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间充质乳腺肿瘤器官的形态学筛选以鉴定逆转上皮-间充质转化的药物

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发表时间:2021-07-20 14:23作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

上皮间充质转换(EMT)与干细胞的特性和对癌细胞的治疗耐药密切相关。因此,能够重新规划EMT程序的药物的鉴定可能会提供新的治疗策略。在这里,我们报告了从克隆-低乳腺肿瘤,一种间充质亚型的三重阴性乳腺癌细胞,显示出一个独特的器官结构,扩展的“尖峰”在三维基质。在miR-200诱导的间充质-上皮转变(MET)后,细胞器向光滑的圆形形态转变。在这些观察的基础上,我们发展了一种形态学筛选方法和伴随的分析管道,利用深层神经网络和最近邻分类来筛选EMT逆转药物。通过筛选靶向表观遗传药物库,我们确定了多个I类HDAC抑制剂和溴结构域抑制剂逆转EMT。这些数据支持利用间充质乳腺肿瘤器官的形态学筛选作为一个平台来识别逆转EMT的药物。

导言

三阴性乳腺癌(TNBC)是由雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和Her 2缺乏表达而定义的一类异质性肿瘤。TNBC可分为4种亚型,其中以claudin低亚型最多,转移率和耐药率较高。1,2,3,4。上皮间充质转换(EMT)是一种进化保守的发育过程,在此过程中,细胞失去上皮标记,获得间充质性状。作为对多向信号的响应,一组EMT相关的转录因子和表观基因调节因子参与了这一复杂的转变。EMT通过增强癌细胞的运动能力、侵袭力和对凋亡刺激的抵抗力而赋予癌细胞转移特性。此外,中间或部分EMT肿瘤细胞具有较强的可塑性,显示出肿瘤干细胞的特性,并表现出明显的抗药性。5,6,7。EMT信号也被发现与预后差的乳腺癌亚型有关,这种亚型是由不同的肿瘤免疫微环境所决定的。8。以往的新辅助临床试验显示,传统的内分泌治疗(来曲唑)或化疗(多西他赛)后残留的乳腺癌表现出这些中间的EMT特征以及肿瘤的起始特性。9。因此,EMT状态常常是乳腺癌亚型治疗耐药性期间观察到的“默认”表型。在我们实验室开发的临床前claudin低/间充质转基因小鼠模型中,miR-200微RNA的重新表达,它们是间充质-上皮转换(Met)的主要调节因子。10,11,12、逆转肿瘤干细胞特性及致敏肿瘤化疗13。因此,鉴定药物可以使miR-200出现并使细胞重新进入上皮样状态,这可能会提供新的治疗策略。

在过去的几年中,已经作出了几项努力,以筛选EMT-逆转药物.我们先前开发了“Z-cad”双慢病毒荧光报告系统,该系统由不稳定的绿色荧光蛋白(Gfp)组成,其中含有ZEB 1由E-cadherin驱动的3‘UTR和红色荧光蛋白(RFP)Cdh 1)启动子14。利用该报告系统,我们进行了高通量小分子药物筛选,并鉴定了几种gsk 3β抑制剂能够抑制mda-mbb-231细胞的二维培养。15。同样,其他研究利用了aCdh 1启动子驱动荧光素酶报告在高通量筛选中发现蛋白激酶A(PKA)激活和组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂能够恢复上皮分化。16,17.

近年来,三维器官培养系统已经成为细胞行为分析和个性化医学应用的改进模型。细胞器维持细胞与细胞之间的相互作用,在组织学和转录学方面表现出与原始组织更多的相似性,并为治疗反应提供更准确的预测。18,19,20,21,22,23,24,25。到目前为止,已经有数十个药物筛选在器官培养中进行,它们主要使用基于活力的端点来确定药物的活性。21,26,27,28,29,30,31,32。由于逆转EMT不一定改变细胞的活力,而且许多间充质细胞表现出独特的细胞器形态,因此开发一个以EMT重编程为重点的形态学筛选平台为药物发现提供了有价值的工具集。

