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不受转化生长因子β-受体信号抑制的致癌性braf驱动右半结肠肿瘤的发生

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发表时间:2021-06-10 10:46作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

右半侧(近端)结直肠癌预后差,突变明显,其特点是致癌。BRAF错配修复和转化生长因子β信号的突变和异常。在此,我们描述了一个由致癌性braf和上皮β受体信号丧失所驱动的右侧结肠癌的小鼠模型。在此模型中发生的近端结肠肿瘤呈胎儿样祖细胞表型(Ly6a/Sca 1+),更重要的是,缺乏表达。Lgr5及其相关的肠道干细胞信号。这些特征在人类中得到了概括。BRAF-突变型、右侧CRCs,代表左、右侧疾病的基本区别.微生物驱动的炎症支持这些肿瘤的发生和发展,具有胎儿样特征,与其对富含微生物的右结肠和抗生素敏感性的偏好相一致。MAPK通路激活突变通过ERK依赖于激活转录辅激活因子YAP来驱动这种胎儿样信号,但同样的类胎转录程序也是由不依赖MAPK的炎症启动的。重要的是,在这两种情况下,上皮转化生长因子β受体信号在抑制这些胎儿样祖细胞的致瘤潜能方面起着重要作用。

导言

结直肠癌(CRC)是引起全世界癌症相关死亡的主要原因之一,它是由大肠/结肠衬里的上皮细胞引起的一组异质性肿瘤。近年来,结直肠肿瘤的解剖位置/侧方已成为疾病进展、对全身治疗的反应和临床结果的重要决定因素。事实上,出现在脾曲的近端(右)或远端(左)的结直肠肿瘤,在流行病学、组织病理学和分子景观方面表现出深刻的差异。1,2,3.

左侧crc是从良性腺瘤发展而来,通过传统的腺瘤-癌通路,通常会引起wnt信号的异常激活,最明显的是通过双等位失活肿瘤抑制器。APC,或激活突变CTNNB 1,两者均导致β-catenin的稳定和核转运.癌前管状、绒毛状或管状绒毛腺瘤向腺癌发展的基础是癌基因和抑癌基因突变的积累,如克拉斯, PIK3CA, TP 53,和Smad 4,以及染色体不稳定4,5。右侧crcs(Rcrc)被认为是通过另一种锯齿状肿瘤途径产生的,这是因为前体病变,即增生性息肉、无梗锯齿状腺瘤/病变(Ssa)和传统锯齿状腺瘤(Tsa),有着独特的锯齿状隐窝形态,这是由于上隐窝上皮明显皱折造成的。6,7,8。特别是SSAS,有很大的恶性进展风险。6,7,8。除了纵向切片所见的锯齿隐窝结构外,右侧肿瘤通常表现出其他共同的组织病理学特征,包括扁平/无柄的形态,黏液性组织学,以及侵袭性局部浸润和腹膜转移/癌瘤病的倾向。9,10,11,12,13。Rcrc的预后比其左侧的rcrc差,其特点是微卫星不稳定、mapk、tgtβ和错配修复途径的异常。9,10,11.

致癌突变BRAF,在brf丝氨酸-苏氨酸激酶(Brf)的残基600处,产生了一种由丙戊酸转变为谷氨酸的替代物(Brf)。V600E),已被确定为相当大一部分锯齿性癌前病变和rcrc的关键启动事件。14,15。独立于上游RAS信号,BRAFV600E癌蛋白引起MAPK(RAS-RAF-MEK-ERK)信号级联的本构激活,在细胞存活、增殖、分化、衰老和凋亡中起关键作用。以前对rcrc进行建模的尝试,利用BRAFV600E单独,主要导致小肠肿瘤显示wnt通路激活。16,17,18。然而,这些发现与窝藏病人的数据不一致。BRAFV600E右侧结肠肿瘤,明显缺乏核β-catenin阳性。19。关于这种明显缺乏Wnt-通路激活的问题,最近的文献表明河马通路效应剂YAP/TAZ参与了胎儿样的重新编程和动员,Lgr5结肠炎相关再生早期的上皮细胞20。在这方面,Lgr5+肠道干细胞(ISC)信号被抑制,伴随着胎儿肠道标志物的表达增加,例如Ly6a/SCA 1Anxa 1,除其他外21,22。类似地,yap/taz信号驱动在辐射诱导再生过程中发生的瞬态胎儿重编程,其基础是抑制Lgr5+ISCS与Wnt信号的衰减23。最后,该yap/taz再生信号也与apc缺陷灶向小鼠小肠腺瘤的进展有关。23。由于慢性炎症、组织损伤和修复与CRC的风险升高有关,这种YAP/TAZ依赖的胎儿样,Lgr5再生状态在缺乏Wnt通道异常的右半结肠肿瘤的发生发展中起着重要作用。

到目前为止,由于缺乏可处理的肿瘤模型,无法忠实地再现致癌brf驱动的rcrc的地形和分子地貌,因此阻碍了解释潜在分子机制和开发靶向治疗方法的努力。在这里,我们描述了一种由致癌brf和上皮β受体信号丧失所驱动的人样小鼠右侧结肠癌模型,该信号传导于具有胎儿样祖表型的近端结肠肿瘤。Ly6a/Sca 1+),更重要的是,缺乏表达。Lgr5及其相关的肠道干细胞信号。我们进一步认为,微生物驱动的炎症在这些肿瘤的发生过程中起着重要作用,这与长期以来的观点一致,即肠道微生物群是crc发展的关键因素,尤其是右半侧疾病的发病机制。24,25。最后,无论是由癌原性braf或炎症直接诱导,我们表明这些胎儿样祖细胞的成瘤潜能受到上皮转化生长因子β信号的根本抑制。

