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TSC 2通过非规范的RAGC和TFEB依赖机制调节溶酶体的生物发生

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发表时间:2021-07-20 14:14作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

结节性硬化症(TSC)是由TSC 1TSC 2突变,导致雷帕霉素复合物1(MTORC 1)机械靶的过度激活。转录因子EB(转录因子EB)是溶酶体生物发生的主调节因子,通过rag gtp酶依赖的磷酸化被mTORC 1负调控。在此,我们发现TSC相关的肾脏肿瘤,肺淋巴管平滑肌瘤病,TSC 2肾脏的溶酶体生物发生增加。+/−老鼠,和TSC 1/2-缺乏细胞通过TFEB依赖的机制。有趣的是TSC 1/2-细胞缺乏时,TFEB在mTORC 1依赖位点发生低磷酸化,表明在TSC 1/2复合物不存在的情况下,mTORC 1不能磷酸化TFEB。重要的是,作为RAGC的GTPase激活蛋白,卵泡蛋白(FLCN)的过表达增加了mTORC 1位点的TFEB磷酸化。TSC 2-缺乏细胞。本构活性RAGC的过表达足以使TFEB重新定位于细胞质。这些发现通过TFEB和RAGC建立了TSC蛋白作为溶酶体生物发生的关键调节因子,并鉴定了TFEB作为细胞增殖的驱动因子。TSC 2-缺乏细胞。

导言

结节性硬化症(TSC)是由突变性失活引起的。TSC 1TSC 2抑癌基因1。TSC影响多种器官,包括脑、心、肾、肺和皮肤。2。虽然TSC的大多数肿瘤是良性的,但恶性肿瘤也会发生,尤其是在肾脏。3。TSC 1和TSC 2是整合细胞外环境(氧、能量、营养、生长因子)信号的蛋白质复合体的一部分,通过富集于脑中的小GTPase Ras同源物(Ras),调节雷帕霉素复合物1(MTORC 1)的机械/哺乳动物靶标的激酶活性。4,5,6,7,8。赖氨酸依赖的mTORC 1活化发生在溶酶体表面。9。标志TSC 1TSC 2-缺乏细胞(下称“缺陷细胞”)TSC-缺陷细胞)因此是mTORC 1的过度激活,而mTORC 1被认为是TSC肿瘤发生的主要驱动力。

转录因子EB和转录因子家族的其他成员(MITF,TFE 3,TFEC)是溶酶体基因表达、溶酶体生物发生和自噬的主要调节因子。10,11,12,13,14。Tfb的定位和功能受到mTORC 1激酶活性的密切调控,tfb磷酸化导致14-3-3-3蛋白对细胞质的固存作用。13,15,16,17.

溶酶体中mTORc 1的合成是通过与ras相关的gtp结合蛋白(Rag Gtpase)相互作用来实现的,这些蛋白质在氨基酸丰富时被激活。18。为了被mTORC 1磷酸化,tfb也需要被rag gtp酶招募到溶酶体中。19。卵泡蛋白(FLCN)是一种用于RAGC/D的GTPase激活蛋白。19,20,21,22从而调节溶酶体表面mTORc 1和TFEB的丰度。19,23,24。生殖系突变FLCN遗传性癌症综合征BIRT-Hogg-Dube(BHD)25,26,与TSC具有共同的临床表型,包括皮肤良性肿瘤、囊性肺疾病和肾细胞癌(RCC)。

因为mTORC 1在TSC中是多活性的,所以TFEB应该是主要的细胞质。TSC-缺乏细胞。然而,以前的研究TSC-缺乏细胞在TFEB定位方面显示出相互矛盾的结果。13,15,24,27,28,29。这里我们证明,尽管mTORC 1的活性很高,但在TSC-缺乏细胞,TFEB以细胞核为主,且在mTORC 1依赖的位点意外地低磷酸化。此外,TFEB在体内外促进溶酶体基因的表达并促进细胞增殖。TSC 2-缺乏细胞。最近发现bhd的肾肿瘤发生与tfb有关。24。这支持了TFEB的调控是TSC肿瘤发生与BHD之间的重要机制联系的概念,在这些疾病中有一些临床相似之处,并进一步强调了TFEB可能是TSC肿瘤发生的主要驱动因素之一。综上所述,我们的发现表明TFEB是TSC蛋白与疾病相关的关键靶点.

