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一种构象液杀瘤肽复合物治疗膀胱癌的临床研究

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发表时间:2021-06-10 10:32作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

部分展开的α-乳清蛋白形成油酸复合物哈姆雷特,具有很强的杀瘤活性.在这里,我们定义了一种基于肽的靶向和杀伤肿瘤细胞的分子方法,并证明了其临床潜力(ClinicalTrials.govNCT 03560479)。从α-乳清蛋白中提取的39-残基α-螺旋肽可通过形成油酸复合物(α1-油酸)来提高肿瘤细胞的杀伤力。核磁共振测量和计算模拟显示,脂质核心周围有构象流体,α-螺旋肽基序。在一个单一的中心,安慰剂对照,双盲期I/II期非肌肉浸润性膀胱癌的介入临床试验,所有的主要终点的安全性和有效性的α1-油酸,作为中期分析评估。膀胱内注射α1-油酸酯可引起肿瘤细胞大量脱落,肿瘤体积缩小,但未发现药物相关的副作用(主要终点)。SHIP细胞含有α1-油酸,经治疗的肿瘤显示有凋亡的迹象,肿瘤相关基因的表达被抑制(次级终点)。这些结果对于膀胱癌来说尤其令人鼓舞,因为那里的治疗失败和高复发率造成了巨大的、未得到满足的医疗需求。

导言

有针对性的癌症治疗取得了重大进展,但缺乏肿瘤特异性仍然是一个令人关注的重大问题。1,2。目前很少有治疗方法在不损害健康组织的情况下杀死癌细胞,严重的副作用已被认为是为生存或治疗付出的必要代价。成功地结合有效和增加肿瘤选择性的概念被认为是正确的怀疑。然而,一项偶然的发现提供了对由未折叠的多肽链引起的肿瘤特异性细胞死亡机制的深入了解,这些多肽链通过形成脂肪酸复合物来获得杀瘤活性。3,4。肿瘤模型和临床研究中的广泛观察进一步将蛋白质-脂质复合物定义为一类具有显著治疗潜力的有趣分子。5.

这些发现具有挑战性,因为蛋白质的展开和结构定义的丧失与毒性的增加有关,这是由于非晶态聚集体和淀粉样纤维的形成。6,7。通过表位特异性的相互作用和对有限数量的细胞靶点的适宜性,天然蛋白质结构常常被认为是生物功能的先决条件。然而,在某些情况下,缺乏结构定义可能会导致功能的增加,部分原因是揭示了不同的构象,暴露了在自然状态下不可用的肽基元。8,9。在抗菌肽中,膜扰动α螺旋的这种效应已经被预测,在这种情况下,不稳定脂质双层的能力被认为存在于三维构象中,而不是氨基酸序列上。10.

α-乳清蛋白对哺乳类动物的生存至关重要.在天然状态下,该蛋白在乳糖合成酶复合物中充当底物指定物。11确定了牛奶的营养成分和流动性。相反,部分展开的α-乳清蛋白形成了一种油酸复合物,名为哈姆雷特,具有很强的杀肿瘤活性。3,4,8,9。哈姆雷特复合物以快速的动力学作用杀死多种肿瘤细胞,并在结肠癌、胶质母细胞瘤和膀胱癌的动物模型中显示出治疗效果。12,13,14,15。早期,研究者驱动的临床研究表明,哈姆雷特在膀胱肿瘤患者中具有局部的抗皮肤乳头状瘤作用,并能诱导肿瘤细胞脱落到尿液中。5,16.

本研究提出了一种从α-乳清蛋白中提取的合成的肽基药物候选物,它能复制哈姆雷特的杀瘤特性,并能将这些发现完全转化为临床。通过核磁共振分析和计算模拟,定义了这种“函数增益”的分子基础,包括决定脂肪酸结合效率和杀瘤活性的三维结构单元。在一项完全控制的临床试验中,证实了该复合物在非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC)患者中的治疗效果。

