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IL-6和CD 40双重靶向对胶质母细胞瘤的协同免疫治疗

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发表时间:2021-06-10 11:03作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

免疫冷肿瘤,包括胶质母细胞瘤,主要是由于免疫抑制性巨噬细胞(Mϕs)的广泛浸润而不能接受检查点阻断治疗。与IL-6在Mϕ极化过程中的促肿瘤作用相一致,我们发现通过基因消融或药物抑制靶向IL-6可促进T细胞向GBM的浸润,提高小鼠的存活率;而IL-6的抑制并不能协同PD-1和CTLA-4检查点的阻断。有趣的是,抗IL-6治疗降低了GBM相关Mϕs中CD 40的表达,我们鉴定了STAT 3/HIF-1α介导的轴突,IL-6发挥抗肿瘤作用,诱导M-ϕ中CD 40的表达,联合IL-6抑制和CD 40刺激可逆转Mϕ介导的肿瘤免疫抑制,使肿瘤对检查点阻滞敏感,并延长动物在两种同基因GBM模型中的存活,特别是在阻断检查点后诱导GL 261肿瘤完全消退。因此,抗体鸡尾酒免疫疗法,结合检查站阻断和双重靶向的IL-6和CD 40,可能为GBM和其他实体肿瘤提供令人兴奋的机会。

导言

免疫疗法在癌症治疗中有着巨大的应用前景。然而,目前针对实体肿瘤的免疫治疗方法仍然是一个重大挑战,特别是对于免疫寒冷的肿瘤,即那些以低T细胞浸润为特征的肿瘤,包括胶质母细胞瘤(Gbm)。1,2,3,4,5,6。在这些肿瘤中,治疗困难和失败在很大程度上是由于免疫敌对的抑制性肿瘤微环境,消除了T细胞的浸润和激活。GBM是成人最常见的原发性脑恶性肿瘤。GBM是人类最致命的恶性肿瘤之一,中位生存期约为14-16个月。GBM对包括手术切除、放疗和化疗在内的标准疗法具有很高的抗药性。7,8。与其独特的免疫抑制微环境所致的免疫寒冷性质相一致,gbm一般不适用于基于T细胞的免疫治疗,包括pd-1/pd-l1靶向检查点的抑制和嵌合抗原受体修饰的T细胞过继细胞转移。2,9,10,11。因此,制定有效的策略来逆转肿瘤免疫抑制,是成功的抗GBM免疫治疗的关键。

肿瘤相关巨噬细胞(Mϕs)在肿瘤进展、肿瘤免疫抑制和治疗耐药中起着重要作用。12,13,14。肿瘤微环境中的Mϕs具有促进肿瘤的功能:分泌生长因子和释放免疫抑制因子,如白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子-β(TGF-β)和精氨酸-1(arginase-1),至少部分是通过替代的M-ϕ极化来实现的。15,16,17,18。值得注意的是,mϕs是gbm中非肿瘤细胞的主要群体,占gbm肿瘤细胞总数的一半。19,20提示肿瘤Mϕ是免疫抑制的主要来源。然而,控制Mϕs介导的GBM免疫抑制的确切机制尚不清楚,对这些机制的深入了解将有助于确定激活抗肿瘤免疫的关键治疗靶点。

我们先前的工作表明,血管小生境来源的IL-6在gbm中诱导了选择性Mϕ激活,提示IL-6是gbm免疫治疗的一个治疗靶点。21。在这里,我们报告了基因消融或药物抑制IL-6部分逆转Mϕ介导的GBM免疫抑制,但不敏感对抗PD-1/CTLA-4治疗。在转录组分析的基础上,通过STAT 3/HIF-1α/CD 40确定了IL-6诱导Mϕ活化的机制,建立了抗IL-6和Pro-CD 40双重靶向策略,为实体肿瘤激活M-ϕ免疫和改善T细胞免疫治疗提供了令人兴奋的机会。