结果

TSC中溶酶体丰度、溶酶体基因表达和蛋白水平均有不同程度的提高。

肾脏疾病是TSC发病率和死亡率的主要来源。30,31。为探讨肾损害的发病机制,对18月龄的肾进行了透射电镜检查。TSC 2+/−小鼠,发育肾囊肿和膀胱腺瘤32。这表明囊性上皮细胞内的溶酶体数目比正常的邻近肾增加了3倍(见图)。1A,b)。随着溶酶体数目的增加,溶酶体胆固醇转运体niemann-pick c1(Npc 1)的表达也随之增加。33,在小鼠肾脏囊性上皮细胞中富集。1C)。有趣的是,NPC 1在TSC患者(血管平滑肌脂肪瘤和肾细胞癌)的肾脏病变中也比相邻的正常肾脏丰富(图1)。1D-f,补充图。1A)。在……里面TSC 1−/−TSC 2−/−小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)、溶酶体基因等mRNA水平NPC 1, 尼曼-选择c2(Npc2), 组织蛋白酶K(CTSK)六氨基化酶与对照组相比增加2~6倍(图1)。1g,h),NPC 1和组织蛋白酶K蛋白水平较高。TSC 2−/−MEFS与对照组比较(图1)。1I)。这些结果证实了溶酶体,越来越被认为是肿瘤发生的关键驱动因素。34,35,36,富含TSC。

图1:TSC溶酶体生物发生增加。
figure1

a透射电镜显示18mo肾囊衬里细胞溶酶体增多(白色箭头)TSC 2+/−小鼠与正常肾脏相比。N表示核。标尺=2公厘。b18mo 10个领域/肾脏溶酶体的定量研究TSC 2+/−小鼠囊肿及邻近正常小管(n=4肾),p=0.0285。ce肾囊肿溶酶体标记NPC 1的免疫组织化学研究TSC 2+/−老鼠(n=6个肾脏),(左图像刻度栏=100米,右图像刻度栏=20m)(c),人肾血管平滑肌脂肪瘤(n=3个病人样本)(左图像标度栏=100米,右图像刻度栏=10m)(d)和TSC相关的肾细胞癌(n=3个病人样本)。标尺=100毫米(e)。D中的虚线显示右侧血管平滑肌脂肪瘤细胞与左侧血管之间的边界。fNPC 1对TSC相关肾细胞癌的光密度定量(3例标本中5个肿瘤随机区和正常相邻肾切片的20次测量)。g, h人溶酶体基因的qRT-PCR分析TSC 1+/+TSC 1−/−多边环境基金(g)和TSC 2+/+TSC 2−/−多边环境基金(h), (n=每个条件下3个生物复制)。i细胞溶酶体蛋白NPC 1和组织蛋白酶K(CTSK)的免疫印迹分析TSC 2+/+TSC 2−/−多边环境基金(n=每种条件下生物复制3次,样品不连续,来自同一凝胶)。图为均值±SD。使用Mann-Whitney对b进行了统计分析。U测试*p < 0.05. Statistical analyses in (f), (g),以及(h)用双尾学生表演。t-测试*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Source data are provided as a Source data file.