结果

肽特异性杀瘤活性

为了了解特异性肽基序与肿瘤细胞死亡的关系,我们合成了人α-乳清蛋白N端α-螺旋结构域(残基1-39,α1)或β-片状结构域(40-80,β)。1A)。α1肽与油酸酯(α1-油酸酯,1:5)和圆二色光谱(CD)形成配合物,发现这些配合物中α-螺旋结构含量增加。1B)。β-油酸酯复合物的结构保持不变(图1)。1B)。α1-油酸在人肺癌、肾癌细胞和小鼠膀胱癌细胞中引起快速、剂量依赖性的死亡反应(图1)。1C,d)。β-油酸复合物缺乏杀瘤活性,裸露的α-螺旋肽(35μM)或油酸盐(175μM)作用下的肿瘤细胞均无抑瘤作用(图1)。1C,d和补充图。1)。细胞活力的丧失是不可逆转的,如10天后用菌落分析所显示的那样(见图)。1E和补充图。1)。膜泡发生在肿瘤细胞内,暴露于α1-油酸,但裸露的肽-和油酸的对照是不活跃的(图一)。1F和补充图。1)。快速K+记录通量,进一步确定膜的反应(图)。1g)。Na预处理细胞+和K+通量抑制剂将细胞死亡降低40%-50%,将膜反应与肿瘤细胞死亡联系起来(图1)。)。肿瘤细胞快速内化α1-油酸复合物,TUNEL染色显示α1-油酸可诱导肿瘤细胞双链DNA断裂,提示细胞凋亡。1I,j).

图1:两种非同源α-螺旋肽-油酸复合物的杀瘤活性。
figure1

aα-乳清蛋白(PDBID:1B9O)晶体结构的带状表征,表示α1(蓝色)、β(绿色)和α2(灰色)结构域。没有显示钙离子。b合成α1肽、β肽及其各自的油酸肽配合物的远紫外圆二色谱。c, d人肺(A 549)、肾脏(A 498)和小鼠膀胱癌细胞(MB 49)的死亡反应被量化为ATP水平的降低(c, PA 549=3.26E−5,A 498为0.013,MB 49为0.005,与β-油酸盐相比,α_1-油酸)或PrestoBlue荧光(d, PA 549=0.007,A 498为0.003,MB 49为0.002,α1-油酸酯为β-油酸)。细胞经α1-油酸复合物(蓝色)或β-油酸盐复合物(绿色)处理(3h,35μM,与PBS对照组相比,细胞死亡)。对照暴露于裸肽或油酸单,见补充图。1D. e菌落分析显示α1-油酸的剂量依赖性长期效应。通过两个独立的实验,给出了一幅具有代表性的图像。标尺=5毫米。fα1-油酸可引起A 549肺癌细胞(35μM,10 min)快速膜泡。标度棒=10μm。三个独立实验显示了一幅有代表性的图像。g K+α_1-油酸盐对A 549肺癌细胞外排的影响及其抑制作用2. h离子通量抑制剂阿米洛利和巴克尔对细胞死亡的抑制作用2(100μM),用预蓝荧光法测定P=0.031(21μM+BaCl)2,0.005为21μM+阿米洛利,0.028为35μM+BaCl。2,35μM+阿米洛利组与NO抑制剂组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。iα1油酸盐处理A 549肺癌细胞TUNEL染色检测DNA链断裂(英文)n=每组50个细胞)。标尺=20μm。jAlexaFluor 568标记的α1-油酸酯(Red)被A 549肺癌细胞内化。细胞核被DAPI(蓝色)反染(n每组52个细胞)。标度棒=10μm.三个独立实验的平均±扫描电镜数据,*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, analyzed by two-tailed unpaired t-测试(c, d, h, j)和使用Dunnett校正的双向方差分析(i).

在具有膜整合特性的蛋白质筛选中,发现SAR 1与油酸形成杀瘤复合物,α-油酸的复制作用(补充图1)。12)。SAR 1是COPII复合物的一种膜整合蛋白,通过插入其N端两亲性α-螺旋来诱导膜管的形成。17,18,19。N-末端α-螺旋肽(残基1-23,sar1alpha)形成油酸复合物,有效地杀死肿瘤细胞(补充图1)。12)。裸露肽和油酸盐对照组不活跃(补充图)。1)。沙雷酸盐在肿瘤细胞中触发膜泡,快速K+记录到通量,Na可部分抑制肿瘤细胞的死亡。+和K+助熔剂抑制剂,表明这两种配合物的作用方式相似,尽管具有低序列同源性(补充图)。2)。然而,Sar1-β-油酸复合物和裸肽对照物并没有引起肿瘤细胞死亡(补充图5)。12).