结果

IL-6在GBM肿瘤免疫抑制中的作用

我们研究了IL-6在GBM肿瘤免疫抑制中的作用,最初采用遗传方法(图1)。1A)。认为肿瘤相关内皮细胞(Ecs)是gbm中IL-6表达的主要来源。21我们利用他莫昔芬诱导的EC基因敲除系统精确调控肿瘤微环境中IL-6的表达.GBM诱导Ntv-a;Ink4a-Arf−/−;PTENFl/fl;LSL-LUC供体小鼠通过RCAS(复制型禽肉瘤-白血病病毒长端重复剪接受体)介导的基因转移,然后原位植入肿瘤细胞Cdh5-CREERT 2;IL6Fl/flIL-6的表达受EC特异性启动子Cdh 5的调控.肿瘤来源单细胞悬液的流式细胞术分析表明,IL-6的基因消融术增加了细胞毒性CD8的数量。+GBM中的T细胞(图1.1B,c)。此外,CD3也有类似的增长趋势。+和CD4+T细胞也是如此,而自然杀伤(NK)细胞的数量则保持不变。值得注意的是,IL-6基因敲除减少了总髓系细胞和M-ϕs的数量,提示T细胞募集或激活的增加可能是由于免疫抑制性M-ϕs向肿瘤的浸润减少所致。流式细胞仪对肿瘤细胞的分析表明,IL-6基因敲除增强了CD3的浸润。+T细胞进入肿瘤(图1)。1D)CD8的增加部分+CD 45中的T细胞+CD3+T细胞(图1.1E和补充图。1),与CD 45减少有关+CD11b+髓系细胞与CD 45+CD11b+F4/80+Mϕs(图1.1F)。肿瘤相关Mϕs分泌大量抗炎、免疫抑制细胞因子,如IL-10和TGF-β,抑制T细胞浸润和活化。酶联免疫吸附试验(ELISA)结果显示,IL-6消融能显著降低GBM肿瘤组织中IL-10和TGF-β的表达,但对正常脑组织的表达无明显影响(图1)。1g,h)。这些发现共同提示了IL-6在gbm免疫抑制中所起的关键作用,支持了我们先前的工作,表明ecs中的IL-6基因敲除可以抑制gbm的生长,并提高荷瘤小鼠的存活率。21。此外,这些结果提示IL-6阻断可能是激活T细胞抗肿瘤免疫的一种策略.

图1:IL-6基因消融逆转GBM免疫抑制.
figure1

RCAS介导的基因工程诱导GBM的研究Ntv-a;Ink4a-Arf−/−;PTENFl/fl;LSL-Luc供体小鼠,然后植入原位肿瘤Cdh5-CREERT 2;IL6Fl/fl受体小鼠用IL-6-ΔEC预处理或不加他莫昔芬(对照组)处理.肿瘤植入后2周切除肿瘤。a示意图法b, c用细胞因子法分析肿瘤细胞来源的单细胞悬液。b有代表性的细胞分类。c定量结果(均值±扫描电镜)n=4只小鼠)。双尾学生的统计分析t-测试。df流式细胞术分析肿瘤细胞来源的单细胞悬液。dCD3分析+T细胞左,有代表性的单元格分类。对,量化结果(n=6只小鼠,平均±SEM)。双尾学生的统计分析t-测试。e, f分析eCD4+/CD8+T细胞或f髓系细胞(n=6只小鼠,平均±SEM)。双尾学生的统计分析t-测试。g, h对正常脑组织和肿瘤组织进行酶联免疫吸附试验(ELISA)。g伊-10和h转化生长因子-β表达(平均±扫描电镜)n=4只小鼠为IL-6-ΔEC ggm组和n=其他各组小鼠3只)。用SIDAK‘s检验进行双向方差分析。源数据作为源数据文件提供。