TSC-缺乏导致TFEB的核定位和活性增加,而在丝氨酸142和211处,TFEB磷酸化降低。

为了了解TSC高溶酶体丰度的机制,我们重点研究了已知的溶酶体生物发生调控因子(TFEB、TFE 3、MITF、TFEC)。10,11,13。我们发现TFEB,但不是TFE 3MITF,在TSC-补充图(补充图)1B). 特快专递没有表达。如前所述,尽管mTORC 1磷酸化TFEB会导致其细胞质固存。13,15,16,17,TFEB的本土化TSC-缺乏细胞是有争议的15,16,24,27,29。我们发现TFEB主要存在于黑色素瘤黑色素瘤(HMB 45)和npc 1阳性淋巴管肌瘤病(LAM)结节中,这是TSC的肺部表现。37(补充图。1C-E)。TFEB在TSC相关的肾癌和肾血管平滑肌脂肪瘤中也主要是核的。2A-C),以及TSC 1/2-零MEFs(附图)2A).

图2:TSC 2失联可诱导核定位,增加TFEB的转录活性。
figure2

aTFEB在TSC相关肾细胞癌中增加,且主要为细胞核.虚线显示肿瘤与正常相邻肾的边界。标尺=100公厘。bTFEB光密度定量从a,(15个测量的5个随机区肿瘤和正常相邻肾脏每切片在3例患者样本)。c与血管相比,TFEB主要存在于血管平滑肌脂肪瘤中。虚线显示右侧肿瘤细胞与左侧血管之间的边界。黑色箭头表示肿瘤细胞中有核TFEB。白色箭头表示血管壁细胞中的细胞质TFEB(n=3个病人样本)。左图像标尺=100 m,右图像标尺=10μm。d, e转染HeLa-TFEB-gfp细胞TSC 1TSC 2SiRNA作用72h,共聚焦实时成像显示。标尺=50m(d)。用ImageJ对GFP的核/细胞质比进行了量化,如方法中所描述的,(n=每个条件3个随机场,29个Ctrl siRNA细胞,30个Ctrl siRNA细胞TSC 1SiRNA和29个细胞TSC 2对siRNA进行了分析。e). f转染HeLa-TFEB-GFP细胞的代表性免疫印迹Ctrl,TSC 1TSC 2SiRNA作用72h(n=每个条件下3个生物复制)。用所指示的抗体染色进行印迹分析,磷脂S6(S 235/S 236)是mTORC 1活性升高的指标,NPC 1是TFEB转录活性的指标。g用ImageJ对荧光粉TFEB S 142和磷酸盐TFEB S 211进行了密度测定,并将其归一化为总TFEB-GFP(n=每个条件下3个生物复制)。h稳定表达HeLa和HeLa-TFEB-GFP的荧光素酶活性GPNMB荧光素酶报告和转染TSC 2FLCN(作为阳性对照)siRNAs持续72h(n=每个条件下3个生物复制)。图为均值±SD。对两尾学生进行了统计分析。t-测试或单向方差分析,如果超过两组,**p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Source data are provided as a Source data file.

为了了解tfb在tsc中核化的机制,我们使用稳定表达tfbb-gfp的hela细胞,尽管mtorc 1活性很高。13,15,16,17。首先,我们证实了外源gfp标记的tfb的核富集。TSC 1TSC 2被siRNA击倒(见图。2D,e)。接下来,我们检测了TFEB在mTORC1依赖位点(S 142和S 211)的磷酸化。令人惊讶的是,mTORC 1依赖的两个位点都在TSC-缺乏HeLa-TFEB-GFP细胞。2F,g).

以确定核TFEB是否在TSC 2-缺陷细胞活跃,我们从跨膜糖蛋白nmb(Gpnmb)启动子、tfe 3-tfb靶和溶酶体糖蛋白中产生一种新的荧光素酶结构。38. TSC 2SiRNA的下调增加了GPNMB启动子在HeLa细胞中为10倍,在HeLa-TFEB-GFP细胞中为27倍。2H)。下调FLCN,作为阳性对照,提高了.的启动子活性。GPNMBHeLa细胞为7倍,HeLa-TFEB-GFP细胞为10倍。2H).