结果

BRAFV600E和转化生长因子β-受体丢失驱动的Wnt-低肿瘤在右半结肠。

鉴于rCRCs与BRAF、转化生长因子β-受体信号的缺陷和失配修复基因的表观遗传沉默MLH 12,我们针对这些突变到小鼠肠道。我们使用他莫昔芬诱导的肠上皮细胞特异性维林Cre。有条件地激活BRAFLSL-V600E敲入等位基因,或删除编码转化生长因子β受体TGF BR 1/ALK 5或错配修复蛋白MLH 1的基因的杂合等位基因。TGF-BR 1/ALK5Fl/flMLH 1Fl/fl分别)26,27,28。维林Cre; 碱5Fl/fl小鼠(被指定为A)没有因所指示的诱导机制而发展成肿瘤(一次为3毫克),而另一组接受更严格制度的20只小鼠(连续天为3毫克,2毫克)则未在475天内发展成肿瘤(图1)。1A)。此外,VillinCre; MLH 1Fl/fl和VillinCre; BRAFLSL-V600E/+(指定B)小鼠主要在小肠内发生肿瘤(图一)。1A,补充图。1A,b).

图1:上皮特异性BRAFV600E突变与失去转化生长因子β受体信号一起驱动右侧肿瘤的发生,而不激活Wnt通路。
figure1

aKaplan-Meier生存曲线显示肠道无瘤生存(诱导后几天); BRAFV600E/+(B)n=11;3毫克他莫昔芬诱导),VillinCre; 碱5Fl/fl (a;n=3;3毫克他莫昔芬诱导)和VillinCre; BRAFV600E/+; 碱5Fl/fl(学士;n=18;2mg他莫昔芬诱导小鼠。一只小鼠在诱导后550天被检查(用Kaplan-Meier曲线上的勾痕表示)。(*)p=1.835e−7,B与BA比较;Mantel-Cox对数秩检验,双尾检验).bBA小鼠结肠代表H&E染色n=8)(瑞士卷)。右侧,左面板虚线区的高倍率,突出腺癌的近端(右侧)结肠位置。标尺,500μm。cBA小鼠肠道肿瘤部位评分(n=11只老鼠)。平均±S.E.M.(*)p=0.0194,*p=0.0003,*p=8.5E−6;Mann-WhitneyU-测试,双尾)。d图示BA小鼠肠道肿瘤分布,圆周大小与区域肿瘤数成正比(c)。蓝色,盲肠,近端结肠;红色,左结肠(降)至直肠;对角线,脾曲。e典型的肠系膜浸润图像,肿瘤上皮以点状轮廓(H&E;左侧)和粘液染色(AcianBlue/PAS;右侧)突出显示于BA小鼠的原发肿瘤切片(n=5)。标尺,500μm。f具有代表性的肿瘤切片,来自VillinCre; APCFl/+、B、BA小鼠(n=5只小鼠(每组5只),免疫组化β-catenin和Wnt-通路激活标记物染色。Lgr5, Axin 2,和鼻孔(ISH)。标尺,100μm。gWT VS中Wnt激活(WA)签名的方框图BRAF-来自患者的突变型CRCs,右侧和左侧CRCs,跨CMS亚型.中值显示的框从第25至75百分位数和晶须,它扩大了1.5×四分位数范围。左面板n=579,中间n=604和右n=467个独立样本(左、中面板:*)p < 0.001, T-试验,双尾;右面板:*p < 2e−16, T-试验,两尾)。

我们认为β受体失活是由于错配修复缺陷(由微卫星序列引起)在人类癌症中发生的。TGF-BR 2,从小鼠基因组中缺失)29-可能与突变体braf协同引发右侧结肠肿瘤。的确,VillinCre; BRAFLSL-V600E/+; 碱5Fl/fl(指定BA)小鼠与B小鼠相比,肿瘤迅速发展,中位生存期分别为192天和485天。1A)。最关键的是,BA小鼠的腺癌主要发生在近端结肠,相当于人的右结肠(图1)。1B-d)。进一步重组RCRC,BA肿瘤表现出扁平/无柄的形态,黏液的分化和明显的侵入肠系膜的能力(见图)。1B、e)。

为了确保ba小鼠肿瘤的优势右侧不受肠道长度的局部重组效率的影响,我们在Villincre中对tdato报告基因的表达进行了评分。; Rosa 26LSL-tdTomato/+小鼠服用不同剂量的他莫昔芬。事实上,当剂量为80毫克/千克时,虽然出现的肿瘤是右侧的,但与小肠相比,结肠和盲肠的重组效率最低,这凸显出该模型中肿瘤的优先右侧性是特定遗传背景的结果(补充图1)。1C).