IL-6中和能提高动物的存活率,但不会使GBM对免疫检查点的阻断敏感。

摘要由于肿瘤中T细胞浸润较少,gbm对免疫检查点阻滞不敏感,这在临床上仍然是一个重大挑战。4。考虑到IL-6对肿瘤T细胞浸润和活化的负性作用,我们接下来在遗传小鼠GBM模型中测试IL-6中和抗体的治疗潜力,特别是联合免疫检查点抑制剂(ICIS、抗PD-1和抗CTLA-4抗体)。2A)。生存分析显示抗IL-6治疗中度但显著(P < 0.05) improved the survival by over 30% (+8 days, comparable to 22 days of median survival in control mice, Fig. 2B)。此外,抗IL-6治疗可以抑制肿瘤的生长。2C)。根据我们的结果,通过基因IL-6消融(图)。1),流式细胞仪分析显示IL-6中和增强了CD 45的浸润。+CD3+T细胞进入肿瘤(图1)。二维空间)和减少CD 45的征聘+CD11b+髓系细胞与CD 45+CD11b+F4/80+Mϕs(图1.2E和补充图。2),但不影响CD 45的人口。+CD11b+Ly6GLy6CINT中性粒细胞和CD 45+CD11bCD3NK1.1+NK细胞(附图)2)。然而,IL-6中和作用适度地提高了CD8的比值。+T细胞在肿瘤相关CD 45中的表达+CD3+T细胞(图1.2F),但没有激活这些T细胞,这一点在Ki 67中没有检测到增加。+、干扰素-γ+,或CD 69+激活CD 45中的T细胞+CD3+T细胞(图1.2G)。相反,单用ICIS治疗并不能显著延长动物的存活时间(如图所示)。2B)或抑制肿瘤生长。2C),与在人类临床研究中观察到的类似结果一致。22,23。ICI单药不刺激CD3+渗透(图1.二维空间)或抑制肿瘤中髓样细胞的数量(如图所示)。2E);它并没有增强CD8的无线电功能。+/CD3+T细胞或影响Ki 67、干扰素-γ(IFN-γ)及CD 69在CD3中的表达+T细胞(图1.2F,g),提示ICIS不能诱导GBM中T细胞活化。值得注意的是,与单一药物治疗相比,ICIS和抗IL-6抗体联合治疗并没有协同延长生存率或降低肿瘤生长。2B,c)。根据这些发现,联合治疗未能协同促进肿瘤相关T细胞的细胞浸润或激活(图一)。2D-g)。综上所述,我们的数据表明,IL-6中和增强了T细胞向GBM肿瘤的浸润,提高了动物的存活率;然而,由于免疫抑制的逆转不足和肿瘤微环境中T细胞的浸润/激活有限,IL-6对免疫检查点阻断不敏感。

图2:IL-6中和增强了T细胞对GBM肿瘤的浸润,提高了动物的存活率,但不使肿瘤对免疫检查点阻滞敏感。
figure2

在WT B6小鼠体内诱导GBM,然后注射对照IgG、抗IL-6抗体(Ab)、免疫检查点抑制剂(ICIS)或ICIS+抗IL-6抗体。a示意图法b, c生存和肿瘤生长分析(n=8-12只小鼠n数字如图所示)。b监测小鼠生存60d,进行双侧对数秩Mantel&Cox分析。中位生存期。c第13~23天用生物发光显像分析肿瘤体积(平均±SEM)。用Dunnett检验进行双向方差分析。dg治疗后2天切除肿瘤。肿瘤来源的单细胞悬液用抗CD 45抗体染色,dCD3,eCD11b,fCD4,CD8,CD3,和gKi 67,IFN-γ,CD 69,流式细胞仪分析。dCD3分析+T细胞左,有代表性的单元格分类。对,量化结果(n=6只小鼠,平均±SEM)。用Fisher‘s LSD检验进行单因素方差分析。eg免疫细胞量化结果(n=6只小鼠,平均±SEM)。用Fisher‘s LSD检验进行单因素方差分析。源数据作为源数据文件提供。

IL-6诱导Mϕ介导的免疫抑制但刺激CD 40的表达

为了探讨IL-6调节Mϕ介导免疫抑制的机制,我们从转录水平研究了IL-6对小鼠骨髓Mϕs基因表达的影响。IL-4作为对照,在诱导M2极化和M-ϕ免疫抑制方面具有良好的作用。主成分分析显示,IL-4或IL-6引起的分化或谱系变化有不同的变化(图6)。3A)。此外,IL-4和IL-6处理的Mϕs与对照未处理的Mϕs相比,表现出明显的表达谱,如火山图和热图分析所示。3B,c)。免疫抑制细胞因子的特异性分析表明,IL-6主要诱导IL-10、TGF-β2和精氨酸酶-1/2的表达,而IL-4则显著增加精氨酸酶-1的表达,但不增加IL-10的表达。三维空间)。流式细胞仪检测IL-6诱导的IL-10表达。3E)。有趣的是,IL-4和IL-6以不同的方式诱导M2 Mϕ相关标记的表达:IL-4似乎选择性和明显地诱导CD 206(姆尔克1)表达,而IL-6更广泛地刺激CD 206、CD 86、Toll样受体2(TLR 2)、凝血因子XIII(F13a1),以及serpin家族b2(Serpinb 2)(图1.三维空间)。流式细胞仪分析证实IL-4和IL-6均能增强Mϕs中CD 206的表达。3F)。这些结果共同提示IL-4和IL-6在诱导MϕM2极化和免疫抑制中具有积极作用,提示IL-6对Mϕ产生免疫抑制表型有明显的促进作用。

