕见MTAP删除。如果MTAP缺失确实会导致mta在原发性肿瘤中的积聚,我们期望观察到更高的mta水平(按>20倍的顺序,如图3C中的体外细胞内数据所示)。9)在相当一部分GBM肿瘤中。我们的研究评估了MTA在块状GBM肿瘤中的作用,该肿瘤是肿瘤和基质细胞的异质混合物。对这类肿瘤进行代谢组学和Westernblots的一个缺点是,所测量的信号(即MTA水平和SDMA水平)来自肿瘤和基质细胞。虽然肿瘤细胞产生的信号被基质细胞稀释,但在切除的大体积肿瘤中仍能看到明显的代谢异常,如2-HG的升高(图1)。2F和补充图。7)。然而,我们从两个不同的数据集(HF系列和MDA系列)中分析GBM肿瘤的数据表明,没有明显的1.4倍(p=0.2和1.14倍(p=0.9)MTAP-删除的肿瘤与完整的肿瘤如果以细胞培养数据为参照点,这些数字太低,不能用基质污染引起的信号稀释来解释。然而,我们的数据并不能保证MTA在MTAP-被删除的胶质瘤细胞;只是这种积累要比培养中报道的要少得多。

总之,纯合子的MTA极高。MTAP-体外缺失的细胞没有延伸到我们对原发性GBM肿瘤的代谢物分析。多种原因可能解释了细胞培养和人类肿瘤数据之间的差异。我们赞成的解释集中在这样的观察上:MTAP-被删除的细胞将MTA排出到培养基中(如图所示)。)。在文献中,我们注意到不同的研究在报告的MTA增加的程度上有很大的差异。MTAP-删除的对抗MTAP-完整的癌细胞株(附图)。2)。根据我们自己的体外数据,仔细分析这些结果,发现MTA分泌出纯合子。MTAP-被删除的细胞。因此,不同研究之间的差异似乎产生于样品处理过程中细胞内和细胞外代谢物水平的差异。MTA分泌MTAP-删除的细胞与以前的研究一致19,55进一步证实了这一发现。

我们发现的另一种解释是人类GBM肿瘤环境被MTAP表达的非恶性间质细胞广泛浸润(如图所示)。3和附图。1516)。调查.的影响MTAP-附近的WT细胞MTAP-细胞内和细胞外MTA水平上的缺失细胞,我们共同培养。MTAP-删除带有MTAP-WT。我们观察到,这种共培养消除了MTA在条件培养基中的积累。MTAP-被删除的细胞。此外,我们发现MTAP-已删除的悬浮细胞MTAP-WT白血病细胞(mv-4-11,髓样细胞)与单细胞培养相比,具有较高的sdma水平--表明rmt 5活性较高,细胞内mta水平较低。MTAP-被删除的细胞。还有,培养MTAP标记D3-MTA的WT细胞显示细胞内MTA、蛋氨酸和SAM的标记,证明MTA的摄取、消耗和代谢MTAP-WT细胞。这些发现表明,基质细胞对MTA的代谢可能是导致原发性GBMs中MTA没有任何明显增加的主要原因。然而,我们的研究并不排除其他可能影响MTA积累的因素。MTAP-删除细胞,即Sanderson等人所显示的极端半胱氨酸缺乏症。11(虽然生理介质质体仍能产生MTA分泌MTAP-删除胶质瘤细胞,补充图。10)。我们的发现突出了体外模型与原发性人类肿瘤之间的代谢差异。众所周知,细胞培养条件并不总是准确地反映生理代谢状况。11,56,57我们的研究举例说明了另一个方面,基质浸润,作为一个复杂的因素,肿瘤代谢。我们的结果提出了更系统的努力,以验证细胞培养和异种移植研究的癌症代谢与原始的人类肿瘤数据。

MTAP缺失可以被利用,因为在各种癌症中有选择性的弱点已经引起了极大的兴奋。我们的分析挑战了治疗所需的代谢条件,以利用与MTA升高相关的脆弱性。MTAP缺失存在于原发性人类肿瘤中,这使得这些缺失是否会转化到临床上产生了停顿。然而,我们的发现并不排除MAT2A和/或PRMT 5抑制剂在肿瘤学中的应用。仅仅是,这些抑制剂必须通过MTA积累以外的机制实现治疗窗口。事实上,最近的研究已经指出MTAP-缺失-不依赖于PRMT 5抑制的敏化机制58。我们数据集中的一些GBM肿瘤显示出相对较低的SDMA水平--表明PRMT 5活性较低--没有MTAP删除(图1.2G)。也许这种低PRMT 5活性的肿瘤可以作为针对PRMT 5或MAT2A的靶向治疗的合适选择,只要能找到一个可靠的分子标记来识别它们。


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