为准备临床试验,在携带MB 49诱导的膀胱肿瘤的C57BL/6J小鼠上研究了α1-油酸酯的安全性。13。实验结果表明,与假手术组比较,治疗组小鼠的治疗效果100%,且无毒副作用,为临床试验计划提供了必要的背景资料。13.

油酸肽配合物的生物分子NMR分析

1α-油酸和α-α-油酸盐配合物的HNMR谱检测到裸露肽的尖峰信号向宽信号转变,油酸盐配合物的化学位移分散性差(图1)。2A,b),表示从随机线圈快速交换时间到中间毫秒时间尺度的构象变化。酰胺、侧链甲基和芳香区域的加宽表明,脂肪酸和多肽之间的相互作用贯穿于分子中。二维核超豪泽效应光谱(2DNOESY)确定了非共价的,相对较短的通过空间相互作用的各个肽和脂肪酸。在油酸的烯烃质子(5.23ppm)与α1的Hα和芳香质子之间以及与油酸油酸烯烃质子之间存在着重要的核过度效应(NOES)(图1)。2C,d)。在7.6到8.8ppm之间观测到的酰胺质子的近场化学位移表明,α1和α1-油酸中存在二级结构。从一维中获得的分辨率良好的信号1HNMR谱提供了每1肽3.7个油酸分子的化学计量比。化学位移图谱显示了一簇脂肪侧链的残基,这些残基改变了油酸的结合,提供了肽与脂肪酸相互作用的进一步证据(图一)。2E,f).

图2:裸露的α1-和sar1α肽及其油酸配合物的生物分子NMR分析。
figure2

a,b一维1核磁共振谱裸字母1-(a、黑色)和sar1alpha-(b,黑色的)肽是由一系列的结构组成的,这些结构可以快速地相互转换,因此被看作是尖峰。α_1-油酸(a、红色)和沙雷-α-油酸盐配合物(b(红色)显示出更宽的山峰。箭头表示吲哚1H信号来源于sar1alpha肽中的三条Trp侧链。c, d二维1α-油酸和α-α-油酸盐配合物的HNOESY光谱,表明脂肪酸与相应肽的原子水平接近。该光谱突出了油酸的9,10-烯烃质子(5.23ppm)与α-油酸配合物的H-α质子和芳香质子之间的NO。c)和α-油酸盐配合物(d). e, f二维1H-13C异核单量子相干(HSQC)光谱覆盖α1肽(红色)和α1油酸复合物(黑色)。在芳香侧链区和咪唑环质子中检测到化学位移扰动。e,绿色圈区域),以及在脂肪侧链区(f). g大小排除HPLC(SE-HPLC)的α1肽和α1油酸复合物,映射到一个标准的校准曲线。hα1肽、α1油酸复合物、人血清白蛋白(HSA)和油酸悬浮液的扩散顺序核磁共振波谱(DISY)。

采用尺寸排阻高效液相色谱(SE-hplc)和扩散有序核磁共振谱(DISY)对水动力体积进行了测量,结果表明α1-油酸配合物RH大得多(分别为27.4和29.3),比裸露肽(SE-HPLC中的16.1个,多迪的14.4个)大得多(如图所示)。2G,h和附图。34)。明显较大的R2与α1肽和人血清白蛋白(Hsa)相比,配合物的横向弛豫速率(横向松弛率)表明交换过程要慢毫秒到微秒(补充表)。1和附图。56)。重要的是,R2该配合物在水溶液中与油酸盐有明显的差异,表明配合物的动力学与不含肽类成分的油酸/油酸形成的胶束/囊泡状颗粒有明显的差异。

肽和肽-油酸体系的计算分析

计算模拟还指出了结构的异质性,表明赤裸肽和肽-油酸配合物属于宽的构象空间,盆地较深(见图)。3A,b)。代表结构映射到不同的自由能表面极小,显示突出的α-螺旋二级结构元素和一个疏水油酸核心的肽-油酸配合物(图一。3C,e)。肽-油酸折叠在这个核心不同于裸露的肽,显示多个局部极小(图1)。3D,f,和补充表23)。裸α1的特征是各种部分折叠的螺旋旋转构象,而裸露的sar1α组合则表现出随机线圈、α螺旋结构和β片结构的混合。

