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WSX 1通过下调pd-l1的表达,在肝细胞癌中发挥抑癌作用

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发表时间:2021-06-10 10:54作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

WSX 1是IL-27的受体亚单位,在免疫细胞中广泛表达,与免疫应答密切相关,但其在非免疫细胞中的作用尚不清楚。本文报道了WSX 1在人肝细胞中的高表达,而在肝细胞癌(HCC)细胞中的表达下调。使用NRAS/AKT来源于自发性肝癌小鼠模型,我们揭示了wsx 1在很大程度上依赖于CD8的不依赖于IL-27的肿瘤抑制作用。+抑制肿瘤pd-L1表达及相关CD8的T细胞免疫监测+T细胞衰竭。机械地,WSX 1转录下调PI3K-PI3Kδ的一个亚型,从而使AKT失活,减少AKT诱导的GSK 3β抑制。活化的GSK 3β促进Pd-L1的降解,导致Pd-L1的降解。总之,我们证明WSX 1是一种肿瘤抑制因子,通过阻断PI3Kδ/AKT/GSK 3β/PD-L1通路,增强肝脏免疫监视功能。我们的研究结果可能有助于了解宿主对免疫反应的稳态控制,并有助于癌症免疫治疗的发展。

导言

肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是全世界最常见的恶性肿瘤之一,是导致癌症相关死亡的第五大原因。1,2,3。肝癌的发展是一个多因素的过程,调控基因的遗传和表观遗传改变导致癌基因的激活和抑癌基因的失活。4。与大多数其他恶性肿瘤不同,肝癌是一种炎症和免疫相关的肿瘤,几乎完全发生在炎症的纤维化或肝硬化环境中。值得注意的是,我们设计了一个严格控制的免疫网络来检测和消除转化的细胞,但是这个过程在肝癌中经常被失调。5。最近针对免疫检查点的免疫治疗的突破大大提高了肝癌患者的生存率。6,7,进一步支持免疫调节失调在HCC发展中的重要作用。然而,到目前为止,HCC细胞诱导免疫耐受和逃避宿主稳态免疫监视的机制尚不清楚。

程序性死亡配体-1(pd-l1)是一种重要的免疫检查点蛋白,它与T细胞的受体pd-1(pd-1)相互作用,激活协同抑制信号,抑制效应T细胞功能。8,9。Pd-l1/pd-1轴的生理作用是维持外周耐受和自身免疫之间的平衡,但癌细胞劫持这一过程以逃避宿主的免疫监视。10。癌细胞通过pd-L1的表达逃避免疫消除,pd-L1与T细胞上的pd-1相互作用,诱导免疫抑制。11,12。在过去的十年中,pd-l1/pd-1轴的阻断对包括肝癌在内的多种晚期癌症表现出了显著的临床疗效。6,7,13。针对pd-L1/pd-1的抑制剂nivolumab和durvalumab在第二阶段临床试验中取得了有希望的结果,并被美国食品和药物管理局(FDA)批准为肝癌的二线治疗方案。6,13,14,15。这些令人鼓舞的临床益处突出了PD-L1/PD-1轴在HCC发病中的关键作用。在生理条件下,Pd-L1的表达受到严格控制,以防止免疫过度反应,同时保持适当的免疫防御水平。然而,这种控制系统常常在癌症中被破坏,导致PD-L1调控失调,进而引发PD-L1/PD-1轴介导的免疫逃逸,促进肿瘤的形成。尽管如此,对Pd-L1表达的稳态调控及其在癌症中的调控机制知之甚少。了解PD-L1的多方面控制有助于制定更有效的治疗策略。

与IL-12受体β2链同源的WSX 1是一种Ⅰ类细胞因子受体,由单个跨膜结构域、WSX 1特征基序、胞内区的方框1基序和细胞外结构域的7个潜在N-糖基化位点组成。16。WSx 1与gp 130一起构成了IL-27的功能信号转导受体;缺少这两种亚单位都可以减弱IL-27介导的信号传递。17。Wsx 1以前被认为仅在免疫细胞中表达,介导IL-27依赖的促炎或抗炎免疫反应。17,18。然而,我们和其他人已经证明WSX 1也在多种类型的上皮性肿瘤细胞中表达,包括乳腺肿瘤、黑色素瘤和肺癌。19,20,21。WSX 1致敏IL-27非依赖性自然杀伤细胞介导的乳腺肿瘤抗肿瘤监测20并以IL-27依赖的方式抑制黑色素瘤的生长。19。此外,最近的一项研究报道,小鼠WSX 1缺乏可促进突变型p53的致癌性。22,表明WSX 1具有抑瘤作用。WSX 1的这些生物学功能在很大程度上取决于其配体IL-27的存在。

在这项研究中,我们揭示了wsx 1作为潜在的肝癌抑制因子的一种与IL-27无关的生物学功能,这种功能主要依赖于wsx 1对CD8的调节。+T细胞介导的适应性免疫。简单地说,我们使用多个人体组织微阵列,自发肝癌小鼠模型,以及目前的免疫和分子分析工具来显示wsx 1下调肿瘤pd-l1和减少CD8。+T细胞衰竭在肿瘤的微环境中,导致癌基因介导的肝癌的形成受到抑制.

结果

WSX 1在正常肝组织中高表达,其在肝癌中的表达下调与预后不良密切相关。

虽然WSX 1在免疫系统中的作用已被广泛研究,但其在非免疫细胞中的表达模式和生物学功能尚不清楚。为了阐明WSX 1的生理分布,我们首先用人多个正常组织芯片(FDA662a)检测了33种不同类型的正常器官组织中WSX 1的表达。与以前的报告一致16,17,18WSX 1在脾脏、淋巴结等免疫细胞富集组织中呈阳性表达,在胸腺和骨髓中表达水平较高。出乎意料的是,我们观察到WSX 1在多个正常人体器官中的高表达,如结肠、肠道和肾脏(附图)。1)。值得注意的是,正常人肝组织对WSX 1呈均匀阳性染色(图1)。1A)肝细胞胞浆和细胞膜中分布均匀。此外,WSX 1在肝组织中的表达水平甚至高于免疫细胞富集组织。结合我们先前的发现,wsx 1缺乏的小鼠对肝脏炎症高度敏感。23,24我们推测WSX 1在肝脏中起着至关重要的作用。