在……里面TSC 1-零和TSC 2-我们观察到的零MEF增加了TFEBMRNA表达(附图)1B因此,在这些细胞系中,TFEB的核定位和活性增加可能是由于其较高的总水平所致。HEK293T细胞TSC 2被siRNA击倒后,我们只发现TFEBMRNA表达(20%)。3A),在蛋白质水平上没有明显的变化(如图所示)。3B),主要是核TFEB(图1)。3C)。同样,在HeLa细胞之后TSC 2经CRISPR基因敲除后,我们观察到其mRNA表达增加了50%。TFEB(无花果)三维空间),在蛋白质水平上没有明显的变化(如图所示)。3E),核/细胞质分馏后核TFEB明显增加(图1)。3F表明TFEB核定位的增加并不是由表达增加所致。

图3:内源性TFEB和TFE 3在TSC 2缺乏的HEK293T和HeLa细胞的细胞核中富集。
figure3

aQRT-PCR分析TSC 2TFEB转染对照组或对照组的HEK293T细胞中的表达TSC 2SiRNA作用72h(n=每个条件下3个生物复制),p < 0.0001 for TSC 2p=0.0008TFEB. b转染的HEK293T细胞全细胞裂解物的免疫印迹分析a)有指示的抗体,并用于在.中进行分馏。c). c转染的HEK293T细胞胞浆(Cyto)和核(核)组中TFEB和TFE 3的免疫印迹分析(英文)a),GAPDH和CREB分别作为细胞质和核分数的标记物。dQRT-PCR分析TFEB非靶向控制的HeLa细胞中的表达克特)或TSC 2CRISPR敲除(TSC 2 KO) (n=3次生物复制),p=0.0062。e全细胞裂解物中TFEB和TFE 3的代表性免疫印迹克特TSC 2 KOHeLa细胞用于(f),以磷S6(S 235/S 236)和p4E-BP1(Thr 37/46)作为mTORC 1活性的指标,NPC 1作为TFEB转录活性的指标。fHeLa细胞质(细胞)和核(核)组分中TFEB和TFE 3的免疫印迹克特TSC 2Ko细胞、GAPDH和CREB分别作为细胞质和核分数的标记物。n=每个条件下3个生物复制)。图为均值±SD。对两尾学生进行了统计分析。t-试验,**p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Source data are provided as a Source data file.

TFE 3也主要是在TSC-缺乏细胞(图1.3C,f,补充图。2B, c)类似于TFEB,TFE3mRNA和蛋白质的表达不受TSC 2损失。在mTORC 1依赖的磷酸化位点(S 142,S 211和S 142/S 211),TFEB过表达,丝氨酸向丙氨酸突变,导致两者的核定位。TSC 2-表达和TSC 2-缺乏HeLa细胞(附图)。3).

为了证实gpnmb启动子活性的提高和溶酶体基因表达的增加,TSC 2-细胞缺乏时,我们用siRNA下调TFEB,观察到细胞减少。GPNMB启动子活性(附图)4A),GPNMB蛋白的表达(附图)。4B),以及多个溶酶体基因的表达减少,包括GPNMB,ATP酶H+转运VO亚基D2((ATP 6V0D2)、白细胞介素33(伊-33) NPC 1和Mucolipin1(MCOLN 1)(补充图。4C).

TFEB击倒降低TSC 2-缺陷细胞

为了更好地了解TFEB在TSC中的作用,我们击倒了TFEB。TFEB在……里面TSC 2-用两种不同的shRNAs表达和缺失MEFs(图1)。4A)。下调TFEB减少.的增殖TSC 2−/−MEF,减少25%ShTfeb#1减少45%ShTfeb#272h(图1.4B). TFEB下调不影响TSC 2+/+MEFs(图1.4B)。雷帕霉素(20 Nm)对细胞增殖无明显影响。TSC 2-缺乏细胞TFEB监管下调(附图)5A),尽管它降低了TFEB约2倍(补充图.)5B)。体内,皮下生长TSC 2-空的MEFs在细胞中减少了3倍TFEB监管下调(图一)4C)。把这些数据结合起来TFEB作为.的司机TSC 2-体外和体内缺乏细胞增殖。

