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抑制DNA损伤反应磷酸酶PPM1D重组中性粒细胞增强抗肿瘤免疫应答

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发表时间:2021-06-16 15:33作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

PPM1D/Wip 1是抑癌基因p53的负调节因子,在多个实体肿瘤中均有过表达。最近的报道将功能增益突变联系在一起。PPM1D免疫细胞对几种人类癌症的治疗效果更差。这里我们展示了基因敲除小鼠PPM1D或有条件地击倒.PPM1D在造血系统、髓系细胞或中性粒细胞中,均显示出明显降低同基因黑色素瘤或肺癌肿瘤的生长。PPM1D敲除中性粒细胞广泛浸润肿瘤。化学抑制Wip 1在人或小鼠中性粒细胞中增加抗肿瘤表型,p53依赖的共同刺激配体的表达,以及共同培养的细胞毒性T细胞的增殖。这些结果表明,抑制中性粒细胞中Wip 1的表达增强了免疫抗肿瘤反应。

导言

先天免疫细胞和适应性免疫细胞的免疫监视可以消除异常细胞,有效抑制肿瘤的发生。1。然而,肿瘤与免疫系统之间的持续相互作用可能通过免疫编辑导致免疫抑制。2。以免疫检查点抑制剂为基础的抗癌治疗将减少免疫抑制作为一种有效的治疗策略。3。然而,目前的抗肿瘤免疫治疗只对一小部分患者完全有效,这反映了肿瘤免疫反应的复杂性。4。在肿瘤微环境(TME)中,中性粒细胞与其他造血细胞一起形成抗肿瘤免疫反应,影响免疫治疗方案的疗效。中性粒细胞属于先天免疫系统的髓系,在癌症中起着双重作用。在肿瘤发生的早期阶段,肿瘤相关的中性粒细胞(Tans)刺激抗肿瘤免疫反应。5。在肿瘤细胞持续的病理信号传递下,中性粒细胞可能具有免疫抑制作用,并对主要的抗肿瘤效应细胞、CD8+细胞毒性淋巴细胞和NK细胞产生负调控作用。6,7.

P53对TME免疫反应的调节作用被认为是其抑癌功能的一个重要方面。8,9,10。野生型p53诱导磷酸酶Wip 1PPM1D基因,是一种金属依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,在dna损伤剂作用下由p5 3转录诱导。11,12。基于细胞的研究表明wip 1负调控多种肿瘤抑制因子,包括p53、atm和MAPK。13,14,15,16。这个PPM1D基因扩增和/或wip 1蛋白在几种人类癌症中过度表达;过高表达wip 1的肿瘤通常保留野生型p5 3,尽管功能受损。17,18,19。Wip 1加速几种小鼠肿瘤模型的发生并增加自发肿瘤的发生率。13,20,21,22,23.

Ppm1d在免疫细胞分化过程中发挥细胞类型特异性作用。24,25。它正调节T细胞和B细胞的发育,但负调节中性粒细胞的发育。26,27,28,29,30。最近的研究表明,免疫细胞中PPM1D/Wip 1的活性水平影响肿瘤的进展。蛋白质截短变异体(PTVS)的存在PPM1D在免疫细胞中,而在乳腺癌和卵巢癌的肿瘤中,患者的预后更差。31。这些体细胞PTVPPM1D该基因被聚集在第6外显子中,并通过增加蛋白质的稳定性和活性而获得“功能增益”。32。对于其他几种癌症,PTV的存在PPM1D免疫细胞与患者预后不良相关33,34,35,36。有趣的是,在最近公认的不确定电位(芯片)克隆造血的前期条件下,也发现了相同的PTVS。PPM1D被鉴定为驱动基因37。不像其他芯片驱动基因,PPM1D突变与骨髓增生异常综合征(MDS)或急性髓系白血病(AML)风险增加无关。38。克隆造血PPM1D外显子6突变也被发现与年龄增长显著相关。39或事先接触化疗40,41通常与更糟糕的结果有关42.