图1:WSX 1在正常肝细胞中高表达,其在HCC中的表达下调与预后不良有关。
figure1

a人正常组织芯片(TMA,FDA662a)中WSX 1的免疫组织化学(IHC)染色所显示的图像代表了两个个人的结果。b肝癌组织(BC03116a和HLiV-HCC180Sur-03)中WSX 1的IHC染色n=17),NAT(n=103,P < 0.0001 compared to normal liver tissue), and HCC (n=130,P < 0.0001 compared to both normal liver tissue and NAT) samples. Statistical analysis results are based on quantification of the percentage of WSX1+每个TMA组织核心的面积。c低肝癌患者整体生存率的比较(英文)n=47)和WSX 1高表达组(n=43,P=0.0034)。由于缺乏生存数据,TMA BC03116a的40例HCC患者被排除在外。dWSX 1在包括NAT在内的HCC不同病理分级中的表达水平n=103),一级(n=21),二级(n=73,P=0.0321(与一级相比)和三级(n=34,P < 0.0001 compared to grade I and P=0.0123与二级相比)。量化和统计分析结果显示在右边。标尺,50μm,定量数据为平均±SD。单因素方差分析计算P价值。在方差分析中,采用Tuke-Kramer多重比较检验进行配对比较。采用Kaplan-Meier法进行生存曲线分析,用对数秩检验比较各组间的总生存率。所有的统计检验都是双面的。*P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001. HCC hepatocellular carcinoma, NAT normal tumor-adjacent liver tissue. Source data are provided as a Source Data file.

为了验证上述结果并探讨WSX 1是否与HCC的发生有关,我们进一步分析了WSX 1在人肝组织芯片(BC03116a和HLiV-HCC180Sur-03)中的表达,其中包括130例HCC、17例健康供体正常组织和103例癌旁正常肝组织(NAT)。130例HCC的临床和病理特点见表。1。在130例HCC患者中,90例(HLiV-HCC180SuR-03)可获得相对存活随访信息.由于阳性染色区域的强度相似,结果被量化为wsx 1的百分比。+该区域由ImageJ软件开发。我们一致观察到WSX 1在正常肝组织(平均±SD,48.97%±6.64%)呈均匀扩散型,主要分布在肝细胞中。而WSX 1在NAT中的表达显著低于NAT(39.31%±8.58%)。P < 0.0001) and was the lowest in HCC tissues (14.31% ± 7.95%, P < 0.0001, Fig. 1B)。此外,以中位数为界,HLiv-HCC180Sur-03中的90例HCC患者被手动划分为低度(n=47)和高(n=43)WSX 1表达组。正如预期的那样,WSX 1表达较低的患者总生存期较短(危险比[HR]=2.460,P=0.0034,图1。1C)。此外,我们观察到WSX 1在Ⅲ级组织中的表达较低(10.31%±5.18%)。n与Ⅰ级(19.51%±8.67%)比较,差异有显着性(P<0.05)。n=21,P < 0.0001) and grade II (14.80% ± 7.97%, n=73,P=0.0123)。WSX 1的表达与年龄、性别或TNM分期无关(表)1)。这些结果表明WSX 1在HCC的发生发展中起着消极的作用。

表1 TMAS中130例HCC患者的临床和病理资料。

WSX 1在体内独立于IL-27延缓肝癌的发展。

为了阐明WSX 1在肝癌发生中的作用,我们在免疫能力强的FVB/NJ小鼠中建立了自发性肝癌小鼠模型。与以前的研究一致25,26,我们发现水动力注射(HDI)NRAS/AKT癌基因在6周内诱发结节性和弥漫性肝癌的发生,无例外。2A)。苏木精和伊红(H&E)染色显示肿瘤病变占肝实质的90%以上。然而,每周一次的hdi质粒DNA编码WSX 1,肝癌的形成明显延迟,散发分布的肿瘤结节约占20%的肝实质。P < 0.0001, Fig. 2B,c)。WSX 1的HDI导致肝脏重量显著下降(P=0.0088,图1。二维空间),具有明显的生存扩展(HR=0.2046,P=0.0217,图1。2E)。此外,与我们在人肝癌组织中的结果一致,癌基因处理的小鼠肝组织中WSX 1的表达比未处理的小鼠降低,并且在编码WSX 1的质粒HDI后基本恢复(如图1所示)。2K).

图2:WSX 1延缓致癌NRAS/AKT-体内诱导肝癌的发生。
figure2

a(上)NRAS/AKTFVB/NJ小鼠癌基因自发肝癌模型(n=8)。箭头代表水动力注射WSX 1每周。(下)代表整个小鼠肝脏的癌基因和癌基因+WSX 1组。b苏木精与伊红(H&E)组织学比较。c基于H&E结果的肝前病变/肿瘤病变面积百分比的比较(P < 0.0001). d癌基因与癌基因+WSX 1组肝脏重量的差异(P=0.0088)。e整体生存比较(P=0.0217)。f(上图)野生型或WSX 1型肝癌小鼠模型概述−/−C57BL/6J小鼠(n=6)。(下)野生型或WSX 1型小鼠肝脏的典型图像−/−老鼠。gH&E组织学比较。h肝前病变/肿瘤病变面积百分比的比较(P=0.0012)。i野生型与WSX 1型肝脏重量的差异−/−老鼠(P=0.0328)。j整体存活率比较(P=0.0252)。kWSX 1在小鼠肝组织中表达的载体、癌基因和癌基因+WSX 1组。标度条,100μm。所有数据和图像代表3个独立的实验。定量数据以均值±sd表示,并由双面学生进行分析。t测试一下。采用Kaplan-Meier法进行生存曲线分析,用对数秩检验比较各组间的总生存率。*P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001. Source data are provided as a Source Data file.