在过去的十年中,计算机视觉的革命导致了一种基于深度神经网络(DNN)结构的图像分析的根本不同类型的发展。这些系统直接工作在原始图像上,并提供了一种综合的方法,将图像特征提取结合起来,通常使用叠加的卷积层和池层,并使用人工神经网络进行分类任务。33,34,35,36。在表型筛选方面,机器学习最常见的应用是检索模拟控制的化合物(分类)或将具有相似作用机制的化合物放在一起(聚类),这两种方法都是利用dnn和基于图像嵌入的方法成功地解决的。37,38,39,40。在本研究中,我们利用了Trp53-空的claudin-低宝石模型,它在Matrigel中产生了尖峰状的类细胞器结构。然后,我们优化了一个三维器官培养平台,并使用一个诱导型miR-200C过表达系统作为对照来逆转EMT。这产生了两种不同的形态,可以在视觉上加以区分,但很难客观地进行分割,从而排除了利用依赖于精确分割的传统图像分析方法的可能性。因此,我们开发了一种筛选方法,将经过预处理的DNN的一般图像特征与k-最近邻(k-NN)模型结合起来,将实验处理的相似性映射到参考控制中。使用这一方法,我们发现了许多小分子抑制剂在表观遗传药物筛选中逆转了EMT。这些化合物分为两大类,一类是HDAC抑制剂,一类是溴域抑制剂(BRD)。这些数据支持使用间充质细胞器形态学筛选EMT-逆转药物的发现。这些筛选也作为第一步,提供洞察表观遗传调控的EMT表型。

结果

诱导miR-200 C表达改变细胞形态的EMT程序设计

我们首先建立了几个原代细胞系Trp53-小鼠乳腺肿瘤模型。这些Trp53-GEM肿瘤以前是通过移植BALB/c小鼠的供体乳腺上皮来建立的。Trp53已从生殖细胞系中删除,进入同基因宿主,以派生出多种Trp53-零乳腺肿瘤41,42。比较癌基因组学和基因图谱显示,由此产生的乳腺肿瘤代表了相应的人类乳腺癌亚型。43,44,45。作为工程Trp53盒内含有新霉素耐药标志41,46在培养基中加入G 418,去除基质细胞,产生原代细胞系。有趣的是,当嵌入Matrigel,来自T11和T12的单细胞,两个Trp53-低乳腺肿瘤模型,生长成器官样结构,投射到周围的基质中(如图所示)。1A,b)。在Teton-miR-200C细胞中加入多西环素(Dox)诱导表达MET启动子miR-200C,在不明显影响细胞器大小的情况下,阻止了这些侵袭性突起的形成。1B,补充图。1A,b,以及补充电影1在RNA和蛋白质水平上均能明显诱导细胞角蛋白K8的表达(图一)。1C和补充图。1C-E)。Phalloidin染色的F-actin显示,克隆蛋白低的细胞器中的细胞是侵袭性的,因为F-actin存在于类似于内隐吸虫的结构中;而在miR-200 C诱导的细胞器中,F-actin有皮质排列,而没有明显的内胚层。1D,补充图。2A,以及补充电影25)。此外,miR-200C诱导可促进上皮标记物E-cadherin的表达,降低间充质转录因子ZEB 1的表达,如Z-cad报告分析、免疫印迹和免疫染色所证实。1E,f,以及附图。2B-d)。这种形态开关(尖峰到圆形)为EMT/MET动力学提供了一个独特的实时读出,并提供了利用这些三维细胞器进行图像筛选以识别能够改变EMT/MET可塑性的小分子的可能性。

图1:诱导miR-200C表达逆转EMT,改变细胞器形态。
figure1

a常规培养格式的三维器官培养示意图。b用相差显微镜观察T11和T12细胞器的形态。具有代表性的独立生物复制图像(n=10)。标尺:100μm。cT11细胞器切片中角蛋白8的IF染色。具有代表性的独立生物三重体图像。标尺:20μm。d载体或剂量处理的T11整装类细胞器的F-actin染色。具有代表性的独立生物三重体图像。标尺:50μm。eZ-cad报告在车辆或剂量处理的T11整装有机体成像。根据报告系统的设计,EMT细胞为绿色,MET细胞为红色。具有代表性的独立生物三重体图像。标尺:50μm。fT11和T12类细胞器EMT标记的免疫印迹分析。具有代表性的独立生物三重体图像。