TGF-β生长抑制信号是通过一个由TGF-BR 1/ALK 5和TGF-BR 2同源二聚体组成的异四聚体复合物传递的。鉴于TGF-BR 2比在TGF-BR 1在人类肿瘤中30,我们还生成了VillinCre; BRAFV600E/+; TGF-BR 2Fl/fl小鼠31。这些小鼠还发展主要是近端结肠腺癌,直接再现BA模型(补充图)。1D)。重要的是,BA和VillinCre之间的这种共同的表型; BRAFV600E/+; TGF-BR 2Fl/fl小鼠排除非典型受体特异性转化生长因子β信号在抑制右侧肿瘤发生中的作用。

接下来,我们试图确定BA肿瘤是否表现出Wnt通路的激活。不像APC-缺陷(VillinCre); APCFl/+)或B型肿瘤,BA瘤未见核β-catenin积聚(图1)。1F)。此外,我们还检测到某些wnt靶基因的表达减弱。Lgr5, Axin 2,和鼻孔)和我们先前报道的wnt-目标基因标记。32,证实这些右侧结肠肿瘤缺乏Wnt通路激活(图一)。1F,补充图。2)。使用VillinCre的rna-seq(rna-seq)数据; APCFl/fl肠组织,在诱导后第4天收获,我们接下来衍生出一个Wnt激活(WA)信号(补充图)。3A),过滤后只保留聚集在一起的上皮基因。AXIN 2(β-catenin依赖性wnt信号的一个重要的转录靶点)在大量的人类基因表达数据中33,34,35。重要的是,这一特征在病人肿瘤中被显著下调。BRAF-与BRAF野生型对应物,右侧和左侧位置,CRC共识分子亚型(CMS)1(为MSI和炎症/免疫基因的表达富集)和CMS 2(富集于与典型Wnt信号相关的基因;图1)。1g)36。这些结果表明,虽然BRAF的激活并不足以促进右半结肠肿瘤的形成,但上皮型β受体信号的同时丢失与人rCRCs的组织学特征和减弱的Wnt/β-catenin信号共同参与了近端结肠肿瘤的发生。

BA肿瘤从早期开始就表现出胎儿样的分化。

由于明显缺乏Lgr5+在BA肿瘤中,我们下一次确定这些肿瘤是否再现了Lgr5-独立的胎儿球形签名21与电离辐射或葡聚糖硫酸钠(DSS)处理后的再生反应相关20,23。Rna-seq和基因集富集分析(Gsea)显示,与Villincre相比,BA肿瘤与胎儿样信号有很强的关联。(WT)控制(图1.2A-C,补充表1)。值得注意的是,这些胎儿标记包括Ly6aAnxa 1,两个基因在dss诱导的再生过程中高表达。20。我们还发现BA肿瘤中与炎症反应相关的基因的富集(图一)。2A,右面板)37。考虑到许多胎儿标记物可能由基质细胞表达,特别是免疫浸润,我们证实了某些胎儿标记物在上皮细胞中的特异性表达。Ly6aAnxa 1)通过原位杂交(ISH)。二维空间)。有趣的是,细胞角蛋白7--一种通常不在成人肠道上皮中表达的角蛋白,而是胎儿基因程序的一个组成部分--在BA结肠肿瘤上皮中强烈表达(补充图1)。1E)。事实上,CK7在crc中被作为锯齿路径的独立标记而被提出。38.

图2:WNT-低的,右侧的肿瘤表现出胎儿样的信号,从早期开始存在.
figure2

aGSEA图显示胎儿球体的富集和特征性炎症反应信号在端点BA结肠肿瘤(n=4)VS WT近端结肠(n=3)。其他正常浓缩分数,FDR错误发现率。(p=0.0,代表p < 0.001 calculated empirically.) b热图显示Z评分转化的胎儿特征基因的相对表达水平在BA肠肿瘤端点间差异表达(n=4)和WT近端结肠组织(n=3)。cBA肠肿瘤与WT近端结肠中胎儿标记物的qRT-PCR检测(英文)n=每组4只)。平均±S.E.M.(*)p=0.0286,与WT比较;Mann-WhitneyU-测试,双尾)。d胎儿标记物染色的代表型肠肿瘤上皮ISHLy6aAnxa 1 (n=5只老鼠)。标尺,100μm。eGSEA图显示胎儿球体征(左面板)正富集,Lgr5+诱导后30天BA近端结肠组织与WT对照组织的ISC签名(右面板)n=每组5人)。其他正常浓缩分数,FDR错误发现率。(p=0.0,代表p < 0.001 calculated empirically.) f热图显示Z评分转化的胎儿特征基因在BA近端结肠组织中的相对表达水平(n=5),与WT(n=4),上岗后30天。g诱导后30d,A、B、BA标记物与WT近端结肠组织标记物的qRT-PCR检测(英文)n=每组4人)。平均±S.E.M.(*)p=0.0286,与WT比较;Mann-WhitneyU-测试,双尾)。h代表WT和BA结肠近端组织的ISH,胎儿标记物染色Ly6aAnxa 1,30天后上岗(n=每组5人)。标尺,100μm。

接下来我们将讨论胎儿样基因信号是否在肿瘤发生过程中出现,或者它是否早于肿瘤发生时出现。为此,我们在诱导后第30天(D30)从BA和WT小鼠的结肠近端组织中提取,并在此早期用rna-seq检测相同的胎儿标记物的表达。事实上,我们发现胎儿样基因的特征明显丰富,并且抑制了Lgr5+ISC签名22(无花果)2e-g,补充表1)在D30 BA组织中相对于WT近端结肠。我们再次证实了上皮细胞特异性表达Ly6aAnxa 1(图)2H).