WSX 1−/−用C57BL/6J小鼠建立自发性肝癌模型。NRAS/AKT注射癌基因。因此,尽管WSX 1−/−老鼠一般都是有生存能力的,并且没有明显的异常,他们更容易受到NRAS/AKT-诱发致癌(图1.2F)。具体来说,与野生型小鼠相比,WSX 1−/−小鼠肿瘤形成较早,肿瘤较多(P=0.0012,图1。2G,h),肝脏重量增加(P=0.0328,图1。2I),存活率显著下降(HR=4.821,P=0.0252,图1。2J)。这些结果进一步支持了WSX 1在肝癌发展中的抑瘤作用。

此外,先前的一项研究报告,wsx 1对黑色素瘤细胞增殖的抑制作用取决于其配体IL-27的存在。19。因此,我们在IL-27p28中建立了自发性肝癌小鼠模型。−/−C57BL/6J小鼠。IL-27p28是异二聚体细胞因子IL-27中不可缺少的组成部分。27。结果发现,IL-27p28缺乏对WSX 1的抑瘤作用无明显影响。在没有IL-27的情况下,WSX 1仍然受损。NRAS/AKT癌基因诱导的肝癌的形成和整体生存率的改善(补充图。2提示WSX 1在HCC中的抑制作用与IL-27无关。

WSX 1通过最大化CD8来阻碍肝癌的发展+T细胞介导的抗肿瘤免疫监测

肿瘤细胞和免疫系统之间的串扰被公认为肝癌发展的关键因素。5。考虑到WSX 1对肝癌细胞体外增殖和迁移无明显影响(附图)。3B,c),而长期以来有报道称WSX 1与免疫调节密切相关。16,17,18我们推测,免疫系统可能参与了WSX 1的抑瘤功能。为了验证这一假设,我们用免疫缺陷NOD建立了自发性肝癌小鼠模型。SCIDγ(NSG)小鼠(缺乏成熟T细胞、B细胞和NK细胞)。正如预期的那样,WSX 1未能阻止NRAS/AKT癌基因诱导的NSG小鼠肝癌的发生P=0.99,附图。4),强烈支持我们的观点,一个完整的免疫系统是必不可少的抗肿瘤功能的WSX 1。

为了确定免疫如何促进WSX 1的抑瘤功能,我们从自发性肝癌小鼠模型的整个肝脏中分离出肝内浸润免疫细胞,然后用飞行时间质量流式细胞术(Cytof)进行细胞分析。34个细胞标记物表达谱的表型分析确定了6种主要的免疫细胞亚群:T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞和其他CD3。细胞(图1.3A)。如图所示。3BWSX 1对这6种细胞亚群在肝内免疫细胞中所占比例无显著影响。有趣的是,约80%的肝内免疫细胞由T细胞组成。3B)。因此,我们的进一步分析集中在T细胞簇上。如图所示,在整个肝内T细胞群体中,CD4所占的比例。+、CD8+,CD4+CD8+双阳性(DP)和CD4CD8癌基因+WSX 1组与癌基因+WSX 1组的双阴性T细胞相似(图1)。3C),和CD8+T细胞占两组肝内T细胞总数的50%.此外,在T细胞面板中,相图分析确定了13个T细胞亚群:2个CD4。+(T2和T10),7 CD8+(T3,T5,T7,T8,T9,T11,T12),3DP(T1,T4,T6)和1 DN(T13)。三维空间)。在热图中显示每个T细胞簇上28个不同标记的表达谱。3E)。图形3F显示每个T细胞簇在整个肝内T细胞群中所占的比例。值得注意的是,WSX 1显著增加了T6的比例(DP T,P=0.0003),T9(CD8)+T,P=0.0016)和T13(DN T,P=0.0453)子集,但减少了T1(pd-1)的比例。+滞后-3+DP T,P=0.0114),T5(滞后-3)+CTLA-4罗氏CD8+T,P=0.0126)和T11(Pd-1)罗氏滞后-3+CTLA-4+CD8+T,P=0.0216,图1。3F)子集。这些结果表明WSX 1治疗主要影响CD8。+T细胞此外,所有CD8+Pd-1、ctla-4和延迟-3是抑制T细胞功能的受体,包括t1 dp T细胞簇在内的t-细胞簇均有较高的pd-1、ctla-4和延迟-3的高表达。28。T细胞衰竭的特点是免疫抑制受体的共同表达(如pd-1、延迟-3、ctla-4)和T细胞功能的进行性丧失,包括细胞因子的递阶性丧失(如IL-2、IFN-γ)。29,30。最近的研究表明hmg-box转录因子TOX是T细胞衰竭的中枢调节因子。31,32,33,34.

图3:WSX 1通过减轻T细胞衰竭抑制肝癌的发展。
figure3

aT分布随机邻居包埋(t-SNE)地图从飞行时间的质量流式细胞术(CyTOF)分析从肝癌小鼠模型中获得的肝内免疫细胞在图中。2A (n=4)。细胞的颜色由R表型鉴定的簇组成。聚类按表达谱分组,手动划分为6个主要细胞亚群:T细胞、B细胞、NK细胞、Mϕ、DC和其他CD3。细胞。bT、B、NK、Mϕ、DC及其他CD3的百分比所有肝内免疫细胞中的细胞(n=4)。cCD4比例+、CD8+,CD4+CD8+DP和CD4CD8肝内总T细胞中的DN T细胞亚群(n=4)。d肝内T细胞经细胞TOF分析后的T-SNE图谱。通过28个标记的表达谱鉴定出13个T细胞亚群。e热图显示13个T细胞簇中28个T细胞板标记的表达。f2 CD4比例的差异+(T2和T10),7 CD8+(T3,T5,T7,T8,T9,T11,T12),3 dp(T1,T4,T6)和1个DN(T13)T细胞团群。n=4)。WSX 1降低了T1的比例(P=0.0114),T5(P=0.0126)和T11(P=0.0216),同时增加了T6的比例(P=0.0003),T9(P=0.0016)和T13子集(P=0.0453)。所有数据都代表了两个独立的实验。定量数据以均值±sd表示,并由双面学生进行分析。t测试一下。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. NK cells natural killer cells, Mϕ macrophages, DCs dendritic cells, DP double positive, DN double negative. Source data are provided as a Source Data file.