我们推测免疫细胞中Wip 1的表达水平通过改变TME中的免疫抑制程度而影响肿瘤的进展。我们开始研究Wip 1表达水平或活性对抗肿瘤免疫反应的影响。

在这项工作中,我们展示了PPM1D在人和小鼠肿瘤浸润的中性粒细胞中过度表达,其在髓系细胞中的基因缺失或化学抑制增加了它们的抗肿瘤表型,抑制了肿瘤的发生。

结果

造血系统Wip 1缺乏抑制肿瘤生长

为了研究降低免疫细胞中Wip 1表达对肿瘤进展的影响,我们建立了条件基因敲除小鼠系。PPM1D基因。通过敲除鼠标项目(KOMP)43,第3外显子PPM1D基因被确定为一个关键外显子,其缺失导致Wip 1的表达和功能丧失(补充图)。1A)。我们给ES细胞注射了PPM1DTm1a(KOMP)WTSI将基因捕获等位基因克隆到C57BL/6小鼠中。通过F2代分别与c57bl/6β-actin-cre小鼠或c57bl/6β-actin-flp小鼠杂交,获得了PPM1DTm1b(KOMP)WTSI等位基因,生殖细胞系PPM1D敲除(此处称为PPM1D二氧化钾)在内源性调控下表达LacZ报告蛋白的PPM1D启动子或带有条件敲除等位基因的小鼠PPM1DTm1c(KOMP)WTSI(在此称为PPM1Dfl),表示野生型Wip 1。在全身或组织选择性地暴露于cre重组酶后,氧氟沙星第3外显子两侧位点之间的重组会产生基因敲除等位基因,PPM1DTm1d(KOMP)WTSI,称为PPM1DKO_3。人类FES启动子在造血祖细胞和髓系细胞中具有很高的活性,表达fes-cre基因的小鼠对研究造血系统中的基因缺失很有帮助。44,45。通过Fes-cre小鼠的连续杂交PPM1DFl/fl老鼠,我们生产PPM1DFl/fl;tg(fes-cre)小鼠,在此称为PPM1DFES-cre小鼠,缺乏WIP 1在造血细胞中的表达(补充图。1B)。植物基因组DNA分析PPM1DFl/fl小鼠证明在皮肤成纤维细胞和肝脏标本中都存在第三外显子的等位基因(补充图)。1C,左面板)。在……里面PPM1DFES-cre仅在造血祖细胞中表达cre重组酶的小鼠,以及含有肝内造血细胞和肝细胞的肝样本基因组DNA,其第3外显子缺失,产生了代表基因敲除等位基因的296 bp产物(补充图)。1C、右面板和附图。1D)。同时,缺乏造血细胞的皮肤成纤维细胞根据其各自的造血细胞含量,表现出基因敲除等位基因的缺失。此外,我们还杂交了r26R-eyfp报告小鼠。46用Fes-cre小鼠证明造血细胞发生了成功的cre基础重组,但不能在其他组织类型中发生,如肠上皮(附图)。1E)。老鼠的等位基因是纯合子的,PPM1DFl/fl,表达野生型Wip 1,表现为与野生型小鼠无区别。与前面描述的生殖系Wip 1基因敲除小鼠的结果一致(PPM1DTm1Lad/tm1Lad)27,28,47, PPM1DFES-cre小鼠外周血淋巴细胞减少,粒细胞增多,淋巴细胞减少,中性粒细胞减少,随年龄增长(图二)。1A).

图1:造血细胞缺乏抑制实体肿瘤的生长。
figure1

a年龄分层淋巴细胞及外周血粒细胞数PPM1DFl/flPPM1DFES-CRE (PPM1DFl/fl;Fes-CRE小鼠(n=12种基因型)。bB16F10黑色素瘤生长曲线下肿瘤体积(左)和肿瘤生长面积(AUC)(右)PPM1DFl/fl (n=5)和PPM1DFES-CRE (n=6)小鼠。c肿瘤体积(左)和AUC(右)对B16F10肿瘤生长的影响PPM1DFl/flPPM1D二氧化钾/二氧化钾 (n=5种基因型)。d肿瘤体积(左)和AUC(右)对B16F10肿瘤生长的影响PPM1D二氧化钾/二氧化钾骨髓细胞n=4种基因型)。e肿瘤体积(左)和AUC(右)对LLC 1肺癌生长的影响PPM1DFl/flPPM1DΔHSC老鼠(n=6种基因型)。f肿瘤体积(左)和AUC(右)对LLC 1肿瘤生长的影响PPM1DFl/fl, PPM1DFES-CRE,和TG(UBC-PPM1D)小鼠(n=4种基因型)。数据表示为均值±扫描电镜。学生的t测试(双尾)(be),普通单向方差分析(f),与SIDAK的多重比较检验(a): *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001 (one representative experiment out of 3 is shown for Panel bf)。源数据作为源Excel数据文件提供。

我们用C57BL/6同基因B16 F10黑色素瘤和LLC 1 Lewis肺癌模型研究了造血系统耗竭Wip 1对肿瘤生长的影响。48,49。相比较PPM1DFl/fl小鼠,我们观察到明显降低了B16F10肿瘤的生长速度。PPM1DFES-cre老鼠(图1.1B)。我们观察到B16肿瘤的生长也有类似的下降。PPM1D二氧化钾/二氧化钾(生殖细胞-基因敲除)小鼠与PPM1DFl/fl老鼠(图1.1C)。以检验其抑癌特性。PPM1D-耗竭的免疫细胞可移植到野生型小鼠,我们移植了从野生型或野生型中分离出来的骨髓(Bm)细胞。PPM1D二氧化钾/二氧化钾将小鼠转化为辐射致死的野生型小鼠。我们观察到与野生型小鼠相比,用敲除的BM细胞移植的WT受体小鼠的B16肿瘤生长速度降低(图1)。1D)。由于Wip 1的缺陷已被报道会损害hsc的功能。50,我们证实了yfp标记的有效植入。PPM1D二氧化钾/二氧化钾移植至致死辐照WT小鼠12周后的供体细胞(补充图)。2)。此外,我们挑战PPM1DFl/flPPM1DFES-cre小鼠LLC 1 Lewis肺癌细胞。同样,LLC 1肿瘤的生长也延迟了。PPM1DFES-cre小鼠与野生型Wip 1表达小鼠比较(图1)。1E)。人类人口研究表明,患者预后不佳与血液细胞中的存在有关。PPM1D能提高蛋白质稳定性的ptv变异体31,36,42。为了研究Wip 1过表达的影响,我们使用了带有ubc基因的转基因小鼠。PPM1D转基因,普遍表达2到4倍高水平的wip 1。51,52。重要的是,在UBC中LLC 1肿瘤的生长速度明显加快-PPM1D转基因小鼠PPM1DFl/flPPM1DFES-cre老鼠(图1.1F)。这些实验表明,造血细胞中Wip 1的高水平增加了肿瘤的进展。

Wip 1缺乏的中性粒细胞广泛浸润肿瘤

荷瘤PPM1DFES-cre与荷瘤小鼠相比,小鼠外周血淋巴细胞数量明显减少,粒细胞计数显著增加。PPM1DFl/fl老鼠(图1.2A)。为了探讨WIP 1在造血细胞中缺失所致的肿瘤抑制机制,我们用流式细胞术(附图)对Wip1WT和Fes-cre小鼠B16黑色素瘤肿瘤的免疫浸润进行了研究。3)。CD 45+白细胞浸润到B16-F10肿瘤中的比例较高。PPM1DFES-cre小鼠与PPM1DFl/fl小鼠,但差异没有达到统计学意义(图)。2B)。CD3+T细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞比例。2C)之间没有明显的区别。PPM1DFES-crePPM1DFl/fl小鼠,尽管有大量的外周血淋巴细胞减少。与荷瘤小鼠相比,肿瘤免疫浸润PPM1DFES-cre小鼠CD11b+髓系细胞比例明显增加,F4/80+肿瘤相关巨噬细胞(TAMS)比例不变,Ly6G+肿瘤相关中性粒细胞(TANS)比例显著增加(图一)。二维空间)。此外,免疫组织化学(Ihc)分析显示,大量的中性粒细胞弹性蛋白酶阳性的tans在从PPM1DFES-cre与对照组小鼠比较(图1)。2E).