图3:IL-6诱导Mϕ介导的免疫抑制,但刺激CD 40的表达.
figure3

ae分离小鼠骨髓Mϕs,用50 ng/ml IL-4和IL-6处理2天,然后进行rna-seq分析。n=3只老鼠)。基因被定位a主成分和b火山图分析。c分泌基因热图。d免疫抑制细胞因子(TOP)和M2 Mϕ激活相关基因的表达。左边,热图。对,控制的折叠表达方式。e, f用IL-4和IL-6处理骨髓源性小鼠Mϕs 2d,用流式细胞仪进行分析。eIL-10表达左,有代表性的分类。对,定量结果(n=3只小鼠,平均±SEM)。单因素方差分析与Dunnett检验。fCD 206表达(n=3只小鼠,平均±SEM)。单因素方差分析与Dunnett检验。gMϕ激活相关受体基因的表达。左边,热图。对,定量结果(n=3只小鼠,平均±SEM)。用Dunnett检验进行双向方差分析。h用IL-4和IL-6处理骨髓源性小鼠Mϕs,用流式细胞仪进行分析.左,有代表性的分类。对,定量结果(n=3只小鼠,平均±SEM)。单因素方差分析与Dunnett检验。i在对照组WT或IL-6-ΔEC小鼠中诱导GBM.肿瘤植入后2周,用流式细胞仪(平均±扫描电镜)分析肿瘤来源的单细胞悬液。n=3只小鼠为对照组n=4只小鼠(IL-6-ΔEC组)。双尾学生的统计分析t-测试。j建立小鼠GBM模型。用IL-6 Ab和ICIS或对照抗体治疗2天后,用流式细胞仪(FCM)对肿瘤进行分析。n=5只小鼠,平均±SEM)。双尾学生的统计分析t-测试。源数据作为源数据文件提供。

多种机制介导Mϕ活化及其对T细胞的共同刺激促进抗肿瘤免疫,主要通过肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族介导。Tnfrsf1a/b)和CD 4024,25。与我们所发现的IL-6诱导MϕM2极化和免疫抑制的结果不同,我们的rna序列分析结果意外地显示IL-6刺激CD 40的表达,而不是肿瘤坏死因子R1α/β(如图所示)。第三代)。此外,IL-6,而不是IL-4,在mRNA和蛋白水平上都能持续诱导CD 40的表达(如图所示)。3G,h)。流式细胞仪分析表明,IL-6对肿瘤源性M-ϕs的CD 40表达有明显的促进作用(附图)。3)。这些发现提示IL-6在促肿瘤免疫和抗肿瘤免疫中具有双重作用,分别通过免疫抑制细胞因子和Mϕ激活信号CD 40的表达介导。此外,流式细胞仪对肿瘤来源的单细胞进行了分析,发现遗传的IL-6消融抑制了肿瘤Mϕs中CD 40的表达,而CD 40的降低则说明了这一点。+F4/80+细胞群体但在CD 40中不存在F4/80+细胞种群(图1.3I提示IL-6在GBM微环境中对CD 40的Mϕ表达具有正调控作用。同样,在抗IL-6抗体和ICIS治疗的肿瘤中,CD 40的Mϕ表达也明显降低(如图所示)。3J),这可能是由于CD 40表达下调导致Mϕ激活不足所致。

IL-6通过STAT 3和HIF-1α诱导CD 40表达

考虑到IL-6诱导M型ϕ极化的机制已经得到了很好的界定。21,26,27我们主要研究IL-6调控CD 40表达的分子机制。对前20种转录因子的计算生物信息学分析表明,IL-6单独诱导低氧诱导因子(HIF)-1α、Ets 2、NK-κB2、STAT 3和Bcl 3的表达均达到一个较强的水平(rna-seq法测定,每千伏酶(FPKM)>1.0,与对照组和IL-4处理的小鼠Mϕs(Fig)相比,差异无显着性(P>0.05)。4A)。我们最初的研究重点是参与IL-6信号调节的hif-1α、nk-κb和stat 3。28,29,30,31。小干扰RNA(SiRNA)介导的STAT 3基因敲除,而非NK-κB2基因的敲除,使IL-6诱导的人Mϕ的CD 40表达明显减少(图一)。4B)。此外,染色质免疫共沉淀(芯片)分析显示STAT 2与CD 40启动子,特别是在转录起始点下游的−821至−577之间,以IL-6诱导的方式相互作用(如图6所示)。4C,d),表明STAT 3在IL-6诱导的CD 40转录中起着关键作用。