图4:TFEB下调减少扩散TSC-缺乏细胞。
figure4

a转录因子EB基因shRNA基因敲除的确证TSC 2+/+TSC 2−/−多边环境基金(n=每个条件下3个生物复制)。b增殖TSC 2+/+TSC 2−/−MEF克特TFEB结晶紫染色法测定shRNA(n=每个条件下的12个生物复制)。c肿瘤体积TSC 2−/−MEF克特TFEB免疫缺陷小鼠皮下注射shRNA#2(n=每组10人)。图为均值±SD。对两尾学生进行了统计分析。t-试验,**p < 0.01, ****p < 0.0001. Source data are provided as a Source data file.

FLCN和TSC 2协同调节TFEB的定位、活性和磷酸化

FLCN是RAGC/D的一个空白,它将RAGC/D从非活动(Gtp)绑定形式转换为活动(Gdp)约束形式,从而便利TFEB在溶酶体表面被mTORC 1磷酸化。19,20,21,22,23,39。有趣的是,我们发现FLCN表达增加了~2倍TSC 2Hela和Hela-TFEB-GFP细胞的下调(图1)。5A)。为了检验TSC 2和FLCN之间的关系,TSC 2FLCN在HeLa和HeLa TFEB-GFP细胞中单独和联合应用siRNA下调表达。联合下调TSC 2FLCN导致TFEB-GFP的核定位更强(见图)。5B,c),进一步增加GPNMB活动(图1.5D),S 211磷酸化进一步降低(图1)。5E,f),且溶酶体基因的表达高于单基因敲除。TSC 2FLCN(无花果)5G)。同时,我们发现在HEK293T细胞中,FLCN(Myc-FLCN)的过表达部分恢复了HEK293T细胞S 142和S 211的TFEB磷酸化。TSC 2SiRNA下调(图1.5H,i)。进一步研究CRISPR介导的TSC 2和FLCN基因敲除将对这些基于siRNA的发现起到重要的补充作用。

图5:TSC 2和FLCN在TFEB磷酸化、核易位和溶酶体基因表达调控中起协同作用。
figure5

aQRT-PCR分析FLCN转染的HeLa和HeLa-TFEB-gfp细胞克特TSC 2SiRNA作用72h(n=每个条件下3个生物复制),p=0.0005pHeLa TFEB-GFP细胞=0.007。b, c用指示siRNAs转染HeLa-TFEB-GFP细胞72h,固定和染色后进行共聚焦成像分析。标尺=50m,b,用细胞轮廓仪定量测定TFEB-GFP的核/胞质比c(146个细胞在Ctrl siRNA中被分析,140个细胞在TSC 2SiRNA,120细胞FLCNSiRNA和88细胞TSC 2+FLCNSiRNA分析n=3个生物复制体)。d稳定表达HeLa和HeLa-TFEB-GFP的荧光素酶活性GPNMB荧光素酶报告,转染指示siRNAs 72h(n=每个条件下6个生物复制)。e, f磷酸化TFEB在HeLa-GFP-TFEB细胞S 211下调后的代表免疫印迹TSC 2, FLCN,或用所指示的抗体染色,以膦-S6(S 235/S 236)作为mTORC 1活性的指标(e),用ImageJ定量,归一化为总TFEB-GFP(n=每个条件下3个生物复制)(f). gSiRNA下调72h后HeLa细胞溶酶体基因的表达TSC 2, FLCN,或两者兼而有之(n=3个生物复制条件)。h, iMyc-FLCN在HEK293T细胞中的过表达TSC 2SiRNA下调增强了S 211和S 142的TFEB-GFP磷酸化。h),用ImageJ定量,归一化为总TFEB-GFP(i) (n=3个生物复制体)。图为均值±SD。对两尾学生进行了统计分析。t-测试,或单因素方差分析,如果超过两组,*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Source data are provided as a Source data file.