我们的独立多色流式细胞仪实验进一步验证了CD8的有效性。+癌基因+WSX 1组T细胞不仅T细胞耗竭标记物(pd-1:P=0.0074;CTLA-4:P=0.0471;滞后-3:P=0.0295),也是T细胞耗尽驱动程序TOX(P=0.0116,补充图。5B,d)。此外,WSX 1还提高了T细胞功能标记物的表达水平(颗粒酶B:P=0.0344;穿孔素:P=0.0440;Ki67:P=0.0418;IL-2:P=0.0405;干扰素-γ:P=0.0268;附图。5C,d)。以上结果表明,wsx 1的存在可以减轻CD8。+T细胞衰竭可能与WSX 1介导的肝癌形成和进展的抑制有关.

为了验证我们的假说,wsx 1的抑瘤作用依赖于它对CD8的影响。+T细胞,我们接下来在体内进行CD8的消耗。+和CD4+T细胞和NK细胞使用特异性抗体。在体免疫细胞耗竭的效率如图所示。4A。CD8耗竭+T细胞明显损害WSX 1介导的抑制癌基因攻击所致肝癌的发展,从而产生大量结节性和弥漫性肝癌(P=0.0002,图1。4B,c)。相反,CD4的消耗+T细胞或NK细胞无明显作用,或仅轻度增加肝脏重量.因此,体内CD8的消耗+T细胞几乎完全消除WSX 1诱导的存活延长(HR=7.078,P=0.0343,图1。4D).

图4:WSX 1诱导的肝癌回归依赖于CD8+T细胞。
figure4

抗CD8耗竭抗体+T(α-CD8),CD4+用T(α-CD4)和NK(α-NK)细胞对自发性肝癌模型小鼠进行免疫细胞耗竭实验。a流式细胞术验证了体内免疫细胞耗竭的效率。分类CD8的选通策略+T细胞,CD4+T细胞和NK细胞如图所示.8A. bWSX 1在体内免疫细胞缺失前后对肿瘤生长的影响n=5)。红色箭头代表WSX 1每周注射一次。绿色箭头代表每周注射3次指示抗体。cCD8耗竭+T细胞受损WSX 1介导的抑制肝癌形成(P=0.0002)。dCD8耗竭+T细胞抑制WSX 1诱导的生存期延长(HR=7.078),P=0.0338)。所有的数据和图像代表了两个独立的实验。定量数据以均值±SD表示,用单因素方差分析(ANOVA)进行分析.在方差分析中,采用Tuke-Kramer多重比较试验进行配对比较。采用Kaplan-Meier法进行生存曲线分析,用对数秩检验比较各组间的总生存率。所有的统计检验都是双面的。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Source data are provided as a Source Data file.

WSX 1通过下调pd-L1在肿瘤细胞中的表达,减轻pd-L1/pd-1轴诱导的T细胞衰竭。

由于编码WSX 1的质粒DNA的HDI对肝内CD8中WSX 1的表达没有显著影响+T细胞(附图)5D()我们推测WSX 1对T细胞衰竭的调控主要是通过其对肿瘤细胞的影响来实现的。认为pd-L1与其受体pd-1在T细胞上的结合是T细胞衰竭的重要原因。35接下来我们将测试WSX 1是否通过影响Pd-L1在肿瘤细胞中的表达来减少T细胞衰竭。首先,我们利用低表达WSX 1的人肝癌细胞株SNU449和SNU475构建了2个稳定的wsx 1过表达细胞系(449)。WSX 1和475WSX 1)。我们还使用CRISPR/Cas9引导RNA(CrWSX 1)在人肝癌细胞株SNU398中敲除WSX 1,该细胞系具有较高的WSX 1(补充图1)的表达水平。3A)。与亲代细胞相比,pd-L1在wsx 1-高表达细胞株449中的表达和总蛋白水平均降低。WSX 1 (P < 0.0001) and 475WSX 1 (P=0.0002,图1。5A,b),但在WSX 1-敲除细胞(P=0.0028,图1。5C,d).

图5:WSX 1过表达下调肝癌细胞中pd-L1的表达。
figure5

aWESTERNBLOTTING分析WSX 1、FLAG和Pd-L1的蛋白水平。用编码WSX 1标志(449)的质粒DNA转染肝癌细胞株SNU449和SNU475。WSX 1和475WSX 1)或载体质粒。b流式细胞仪分析WSX 1过表达对细胞表面Pd-L1表达的影响。Wsx 1过表达降低pd-l1的比例+SNU449中的HCC细胞(n=4个独立实验,P < 0.0001) and SNU475 cells (P=0.0002)。cSNU398细胞WSX 1和PD-L1蛋白水平的免疫印迹分析。采用CRISPR/Cas9引导RNA对人WSX 1(CrWSX 1)进行敲除,并加入非靶向性的crRNA作为对照(CrCtrl)。dWSX 1基因敲除增加了pd-l1的比例。+SNU398细胞中的肝癌细胞(n=4个独立实验,P=0.0028)。e从肝癌小鼠模型中获得的小鼠肝细胞的细胞TOF分析的T-SNE图谱见图。2A。用PD-L1和WSX 1的表达强度来表示细胞的颜色。fPd-L1比例的差异+ (n=4只老鼠,P=0.0012)和WSX 1+小鼠肝细胞(P=0.0002)。所示数据是两个独立实验的代表。g小鼠肝溶解物中pd-L1蛋白水平的免疫印迹分析(C1-C3代表“癌基因”组的独立样本,T1-T3为“癌基因+WSX 1”组的独立样本)。所有的图像都代表了3个独立的实验。定量数据以均值±sd表示,并由双面学生进行分析。t测试一下。**P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. The gating strategy for sorting PD-L1+肝癌细胞如附图所示。8B。源数据作为源数据文件提供。

为了证实WSX 1与PD-L1在体内的联系,我们对自发性肝癌模型小鼠全肝细胞进行了细胞TOF分析。由于自发性肝细胞癌模型的独特特征,没有明确的界限来区分肿瘤病灶、癌前增生区和正常肝组织。没有特异性的标记物可以区分自发肿瘤细胞和正常肝细胞。因此,我们的进一步研究从整体上分析了肝细胞。与体外实验结果一致,CytoF分析结果表明WSX 1确实降低了pd-L1在肝细胞中的表达。P=0.0012,图1。5E,f),经小鼠肝溶解物免疫印迹分析进一步证实。5G)。其次,为了进一步支持WSX 1介导的PD-L1下调可以减少T细胞衰竭和增强T细胞介导的杀伤作用的观点,我们用不同比例的活化人效应T细胞(E)和肿瘤细胞(T)进行了共培养实验。WSX 1-过表达449的存活率WSX 1(e:t=1:1,P=0.0029;E:t=2:1,P=0.0108)和475WSX 1(e:t=1:1,P=0.0022;E:t=2:1,P0.0038)细胞不到亲本细胞存活率的一半(补充图)。6A)。此外,与449共培养的T细胞WSX 1 (P=0.0131)和475WSX 1 (P细胞pd-1表达明显降低(附图)。6B,c)。以上结果共同验证了WSX 1能下调肝细胞中pd-L1的表达,同时降低pd-L1/pd-1轴介导的T细胞耗竭,保证免疫监测的生物学功能。