图4:IL-6通过STAT 3和HIF-1α诱导CD 40表达.
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a取小鼠骨髓来源的Mϕ,用50 ng/ml的IL-4和IL-6处理2天,然后进行rna-seq分析。n=3只老鼠)。所示为IL-6诱导的转录因子。左边,热图。对,控制的折叠表达方式。b用靶向NF-κB2、STAT 3或对照序列的siRNA转染人单核细胞,用IL-6或对照培养基处理。细胞裂解物免疫印迹。本实验分别重复两次,结果相似。ce人单核细胞经IL-6或对照培养基处理后,d常氧或e缺氧。核蛋白免疫沉淀d反STAT 3或e抗HIF-1α抗体,用不同引物进行芯片分析.c结果来自实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)。n=3例人体标本,即±SEM)。用图基检验进行双向方差分析。f人单核细胞在常氧或缺氧条件下用IL-6或对照培养基处理,然后进行免疫印迹分析。本实验分别重复两次,结果相似。g用靶向HIF-1α或对照序列的siRNA预处理人单核细胞,缺氧条件下用IL-6或对照组处理。细胞裂解物免疫印迹。本实验分别重复两次,结果相似。源数据作为源数据文件提供。

考虑到HIF-1α是细胞对缺氧反应的主要调节因子,在IL-6诱导转录因子的顶端被发现(如图1所示)。4A我们研究了缺氧条件下HIF-1α在IL-6诱导的CD 40表达中的作用.我们的数据表明,缺氧条件下,HIF-1α与TSS下游−402至−161启动子区的CD 40启动子结合,IL-6显著增强了这一结合(如图4 0 1所示)。4C,e)。此外,免疫印迹分析表明,低氧刺激IL-6诱导的CD 40表达。4F)。SiRNA介导的HIF-1α基因敲除阻断IL-6诱导的CD 40表达(如图所示)。4F,g)。我们的数据显示IL-6通过STAT 3和HIF-1α诱导CD 40的表达.

IL-6中和和CD 40刺激使GBM对免疫检查点阻滞的敏感性

给予IL-6在免疫抑制细胞因子介导的肿瘤前效应免疫和CD 40介导的抗肿瘤免疫中的双重作用。3),我们下一步尝试联合CD 40激动剂的实验治疗,以最大限度地提高抗IL-6治疗中的肿瘤免疫能力。在野生型(WT)小鼠中进行基因诱导,然后单独或联合应用IL-6中和抗体、CD 40激动剂抗体和ICI治疗。5A)。我们的数据显示,仅刺激CD 40并不影响肿瘤的生长。5B)或动物生存(见图。5C)。在一项平行的研究中,联合应用CD 40激动剂和检查点抑制剂也不能延长动物的存活时间(补充图)。4)。然而,将IL-6中和和CD 40刺激相结合的双重治疗能显著提高GBM对ICI治疗的敏感性,如CD 40抗体、IL-6抗体和ICIS三联疗法(如图1所示)。5B)和提高小鼠的存活率,几乎翻了一倍中位生存期(37天),相比之下,在21天的对照组,IgG处理的小鼠(图一)。5C)。这些结果提示双靶向IL-6和CD 40是克服GBM抵抗ICI的有效策略。

图5:IL-6中和和CD 40刺激使GBM对免疫检查点阻断治疗敏感.
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大鼠移植性GBM的实验研究ac,来源于RCAS基因工程模型的肿瘤细胞(n=6-7只小鼠n数字如图所示)或dfGL 261肿瘤细胞(n=8-9只小鼠n数字如图所示),然后是不同的治疗和生存分析。a, d实验程序。b, e用生物发光成像技术分析肿瘤体积。c, f用双侧对数秩Mantel-Cox分析法监测和分析小鼠的生存情况.中位生存期。源数据作为源数据文件提供。

此外,我们在独立的GL261小鼠GBM模型中测试了双重靶向治疗的疗效。5D)。与在基因诱导的GBM模型中观察到的结果相似,proCD 40和抗IL-6单药对肿瘤生长和动物存活的治疗作用分别有限和中等(如图1所示)。5E,f)。与先前公布的数据一致32GL 261肿瘤对ICI治疗有部分反应。值得注意的是,ICIS与IL-6和CD 40双重靶向作用的结合导致了完全的治疗反应,所有治疗动物在治疗结束时存活,没有发现肿瘤(图1)。5E,f).