图2:Wip 1缺乏的中性粒细胞广泛浸润肿瘤,其耗竭加速了Wip 1缺陷小鼠的肿瘤发生。
figure2

a外周血成分PPM1DFl/fl(WT)和PPM1DFES-CRE(FES-CRE)小鼠携带B16。F10黑色素瘤肿瘤(第16天)n=6种基因型)。板bd免疫细胞浸润B16肿瘤PPM1DFl/fl(WT)和PPM1DFES-CRE(FES-CRE)小鼠(n=4种基因型)。bCD 45+白细胞。cCD3+T细胞,CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。dCD11b+髓系细胞,f4/80+巨噬细胞和Ly6G+中性粒细胞。eB16肿瘤的中性粒细胞浸润PPM1DFl/flPPM1DFES-CRE小鼠由IHC可视化。中性粒细胞弹性蛋白酶阳性细胞(α-埃莱恩,棕色)与抗染色(蓝色)(一个有代表性的实验,4显示)。f, g肿瘤体积(左)和AUC(右)对B16F10肿瘤生长的影响PPM1DFES-CRE小鼠连续注射中和抗Ly6G进行免疫细胞耗竭的实验研究+抗体(面板)f, n=4对WT和n=3或中和抗CD8+抗体(面板)g, n=每组4人)。数据表示为均值±扫描电镜。学生的t测试(双尾)(ad)或普通单因素方差分析与Sidak的多重比较检验(f, g): *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001, ns—nonsignificant (one representative experiment out of 2 is shown for panels fg)。源数据作为源Excel数据文件提供。

为了测试Wip 1缺陷的中性粒细胞是否直接参与肿瘤抑制,我们通过连续IV注射中和抗Ly6G抗体来耗尽外周中性粒细胞。虽然中性粒细胞的耗竭导致野生型和野生型肿瘤的生长增加。PPM1DFES-cre小鼠中性粒细胞耗竭PPM1DFES-CRE小鼠明显加速肿瘤的生长,特别是在后期(如图所示)。2F)。同样,我们通过连续四次注射中和抗CD8抗体来耗尽外周细胞毒性CD8+T淋巴细胞(CTL)。2G)。CTL耗竭显著促进肿瘤生长PPM1DFES-cre小鼠,但其作用小于中性粒细胞耗竭的作用。CTL缺失使两种基因型的终点肿瘤体积略有增加,但未达到统计学意义。这些观察表明,基因的缺失PPM1D在免疫细胞中,通过增加中性粒细胞的浸润,抑制免疫能力强的小鼠移植瘤的生长。

Wip 1抑制对中性粒细胞表型的影响

最近的研究表明中性粒细胞是异质性的,但中性粒细胞亚型的个体发生和表型尚不完全清楚。53,54,55。中性粒细胞多样性的一个相关方面是其作为抗肿瘤n1或亲肿瘤n2亚型的潜在极化。56,57。我们研究了GSK 2830371对Wip 1磷酸酶活性的抑制作用。58,或基因敲除PPM1D人和小鼠中性粒细胞分离特性的研究。在正常培养基中培养时,供者血中性粒细胞存活时间较短,存活时间仅为24 h,存活时间仅为5%,GSK 2830371对Wip 1磷酸酶活性的抑制对中性粒细胞存活无明显影响(图一)。3A)。与正常培养基相比,与肿瘤条件培养基(TCM)孵育24h和36h时,其存活时间明显延长,而在GSK 2830371存在下,中药激活则使其存活率进一步显著提高。相应地,从b16f10肿瘤中分离出的肿瘤相关中性粒细胞(Tans)也被植入体内。PPM1D二氧化钾/二氧化钾小鼠与PPM1D+/+在中药培养过程中,小鼠的存活率显著提高(附图)。4A)。因此,由于化学抑制或基因缺失而丧失Wip 1活性与肿瘤细胞分泌的可溶性因子协同作用,从而延长中性粒细胞的寿命。通过呼吸爆发产生活性氧(ROS)是一种中性粒细胞效应,与抗菌和抗肿瘤活性相关。GSK 2830371对Wip 1的抑制作用在PMA刺激人供者血中性粒细胞后产生的ROS呈剂量依赖性增加(图一)。3B)。同样地,pma激活了中药刺激的小鼠骨髓中性粒细胞。PPM1D二氧化钾/二氧化钾与类似处理相比,小鼠的活性氧生成明显增加。PPM1D+/+BM中性粒细胞(附图)4B),与上一次报告一致27。中药GSK 2830371治疗WT-BM中性粒细胞后,PMA刺激前无明显增加ROS的作用。从健康献血者血液中分离出的人中性粒细胞表现出成熟中性粒细胞的多叶核特征,与中药共孵育6h可导致细胞核高度分段的中性粒细胞的流行,GSK 2830371的加入进一步增加了核形态高度分段的频率(图1)。3C和补充图。4C)。在缺乏GSK 2830371的情况下,与中药长期孵育导致凋亡的中性粒细胞呈浓缩核,中性粒细胞存活稀疏,而GSK 2830371的加入降低了凋亡细胞的发生率。与上一次报告一致27,基因敲除PPM1D增加高节段核中性粒细胞的发病率(补充图)。4D)。因此,基因消融PPM1D或化学抑制Wip 1改变细胞内特性的人或小鼠中性粒细胞,与增加N1极化相一致。