在rCRCs和我们的BA模型中显示了低Wnt通路的激活(如图所示)。1FG,补充图。2接下来,我们从我们的端点肿瘤和d30 BA RNA-seq数据(补充图)中生成了一个类似的上皮特异性基因标记(命名为BA)。3B)。使用此ba签名查询crc患者数据集。34,35,我们发现与BRAFCRC患者肿瘤的突变、右侧和CMS 1亚型(图1)。3A-c)。我们还发现,我们的BA和WA信号及其相关CMS亚型在患者样本中呈显著的负相关,我们的BA信号与Mustata等人的胎儿球体特征呈正相关。21(无花果)三维空间,补充图。3C)。此外,我们观察到我们的BA特征与更高级的原发性肿瘤分期(T3-4)之间有显著的关联,这与我们的BA模型的局部侵袭行为一致(图1)。3E)。因此,我们的BA信号也与复发患者的生存期较短有关,并显示复发时腹膜疾病发生率增加的趋势(图1)。3F,补充图。三维空间),符合rCRCs患者转移扩散的模式。12,13.

图3:预后不良BRAF-突变型,右侧患者CRCs是Wnt-低,并表达BA标志从一开始.
figure3

a在WT VS中显示BA签名的表达式BRAF-来自病人的突变型CRCs(n=579)。中位数显示为方框,从第25百分位数延伸至第75百分位数,而晶须则延伸1.5×四分位数范围(*)p=3.58e−5;T检验,双尾)。b例图显示患者右侧和左侧CRCs BA信号的表达(n=604)。中位数显示为方框,从第25百分位数延伸至第75百分位数,而晶须则延伸1.5×四分位数范围(*)p=1.28e−9;T检验,双尾)。c框图显示跨CMS子类型的BA签名的表达式(n=461)。中间值显示为方框,从第25百分位数延伸至第75百分位数,而晶须则是间隔范围的1.5倍(*)p=2.16e−13;T检验,双尾)。d人肿瘤WA和BA特征值的散点图呈负相关(Pearson‘s)r=−0.232,p=8.36e−9,双面)(n=467)。CMS图被覆盖,突出了CMS 1和CMS 2子类型之间签名的差异表达。CMS 1(MSI-高,免疫):橙色;CMS 2(典型Wnt信号):蓝色;CMS 3(代谢失调):粉红色;CMS 4(间充质):绿色。中位显示的框,从第25至75百分位数和胡须,它延长了1.5倍的中间四分位数范围。eBA信号在T3-4人肿瘤中的表达高于T1-2(*)p=0.0002;t检验,双尾)(n=604)。中间显示的框,从第25至75百分位数和胡须,扩大了1.5×四分位数范围。f具有BA特征性高肿瘤(红色)的患者在复发后的存活时间比携带BA信号的患者-低肿瘤患者(蓝色)(*)要短。p=0.00016;Wald检验,双尾)(n=197)。g管状绒毛腺瘤(TVA)中WA信号的表达较高。n=29)高于无柄锯齿状腺瘤(SSA)(n=15)(*)p=1.538e−05;t检验,双尾)。中间显示的框,从第25至75百分位数和胡须,扩大了1.5×四分位数范围。hBA信号在无柄锯齿状腺瘤(SSA)中的表达高于管绒毛腺瘤(TVA)(*)。p=1.498E−05;T-测试,双尾)。中间显示的框,从第25至75百分位数和胡须,扩大了1.5×四分位数范围。iBA信号的较高值与WA信号在TVA/SSA人癌前病变中的低表达值显著相关(Pearson‘s)。r=−0.66,p=1.11e−06)。回归曲线为95%置信区间(阴影区)。

我们还观察到在无柄锯齿状腺瘤/病变(Ssa)中BA的特征与肾小管绒毛腺瘤(Tvas)相比显著增加,而管绒毛腺瘤(Tvas)是CRCs癌前病变与突变相关的。BRAF和Wnt-途径的成分,分别(图)。第三代、h)39。此外,我们发现这些癌前病变中的WA和BA信号之间存在显著的负相关关系,这意味着它们的基础生物学从一开始就存在着根本的差异(图1)。3I)39。这些数据支持了这样一种观点,即表达胎儿样BA信号的细胞存在于人类右侧肿瘤发生的早期阶段,这与我们在BA模型中的发现相似,在BA模型中,这种特征是在早期肿瘤发生过程中出现的。

BRAFV600E促进Yap依赖的胎儿样分化

转录辅激活子yap在损伤再生过程中对胎儿重编程的中心作用20,23接下来,我们检查了我们的端点肿瘤和d30 RNA-seq数据,以确定在我们的BA模型中YAP活性是否与胎儿样表型有关。利用由Gregorieff生成的yap目标基因签名等人.=‘class 1’>在终点肿瘤和d30个BA结肠组织中,我们发现与YAP的激活有很强的相关性(图).4A、b、补充表1)23。这个yap标记中的顶级基因特别包括胎儿标记,例如Ly6aAnxa 1,以及经典的YAP目标,例如CTGF23.