三维有机物筛选方法的优化及图像分析

为了进行筛选,我们首先优化了一种自动化的方法,可以重复生成384井板格式的有机化合物。由于未稀释的Matrigel对于机器人液体传输来说太粘稠,所以我们在50%的Matrigel稀释培养基中测试了细胞器的生长,并证实其细胞器表型与未稀释Matrigel中观察到的相似(附图)。3A)。对于器官培养,在井底加入60%Matrigel的无细胞涂层,防止细胞粘附在井底(补充图)。3B)。然后,将50%Matrigel稀释后的细胞转移到预涂板上,形成1 mm厚的半月板,每孔含有500个细胞。在允许细胞恢复2天后,用针头转移法对平板进行药物治疗(如图所示)。2A)。每个平板包括16口车辆(DMSO)处理的负压控制井,16口剂量处理井(用于miR-200C诱导)作为EMT逆转阳性对照,16口无细胞介质专用井作为毒性对照。细胞在药物存在下孵育5天,然后用ImageXpress微共聚焦系统采集亮场z叠图像。

图2:三维器官培养与RESNET的发展。
figure2

a组织培养原理图和筛选工作流程。通过首先沉积60%Matrigel的缓冲层来防止细胞粘附到底部产生板。然后加入含有50%Matrigel的细胞,然后加入培养基。药物在细胞播种2天后使用100 nl引脚工具进行转移,并在随后的几天内进行连续明亮场成像。b图像分析管道三维图像堆栈首先对背景进行校正,并将其投影到一个z平面中。然后,从RESNET-18在ImageNet数据集上预培训的平层中导出高级图像特征。然后利用主成分分析来探索响应模式(每个主成分解释的方差百分比被标记到轴上),并为后续的分类任务构造k-最近邻模型。每个控制类别使用50/50列车/测试分割来监测检测质量,这在混淆矩阵中显示。阴性井(Neg),DMSO处理井;阳性井(Pos),miR-200C诱导井;介质井,无细胞井。行为/PRED,实际的和预测的。c对照区实验样品RESNET-18特征主成分分析(蓝色,阴性区;深绿色,阳性区;红色,介质区)。药物浓度从低(黑)到高(黄)增加。

接下来,我们开发了一个分析工作流程,利用图像嵌入的方法将类似的井(物候模拟)映射到参考控制井。这里我们使用了一种18层残差神经网络(RESNET-18)结构。47这是在ImageNet挑战数据集上进行的预培训。34并在卷积层和人工神经网络层之间的平坦层提取信息,有效地将图像转换成描述性的数字向量。然后进行主成分分析(PCA)或k-神经网络聚类,分别对表型景观进行可视化,并将实验井映射到控制样条件下。主成分分析结果表明,控制组具有良好的聚类性,正、负性控制主要分离在第一主成分中,而正控制和媒介控制主要由第二主成分分离。这随后促使我们生成一个k-NN模型,分别将药物治疗井的统计映射到参考对照(图1)。2B)。在最初的优化试验中,采用时间推移显微镜来确定阴性(DMSO)和阳性(DOX)对照能够完全统计解决的时间点。我们发现,DMSO处理过的井和miR-200诱导井在药物治疗5天后是完全不同的,这一时间点被用于所有后续的筛选试验(补充图)。3C)。为了监测检测质量,我们将对照井分为不重叠训练和测试组.所有测试井都可以使用这种分析管道正确地分配给各自的处理组,这意味着模型是功能性的(图)。2B)。为了评估次抽样的效果和分类所用的邻域数,我们用随机分配的子样本训练了100次k-NN模型的迭代,每个K-值在1到6之间。这些数据在任何给定的子样本或K-值上训练时的差异最小,表明该方法是稳健的,不受抽样方法的影响(附图)。4).