图3:PPM1D-缺乏的小鼠和Wip 1-抑制人中性粒细胞表现出N1中性粒细胞的特征。
figure3

a供者血中性粒细胞存活。新鲜分离的中性粒细胞在常规培养基(NA)或肿瘤条件培养液(TCM)中培养,分别用载体(NT)或5μM GSK 2830371(GSK)处理24h(左侧)或36h(右侧);n=每项条件3)。bDFCDA(2‘,7’-二氯荧光素二乙酸酯)荧光作为供体血中性粒细胞与载体或GSK 2830371预先孵育6小时后产生活性氧(ROS)的指标。n=每项条件12)。单因素方差分析和Kruskal-Wallis的多重比较检验,p < 0.05; **, p < 0.001; ****. c供者血中性粒细胞在肿瘤条件培养液(TCM)与载体(TCM)或5μM GSK 2830371(TCM+GSK)培养6或36h的形态学观察,红色箭头显示核浓缩的凋亡中性粒细胞。用5-Grünwald Giemsa液染色,光镜观察。刻度棒,20μm(6个中有一个有代表性的实验)。dB16黑色素瘤移植后16d细胞因子的相对mRNA表达PPM1D +/+(WT)或PPM1D二氧化钾/二氧化钾(Ko)小鼠(n每种基因型=4)。e基于复合珠(Luminex)的B16肿瘤裂解液中细胞因子蛋白水平的测定PPM1D+/+(WT)和PPM1D二氧化钾/二氧化钾(Ko)小鼠(n=每种基因型的IFN=4ϒ, n=5对Il-1b、4、10和n每种基因型的MMP 9=8)。数据表示为均值±扫描电镜。学生的t测试(双尾)(d),Mann-Whitney检验(双尾)(e),或与Sidak的多重比较检验进行的普通的单向方差分析(a): *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001. Source data are provided as a Source Excel Data file.

中性粒细胞极性通过与肿瘤细胞、基质细胞和其他免疫细胞的相互作用,影响TME的细胞因子位。59,60。我们测定了从WT或Wip1KO宿主中分离的B16 F10黑色素瘤细胞因子mRNA的水平。肿瘤PPM1D二氧化钾/二氧化钾与从肿瘤中分离出的肿瘤相比,小鼠表达的肿瘤坏死因子αm RNA水平升高,il-4、il-10、mmp 9、β和vv生mRNAs水平降低。PPM1D+/+老鼠(图1.三维空间)。肿瘤坏死因子α诱导中性粒细胞n1表型61。相比之下,转化生长因子β参与了肿瘤的免疫抑制,并被证明能诱导中性粒细胞中的n2表型。56。与n1中性粒细胞相比,n2中性粒细胞表达的细胞因子il-4和il-10、细胞外重构因子mmp 9和促血管生成因子VEGF表达较高。62。我们进一步使用了一种基于多路复用珠的方法来量化b16肿瘤细胞因子的水平。PPM1D+/+PPM1D二氧化钾/二氧化钾老鼠。肿瘤组织中IFN-γ、IL-1B水平显著升高,IL-4、IL-10、MMP 9水平显著降低(P<0.0 5)。PPM1D二氧化钾/二氧化钾小鼠与PPM1D+/+老鼠(图1.3E)。高水平干扰素γ暴露可增加N1中性粒细胞极化61.

中性粒细胞Wip 1失活促进肿瘤抑制

为了证实Wip 1缺陷的中性粒细胞在适应性免疫细胞中没有Wip 1缺失的情况下抑制肿瘤生长,我们以Wip 1基因敲除为靶点,以髓系为靶点构建小鼠细胞系。在现有的小鼠品系中,没有一株在中性粒细胞中表现出独特的活性;我们选择了两种模型,LysM-cre和Mrp8-cre。热重,在中性粒细胞中表现出较高的cre活性,并在其他髓系免疫亚型中表现出不同的活性特征。63。在MRP 8-cre中热重小鼠cre重组酶的表达受Mrp 8(S100a8)启动子的驱动,在中性粒细胞和粒细胞巨噬细胞前体中具有较高的活性。64。我们先后PPM1DFl/flMRP8-cre小鼠热重小鼠生产PPM1DFl/fl;TG(S100A8-cre-EGFP)伊洛这里提到的老鼠PPM1DMRP8-cre老鼠。PPM1DMRP8-cre小鼠B16黑色素瘤瘤生长明显减弱(图一)。4A)。为了进一步验证Wip 1在髓系细胞中缺失的重要性,我们使用了第二种髓系靶向模型。在LysM-cre小鼠中,cre重组酶的表达是由溶菌酶2基因驱动的,溶菌酶2基因在成髓细胞及其单核细胞、巨噬细胞和粒细胞子代中具有很高的活性。63,65。LysM-cre小鼠的连续杂交PPM1DFl/fl老鼠,我们生产PPM1DFl/fl;Lyz 2Tm1(Cre)ifo这里提到的老鼠PPM1DLysM-cre小鼠(附图)5A)。我们进一步穿越PPM1DLysM-creR26R-EYFP报告小鼠46的基因缺失PPM1D(补充图。5B)和Wip 1蛋白表达的缺失(附图)。5C)CD11b+,YFP+髓系细胞。与上述结果相似,PPM1DLysM-cre小鼠B16黑色素瘤瘤生长明显减弱(图一)。4B)和LLC 1肺肿瘤(如图所示)。4C),与PPM1DFl/fl老鼠。