图4:BRAFV600E通过YAP激活促进胎儿样分化,支持近端结肠的细胞活力。
figure4

aGSEA图显示BA端点肿瘤中YAP的上调和下调基因信号的富集(n=4)VS WT近端结肠(n=3)。其他正常浓缩分数,FDR错误发现率。(p=0.0,代表p < 0.001 calculated empirically.) bGSEA在诱导后30天,BA近端结肠组织与WT对照组织中YAP上调和下调基因信号阳性富集(P<0.05)。n=每组5人)。其他正常浓缩分数,FDR错误发现率。(p=0.0,代表p < 0.001 calculated empirically.) c诱导后30d,qRT-PCR检测法基(vs-4718)处理的BA小鼠近端结肠组织中的胎儿标记物(qRT-PCR)。n=5只小鼠。平均±S.E.M.(NS不显著;**p=0.0079;Mann-WhitneyU-测试,双尾)。dQRT-PCRLgr5用4-羟基他莫昔芬体外诱导,并于诱导后5天取样,检测出BA细胞器中的胎儿标记物。n=3株未诱导BA小鼠的细胞器系)。折叠变化显示相对于未诱导的器官(Etoh处理)。平均±S.E.M.(*)p=0.05;Mann-WhitneyU-测试,双尾)。eQRT-PCRLy6a在BA类有机物中,用4-羟基他莫昔芬体外诱导,用药后48h取样,诱导后5天。药物在DMSO载体(0.1%)中重组,最终浓度为:维泊芬(YAPI;3μM)、AZD 6244(MEKI;100 NM)、ERKI(100 NM)、eCF 506(SRCI;50 NM)和VS-4718(Faki;1μM)。n=3株未诱导BA小鼠的细胞器系。折叠变化显示相对于DMSO处理,诱导的器官.平均±S.E.M.(*)p=0.05;Mann-WhitneyU-测试,双尾)。f具有代表性的结肠及盲肠近端H&E染色BRAFV600E/+ 碱5Fl/fl 雅普Fl/fl诱导后6天,小鼠出现严重的上皮丢失和坏死,与BA对照组比较,差异有显着性(n=每组5只)。标尺,500μm。g免疫荧光法检测培养的BA和VillinCre;APCFl/+肿瘤球体为SCA 1/LY6A(绿色)和YAP 1(红色)。细胞核用DAPI(蓝色)染色。合并的图像显示在右侧。有代表性的n=3个生物复制体。标尺,100μm。hBrdU百分比的图像分析评分+WT近端结肠上皮细胞n=6)、A(n4)、B(n=6)和BA(n6)小鼠,诱导后30天。平均±S.E.M.(NS不显着;Mann-Whitney)U-测试,双尾)。iCaspase 3裂解率的图像分析评分+WT近端结肠上皮细胞n=6)、A(n=4)、B(n=6),及广管局(n6)小鼠,诱导后30天。平均±S.E.M.(**)p=0.0076,Mann-WhitneyU-测试,双尾)。

接下来,我们使用特征良好和有效的药理学药物来询问在我们的BA模型中诱导YAP激活的信号通路。以往的研究表明,在dss诱导的结肠炎和再生过程中,由细胞外基质重塑而触发的yap的激活依赖于fak信号。20。然而,我们不能用fk抑制剂vs4718在体内抑制胎儿程序。40,41(Faki),暗示在我们的BA模型中,机械转导不参与YAP的激活(图)。4C).

对B和BA小鼠肠道FITC-葡聚糖摄取的评估显示了明显的肠屏障缺陷(补充图)。4B),与盲肠和近端结肠中明显的固有中性粒细胞浸润有关(补充图。4C)。这种局部炎症与肿瘤灶的形成共同定位,提示在我们的BA模型中微环境信号可能在触发胎儿样表型中起作用。因此,我们从未诱导的BA和B小鼠中产生了有机物,并在体外诱导了基因重组。重要的是,在这些无菌培养条件下,在没有基质影响的情况下,突变体的诱导。BRAF单独一次就足以激活胎儿样程序,同时也会丢失Lgr5以及胎儿标记物的扩增(图1.4D,补充图。5A)。在细胞器环境中,FAK的选择性抑制剂不影响胎儿标记物的表达(Vs4718)。40,41或SRC(ECF 506)42,但MEK抑制剂(AZD 6244)对其有明显的抑制作用。43,44、ERK45,和YAP(脊椎动物鳍)20(无花果)4E),MEK和ERK抑制剂抑制典型MAPK靶点的有效性。杜斯普6(补充图。5B)。尤其是MEK抑制剂AZD 6244对BA小鼠的治疗作用43,44(Meki)明显抑制胎儿标记物的表达,证实MAPK通路在体内胎儿样表型形成中的作用(补充图)。4A)。这些结果表明MAPK激活的突变与YAP信号直接结合,从而以上皮细胞内禀ERK依赖的方式诱导胎儿重新编程。在这方面,通过yap体外抑制来抑制胎儿样表型,增加了胚胎样分化程序可能是一种直接启动的适应性存活机制。BRAF-突变上皮。为了用遗传学的方法测试yap在体内的作用,我们生成了维林CreBRAFV600E/+碱5Fl/flYAPFl/fl老鼠。在他莫昔芬诱导后,这些小鼠迅速减轻体重和腹部驼背,并必须在诱导后第6天取样,因为这些临床症状。组织学评价维林CreBRAFV600E/+碱5Fl/flYAPFl/fl肠组织证实了YAP对肠上皮细胞存活的必要性,因为在没有YAP的情况下,我们在近端结肠中检测到明显的上皮坏死,尽管它在肠道其他部分也很明显(见图)。4F)。与以往文献一致,他莫昔芬诱导维林CreYAPFl/fl小鼠无明显表型46,证实YAP对正常肠道内稳态是可有可无的。

我们还注意到BRAF他莫昔芬体外诱导突变体(B和BA)在Matrigel中生长,只有在PGE 2存在的情况下才能成功传代。PGE 2是一种强有力的炎症介质,曾被证明是支持胎儿肠球体传代的培养基的关键成分。47。在长期培养中,终点肿瘤BA球体也表现出这种PGE 2-依赖性,并保持着相同的胎儿样表型,LY6A的表达和YAP 1的核定位证明了这一点(见图)。4G)。考虑到我们的右侧结肠肿瘤发生的BA模型中的叶区域炎症,鉴于最近描述的创伤后创面愈合过程中对PGE 2的芽周间质产生的需求,外源性pge 2对长时间器官传代的需求可能具有重要的意义。48。这提示YAP和COX 2(合成PGE 2的酶)的联合抑制可能对治疗突变型braf驱动的rCRCs有一定的疗效。