间充质类细胞器形态学筛选鉴定EMT逆转表观遗传小分子抑制剂

多项研究表明,明显的表观遗传变化与EMT有关,并经常被要求介导EMT转录因子的功能。48,49。因此,EMT逆转表观基因治疗的筛选应能提供对EMT表观遗传学基础的基本认识,并可能导致新的治疗方法。我们从MD安德森癌症中心的应用癌症科学研究所(IACS)获得了一个表观遗传药物库,其中包括65种小分子化学物质,针对多种表观遗传修饰物(读者、作者和橡皮)(补充数据)。1)。这些化合物在四种浓度下进行筛选,并对T11和T12类细胞器进行了两个独立的生物复制。探索性PCA分析表明,药物处理井位于对照组的组分空间内,呈剂量依赖关系,药物浓度较低,主要集中在负控制区,且浓度较高,向阳性和中位对照迁移(图一)。2C)。这些数据鼓励我们使用板块水平和批量聚合数据集来训练一系列k-NN模型。从每个测试板生成的模型被用来提供分析鲁棒性的实时反馈,以及限定单个实验被包含到更大的数据集中。当加入合格的检测批次时,对批聚合模型进行迭代再训练,最终成为用于对实验药物进行分类的模型。对于所有模型,一半的控件被用作培训集,其余的用于根据混淆矩阵计算准确性的统计评估。从这些数据中,我们可以看到,当对T11和T12细胞模型进行批处理(80%)和累积(90%)水平训练时,得到的k-NN模型通常具有很高的准确性,这表明该方法对解决问题的控制是稳健的,并且没有出现主要的批处理效应(补充图)。4).

接下来,药物处理后的有机物被指定为药物活性的连续排序(按剂量-反应曲线下的面积表示,AUC),使用以下三个映射类别的分类概率:阴性(无影响,DMSO样),正(减少分支结构,miR-200C诱导样)或媒体(不存在细胞器)。在我们的数据集中,我们观察到了一些具有饱和信号的药物(即所有数据点都是正的或负的),遵循乙状结肠剂量-反应曲线的药物,最后是具有多阶段反应的药物,其中正向效应转变为毒性效应(即类似于媒体的井),作为增加药物浓度的函数(补充数据)。2)。因此,为了给所有观察到的响应模式提供一个稳健的曲线拟合,我们选择了一种基于支持向量回归的方法。此方法不对曲线的底层形状作出任何假设,因此,与对4参数逻辑回归曲线进行数据拟合相比,该方法更具有普遍性。50。在T11和T12模型中,HDAC和BRD抑制剂被检索为类似miR-200诱导的药物类别,如他们的AUC_pos高分所示(见图)。3A和补充数据2)。在两种克隆-低细胞器模型中,HDACs和BRD蛋白之间的广泛重叠表明,HDACs和BRD蛋白是EMT的共同调节因子(图1)。3B)。针对组蛋白甲基转移酶的抑制剂(HMT,包括PRMT 1/3/4/5、G9a、DOT1L、SETD 7、EZH 2)、组蛋白赖氨酸脱甲基酶(KDM,包括LSD 1、KDM4A/5B/6B)或甲基赖氨酸读取器(MLR,包括L3MBTL3)在大多数浓度范围内与DMSO处理的对照井更相似。

图3:EMT-在器官培养中逆转表观遗传药物筛选。
figure3

aT11和T12类细胞器IACS表观遗传药库筛选的聚类热图。药物处理后的有机物被指定为药物活性的连续排序(按剂量-反应曲线下的面积表示):Neg(无影响,DMSO-样),POS(减少分支结构,miR-200C诱导样)或培养基(无细胞器存在)。采用支持向量回归方法对各类别的浓度概率进行拟合,并根据这些值进行聚类。每种药物的已知分子靶标都显示在注释栏中。每种IACS药物的描述见补充数据1. bVenn图显示了T11和T12模型中重叠的顶部阳性类药物以及它们的目标类别。BRD溴结构域,HAT组蛋白乙酰转移酶,HDAC组蛋白脱乙酰酶,HMT组蛋白甲基转移酶,KDM组蛋白赖氨酸脱甲基酶,MLR甲基赖氨酸读取器,PRMT 1蛋白精氨酸甲基转移酶1。