WSX 1通过增强gsk 3β介导的pd-l1蛋白降解而使pd-l1失稳

在我们观察到WSX 1下调Pd-L1的基础上,我们试图探索其潜在的分子机制。为此,我们首先测试WSX 1是否参与了PD-L1的转录调控。有趣的是,WSX 1对SNU449或SNU475细胞的PD-L1 mRNA水平无显著影响(图一)。6A),提示WSX 1对PD-L1的调节处于蛋白水平。为了验证这一观点,我们用编码标记PD-L1的质粒转染肝癌细胞,该质粒不受内源性PD-L1启动子的调控。正如预期的那样,WSX 1能够下调外源性PD-L1(图1)。6B)。蛋白酶体抑制剂MG 132的加入进一步证实了我们的观点,该抑制剂显著恢复了WSX 1介导的pd-l1在wsx 1-高表达细胞株449中的下调。WSX 1 (P=0.0027)和475WSX 1 (P=0.0362,图1。6C,d)。以前的研究报道了e3泛素连接酶介导的赖氨酸48(K48)多泛素化和随后的蛋白酶体降解控制包括pd-l1在内的多种蛋白质的周转。36。在MG 132存在时,WSX 1-过表达细胞中检测到Pd-L1的K48泛素化增加(如图1所示)。6E)。此外,脉冲追踪分析结果显示,WSX 1明显降低了pd-L1蛋白的半衰期(如图所示)。6f),支持我们的假设,即WSX 1通过促进其泛素介导的蛋白酶体降解而破坏PD-L1的稳定。

图6:WSX 1通过促进GSK 3β介导的PD-L1降解而使PD-L1失稳。
figure6

aQRT-PCR检测显示WSX 1对pd-L1 mRNA表达水平的影响。n=3项独立实验)。bWSX 1对外源性PD-L1-旗表达的影响。将编码PD-L1标志的质粒DNA转染SNU449和SNU475细胞,并进行Westernblotting分析。c蛋白酶体抑制剂MG 132作用12h后PD-L1蛋白水平的免疫印迹分析。d流式细胞仪检测MG 132对细胞表面Pd-L1表达的影响。MG 132抑制WSX 1介导的Pd-L1在两种SNU449(n=5个独立实验,P=0.0027)和SNU475细胞(P=0.0362)。eWSX 1对PD-L1泛素化的影响。MG 132预处理细胞12h,Pd-L1蛋白被特异性Pd-L1抗体抑制。用抗泛素抗体分析pd-L1泛素化。fWSX 1对肝癌细胞pd-L1蛋白半衰期的影响。用25 mM CHX处理肝癌细胞0、4、8和12h,分别收集细胞裂解物,检测Pd-L1蛋白水平。gWSX 1对p-GSK 3β蛋白水平的影响Ser9,总gsk 3β,p-β-cateninSer33/Ser37/Thr 41,以及总β-catenin。β-catenin在Ser33/Ser37/Thr 41上被gsk 3β直接磷酸化,并与p-β-catenin水平成对映体(p-β-catenin)。Ser33/Ser37/Thr 41间接反映GSK 3β活性。hGSK 3β抑制剂LiCl或GSK 3β基因敲除对PD-L1表达的影响。WSX 1-过表达449细胞表面pd-L1的表达WSX 1和475WSX 1细胞经LiCl处理或转染GSK 3βshRNAs 48h后,流式细胞仪分析。i统计分析结果表明,两种LiCl处理(P=0.0135WSX 1P=0.0052WSX 1)和GSK 3β基因敲除(P=0.0020WSX 1P=0.0015WSX 1)增加pd-l1的比例。+肝癌细胞(n=5项独立实验)。jPd-L1-NP(S176A、T180A和S184 A)的一致基序位点定向突变原理图,GSK 3β不能将其磷酸化。kSNU449和SNU475细胞分别转染PD-L1野生型(WT)或PD-L1-NP(突变型)或与WSX 1共转染的SNU449和SNU475细胞。流式细胞术检测细胞表面Pd-L1表达水平的变化。lPd-L1 MFI比值的定量研究。Pd-L1-NP位点定向突变使WSX 1介导的pd-L1下调在两种SNU449中(n=3项独立实验,P=0.0066,而pd-L1-WT)和SNU475细胞(P与Pd-L1-WT相比,=0.0004。定量数据以均值±sd表示,用单因素方差分析或学生分析。t测试一下。在方差分析中,采用Tuke-Kramer多重比较检验进行配对比较。除非另有说明,所显示的数据和图像是3个独立实验的代表。所有的统计检验都是双面的。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. CHX cycloheximide, SP signal peptide, TM transmembrane domain, ECD extracellular domain, ICD intracellular domain, MFI mean fluorescence intensity. The gating strategy for sorting PD-L1+肝癌细胞如附图所示。8B。源数据作为源数据文件提供。