IL-6中和和CD 40刺激加免疫检查点阻断协同减少M-ϕ介导的免疫抑制,增强T细胞浸润和活化

接下来,我们在基因工程的GBM模型中观察了联合治疗对治疗后2天肿瘤免疫功能的影响(图1)。6A)。我们的数据表明,三重治疗几乎完全阻断了肿瘤的生长在治疗窗口,并在较小的程度上,联合治疗与IL-6中和和CD 40刺激明显减少肿瘤生长(图一)。6B)。流式细胞仪分析肿瘤来源的单细胞悬液显示,与对照组相比,所有治疗组均表现出肿瘤相关的Mϕs的免疫抑制活性逆转,而IL 10的数量减少就证明了这一点。+F4/80+细胞增加了70%(见图)。6C)。然而,只有三重治疗引起了显著的(P < 0.01), robust sevenfold increase in the infiltrates of cytotoxic CD45+CD8+T细胞(图1.6d),这很可能导致治疗的好处,包括延迟肿瘤生长和延长动物的生存(图一)。5B,c)。此外,三次处理可增强这些浸润的T细胞的活性,如CD 45的增加所表明的那样。+CD8+基67+和CD 45+CD8+干扰素-γ+表达增殖标记Ki 67和细胞毒性细胞因子IFN-γ的细胞群体(图)。6E,f)。此外,除CD 40单独刺激治疗外,所有治疗方法均降低肿瘤组织中免疫抑制细胞因子(IL-10和TGF-β)的表达,与对照组相比,免疫抑制性细胞因子在肿瘤组织中的表达减少(如图1所示)。6g,h),验证Mϕ介导的免疫抑制在GBM中的逆转。

图6:IL-6中和和CD 40刺激加免疫检查点阻断协同逆转Mϕ介导的免疫抑制,激活GBM相关T细胞.
figure6

用不同的方法诱导小鼠GBM,并进行终点分析。a实验程序。b应用生物发光成像技术对治疗前后肿瘤体积进行分析。左边,有代表性的图像。对,量化结果(n=6只小鼠,平均±SEM)。用Dunnett检验进行双向方差分析。cf流式细胞术分析肿瘤细胞来源的单细胞悬液。c, d细胞被c、抗F4/80和抗IL-10,或d抗CD 45和CD8抗体。左,有代表性的分类。对,量化结果(n=5只小鼠,平均±SEM)。单因素方差分析与Dunnett检验。e, f细胞被e抗CD8及抗Ki 67,或f抗CD8和抗IFN-γ抗体。量化结果显示(n=5只小鼠,平均±SEM)。单因素方差分析与Dunnett检验。g, h肿瘤裂解物g伊-10和h转化生长因子-βELISA分析(均值±扫描电镜)n=4只小鼠ICI+IL-6抗体治疗组,n=6只小鼠为ICIS,CD 40 Ab,加IL-6 Ab治疗组,及n=其他各组小鼠5只)。单因素方差分析与Dunnett检验。源数据作为源数据文件提供。

与GL261GBM模型并行研究(补充图)。6A),三重处理同样减少了IL-10的数量。+F4/80+Mϕs(附图)6B),加强CD 45的渗透。+CD8+T细胞进入肿瘤(附图)。6C),并增加了CD 45的人口。+CD8+干扰素-γ+活性T细胞(附图)6d)。综上所述,我们的数据表明,双靶向IL-6和CD 40结合检查点阻断的联合治疗会强烈逆转Mϕ介导的免疫抑制,导致T细胞浸润和激活。

GBM患者IL-6高表达和CD 40低表达与生存不良相关

最后,我们分析了肿瘤基因组图谱(TCGA)数据集,以探讨IL-6和CD 40在GBM或胶质瘤患者中的作用。我们的结果表明:(1)IL-6刺激CD 40在Mϕs的体外表达(如图1所示)。3G,h(2)IL-6基因敲除或抑制可降低小鼠肿瘤相关Mϕs中CD 40的表达。3i,jTCGA数据中IL-6的表达与CD 40的表达密切相关(图1)。7A)。CD 40的表达与IL-6在GBM中的促炎作用相一致,也与TNF-α、IL-1α、IL-1β等促炎细胞因子的表达有关。7A)。相比之下,另一种调节Mϕ和T细胞功能的重要细胞因子IL-4的表达与CD 40在GBM或所有级别胶质瘤中的表达无关(图一)。7b)。此外,临床总生存期数据显示,高表达IL-6与GBM患者生存不良有关(图一)。7C和补充图。7bCD 40的表达并不是影响GBM患者生存率的一个预后因素(如图所示)。7C和补充图。7b)。有趣的是,IL-6高表达和CD 40低表达的GBM患者总体生存率最差(如图所示)。7D和补充图。7b)。这些临床数据共同支持我们的实验结果,表明IL-6控制GBM相关Mϕs中CD 40的表达,IL-6和CD 40对肿瘤免疫和病理结果有重要的调节作用。