顶级EMT验证-反向命中

为了验证最初的器官筛选,我们对顶级阳性对照样点击率进行了更完整的剂量-反应分析。在这些试验中,每种药物都在T11和T12模型的技术四倍试验中,以10种浓度作为半对数步骤进行测试。质量控制分析表明,在判别控制井方面有100%的效果(附图)。4)。在剂量-反应曲线中,所有药物在重叠浓度范围内与原筛选结果一致(如图所示)。4A,b)。重要的是,改变器官表型所需的药物浓度是从这组实验中解决的。因此,药物活性的排名是根据效力,这里定义为药物的浓度,需要有50%的概率属于阳性对照类分类(PR)。50)。T11中最有效的EMT逆转药物是Fimepinostat(iacs-101190),这是一种双hdac和PI3K抑制剂,在奈米摩尔浓度时显示出很强的正向效应(如图1所示)。4A)。在t12模型中,Fimepinostat在10 NM范围内表现出一种正向效应,但在高浓度时转变为一种毒性更强的表型,导致一条不典型的曲线无法收敛(图1)。4B)。HDAC抑制剂(givinostat、Abexinostat和Mocetinostat)在接近微摩尔浓度时表现出重编程效应。4B)。为了评估药物对细胞活力的潜在影响,我们使用3D细胞TiterGlo(CTG)在结束时做了一个反屏幕,测量ATP水平作为细胞活力的代用品。这些数据表明,大多数药物所需的浓度,以转移有机物从类似于阴性到阳性对照,是低于造成重大毒性(补充图图)。5),表示重新编程事件。

图4:顶级药物的剂量曲线反应。
figure4

T11浓度正控概率的剂量-反应曲线a)和T12(b)细胞器。数据点表示四个技术副本的均值和标准差。曲线采用带约束的四参数Logistic拟合.下表总结了描述效能(最高概率评分)和效能(LogPR 50浓度)的曲线拟合参数。

为了进一步证实药物对EMT重编程的影响,我们在2D培养中对药物处理的T11和T12细胞进行了免疫印迹试验。在Fimepinostat治疗后,我们观察到在T11和T12中,E-cadherin有很强的诱导作用,相反,ZEB 1和段塞在T11细胞中的表达明显降低(如图1所示)。5A,b)。此外,Fimepinostat治疗诱导Cdh 1启动者驱动的rfp报告活动和Cdh 1RNA表达呈剂量依赖性(附图)。6a,b),表明Fimepinostat对E-cadherin的转录激活。两种BRD抑制剂IACS-070654和I-BET 151(IACS-000044)降低了段塞蛋白和RNA的表达。5A-d)。三种Ⅰ类HDAC抑制剂Abexinostat(IACS-100046)、Mocetinostat(IACS-100074)和givinostat(IACS-100753)均能降低T11细胞中段塞蛋白的表达,并诱导T12细胞中E-钙粘素的表达。这三种HDAC抑制剂也增加了Cdh 1-RFP记者活动和CDH1 RNA在T11和T12细胞中的表达,表明其具有转录调节作用。5A-d,以及附图。6C)。所有这些HDAC抑制剂均能有效地上调组蛋白H3和H4的乙酰化水平,说明药物达到了靶点。作为比较,GSK-J4(IACS-001202)是一种KDM6B抑制剂,在屏幕上没有显示出最高的阳性结果,它没有引起EMT蛋白或RNA的可检测的变化(图一)。5A,c)。综合使用两个独立的类细胞器模型,这些研究说明了形态筛选在鉴别EMT重编程药物中的潜在应用,具有较高的准确性和敏感性。

图5:靶向I类HDAC和BRD蛋白的抑制剂逆转EMT。
figure5

a2D培养T11细胞EMT标记的免疫印迹分析Fimepinostat为200 NM,所有其他药物均为1μM浓度。具有代表性的独立生物三重体图像。b2D培养T12细胞EMT标记的免疫印迹分析Fimepinostat为20 NM,所有其他药物均为1μM浓度。具有代表性的独立生物三重体图像。KDM组蛋白赖氨酸脱甲基酶、BRD溴结构域、HDAC组蛋白脱乙酰酶。cT11细胞EMT标记基因的qPCR检测药物浓度,如(a)。数据是相对于Actb平均±S.E.M。独立的生物三胞胎。dT12细胞EMT标记基因的qPCR检测药物浓度,如(b)。数据是相对于Actb平均±S.E.M。独立的生物三胞胎。NS,没什么意义。未配对学生的统计分析t-测试(双尾)。