图4:骨髓免疫细胞的Wip 1缺陷抑制了实体瘤的生长。
figure4

a肿瘤体积(左)、终点肿瘤重量(中心)和AUC(右)对B16F10肿瘤生长的影响PPM1DFl/fl (n=8)和PPM1DMRP8-CRE (n=6)小鼠。bB16F10黑色素瘤生长曲线下肿瘤体积(左)、终点肿瘤重量(右上)和肿瘤生长面积(AUC)PPM1DFl/fl (n=5)和PPM1DLysM-CRE (n=6)小鼠。cLLC 1肺癌生长的肿瘤体积(左)、终点肿瘤重量(右上)和AUC(右下)PPM1DFl/fl (n=5)和PPM1DLysM-CRE老鼠(n=6)。d免疫细胞亚群在LLC 1肿瘤中的浸润PPM1DFl/fl(WT,n=4)和PPM1DLysM-CRE(LysM-CRE,n=5)小鼠。eB16F10肿瘤浸润CD8+T细胞活化标志物的表达PPM1DFl/fl(WT)和PPM1DLysM-CRE(LysM-CRE)小鼠第16天(颗粒酶B-)n=6,Cd69-n=8种基因型)。fYFP+WT对B16F10肿瘤的浸润LysM-cre或YFP+PPM1DLysM-cre野生型荷瘤小鼠中性粒细胞过继转移后n每种基因型=6)。数据表示为均值±扫描电镜。学生的t试验(双尾)(板)d, e和面板a, b, c肿瘤重量)或曼恩-惠特尼试验(双尾)(面板)a, b, e*AUC和小组f): *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 (one representative experiment out of 3 is shown for panel a, b2中的1/2显示在面板上。f)。源数据作为源Excel数据文件提供。

我们研究了LLC 1肺癌肿瘤的免疫浸润。PPM1DFl/flPPM1DLysM-cre老鼠(图1.4D)。CD4数+T细胞明显减少,CD8细胞数减少。+T细胞显著增加PPM1DLysM-cre小鼠与PPM1DFl/fl表明适应性免疫系统具有更强的抗肿瘤作用。NKP 46+自然杀伤细胞和F4-80细胞+巨噬细胞在肿瘤中没有明显的区别。PPM1DLysM-cre小鼠与PPM1DFl/fl老鼠。类似于PPM1DFES-cre老鼠,在移植的肿瘤中,tans的数量大约高出4倍。PPM1DLysM-cre相比较PPM1DFl/fl老鼠(p=0.031)。此外,由于颗粒酶B和CD 69标记的表达显著增加,CD8+细胞在B16F10肿瘤中浸润。PPM1DLysM-cre与WT小鼠相比,小鼠具有更高的激活能力(图1)。4E)。我们证实中性粒细胞浸润增加PPM1DLysM-cre小鼠肿瘤由IHC(补充图。5D,e)。趋化因子受体CXCR 2调节中性粒细胞行为的重要方面,包括骨髓释放和炎症部位(包括肿瘤)的滞留。66。以前,中性粒细胞减少PPM1DKO/KO小鼠被认为是中性粒细胞CXCR 2表达增加所致。27。我们发现CXCR 2 mRNA的表达水平在PPM1D二氧化钾/二氧化钾Tans浸润B16F10肿瘤与PPM1DFl/flTANS(附图)5F)。为了测试这是否是一种细胞内特性,我们采用转移的yfp。+, PPM1D+/+、LysM-cre或yfp+、PPM1DFl/fl,和LysM-cre中性粒细胞对野生型小鼠B16F10肿瘤;YFP+中性粒细胞缺失Wip 1-浸润肿瘤的数量明显高于野生型Wip1yfp+中性粒细胞(图1。4F).

基于Eyfp报告活性,LysM-cre和mrp 8-cre模型均能有效地导致70-80%的中性粒细胞缺失。63。根据LysM-cre和MRP8-cre模型的活性特征,我们不能排除Wip 1缺陷的巨噬细胞参与肿瘤抑制的可能性。Wip 1缺失的巨噬细胞在TME中的可能作用不在目前的研究范围之内。联合观察到,Wip 1缺乏的中性粒细胞大量增加肿瘤浸润,但未见Wip 1缺乏的巨噬细胞(如图所示)。二维空间),以及通过耗尽中性粒细胞完全逆转Wip 1缺乏的小鼠的肿瘤抑制作用(图一)。2F),表明在我们的模型中,Wip 1缺乏的中性粒细胞主要负责观察到的表型。

Wip 1抑制增加4-1BBL和ox-40L的表达

细胞毒性CD8+T细胞是抗肿瘤免疫的主要介质,可通过与中性粒细胞的相互作用来调节其活性。59,67。在肺癌的早期阶段,中性粒细胞通过4-1bbl/4-1bb和ox-40L/ox-40途径刺激CD8+T细胞,从而促进抗肿瘤反应。5。我们研究了化学抑制从人供者血液中分离的中性粒细胞中Wip 1对其共同刺激人供者T细胞增殖能力的影响(图1)。5A)。CD3/28活化的人CD8+T细胞较未活化的CD8+T细胞有明显的增殖作用,而与GSK 2830371预处理的人中性粒细胞共培养则无明显的增殖作用。此外,我们还观察到CD3/28活化的小鼠CD8+T细胞在体外培养后增殖明显增强。PPM1D+/+(WT)中性粒细胞,GSK 2830371处理的WT中性粒细胞,或PPM1D二氧化钾/二氧化钾(Ko)中性粒细胞,与单独培养的活化CD8+T细胞相比(见图)。5B)。激活小鼠CD8+T细胞本身并不能显著促进其增殖。基因缺失PPM1D或化学抑制中性粒细胞中Wip 1的活性,可促进人或小鼠共孵育T细胞的增殖。