图7:人GBM患者IL-6高表达和CD 40低表达与生存不良相关。
figure7

a, bCD 40表达与a中-6和b用GlioVis/TCGA、GBM-RNA-seq(n160例)和低度胶质瘤(n=513名患者)数据集。用线性回归分析进行统计分析。c, d用TCGA-Firehoss数据集分析IL-6和CD 40表达(高/低截止率为40%)与总生存率的相关性。用双面对数秩检验进行统计分析。e一个图式模型。IL-6分别通过IL-10和CD 40的表达诱导Mϕ的抗炎和促炎作用.抗IL-6中和和CD 40激活联合治疗可逆转Mϕ介导的肿瘤免疫抑制,促进T细胞浸润和活化,使肿瘤对检查点抑制敏感。

总之,我们的工作揭示了IL-6在肿瘤免疫调节中的复杂作用。7E):IL-6可诱导选择性Mϕ极化和抗炎免疫抑制,而通过STAT 3/HIF-1α刺激促炎CD 40的表达。因此,抗IL-6单药治疗不能诱导强大的抗肿瘤活性和克服gbm对检查点阻断的抵抗力,这可能是由于共同刺激的CD 40信号减少和T细胞浸润和激活不足所致。基于这些结果,我们开发了双靶点抗IL-6和proCD 40策略,以激活肿瘤免疫,使肿瘤对T细胞免疫治疗敏感,包括检查点阻断。

讨论

免疫检查点阻断激活肿瘤相关T细胞是治疗各种实体肿瘤最成功的免疫治疗方法之一。33,34然而,检查点抑制剂在治疗包括GBM在内的免疫寒冷肿瘤方面基本上无效。4,35。因此,pd-1抑制剂nivolumab和ctla-4抑制剂ipilimumab在最近的gbm临床试验中显示出很少或根本没有整体生存效益,主要是由于免疫抑制微环境中缺乏或缺乏T细胞浸润。22,23。在这里,我们建立了双靶向抗IL-6和亲CD 40策略,以逆转Mϕ介导的肿瘤免疫抑制,并克服原发性肿瘤抵抗免疫检查点阻断在GBM。

肿瘤相关Mϕ占gbm免疫细胞总数的一半以上,可诱导多种免疫抑制功能。20,36,37。越来越多的证据表明,肿瘤Mϕs在GBM免疫治疗中是一个很有吸引力的靶点,特别是在改善检查点阻断治疗方面。38,39,40,41,42,43。IL-6,虽然最初被认为是一种促进炎症的细胞因子28,44,最近已被证明能刺激糖尿病和肥胖情况下与抗炎免疫抑制功能相关的另一种Mϕ激活。26,27。与以往的研究结果一致,表明肿瘤间质分泌IL-6来抑制抗肿瘤免疫。45,我们最近的研究表明,肿瘤血管小生境来源的IL-6诱导了选择性M-ϕ激活。21。在这里,我们的研究表明,IL-6阻断部分逆转肿瘤免疫抑制和刺激T细胞浸润到GBM肿瘤.重要的是,通过无偏转录组分析,我们的工作验证了IL-6驱动了替代Mϕ激活和免疫抑制IL-10的表达,这种激活和表达是通过基因重排过程介导的,这种过程不同于众所周知的Mϕ激活的诱导剂IL-4诱导的机制。17,46。此外,最近的研究表明,IL-6可导致胰腺癌树突状细胞的全身功能障碍,提示抗IL-6治疗有更多的好处。47。然而,我们的工作表明,单独抗IL-6治疗的效果有限,与检查点抑制剂没有协同作用,提示抗IL-6单药可能并不能完全逆转Mϕ介导的免疫抑制,从而激活抗肿瘤免疫。同样,最近的一项研究表明,抗IL-6治疗诱导了类似的治疗效果,但抗肿瘤活性与pd-1的抑制是相加的,这是由于本研究中使用的检查点抑制敏感的小鼠gbm模型所致。32。事实上,抗IL-6单药在临床上并不能有效治疗多种类型的癌症。48,49,50。我们的进一步工作确定了CD 40在抗IL-6和检查点阻断治疗中的肿瘤耐药作用。