为了进一步评估EMT的重新编程是否能提高药物敏感性,我们将T12肿瘤细胞移植到小鼠乳腺脂肪垫中,并在肿瘤可见时开始药物治疗(图一)。6A)。由于Mocetinostat(MOC)目前正在几种肿瘤类型的临床试验中,并且在T12中显示了良好的重编程效果,我们决定在体内测试它的效果。据报道,hdac抑制剂常常与dna甲基转移酶抑制剂如氮杂胞苷(azacytidine,AZA)协同作用,使癌症中异常沉默的基因重新激活。51因此,我们将AZA纳入MOC,以供进一步研究。值得注意的是,氮杂胞苷本身并没有改变细胞器的形态,也没有诱导T 12细胞中E-cadherin的表达(附图)。7)。在体内移植时,应用AZA和MOC联合治疗的T12肿瘤表现出EMT逆转,尽管不同小鼠的肿瘤间存在一些差异,因为这些免疫印迹是在含有基质细胞和免疫细胞的晚期肿瘤上进行的(见图)。6B和补充图。8)。T12肿瘤具有很强的侵袭性,治疗2周后达到伦理终点。单用表观遗传疗法或化疗就能延长小鼠的存活数天。然而,MOC和AZA对卡铂致敏的T12肿瘤的治疗表现为荷瘤小鼠的存活时间延长(如图所示)。6C)。这些数据表明,从形态器官筛选鉴定出的药物有可能用于体内联合治疗。

图6:甲基肌醇与氮杂胞苷联合应用可使间充质肿瘤对化疗敏感。
figure6

a治疗计划示意图。治疗是开始时,肿瘤是可触及的。用氮胞苷(AZA)和莫西他诺他汀(MOC)交替2天周期治疗小鼠,以避免药物干扰。卡铂每周注射一次。bT_(12)肿瘤组织的免疫印迹试验:从单用或表观基因疗法治疗的小鼠的伦理终点获得的肿瘤组织。n=每组5。cT12荷瘤小鼠从治疗开始时间(第0天)的Kaplan-Meier生存曲线。采用对数秩检验(双尾)检验各组间Kaplan-Meier生存曲线的显着性差异。n=每组5。

讨论

在美国,大多数乳腺癌死亡可归因于对常规治疗具有抗药性的复发转移性疾病。探索治疗耐药的分子机制和开发新的治疗方法势在必行,特别是对于没有靶向治疗的TNBC。当EMT赋予癌症干细胞和化疗耐药性时,改变EMT计划的药物的发现可能会提供新的治疗方法,使乳腺癌对标准的护理化疗敏感,并克服治疗的抗药性。此外,EMT逆转药物发现的影响可能远远超出耐药TNBC,扩展到其他类型的耐药癌症和转移性疾病。我们的有机体屏幕的一个独特的特点是它可以区分EMT-重编程效应和直接细胞杀伤,这是大多数细胞活力检测的终点。这一点至关重要,因为这些有针对性的治疗最终可能与临床标准的护理化疗结合使用。

肿瘤器官正被越来越多地用于基础研究和翻译研究。然而,许多用于检测药物作用的端点依赖于生化读数。在这篇文章发表的时候,其他组织已经成功地为药物筛选应用进行了单器官形态分析。52,53,54。利用图像分析的一个有利方面是生物反应的多个方面可以同时被捕获,然后被用来识别独特的分子作用机制。52,55,56。在这些研究中,通过图像分割识别出不同的形态模式。不像那些研究,我们的模型系统创造了一个高度侵入和经常相互连接的形态学,混淆了分割。因此,我们利用DNN派生的图像特征生成一种分析方法,该方法不依赖于显式分割来为该模型系统提供一个自动筛选解决方案。图像分类和回归都可以用DNN启发的方法进行。实际上,人们已经提出了多种方法来实现DNN驱动分析,其中包括对新数据进行DNN体系结构的培训,修复DNN体系结构的描述,以及对剩余部分进行微调,以及直接利用预先训练的卷积层产生的特征作为二次统计建模的输入。从功能的角度来看,训练一个完整的深层神经网络需要几百到数千幅具有代表性的图像,这些图像的主观决定取决于图像的复杂性、训练的类别数以及DNN的具体结构。重要的是,利用大数据的巨大需求主要是由负责特征提取的卷积层的训练驱动的。然而,据观察,在非常大的视觉多样性图像集(如ImageNet数据集)上训练的卷积层通常是信息丰富的,可以通过补充新的数据集对新的应用程序进行“微调”。57。反过来,这又有效地减少了对培训网络所需的大量数据和时间的需求,通常被称为转移学习。最后,图像嵌入简单地将预先训练的卷积层应用于图像,并输出从体系结构的各个层中提取的描述性数字向量。这种方法跳过微调,可以有效地使用相对较小的数据集提供稳健的图像分类。58。同样,我们预计这一方法可以修正到一系列广泛的细胞模型系统中,但要注意的是,表型在视觉上是明显的,并且与从初始训练领域学到的信息有着很远的相似之处。59。有了这个潜在的限制,目前还不清楚这种方法是否会捕捉到不那么明显的表型,还是那些无法预先视觉描述的表型。这种方法的一个潜在的有趣的扩展是使用有机物图像训练DNN的卷积层,以生成一个特定于有机物的特征向量。这可能会进一步提高模型的准确性,并为建立回归模型提供一条途径。然而,要实现这一点,需要一个大得多的数据集,这超出了本研究的范围。