重要的是,突变体braf单独驱动胎儿样分化的能力表明,braf信号本身并不抑制胎儿的表型,而是独立地抑制肿瘤的发生。D30近端结肠组织BrdU阳性评分清楚地表明,消融上皮β受体信号对上皮细胞增殖无影响(图1)。4H)。突变体braf在体内诱导的凋亡水平升高,但在上皮特异性失活转化生长因子β受体信号后被抑制,表明对细胞死亡的敏感性降低(图一)。4I)如先前所报告的那样,在β受体信号丧失之后。49。综上所述,这些发现表明,失去转化生长因子β-受体信号使结肠上皮细胞逃避凋亡,而不是增强其增殖能力。

右侧肿瘤的发生是由微生物引起的炎症所支持的。

我们的结果表明,突变braf可以通过激活yap启动类细胞器中的胎儿样表型,而不需要额外的遗传事件或上下文线索的输入。尽管如此,BA肿瘤的近端结肠位置--一个由肠道菌群大量定植的区域--以及在肿瘤发生早期明显存在的局部炎症,增加了局部微环境因素可能影响肿瘤发生的可能性。事实上,我们的数据显示,黏膜屏障的完整性在BA组织中受到损害,很可能使上皮暴露在肠道微生物群和有毒代谢物中,从而通过引发炎症来促进肿瘤的发生。24,50。为了验证这一点,我们从他莫昔芬诱导时起用广谱抗生素治疗BA小鼠(补充图)。6A)。抗生素能显著延长BA小鼠的存活率并减少肿瘤数量,但这种作用仅对右侧肿瘤有显着意义(图一)。5A,b,附图。6B)。对抗生素和载体处理的d30 BA小鼠rna-seq分析的比较证实,前15条路径中有11条被抗生素治疗显著下调,与炎症和免疫应答有关(补充图)。6C)。虽然仍然存在,但胎儿样表型受到抑制,胎儿标记物的表达减少,包括Ly6a, Ly6d, Krt 7,和Anxa 1,特别是在整个组织和上皮室(如图所示)。5C,补充图。6d)。这些发现支持了这样一种假设,即尽管BRAF突变本身驱动胎儿样分化,微生物驱动的炎症是BA模型中早期肿瘤形成的另一个关键因素,而局部微生物环境支持肿瘤的形成、向右和疾病的进展。因此,我们的研究建立了上皮间的协同关系。BRAFV600E突变,失去转化生长因子β受体信号,和局部炎症微环境驱动右侧,胎儿样肿瘤。

图5:炎症和上皮性转化生长因子β受体丧失在胎儿样肿瘤形成中起协同作用.
figure5

aKaplan-Meier生存曲线强调无瘤生存(在他莫昔芬诱导后的几天)n=28)及经抗生素处理的(n=28)BA小鼠(*)p=0.0006;曼特尔-考克斯对数秩检验,双尾检验)。b经车辆治疗的肠道肿瘤总数(n=28)及经抗生素处理的(n=28)BA小鼠。平均±S.E.M.(*)p=2.9E−7;Mann-WhitneyU-测试,双尾)。c诱导后30天定量逆转录聚合酶链反应(QRT-PCR)对BA小鼠结肠近端组织标记物的定量检测(英文)n=4只小鼠。折叠变化显示相对于车辆处理的BA小鼠平均±S.E.M。(*)p=0.0286;Mann-WhitneyU-测试,双尾)。dKaplan-Meier生存曲线显示舒林达克治疗A的存活时间(诱导后数天)n=5)和B(n=3)小鼠。e舒林酸治疗小鼠肠道肿瘤定位评分(英文)n=5)。平均±S.E.M.(NS不显著;*p=0.0397,**p=0.0079;Mann-WhitneyU-测试,双尾)。f磺胺酸治疗近端结肠肿瘤的代表ISH,胎儿标记物染色Ly6aAnxa 1 (n=5只老鼠)。标尺,100μm。gGSEA的rna-seq数据从磺胺酸治疗的A和WT近端结肠组织,30天后诱导,使用胎儿球体(左面板)和Lgr5+Ic(右面板)基因签名(n=每组4只)。其他正常浓缩分数,FDR错误发现率。(左面板-p=0.0,代表p < 0.001, Right panel—p=0.008,按经验计算。)h磺胺酸处理A小鼠结肠近端组织中胎儿标记物的qRT-PCR与WT小鼠比较,诱导后30d。n=每组4只)。折叠变化显示相对于未治疗的WT小鼠。平均±S.E.M.(*)p=0.0286;Mann-WhitneyU-测试,双尾)。

炎症以一种与MAPK无关的方式驱动结肠肿瘤的发生。

接下来,我们试图建立损伤和炎症的模型,以确定它们是否足以启动和驱动B或A小鼠的肿瘤发生。大剂量舒林达治疗已被证实会导致近端结肠上皮损伤。51。因此,为了提供一个简短的炎症/损伤窗口,我们在诱导后立即给予舒林达14天(补充图)。7A)。这种急性侮辱足以导致A,而不是B小鼠近端结肠肿瘤的形成(如图所示)。5D)。磺胺酸治疗的小鼠肿瘤几乎完全是右侧的(图一)。5E),与受伤地点一致51。与BA模型相似,磺胺酸治疗的A型肿瘤具有侵袭性,有黏液性组织学表现,并对上皮室胎儿的转录本呈强阳性染色(图一)。5F,补充图。7b)。此外,在诱导后第30天(停止治疗后16天),从磺胺酸处理的A小鼠的近端结肠组织中,胎儿样信号有显著的阳性富集,而Lgr5+如在BA小鼠中观察到的那样。5GH,补充表1).