CD 40是肿瘤坏死因子受体家族的一员,是一种共刺激蛋白,在肿瘤中树突状细胞和Mϕs等抗原提呈细胞的促炎免疫激活中起着至关重要的作用。24,51,52,53。以前的研究表明,CD 40刺激可激活肿瘤相关的Mϕs或T细胞,并抑制黑色素瘤、淋巴瘤和胰腺癌的肿瘤进展。54,55,56。同样,CD 40激动剂治疗会重新规划肿瘤的微环境,并使肿瘤对乳腺癌、胰腺癌和骨肉瘤的检查点阻断治疗敏感。57,58,59。然而,与最近的研究相一致的是,基于抗体的CD 40激活单药治疗只对同基因小鼠gbm模型中动物的存活有轻微的影响,尤其是在GL 261模型中。60,61我们的研究表明,单用CD 40抗体治疗没有疗效,也不能使基因工程的ϕ模型中的检查点阻断治疗敏感,提示M的激活机制是多方面的。值得注意的是,我们的rna-seq数据确定了IL-6在调节Mϕ活性方面的复杂作用,包括促炎(刺激CD 40表达)和抗炎(诱导替代Mϕ激活和免疫抑制)功能,这促使我们探索双重靶向抗IL-6和proCD 40治疗,以最大限度地激活Mϕ介导的抗肿瘤免疫。我们的数据显示,这种双重靶向策略在很大程度上逆转了Mϕ介导的肿瘤免疫抑制,并诱导CD8浸润。+T细胞进入肿瘤。最近的一项研究表明,腺病毒基因治疗阻断IL-6受体和激活CD 40能显著延长胰腺癌动物的存活时间,抑制免疫抑制因子tf-β的表达。62。引人注目的是,我们的工作进一步表明,这种双重靶向抗IL-6和亲CD 40策略克服了gbm对检查点阻断治疗的抵抗力,这可能是由于肿瘤免疫状态从免疫冷转为热。我们期望这种双重靶向治疗的剂量和时间的优化将进一步提高GBM的治疗效果。

IL-6是一种多向性细胞因子,主要通过诱导免疫细胞激活Jak/stat-3和RAS/Erk/C/EBP途径来调节免疫和炎症反应。28,29。我们的工作发现IL-6在Mϕ中通过STAT 3诱导CD 40的表达,以前的工作表明,CD 40的参与诱导了jak/STAT 3的磷酸化和激活。63此外,我们还发现缺氧诱导的细胞反应的主要调节因子HIF-1α在缺氧条件下对IL-6诱导的Mϕs CD 40的表达至关重要,因为STAT 3和HIF-1α在IL-6刺激下与CD 40启动子结合。有趣的是,众所周知,缺氧诱导了STAT 3的激活,STAT 3通过蛋白质相互作用使hif-1α稳定。64,65,66提示IL-6激活STAT 3激活HIF-1α,进一步增强缺氧条件下Mϕ的CD 40表达。这些结果说明IL-6通过STAT 3和HIF-1α诱导炎症性CD 40表达的低氧诱导机制,以及IL-6在抗炎替代的Mϕ激活和肿瘤免疫抑制中的作用。我们的工作表明,低氧可增强IL-6介导的CD 40在肿瘤Mϕs中的表达,提示通过调节肿瘤代谢或血管正常化来缓解肿瘤缺氧可能需要额外的CD 40激动剂来刺激抗肿瘤免疫。

总之,我们的工作揭示了IL-6调节的细胞机制,通过IL-10和STAT 3/HIF-1α/CD 40的表达来控制M-α介导的肿瘤免疫。我们的研究结果提示,双靶向IL-6和CD 40可能为逆转Mϕ介导的肿瘤免疫抑制和改善T细胞免疫治疗GBM提供了令人兴奋的机会。这种双重靶向治疗可作为治疗标准后的辅助治疗,包括外科手术和放化疗,从而减轻GBM的肿瘤负担,导致免疫原性细胞死亡。值得注意的是,我们的工作表明,双靶向IL-6和CD 40+icIS完全消除所有治疗小鼠的GL 261肿瘤,提示混合免疫疗法结合抗IL-6或IL-6受体的中和抗体(如tocilizumab或sarilumab)和抗CD 40激动剂抗体(如APX005M)可能是治疗GBM的有效方法,可能对其他免疫寒冷的肿瘤,如胰腺、卵巢和前列腺癌有明显的免疫抑制性Mϕs浸润。


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