图3:肽类和肽-油酸体系的自由能面分析。
figure3

a, bα1(黑点)和α1-油酸(红点)系统二面体主成分分析(PCA)图的叠加a)和sar1alpha(青色点)和sar1alpha-油酸盐(洋红点)体系(b)。主分量(PC)1和PC2表示两个最大方差的轴向,通过数学变换进行降维。cf作为α1-油酸的前两个主成分的函数,自由能表面(c),赤裸字母1(d),α-油酸盐(e),赤裸的sar1alpha(f)。肽或肽-油酸复合物的代表性结构,以及它们各自的局部极小注释,从N端(蓝色)到C端(橙色/棕色)被着色。α-1-油酸杂岩的自由能面包含2个极小盆地,A1和B1,A1代表主要构象系综。Ssar1alpha-油酸络合物的自由能面包含3个极小盆地,A3、B3和C3(A3盆地包含主要的结构系综),其特征是一个突出的α-螺旋次级结构单元,模拟计算的α-螺旋倾向表明。相反,裸露的sar1alpha的自由能表面表现出很大的结构异质性。在这里,极小盆地A4和D4用螺旋结构表示,B4用β结构表示,C4和E4用随机线圈结构表示。

接触概率分析表明,α1或sar1α与油酸盐的相互作用主要是疏水作用,与烯烃质子的接触概率大于0.9(补充表)。45)。肽-油酸配合物显示出相对较宽和较深的自由能极小盆地,这意味着大量的证实是同样有可能访问的(图一)。3C,e)。当与R2弛豫速率,在短时间内对各种构象进行多次取样的可能性提供了一种论点,即这些α-螺旋配合物可能与癌细胞表面存在的多个可能的结合伙伴相互作用,而不是针对特定的伙伴。20.

基于这些广泛的研究和实验方面与模拟预测的紧密一致,可以清楚地发现明显无关的肽α1和sar1α可以形成具有共同结构特征的复合物,包括一个灵活的肽单元和一个脂肪酸簇。这一概念与某些抗菌药物两亲性α螺旋之间的序列功能不一致相一致,其中具有类似整体性质的多肽,如疏水性或电荷,可能具有显著不同的活性水平。10.

α1-油酸钠在NMIBC患者中的安慰剂对照随机临床试验

NMIBC是常见的,尽管目前的治疗方案,复发率很高。21,22。为探讨在小鼠MB 49膀胱癌模型中观察到的治疗效果能否转化为临床,在GMP条件下制备了研究产品α1-油酸。α-1-油酸盐配合物进一步进行了正式毒性试验,其结果已经公布。13。在1.7至17毫米浓度范围内未检测到对膀胱组织的毒性13.

在单中心、安慰剂对照、双盲阶段I/II试验(EudraCT No.2016-004269-14)、ClinicalTrials.govNCT 03560479(补充说明)中测试了α1-油酸酯的临床安全性和治疗潜力。1,补充表6)。怀疑NMIBC患者随机1/1在内镜下经尿道电切术(Turb)切除肿瘤前22天内接受α1油酸或安慰剂治疗(图1)。4A,b)。α1-油酸酯(1.7mm)或安慰剂(PBS)6次(30 mL,第1、3、5、8、15和22天)。安慰剂溶液的外观与主动治疗相同。治疗组和安慰剂组的人口统计数据、病史和生命体征没有差别(详见补充表)7).

图4:临床研究方案、人口学数据和不良事件。
figure4

a学习配偶图。乙学习协议。在诊断和知情同意后,受试者在预定的经尿道电切术(Turb)前的一个月内接受了6次α1-油酸或安慰剂的膀胱内注射。第一次滴注后52天进行安全随访。c活动组和安慰剂组的不良事件(AES)数目。未记录药物相关不良事件。活动组12名受试者和安慰剂组11名受试者共报告了29例AES。与研究产品无关。安慰剂组1例AE严重,2例中度。活动组有1例中度AE。安慰剂组的两名受试者报告了严重的AE(SAES)。对AES进行描述性评价,安慰剂组与活性组AE谱相似。