糖原合成酶激酶3β(gsk 3β)是一种重要的激酶,可促进pd-l1磷酸化及随后的k48泛素化。37。考虑到WSX 1促进PD-L1泛素化,我们研究了WSX 1与GSK 3β在PD-L1降解过程中的联系。为支持这一点,上一份报告38发现wsx 1内源水平较低的肝癌细胞株su 449和smu 475均有磷酸化gsk 3β(p-gsk 3β)的基础水平升高。Ser 9),代表GSK 3β激酶活性的抑制。在我们的研究中,wsx 1在su 449和su 475细胞中的过表达导致p-gsk 3β的显著下降。Ser 9对GSK 3总β水平无显著影响(图1)。6g),提示GSK 3β活性增加。据报道,gsk 3β可在Ser33/Ser37/Thr 41(p-β-catenin)上特异性地磷酸化β-catenin。Ser33/Ser37/Thr 41)39,其水平间接反映GSK 3β酶活性。值得注意的是,p-β-catenin的含量增加了。Ser33/Ser37/Thr 41同时,我们也发现了WSX 1增强GSK 3β活性的观点(图1)。6g)。报道了gsk 3β抑制剂LiCl对pd-l1降解的抑制作用。40。在我们的研究中,LiCl治疗对WSX 1诱导的pd-l1在449的下调有很大的帮助。WSX 1 (P=0.0135)和475WSX 1细胞(P=0.0052,图1。6h,我)。为进一步支持我们的假说,转染了抗人GSK 3β(shGSK 3β)的短发夹RNA,建立了WSX 1基因敲除肝癌细胞。结果,gsk 3β基因敲除在很大程度上逆转了wsx 1诱导的pd-l1在449的下调。WSX 1 (P=0.0020)和475WSX 1细胞(P=0.0015,图1。6h,我)。此外,我们从野生型PD-L1结构(标志-PD-L1-WT)中,通过突变PD-L1(S176A,T180A和S184 A)上的3个磷酸化共识基序,合成了标志-PD-L1-NP表达结构。6J),以前有报道说它完全废除了gsk 3β介导的pd-l1磷酸化。37。WSX 1明显下调了旗标-PD-L1-WT,但只略微降低了旗标-PD-L1-NP的表达(SNU449:P=0.0066;SNU475:P=0.0004;图1。6k,l)。这些结果表明WSX 1通过促进GSK 3β介导的PD-L1磷酸化及随后的降解而下调PD-L1的表达。

WSX 1通过激活PI3Kβ/δ信号通路增强GSK 3δ活性

蛋白激酶B(PKB/AKT)是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,在体内外均能磷酸化GSK 3β。41,42。此外,越来越多的证据证明AKT通路在肝癌的发生和pd-l1的调控中起着关键的作用。2,43。我们推测WSX 1通过调节AKT来增强GSK 3β的活性。事实上,我们发现wsx 1显著抑制了aKT的活化,而pAKT的活性却下降了。瑟473(无花果)7A)。结核蛋白(TSC 2)在Thr 1462被活化的AKT直接磷酸化。44。PTSC 2的还原进一步证实了WSX 1对AKT活性的抑制作用。Thr 1462(无花果)7A).

图7:WSX 1通过阻断PI3Kβ/AKT信号通路,减轻GSK 3δ活性的抑制。
figure7

aWSX 1过表达对p-AKT蛋白水平的影响塞尔473、AKT、p-TSC2Thr 1462免疫印迹法检测肝癌细胞中的TSC 2和TSC 2。TSC 2在Thr 1462被AKT直接磷酸化,从而p-tsc2。Thr 1462水平间接反映AKT的活动。b流式细胞仪检测AKT再激活对WSX 1介导的PD-L1下调的影响。将WSX 1单独转染SNU449和SNU475细胞,或用膜结合MYR-AKT共转染SNU449和SNU475细胞。统计分析结果显示在右边(n=5个独立实验,P < 0.0001 in both SNU449 and SNU475 cells). cMYR-AKT转染对p-AKT蛋白水平的影响塞尔473,总AKT和pd-l1在449WSX 1和475WSX 1细胞。dWSX 1、PD-L1和p-AKT表达的免疫印迹分析塞尔473注射FVB/NJ小鼠的全肝溶解物NRAS/AKT含有或不含WSX 1的癌基因(左,C1-C4代表“癌基因”组的独立样本,T1-T4为“癌基因+WSX 1”组的独立样本)。WSX 1与PD-L1和p-AKT相关性的统计分析塞尔473在小鼠肝脏中表达(右)。eWSX 1对PTEN、PI3K-P85、PI3K-p110α和PI3K-p110δ表达的影响。f影响.的影响PIK3CDWSX 1介导的PD-L1还原过表达(左)。PIK3CDPI3K-p110δ编码是PI3Kδ的关键组成部分。重新引进PIK3CDWSX 1损伤引起的Pd-L1在两种SNU449中的减少(n=5个独立实验,P=0.0001)和SNU475细胞(P=0.0013)。gWSX 1对PIK3CDSNU449 mRNA水平(n=3项独立实验P=0.0139)和SNU475肝癌细胞(P=0.0006)。h提示WSX 1通过抑制PI3Kδ/AKT/GSK 3β/PD-L1信号通路,促进抗肿瘤免疫监视。在生理条件下,肝细胞中WSX 1的高表达下调了PIK3δ,从而降低了AKT的激活,从而使GSK 3的β激酶活性从AKT的抑制中释放出来,从而促进了GSK 3β介导的PD-L1的降解。无pd-l1在肿瘤细胞上的过度表达,效应细胞CD8+T细胞最大限度地发挥其杀伤作用,从而抑制肝癌的发展(左)。否则,WSX 1的缺乏导致不受控制的肿瘤性PD-L1的表达,并最终导致肿瘤免疫逃避(右)。iWSX 1,PI3Kδ,AKT,GSK 3β和PD-L1相互作用原理图。定量数据以均值±sd表示,并进行单因素方差分析或学生分析。t测试一下。在方差分析中,采用Tuke-Kramer多重比较检验进行配对比较。相关分析采用Pearson相关检验。除非另有说明,所显示的数据和图像是3个独立实验的代表。所有的统计检验都是双面的。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. myr-AKT myristoylated AKT. The gating strategy for sorting PD-L1+肝癌细胞如图所示。8B。源数据作为源数据文件提供。

上述结果为我们制定了一条途径,其中WSX 1通过激活AKT促进GSK 3β介导的PD-L1降解。为了支持我们的观点,我们转染了编码肉豆蔻酰化AKT(MYR-AKT)的质粒,以重振WSX 1-高表达的肝癌细胞中的AKT活性。事实上,转染MYR-AKT会增加AKT总量和p-AKT。瑟473蛋白质水平(图1.7C)。更重要的是,AKT活性的恢复几乎完全逆转了WSX 1诱导的pd-l1在两种情况下的下降。WSX 1 (P < 0.0001) and 475WSX 1细胞(P < 0.000, Fig. 7b,c)。为了支持这一体外观察,我们在肝癌小鼠模型中的体内研究发现WSX 1的表达与pd-L1水平呈负相关。r=−0.7802,P=0.0224)和AKT活化(r=−0.8662,P=0.0054),用WSX 1、pd-L1和p-aKT的蛋白质水平来衡量。瑟473(无花果)7D)。同时,我们的结果揭示了Pd-L1稳态调控的负调控机制,其中WSX 1阻止AKT介导的GSK 3β抑制,从而激活GSK 3β对PD-L1的降解。