激活RAGC GTPase是必要的,足以将TFEB定位到细胞质中。TSC 2-缺乏细胞

我们的数据显示FLCNTSC 2在tfb磷酸化、定位和活性方面也有类似的作用,导致我们将注意力集中在rag gtp酶上。TSC 2-缺乏细胞。我们发现RAGCRAGD使HeLa细胞的mRNA水平升高。TSC 2FLCN,甚至随着对两者的下调而进一步增加。TSC 2FLCN(补充图。6A)。在HeLa-TFEB-gfp中(不表示可检测到的RAGD)的表达式中发现了类似的模式。RAGCMRNA和蛋白质水平(补充图)。6B,c)。有趣的是,RAGC/D已经被证明是TFEB的目标40.

增加RAGC/D表达在TSC 2-缺乏细胞,加上FLCN表达,提示RAG GTPase在TSC中TFEB核定位中的潜在作用。以确定TFEB是否在TSC 2-缺乏细胞依赖于rag-我们过度表达野生型raga/C和构成性活性(CA)raga/C(Raga)。Q66L-GTP约束,RAGCS75N-国内生产总值)41在HeLa-TFEB-GFP细胞中TSC 2-监管下调。Ca活性raga/C,而非野生型raga/c,降低了hela-TFEB-gfp细胞的核定位。TSC 2-下调监管(图一)。6A)。为了分析杂合二聚体的哪些成分是导致TFEB-GFP核定位降低的主要原因,我们分别表达了野生型(WT)rag A、WT rag C、CA rag A和CA rag C(但不是WT raga、WT RAGC或CA raga)降低了核TFEB-GFP水平。6B,补充图。7a,b)。CARAGC能提高细胞S 211的TFEB磷酸化水平TSC 2监管下调(图一)6CCARAGC与CA RAGA/C组合在将TFEB-GFP重新定位到细胞质方面同样有效(附图)。8a,b)和在S 142/211时增加TFEB的磷酸化(补充图1)。8C)。用mTOR激酶抑制剂Torin 1(250 nM,6 h)处理后,TFEB在两种药物中均有核定位。SiCtrlSiTSC 2HeLa-TFEB-GFP细胞表达CA RAGC(附图)。9)。这些数据表明TFEB在TSC 2-缺乏细胞是RAGC和mTOR-依赖性的。6d).

图6:racc的激活足以使tfb重新定位到细胞质中。TSC 2-缺乏细胞。
figure6

a野生型(WT)RAGA+WT RAGC转染HeLa-TFEB-GFP细胞72 h后的免疫荧光分析与活性(CA)RAGA(RAGA Q66L)+CA RAGC(RAGC S75N)共48 h(n=每个条件下3个生物复制)。bHeLa-TFEB-GFP细胞免疫荧光分析TSC 2SiRNA下调,如a),单独转染WT RAGA、CA RAGA、WT RAGC或CARAGC 48 h(n=每个条件下3个生物复制)。c具有代表性的细胞免疫印迹分析b)有指示抗体(n=每个条件下3个生物复制)。dTSC 2通过RAGC(与BioRender.com创建)调节TFEB细胞质/核定位的工作模型。标尺=50m。源数据作为源数据文件提供。

讨论

在本研究中,我们证明TFEB在人TSC病变和TSC-缺乏细胞并伴有急、慢性下调TSC 2TSC 1,在体外和体内促进溶酶体生物发生和细胞生长。在……里面TSC-细胞缺乏时,TFEB在mTORC 1依赖性位点被低磷酸化.TFEB在TSC中的核定位和低磷酸化是意外的,因为TSC-缺失细胞具有较高的mTORC 1活性,mTORC 1磷酸化TFEB是TFEB细胞质固存的一种成熟机制。13,15,16,17。区域内TFEB定位的先验分析TSC 2-缺乏的细胞表现出不同的结果,一些研究显示主要是核定位。28,29其他主要是细胞质定位15,24,27。值得注意的是,先前的研究集中在培养的细胞模型上,而我们的工作也包括小鼠和人类肿瘤标本的TSC,细胞模型的急慢性丢失。TSC 2的多种方法TSC 2下调(短期衍生TSC 2+/+TSC 2−/−MEFs、siRNA和CRISPR/Cas9下调TSC 2)。目前还不清楚产生不同结果的原因,但可能反映出营养状况和(或)持续时间和范围的差异。TSC 2监管下调。综上所述,我们的数据表明,一个非规范的调控机制负责TFEB在TSC中的核定位。