图5:Wip 1的化学抑制或基因敲除PPM1D中性粒细胞通过p53依赖的共刺激配体诱导细胞毒性T细胞存活。
figure5

a人细胞毒性T淋巴细胞的增殖。供者外周血CD8+淋巴细胞未被激活(非活性),也未被CD3/28微球激活(Act)。单独培养(NT),或与供者中性粒细胞(中性粒细胞)单独孵育6 h或5μM GSK 2830371(PBN+GSK)。n=每项条件4)。b小鼠细胞毒性T淋巴细胞的增殖。PPM1D+/+外周血CD8+淋巴细胞未被激活(NT),也未被CD3/28包被板激活(法案)。单独培养(NT),与PPM1D+/+中性粒细胞经载体(WT PBN)或5μM GSK 2830371(WT PBN+GSK)预处理6h,或与PPM1D二氧化钾/二氧化钾中性粒细胞(KO PBN)(n=每项条件4)。cB16移植瘤中性粒细胞4-1BBLmRNA(左侧)和OX40LmRNA(右侧)的表达PPM1D+/+小鼠(WT Tan)或PPM1D二氧化钾/二氧化钾小鼠(KO Tan)PPM1D+/+小鼠,用车辆(WT PBN)或5μM GSK 2830371(WT PBN+GSK)治疗,或从PB中分离出PPM1D 二氧化钾/二氧化钾小鼠(KO PBN)(n=每项条件3)。d荧光素酶报告法检测HCT 116、p53+/+和HCT 116 p53−/−在人TNFSF 9(4-1BBL)启动子调控下表达荧光素酶的pGL3载体转染细胞(左面板),n=8)或人TNFSF 4(OX40L)启动子(右面板,n=4)。ePBN中4-1BBLmRNA(左侧)和OX40LmRNA(右侧)的相对水平PPM1D+/+小鼠(WT),PPM1D二氧化钾/二氧化钾小鼠(KO),或PPM1D二氧化钾/二氧化钾/Trp53KO/KO双基因敲除小鼠(DKO)(n=4种基因型)。f肿瘤体积(左)和AUC(右)对B16F10肿瘤生长的影响PPM1DFl/fl(WT),PPM1D二氧化钾/二氧化钾(KO2),或Trp53/PPM1D双基因敲除(DKO)小鼠(n=4种基因型)。gPPM1D表面4-1BBL和OX40L蛋白水平的表达二氧化钾/二氧化钾从骨髓、脾脏和血液中分离出的中性粒细胞(n=8,除LysM-CRE BM外n=6)。h肿瘤体积对B16F10肿瘤生长的影响PPM1DLysM-CRE用中和抗4-1BBL和抗OX40L抗体连续注射灭活细胞表面4-1BBL和ox-40L配体的小鼠n=每组4,但PPM1DFl/fl+α-IgG-ctrln=7)。数据表示为均值±扫描电镜。学生未配对t检验(双尾)(面板)d)和Mann-Whitney试验(双尾)(面板)g),单向方差分析(面板)ac, e, f),或双向方差(h): *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001, ****p < 0.0001 (one representative experiment out of three is shown for panels fh)。源数据作为源Excel数据文件提供。

CD8+T细胞的增殖需要通过T细胞受体(Tcr)和包括4-1bb和ox-40受体在内的共刺激途径的联合信号传导;相应的配体4-1 bbl和ox 40 L通常由抗原提呈细胞表达,对刺激细胞毒性T细胞的增殖和激活至关重要。68,69。我们研究了这些共刺激配体在中性粒细胞中的表达是否受到Wip 1磷酸酶的影响。4-1 bbl和Ox 40 L mRNAs在移植瘤B16 tans中的相对水平显著升高。PPM1D二氧化钾/二氧化钾相比较PPM1D+/+(WT)小鼠。5C)。4-1BBL和OX-40L的mRNA水平在WT PBN和WT TANS中基本相同,但KO PBN和GSK 2830371孵育后的mRNA水平较高。这些结果表明,PPM1D中性粒细胞Wip 1活性的丧失增加了中性粒细胞共刺激配体4-1BBL和OX40L的表达。

在其多种功能中,抑癌基因p5 3对肿瘤微环境中的免疫反应起调节作用。9,10。P53对多种肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)细胞因子的表达有调节作用,包括4-1BBL(TNFSF 9)和ox-40L(TNFSF 4)。70,71,72。我们使用公共p53结合和表达资源(Baer)。73目的:探讨p53与TNFSF 9和TNFSF 4基因附近染色质结合的相关性及其表达的变化。TNFSF 9基因的芯片-seq数据显示,淋巴细胞和某些癌细胞株在染色质+47 kb的转录起始点(TSS)中的p53占用率达到峰值(补充图)。6A)。在相应的差异基因表达数据集中,TNFSF 9在多柔比星(DXR)处理的淋巴细胞和成纤维细胞中显著升高(P<0.01),在淋巴细胞和成纤维细胞中显著上调(P<0.01),而在Nutlin处理的淋巴细胞或U2OS细胞中则无显著上调(P>1.5)。73,74。有趣的是,来自TNFSF9TSS的+47 kb的基因组区作为一种增强子,调节TNFSF 9和CD 70的表达,这是另一种TNFSF共刺激细胞因子。75。在同一数据集中,TNFSF 4基因的芯片-seq数据显示,p53在第1内含子(TSS+1.3kb或替代TSS为0.5kb)的染色质中占据峰值(补充图)。6B)。高p53染色质占位的两个区域都包含一个类似典型p53反应元件的序列(补充图)。6C)。为了进一步支持p53对TNFSF 9(4-1BBL)和TNFSF 4(ox-40L)基因的诱导,我们构建了在TNFSF 9或TNFSF 4启动子控制下表达荧光素酶的质粒,并将这些报告载体转染HCT 116细胞。5D)。用这两种报告载体,我们观察到与缺乏p53的HCT 116细胞相比,WT p53(WT)的HCT 116细胞的荧光素酶活性显著提高。−/−).