接下来,我们研究了WSX 1对AKT磷酸化的影响。据报道,导致AKT活化的典型途径主要是由磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的激活引起的,其活性可被抑癌基因PTEN所抑制。41。PI3K包含催化亚基p110-α,-β,-γ和-δ的4种异构体。45。其中PI3Kδ是PI3K亚型之一,构成激活aKT信号通路,在肝癌组织中有高表达,在肝脏恶性肿瘤中发挥重要作用。46,47。有趣的是,WSX 1对PTEN、PI3K-P85(PI3K调节亚单位)或PI3K-p110α(PI3Kα)均无显著影响,而对PI3K-p 110δ(PI3Kδ,图1)有明显的下调作用。7E)。为了揭示PI3Kδ的降低是否与wsx 1诱导的pd-l1下调有关,我们重新引入了PIK3CD,编码PI3Kδ,在WSX 1-高表达肝癌细胞中表达。我们的结果表明,与外源转染MYR-AKT一样,PI3Kδ的重新导入在很大程度上损害了WSX 1介导的PD-L1的还原(SNU449:P=0.0001;SNU475:P=0.0013;图1。7F)。为了进一步探讨WSX 1是如何下调PI3Kδ的,我们对WSX 1高表达和亲代肝癌细胞进行了rna-seq和qRT-PCR分析。我们的结果一致表明WSX 1显著减少了PIK3CD两种基因的mRNA水平WSX 1 (P=0.0139)和475WSX 1细胞(P=0.0006),提示WSX 1转录抑制PI3Kδ的表达。7g)。WSX 1对PI3Kδ/AKT/GSK 3β/PD-L1信号转导的影响在WSX 1-敲除细胞中也得到证实(附图)。7).

总之,在上述结果的基础上,我们能够揭示WSX 1、PI3Kδ、AKT、GSK 3β和PD-L1的相互作用模型(图1)。7H,i)。具体来说,在生理条件下,wsx 1在肝细胞中高表达,通过调控pd-l1的pd-l1水平,调控pd-l1信号通路,使pd-l1在正常肝细胞上稳定表达,从而使pd-l1在正常肝细胞中稳定表达,从而产生有效的CD8。+T细胞介导的免疫监测。然而,当WSX 1被多种致癌信号下调时,PI3Kδ从WSX 1介导的转录失活中逃脱,从而导致转录失活。高活性的AKT使GSK 3β失活,从而阻断GSK 3β介导的Pd-L1降解,导致Pd-L1在恶性肝细胞上过度表达,导致Pd-L1/Pd-1轴介导的肿瘤免疫逃逸,最终导致肝癌的发生发展。

讨论

在过去的几十年里,肿瘤抑制基因已经被彻底的研究,因为它们在维持细胞自主的遗传完整性方面起着不可或缺的作用。这些基因大致可分为两类:调节细胞周期和复制的“守门人”和维持遗传稳定性的“看护者”。48,49。最近,随着越来越多的研究人员认识到免疫系统在肿瘤发展中的关键作用。5,50,大量的证据表明,可能有第三类抑癌基因,即“免疫完整性的守护者”,确保有效的免疫监测。51,52,53,54。一些经典的抑癌基因,如TP 53, PTEN,和Rb1,最近在肿瘤免疫学中被认为是其传统细胞自治抑瘤作用的一种功能延伸。然而,它们的抑瘤功能不完全依赖免疫监测。51,52,53,54。与这些双重功能的抑癌基因相比,wsx 1的抑癌功能完全依赖于它对c88的调节。+T细胞免疫监测。WSX 1对肿瘤细胞增殖(看守人作用)和遗传稳定性(看护作用)均无明显影响。相反,WSX 1扮演“免疫监视捍卫者”的角色,以非细胞自主的方式阻断癌基因诱导的肝癌肿瘤发生。WSX 1抑制pd-L1表达及保护CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫监测从衰竭,从而确保有效的免疫消除恶性细胞。

T细胞衰竭在免疫功能障碍和肿瘤免疫逃避中起重要作用。29。在所有肿瘤浸润淋巴细胞中,CD8。+T细胞是通过执行T细胞受体介导的杀伤恶性细胞来进行抗肿瘤免疫的主要子集。55。CD8的相关性+T细胞浸润,提高了整体生存能力。55,56。不幸的是,肿瘤浸润的CD8+T细胞经常处于衰竭状态,其特征是效应功能的逐渐丧失,T细胞耗尽驱动程序TOX的强劲激活。31,32,33,34,以及抑制性受体pd-1、延迟-3、tim-3和ctla-4的持续表达。28,29。事实上,我们的结果显示严重的CD8。+中的T细胞衰竭NRAS/AKT癌基因驱动的自发性肝癌小鼠模型。然而,WSX 1在肝脏中的表达减少了CD8。+T细胞功能障碍,表现为功能标记物的上调,以及多种抑制受体和TOX的下调。有趣的是,要么使用免疫缺陷小鼠,要么在体内耗尽CD8。+T细胞完全逆转WSX 1的抑瘤作用,提示CD8+T细胞免疫对于WSX 1诱导的肝癌抑制是必不可少的。总之,WSX 1没有直接消除恶性细胞,而是防止T细胞衰竭,从而使细胞毒性CD8的活性最大化。+T细胞