溶酶体是肿瘤发生的新驱动力。34,35,36. TFEBTFE 3是癌基因,易位涉及剪接基因和TFE 3(或TFEB)造成特别咄咄逼人的农村信用社,对儿童和年轻人造成不成比例的影响。42,43。这些易位的rcc,以前被称为“tsc样”。42,可能反映了TSC患者与肾癌的主要相似之处。3,44,其中我们发现高水平的核TFEB和高表达溶酶体蛋白NPC 1。此外,TFEB已被证明是胰腺癌的主要驱动因素。45。我们的数据支持了TFEB的激活是TSC肾肿瘤发生的关键驱动因素这一概念。

TFEB及其家族成员TFE 3和MITF也可能通过增强溶酶体生物发生和/或其他机制参与TSC的其他表现。组织蛋白酶K(一种溶酶体酶)在肺LAM中被上调。46与正常脑相比,TSC相关的室管膜下巨细胞星形细胞瘤中多个溶酶体基因增加。47。TFEB和溶酶体通过一种非规范的RAGC依赖机制直接参与TSC的发病机制,这一假说质疑了mTORC 1对其典型底物的多活性是TSC肿瘤形成的独特驱动因素的观点。

核TFEB增加是BHD综合征的一个特征24,与TSC在临床上有相似之处(这两种疾病都与嗜铬细胞癌、面部良性肿瘤和囊性肺病有关)。48,49。Bhd是由FLCN,已知的RAGC/D缺口20,21,22。不同体外和体内BHD模型的mTORC 1活性水平有很大差异,但也有一些差异。FLCN-缺乏mTORC 1活性较低的细胞50,51而另一些则表现出较高的mTORC 1活性。24,52,53。作为RAGC/D的空白,FLCN基因敲除将导致mTORC 1活性降低。51另一方面,fcn缺失可以通过TFEB增加ragd的表达,从而促进rag gtp酶依赖的mtrc 1的激活。40,事实上在bhd相关的rcc中已经观察到了mtrc 1的过度活动。54。我们发现RAGC和RAGD在两者中的表达都增加了。TSC 2FLCN-缺乏HeLa细胞,RAGC/D在细胞中的表达增加,两者的表达下调。TSC 2FLCN。RAGC/D表达增加TSC 2-缺乏细胞可能是另一种机制,通过这种机制,缺乏TSC 2保持较高的mTORC 1活性,类似于所提议的那样FLCN损失40,55.

我们发现,构成性活跃的RAGC,而非野生型RAGC,足以诱导细胞内TFEB定位。TSC 2-缺陷细胞进一步支持FLCN和TSC 2通过RAGC/D的活性平行调节TFEB的模型。TSC缺乏环境,RAGC/D活性受损是mTORC 1不能磷酸化TFEB的原因。FLCN-缺乏细胞20,24,56。此外,合并损失的事实是FLCNTSC 2诱导TFEB更强的核定位,而FLCN过度表达TSC 2-缺乏的细胞增加了TFEB在mTORC 1位点的磷酸化,支持TSC和BHD之间的致病联系。将需要进一步的工作来确定TFEB灭活可减轻基因工程小鼠的tsc模型的肾脏疾病,最近已被证明为bhd相关的肾脏疾病。24.

总之,我们发现了一种非典型的RAGC依赖途径,TSC复合物的丢失使TFEB进入细胞核,增加溶酶体基因的表达和细胞增殖。TFEB代表了TSC和BHD的临床表现之间先前未被确认的致病联系,可能是治疗这两种疾病的治疗靶点。


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