通过小鼠杂交PPM1D二氧化钾Trp53 14,15基因敲除等位基因后,我们获得了WIP 1和P53纯合双基因敲除小鼠。PPM1D二氧化钾/二氧化钾;Trp53KO/KO、DKO)和B16F10肿瘤的生长情况。PPM1DFl/fl(WT),PPM1D二氧化钾/二氧化钾,DKO小鼠。B16Tans中4-1BBL和ox-40L mRNA水平的研究PPM1D二氧化钾/二氧化钾在WT小鼠的B16tans中,小鼠的水平与其相应水平相比有显著的提高(图1)。5E)。重要的是,DKO小鼠B16tans中两种共刺激细胞因子的相对mRNA水平虽然较高,但与WT小鼠的B16tans相比,差异无显着性(P>0.05)。我们进一步研究了B16黑色素瘤肿瘤的生长速率WT,KO,DKO小鼠(图)。5F)。与我们先前的结果一致,B16F10肿瘤的生长PPM1D二氧化钾/二氧化钾小鼠与PPM1DFl/fl老鼠。与WT或WT相比,p53的缺失大大提高了肿瘤的生长速度。PPM1D二氧化钾/二氧化钾。因此,p53的缺失降低了Wip 1缺乏的造血细胞的体内外抗肿瘤活性。

此外,我们还在蛋白质水平上证实,这两种配体4-1 bbl和ox-40L在PPM1D-从骨髓、脾脏和血液中分离出的缺乏中性粒细胞(如图所示)。5G)。此外,4-1 bbl和ox-40L在细胞表面的中和作用PPM1DLysM-cre小鼠抑制肿瘤的作用PPM1D髓系细胞缺失并显著促进肿瘤生长,与野生型小鼠的比例相同(见图)。5H).

髓系细胞Wip 1失活增强抗肿瘤治疗作用

结果表明,Wip 1是中性粒细胞行为的重要调节因子,尤其与机体抗肿瘤免疫应答有关。5例肺癌患者中有4例PPM1D mRNA水平与患者PBNPPM1DmRNA水平相比,无论是TAN还是从癌周组织分离的中性粒细胞(PTANs)均显著升高(图一)。6A)。此外,我们还研究了PPM1D荷瘤荷瘤小鼠中性粒细胞和B16F10黑色素瘤细胞的mRNA。6B)。相比较PPM1D无瘤WT小鼠骨髓中性粒细胞mRNA水平,PPM1D荷瘤小鼠骨髓中性粒细胞和TANS的mRNA水平均显著升高。接下来,我们使用杂合子。PPM1D+/二氧化钾KO2等位基因表达的小鼠大肠杆菌β-半乳糖苷酶拉茨Z)在内源性控制下PPM1D启动子。相比较PPM1DPBN中的启动子活性,PPM1DB16tans和脾中性粒细胞启动子活性显著升高(图一)。6C).

图6:肿瘤相关中性粒细胞表达较高水平的Wip 1,髓系细胞中Wip 1的失活增强了抗肿瘤反应。
figure6

a5例Ⅰ-Ⅱ期肺癌患者手术切除肿瘤(TAN)、癌周组织(PTAN)或外周血(PBN)中性粒细胞PPM1DmRNA的相对表达(英文)n=5例不同患者进行了4次以上的个体试验)。b幼稚骨髓(WT BM)和B16荷瘤细胞(WT BM B16)中性粒细胞PPM1D mRNA水平的研究PPM1D+/+小鼠和B16肿瘤移植PPM1D+/+小鼠(WT Tan B16)(n=每项条件4)。c外周血(PBN)、脾(脾)、B16肿瘤(TAN)中性粒细胞LacZ活性的流式细胞仪分析PPM1D启动子Lacz报告小鼠(PPM1D+/二氧化钾) (n=每项条件3)。d中和抗Ly6G对小鼠B16黑色素瘤生长的影响+消耗宿主中性粒细胞的抗体和输注PPM1D+/+(WT PMN)或PPM1D二氧化钾/二氧化钾(Ko PMN)供体中性粒细胞(n=4种基因型)。ePPM1D肿瘤体积(左)和AUC(右)对B16F10肿瘤生长的影响+/+(WT,n=5每项条件)及PPM1DLysM-CRE(LysM-CRE,n(6)不加奥沙利铂+5FU联合化疗(化疗)小鼠。fPPM1D肿瘤体积(左)和AUC(右)对B16F10肿瘤生长的影响+/+(WT,n=4每项条件)及PPM1DLysM-CRE(LysM-CRE,n=4,未经治疗,n=5只α-PD1)小鼠,未加抗-PD1抗体治疗(α-PD1)。数据表示为均值±扫描电镜。与邓尼特的单因素方差分析(ac)或西达克(e, f)多重比较测验或学生测验t测试(双尾)(d(第13天):*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001 (one representative experiment out of two is shown for panel d三个中的三个显示在面板上e, f)。源数据作为源Excel数据文件提供。

我们的研究结果表明,在肿瘤微环境中,Wip 1缺陷使中性粒细胞向更高的抗肿瘤潜能转变,部分原因是淋巴细胞共刺激配体的表达增加。这些观察可能具有潜在的治疗作用。虽然最近研制的Wip 1抑制剂是有效和特异的,但它的药代动力学很差。58。此外,系统抑制Wip 1对肿瘤细胞有直接抑制作用,对浸润免疫细胞产生间接抑制作用。为了测试抑制中性粒细胞中wip 1的活性是否能增强抗肿瘤反应,我们用串联WT或wt治疗荷瘤小鼠。PPM1D二氧化钾/二氧化钾中性粒细胞输注。接受WIP 1缺乏中性粒细胞输注的小鼠与接受WT中性粒细胞灌注的小鼠相比,B16黑色素瘤肿瘤的生长明显减慢(图一)。6d和补充图。7A)。有趣的是,当第12天停止治疗时,Wip 1缺乏的中性粒细胞治疗小鼠的肿瘤生长加速。