考虑到BRAF的能力V600E-驱动MAPK激活在体外直接启动一个类似胎儿的程序,我们接下来将讨论MAPK激活是否是通过舒林酸驱动的炎症在体内出现的胎儿样分化的原因。利用MEK抑制剂AZD 6244,我们证明在WT小鼠中,胚胎样程序的激活可能不依赖于MAPK的激活(补充图)。7C).

舒林酸诱导的炎症驱动小鼠右侧肿瘤发生的能力反映了BA小鼠急诊肿瘤的形貌。因此,我们接下来讨论是否可以通过引导炎症到不同的部位来影响肿瘤形成的位置。Dss以前曾被证明能推动转化生长因子β受体基因敲除小鼠的肿瘤发生。52。利用该模型,我们证实DSS诱导的炎症诱导A小鼠肿瘤形成.不出所料,突发性结肠肿瘤具有侵袭性,呈粘液组织学特征,缺乏Wnt通路的激活,并在其上皮中表达胎儿的转录本。重要的是,这些肿瘤位于结肠的远端,就像DSS治疗一样(补充图)。7D-f)。这些发现表明,在炎症刺激驱动胎儿样上皮分化的情况下,转化生长因子β受体信号的丧失是允许炎症部位出现侵袭性结肠肿瘤的原因之一。

讨论

进一步了解突变型braf驱动的rCRCs的分子机制,将有助于制定有效的预防和治疗策略。临床前模型,忠实地再现疾病发生和发展的显著特征,由不同的致癌因素赋予,是这项工作中的一个重要工具。在此,我们描述了一种锯齿状肠癌小鼠模型,其中致癌性braf和上皮转化生长因子β受体的丢失共同促进了右半结肠肿瘤的形成,具有Wnt低的胎儿样信号。该模型中的紧急肿瘤重新描述了人类右侧疾病的地形、分子景观和转移取向,为通过锯齿状肿瘤途径产生的突变brf驱动的rcrc的发病机制提供了重要的见解。

虽然突变体brf驱动的锯齿状肿瘤在人类结肠的右侧表现出明显的偏好,但大多数现有的小鼠模型主要在小肠而不是结肠发生损伤。16,17,18。有趣的是,拉德等人。发现BRAFV600E在整个肠道引起广泛的锯齿状增生。然而,在此模型中,绝大多数进展为不典型增生的增生性息肉位于小肠,病变表现出tsa的特征,而不是ssa,作者将其归因于ssa通常出现在结肠中这一事实。16。相反,BA肿瘤发生在近端/右半结肠,并带有wnt低的胎儿样信号,与此相关。BRAF-突变状态、右侧、高MSI、CMS1CRCs以及人类肿瘤前SSA.

与这里提出的BA模型形成进一步的对比,以前的锯齿状肿瘤发生模型表现出放松管制的Wnt信号。16,17,18。然而,值得注意的是,患者派生的右侧锯齿状前兆病变很少有突变。APCCTNNB 1,虽然较少为人所知的wnt通路的突变可以在发育不良/更高级的阶段中获得。53,54,55。但重要的是,BRAFV600E患者的右侧结肠肿瘤表现为膜性而非核性β-catenin定位。19因此,我们建议我们的BA模型更好地概括这个肿瘤组。

以前的研究使用可诱导的人类BRAFV600K转基因导致上皮锯齿和衰竭/耗竭Lgr5+ISCS,其基础是将其转化为中转放大(TA)祖细胞。18。相比之下,Lgr5+BA模型中的ISCS伴随着具有胎儿样表型的细胞的出现。这些模型之间有几个不同之处,这可能是造成这种差异的原因之一。首先,ba模型在近端结肠发生ssa样肿瘤,而转基因BRAFV600K模型在小肠内发展为增生和TSA样的异型息肉。除了在基础增殖率和隐窝动态方面的区域特异性差异外,决定细胞谱系分配的信号和小生境细胞类型,即成人和胎儿样干细胞群体与TA祖细胞状态/命运之间的相互转换,沿肠道和垂直的隐窝轴方向都有很大的纵向变化。56。因此,BRAFV600E突变的小肠和结肠器官在基础MAPK-通路活性上有很大差异,小肠类细胞器能够耐受较高的BRAF通路活性。V600E表达57。值得注意的是,BRAF的转录图谱V600E结肠器官更接近人类BRAFV600E-突变型CRCs57。其次,ba模型表达了敲门brf的生理水平。V600E内源驱动突变体BRAF启动子,而转基因模型依赖于人类的过度表达。BRAFV600K转基因,它获得MAPK的目标基因的表达,类似于更先进的发育不良肿瘤的水平。在增生性肠组织中还发现ISC标记物减少。BRAFV637E敲入小鼠,其mapk活性与转基因小鼠相当,尽管TA细胞的命运未被明确证明。16,18.