虽然T细胞衰竭已经在多种人类癌症中被证实。29,对其发展的基本机制仍然知之甚少。目前,抑制性受体介导的内源性负调控信号和外源性抑制性肿瘤微环境被公认为T细胞衰竭的关键途径。29。在我们的研究中,WSX 1注射可显著上调WSX 1在恶性肝细胞上的表达,而不影响其对CD8浸润的影响。+提示WSX 1对T细胞耗竭的调控是间接的,最有可能是由于恶性细胞的修饰。大量的证据支持这样的观点,即pd-l1与其受体pd-1在效应T细胞上的结合是导致肿瘤浸润淋巴细胞衰竭和随后的肿瘤免疫逃逸的主要机制。9,29。事实上,我们的研究发现WSX 1明显下调了肝癌细胞上的pd-L1,增强了T细胞介导的肿瘤根除。除了细胞表面抑制受体外,一些免疫调节细胞因子也与T细胞衰竭有关。28,29。免疫抑制细胞因子如白细胞介素-10和转化生长因子-β发挥了积极作用,而γ链细胞因子,包括白细胞介素-2、白细胞介素-7和白细胞介素-21,则与对抗T细胞功能障碍有关。28,29。最近的一项研究报告,癌症细胞来源的胆固醇通过调节内质网应激途径而使T细胞失活,强调代谢因子在免疫调节中的重要性。57。根据我们的rna-seq数据,没有发现编码上述免疫调节细胞因子或代谢物的基因有明显的改变,但它们的参与还不能排除,需要进一步研究。

目前针对pd-l1/pd-1轴的免疫治疗在多种肿瘤类型中显示出良好的临床疗效。58。然而,由于固有的或后天的抵抗,它们对整体生存的益处并不令人满意。59。此外,pd-1和pd-l1不仅存在于肿瘤细胞上,也存在于正常细胞上,因此,pd-l1/pd-1相互作用的非选择性阻断不可避免地会对免疫稳态产生不利影响。43。在这种情况下,了解控制PD-L1的生理平衡系统将有助于制定更有效的治疗策略。在过去的几十年中,许多因素,如干扰素-γ,乳酸和NF-κB,被发现在翻译或翻译后水平上调pd-l1的表达。43。考虑到免疫系统是一个严格调控的网络,在免疫和耐受性之间保持一个微妙和精细的平衡,应该有一个匹配的控制系统来抑制免疫检查点。然而,很少发现PD-L1的负调节因子。有限的研究表明,一些microRNAs,如mir-513,可以抑制pd-l1的翻译。60。最近,一项研究报道细胞周期素D-CDK 4激酶通过上调cullin 3-spope3连接酶而使pd-l1失稳,该酶参与了泛素化介导的pd-l1降解。61。即使如此,人们对pd-L1蛋白转换的负控制还知之甚少。在本研究中,我们发现WSX 1是一种积极参与PD-L1稳态控制的负向力量。

越来越多的证据表明pd-l1受到泛素/蛋白酶体系统的广泛调控。43,62,63。Gsk 3β是一种构成性激活的丝氨酸苏氨酸激酶,可介导pd-l1磷酸化,促进泛素e3连接酶的识别及pd-l1的泛素化。37。活化AKT使GSK 3β失活42,64。在我们的研究中,我们发现WSX 1通过下调AKT和促进GSK 3β介导的泛素化和随后的蛋白酶体降解而使PD-L1蛋白失稳。MYR-AKT的重新引入几乎完全逆转了WSX 1诱导的PD-L1的下降.我们还发现,无论是GSK 3β基因敲除,还是GSK 3β抑制剂LiCl,对WSX 1诱导的效应均有一定的抑制作用,提示其下游可能参与了其他途径。

大量研究表明AKT是以PI3K依赖的方式激活的。41,65。PI3Kδ是PI3K亚型之一,它将磷脂酰肌醇(3,4)-二磷酸(PIP 2)脂转化为磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸(PIP 3)脂,然后与磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸酯(PIP 3)结合,使其活化。45,66,67。PI3Kδ在造血细胞中被公认为典型的表达。66。然而,越来越多的证据证明PI3Kδ在多个实体肿瘤中也有高表达。报道了PI3Kδ通过抑制ptn活性促进乳腺癌和前列腺癌细胞增殖,并通过激活β/β-catenin信号通路诱导大肠癌细胞生长和侵袭。68,69。近年来,肝癌组织中也发现了高表达的PI3Kδ,并与低生存率密切相关。46。有趣的是,我们的结果显示WSX 1降低了PI3Kδ的mRNA和蛋白水平,并且PI3Kδ的重新引入在很大程度上抵消了WSX 1诱导的PD-L1的下调。总之,我们揭示了一种信号通路,WSX 1在不影响PI3K其他经典异构体的情况下下调PI3Kδ,从而降低AKT活性,从而阻止AKT介导的GSK 3β抑制,导致GSK 3β介导的PD-L1降解增加。然而,由于还没有报道WSX 1作为转录因子的作用,WSX 1对PI3Kδ转录抑制作用的机制有待进一步研究。

值得注意的是,有报道称化学AKT抑制剂可以抑制肿瘤的固有表型和pd-l1的转录。70,71但WSX 1对肝癌细胞的增殖和迁移均无明显影响,提示WSX 1对AKT/GSK 3β/Pd-L1信号转导具有独特的调控特性,是传统化学抑制剂所不能模仿的。个体PI3K对AKT活性的特异性异形效应可能是造成这种差异的部分原因,但其潜在机制尚不清楚,需要进一步探讨。

此外,除了pd-l1的泛素化介导的蛋白酶体降解外,据报道,糖基化修饰、亚细胞运输和溶酶体降解也与pd-l1蛋白转换密切相关。43,72。因此,需要进一步研究,以揭示WSX 1的功能机制的总体情况。

我们的研究揭示了一种抑癌基因,WSX 1,作为CD8的“监护人”。+T细胞介导的肿瘤免疫监测,作为免疫检查点PD-L1的稳态“监督者”。考虑到有证据表明肝脏在宿主免疫平衡中起着不可或缺的作用。5-鉴于WSX 1在正常肝组织中的高表达及其与关键癌基因PI3K/AKT信号通路和免疫检查点PD-L1的密切相互作用,我们在这里发现的WSX 1的生物学功能可能只是冰山一角,WSX 1的重要性可能比我们想象的要大。值得注意的是,WSX 1在肝脏以外的多个正常器官中表达,包括结肠、肠道和肾脏,这意味着WSX 1在免疫稳态中发挥着更广泛的作用,这可能为更有效的免疫治疗的发展提供理论依据。


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