我们探讨了联合常规化疗或目前免疫检查点抑制剂治疗与消融中性粒细胞中Wip 1活性的潜在益处。奥沙利铂和5FU对小鼠B16F10黑色素瘤生长有明显的延缓作用,但对小鼠的生长无明显影响。PPM1DLysM-cre小鼠;联合化疗与中性粒细胞缺乏Wip 1导致更大的肿瘤抑制(如图所示)。6E)。同样,联合抗PD1抗体治疗与中性粒细胞Wip 1缺乏症相比,单用抗PD1或Wip 1缺乏治疗能更有效地抑制黑色素瘤肿瘤的生长(如图1所示)。6f).

讨论

化疗仍然是肿瘤学的主要治疗策略之一,但是细胞毒性治疗对免疫系统的影响和TME中免疫细胞与肿瘤的相互作用是目前研究的热点。化疗药物对DNA损伤反应通路的激活不仅能诱导肿瘤细胞死亡,而且还能重塑TME,改变抗肿瘤免疫反应。DNA损伤诱导的p53信号通路的激活会产生细胞类型特异性的选择性压力。在肿瘤中,化疗诱导的选择会导致含有突变的肿瘤细胞克隆存活,从而增强对细胞毒性治疗的抵抗力。在造血系统中,化疗诱导的选择可能导致Ch,其中造血祖细胞中存在的关键基因的体细胞突变提供了细胞毒性选择下的生存和增殖优势,并产生了表型改变的造血后代的克隆性扩增。76。在CH驱动基因中,PPM1DTP 53与以前接受化疗有关77. PPM1D“功能增益”突变为肿瘤细胞提供了选择性优势。32,78,79在造血系统中,导致治疗引起的CH40,80。有趣的是,剪接变异体ppm1d430与Ch相关,具有显著的特性。PPM1D已在几个癌细胞株中检测到ptv,在正常组织中仅在白细胞和睾丸中表达。81.

.的存在PPM1D几种实体肿瘤患者血细胞中蛋白稳定型PTVS与预后不良相关31,33,34,35,36,82我们的研究提出了一种可能的机制,将血细胞克隆扩增的存在联系在一起。PPM1DPTV突变对肿瘤患者的预后更差。在这里,我们已经证明Wip 1负调控髓系细胞的抗肿瘤功能。

我们观察到PPM1D在小鼠血细胞中促进实体瘤的生长,而删除PPM1D在血细胞中抑制肿瘤生长。WIP 1在造血系统中的表达缺失明显增加了髓系粒细胞对实体瘤的浸润。此外,我们观察到由于Wip 1丢失而导致的肿瘤生长的抑制取决于中性粒细胞的存在。

PPM1D-基因敲除小鼠表现出明显的中性粒细胞减少,并随着年龄的增长而发展。28。增加PPM1D抑制骨髓祖细胞向促炎成熟粒细胞分化的活性27。我们在此确认有条件删除PPM1D在造血系统中,小鼠血液中的中性粒细胞数量增加,中性粒细胞表型改变。

在肿瘤发生的早期,中性粒细胞参与抗肿瘤免疫反应,可能是通过刺激适应性免疫和提高CD8+细胞毒性淋巴细胞效率来实现的。5。在后期,肿瘤逃避免疫系统的识别,并通过募集骨髓源性抑制细胞(MdSCs)来促进免疫抑制状态,包括与中性粒细胞具有表型和形态特征的多形核细胞(pmn-mdscs)。7。在TME中,mdSCs阻断免疫效应细胞、T淋巴细胞和NK细胞的功能,导致免疫系统对肿瘤细胞的清除无效;mdSCs严重损害了肿瘤免疫治疗的效果。83。最近,人们提出了旨在消除mdSCs或重新编程pmn-mdSCs的策略,以提高免疫检查点抑制剂的效率。84,85.

在我们的研究中,基因损耗PPM1D中性粒细胞转化为CD8+细胞毒性淋巴细胞的有效激活因子,部分途径是p53依赖性诱导淋巴细胞共刺激配体4-1BBL和ox-40L。由于条件性小鼠模型的局限性,我们不能完全排除某些单核/巨噬细胞髓系细胞对观察到的表型负有一定责任的可能性。虽然在我们的模型中PPM1D靶向抗癌策略已经非常有效,消耗了PPM1D髓系细胞增强抗癌化疗和抗肿瘤免疫治疗。CTL活化和存活的增加对嵌合抗原受体T细胞(car-T)转移和免疫检查点治疗的疗效至关重要。86。将免疫检查点治疗与Wip 1的基因或化学抑制相结合是有道理的。目前,免疫检查点疗法的目标是细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞的负调节因子,如PD1。相反,Wip 1耗竭通过诱导肿瘤相关中性粒细胞表面的刺激配体OX40L和4-1BBL的表达,提高肿瘤微环境中的淋巴细胞刺激信号。因此,通过靶向淋巴细胞调节系统的不同成分,Wip 1抑制可能通过提高抗肿瘤免疫治疗的效率来增强抗PD1治疗。

作为一种实用的方法,化学物质抑制中性粒细胞或其前体中PPM1D的活性可能是一种有效的策略,可通过CTL刺激TME来提高目前抗肿瘤免疫治疗的效率。这一策略对于具有克隆性造血驱动的肿瘤患者尤为重要。PPM1D-激活突变以改善治疗结果。


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