整体的转换Lgr5+在转基因技术中,ISC汇集到TA祖细胞中。BRAFV600K模型18,使人联想到正常的隐窝稳态。在这种情况下,地下室基础上EGFR/MAPK活性的降低阻止了静止的ISC池过早分化,而上隐窝中MAPK信号的升高决定了增殖的TA祖细胞的命运。58。虽然不同命运的决定因素BRAF-这两种模型中的突变细胞仍不清楚,其含义是深远的:Lgr5+在缺乏转化生长因子β信号的情况下,ISCS变为胎儿状状态,刺激侵袭性BA肿瘤的生长,转化为TA样状态导致肿瘤干细胞池衰竭和克隆性灭绝。这可能解释了这样的发现:在转基因模型中,发育不良灶的进展常常伴随着wnt/β-catenin途径突变的获得,从而恢复了ISC标记的表达。18。事实上,这与研究表明BRAFV600E促进ISCs的丢失,但自相矛盾的是,会触发分化;在这里,致癌进展取决于逆转分化的突变(例如消融促进分化的转录因子CDX 2或Smad 4),以恢复干细胞的潜能。59。因此,老化引起的表观遗传改变的获得与brf有关。V600E-驱动转变60,与几项涉及合作灭活的研究CDKN2A/p16INK4a16, Cdx 259,61,或非典型pkcs(pkcζ和pkcλ/ι)62在BRAFV600E-诱发肿瘤发生。同样,我们的研究发现上皮转化生长因子β-受体信号是brf的重要守护者。V600E-驱动右侧肿瘤发生。事实上,我们还发现,胚胎样细胞在右半结肠的成瘤潜能被上皮转化生长因子β受体信号所抑制,而不依赖于驱动胎儿样分化程序的因素,无论是急性炎症性侮辱还是异常的MAPK激活。事实上,这强烈地表明TGF-BR 2BRAF患者rCRCs突变30为胎儿样右侧上皮细胞提供选择性优势。

我们的研究进一步表明,通过erk的MAPK通路从根本上能够以一种Yap依赖的方式驱动结肠上皮中的胎儿样分化程序,并且在体内通过微生物驱动的炎症而进一步增强。围绕YAP在肠道肿瘤发生中的作用存在争议,两者都具有抑制肿瘤的作用。63,64和致癌作用23,65,66,67在不同的背景下。几项研究表明,YAP能抑制肠再生和肿瘤发生过程中的Wnt信号。23,63,64,68,符合对.的压制Lgr5以及我们BA模型中的ISC签名。为了有力地支持我们的发现,在对这篇论文进行审查时,雷什曼等人。报道了BRAF的表达V600E在结肠器官中,可诱发胎儿样的去分化程序,并与河马途径类似人brf的目标的转录特征相关。V600E-驱动的儿童权利委员会57。有趣的是,ERK和yap通路的激活也在炎症驱动的由非典型pkc缺乏症引起的锯齿状肠肿瘤发生模型中检测到,其独立于BRAF(和克拉斯)突变62表明YAP调控异常可能是独特的锯齿状肿瘤路径的基础,而不依赖于驱动基因的突变。

作为倍数Lgr5+Lgr5群体在肠道内表现出表型可塑性和肿瘤的起源潜力,在BA模型和锯齿状肿瘤途径中,可能的起源细胞仍有疑问。最近的一项研究发现了一种罕见的、静止的再生干细胞群体,其区别在于聚集素的高表达。CLU)以及Anxa 1, 克萨德尔,和Basp1,在肠上皮损伤后被动员和扩张,再生所有主要的肠道细胞类型,包括Lgr5+ISCS,以依赖YAP 1的方式69。目前尚不清楚不同的隐窝祖细胞和/或成熟细胞类型是否能够在brf激活后去分化为胎儿状的状态,或者是否处于稳态的结肠隐窝亚群,例如再生干细胞,能够获得类似胎儿的状态。BRAF突变和启动锯齿状肿瘤发生独立于Wnt信号:答案是等待谱系追踪和单细胞基因组方法在我们的BA模型。

我们的数据使我们能够识别和强调患者左、右侧crc的多样性,表明它们在整个肿瘤的形成和发展过程中都是由不同的信号通路支撑的,这些信号通路会导致wnt高,lgr5。+肿瘤表型或brf突变体,胎儿样,lgr5-/Wnt-低表型。然而,含有致癌性BRAF的rCRCs继续构成一项重大的治疗挑战,患者从普遍的治疗方案中获益甚少或毫无益处。而BRAF抑制剂对黑色素瘤有很大的疗效。70,brf-突变的rcrc由于eGFR驱动的mapk通路的反馈激活而无法接受这种治疗。71,72。值得注意的是,由yap驱动的肠上皮再生反应通过激活EGF信号来促进细胞存活。23。因此,Yap的高表达可以预测人braf-和mek-抑制剂对brf-和mek-抑制剂的内源性和获得性耐药性。V600ECRCs73,提供临床相关性,我们的发现,YAP是一个生存因素在BA肿瘤,并主张同时抑制YAP和BRAF-MAPK信号在这种情况下。此外,最近对复合突变类有机物的研究Rspo3-合并和克拉斯/BRAF, Trp53,和Smad 4突变,暗示YAP/TAZ胎儿重新编程和血统逆转在获得耐Wnt靶向治疗。显著的是,新出现的有机物对Yap/TAZ信号上瘾,对Yap/TAZ抑制敏感。74。令人鼓舞的是,胎儿样结肠BA肿瘤上皮细胞对靶向性微环境炎症因子(如PGE 2)也有依赖性。此外,肠上皮对YAP活化的绝对要求BRAF突变为BRAF活化下游提供了一个新的潜在治疗靶点。

我们的BA模型概括了人类的地形、分子景观和转移取向,BRAF-突变型rCRCs,并为这种侵袭性治疗耐药亚型提供潜在的可操作的治疗靶点。


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