弱的或半监督的学习利用已知的实验结构来生成用于训练的伪标签。60。在这里,一般的假设是,在给定的单元模型中,在类似条件下处理的井将具有相似的响应模式,这在这个数据集中得到了直观的证实。在这种逻辑下,可以根据数据运行的实验条件为数据分配伪标签。这类逻辑已成功地部署在其他实验环境中,目的是将具有类似作用机制的药物聚类在一起。60。利用这些标签,构造了一个基于内容检索图像的简单模型。虽然该方法存在一定程度的不精确性,但在不重叠训练/测试分割的实验批次中实现鲁棒模型可以提供性能的鲁棒估计。

在本研究中,我们发展了一种筛选方法,将经过预处理的DNN的一般图像特征与用于映射实验处理与参考控制相似的k-NN模型结合起来。我们之所以选择使用这种方法,是因为从各个层次的dnn体系结构中提取信息所产生的特征空间在各种图像分类任务中都表现出了健壮的性能,并且与“手工构建”的特征空间(如缩放不变特征变换(Sift)、局部二进制模式(Lbp)和定向梯度直方图(Hog)相比,性能相当(如果不是更好的话)。58,61,62,63。利用k-nn将未标记的井映射到控制类条件,通过可视化最近的邻居来确定分类标签,从而提供某种程度的解释,同时仍然考虑到在控制条件下所发现的视觉异质性,这进一步有益于使用k-nn。64,65.

我们的收藏Trp53-空GEM模型显示出明显的肿瘤间异质性,与人TNBC有显著差异。45,66。在对肿瘤衍生的三维细胞器的检查中,我们发现被归类为claudin低亚型的肿瘤模型倾向于形成一个尖峰状的细胞器形态,而那些被归类为基底状的肿瘤模型倾向于形成更圆形的细胞器(补充图)。9)66。这种与间充质性质的相关性可能是由于间充质肿瘤细胞在低密度模型中具有较高的运动能力和侵袭力。虽然T11和T12都被归类为克隆素低肿瘤,但肿瘤间存在异质性,这可以从T11和T12细胞的药物反应差异中反映出来。例如,大多数药物的PR50浓度在T12中低于T11(图1)。4BRD抑制剂仅抑制T12细胞ZEB 1的表达,而不抑制T11细胞的ZEB 1表达,与T11细胞相比,HDACi更容易诱导T12细胞中的E-cadherin表达。5)。这些数据表明,在这两个表型相似的模型中,存在着不同的遗传和/或表观遗传景观。

在过去的几十年中,多个表观基因调节因子被认为是2D中不同癌细胞株EMT程序的调制子,例如HDAC、DNMT、LSD 1、KDM6B、PRMT 5、EZH 2和G9a。67,68,69,70,71,72,73,74,75,76。然而,药物作用是高度上下文依赖和间充质细胞接近EMT光谱结束时,特别难以重新编程。HMT和KDM抑制剂在这些筛选中均未显示为阳性,这一事实表明HMT和KDM在维持claudin-低细胞的EMT状态方面可能不像Ⅰ类HDAC和BRD蛋白那么重要,而靶向HMT或KDM在改善体内化疗反应方面的作用可能较小。作为识别新疗法的发现平台,除了本研究中使用的小焦点表观遗传药物库外,还可以使用该平台分析更多的库。这种方法也可以应用于FDA批准的药物,以促进快速的药物再用途.


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