初步研究终点

根据MedDRA(版本21.1)记录和编码不良事件,并在52天后进行安全跟踪(补充表)8)。与程序相关的急症,如排尿困难和细菌尿症,在治疗组和安慰剂组中的发生率相似。未检测到治疗组所特有的AES,表明研究药物的低毒性(图一)。4C)。此外,没有证据表明,从病人的健康组织样本的α1-油酸,确定组织病理学或TUNEL染色。

记录肿瘤细胞脱落和肿瘤细胞团簇释放情况。每次给药前和滴注α1-油酸或安慰剂后2h,尿中有尿上皮形态的细胞计数。与所有接受治疗的患者相比,在所有就诊时,α1-油酸酯引起的细胞脱落量迅速增加(图1所示)。5A-C和补充图。7)。此外,治疗组将肿瘤细胞团簇释放到尿液中。肿瘤簇相对较大,肿瘤基质的存在支持了肿瘤的起源(图一)。5D-f)。尿脱落细胞按PARIS分类进行病理评分(1~6级,尿细胞学为次要终点)。在治疗组中,接种后样本的Paris评分高于接种前样本(图一)。5G)。安慰剂组细胞脱落率较低的原因是灌注过程,未观察到病理评分或细胞簇脱落的变化(图)。5A-g和补充图。7).

图5:主要终点:膀胱内灌注α1-油酸后肿瘤细胞脱落和肿瘤大小缩小。
figure5

acα1-油酸盐滴注后细胞脱落明显增加。a散点图显示治疗组每名病人六次探访的个别情况(n=20)与接受安慰剂的患者相比(n=20)。线代表中间值。b治疗组在第1-6次接种前(前=白色)和接种后(后=黑色)α_1-油酸酯时尿细胞数的比较显示,接种后细胞数增加(P<0.01)。n=每组20名病人,P2次访问=0.0030,2次访问为1,0.0098次,第3次和第4次访问为<0.0001次,第5次访问为0.0073次,第6次访问为0.0336次)。数据为平均值±扫描电镜。c有代表性的图像,说明α1-油酸滴注后细胞脱落的增加。放大率=×400标尺=50μm。df治疗组与安慰剂组肿瘤细胞簇脱落率差异有显着性(P<0.05)。d与接受安慰剂的患者相比,治疗组的每名患者平均有6次访问的散点图。线代表中间值。e接受α1-油酸(α1-油酸)患者接种后样本中细胞簇数量的增加(n=每组20名病人,P=0.9743次访问1,0.0212次访问2次,<0.0001次访问3次、4次访问和5次访问,0.0005次访问访问6次)。数据为平均值±扫描电镜。fα1油酸盐灌注后癌细胞团的典型图像。放大率=×400标尺=50μm。gα1-油酸盐滴注前后脱落细胞的巴黎级。治疗组(χ2测试)。h在接受α1油酸治疗的患者中缩小肿瘤大小。对诊断时间和TURB时间进行了比较。P=0.04,χ2与安慰剂相比,n=19治疗组和n安慰剂组为20)。iA.B.在诊断时和治疗后在Turb时获得的膀胱镜照片的例子。标尺=5毫米。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. The data were analyzed by two-tailed unpaired Mann–Whitney U-测试(a, d)或反复测量经Sidak校正的双向方差(b, e).

肿瘤的内镜表现在诊断时和手术前用带白光带和窄带成像的灵活膀胱镜进行记录。大小由一位经验丰富的内科学家使用完全开放的柔性钳夹钳和靠近肿瘤的测量装置来评估。39例患者的配对图像由一位独立的NMIBC专家使用简化的Delphi方法进行盲目评价。23处理病变大小、表面坏死和组织血管化的变化。治疗组发现病变缩小(n=19,图1。5H,i)。1例患者因技术原因不能采集治疗前和治疗后的图像.安慰剂组在浅表坏死或血管化方面无差异,病变大小无明显变化(n=20)。

次级终点

肿瘤细胞凋亡的证据是通过染色获得的肿瘤活检在手术时。活组织切片检查治疗诱导细胞凋亡的证据,用TUNEL法进行量化(图1)。6A-c和补充图。8)。与安慰剂相比,治疗组的净平均荧光明显增加(另见图)。1)。染色最强烈的邻近腔,提示可能形成一个梯度,从腔向中心的肿瘤。TUNEL染色强度与单个患者细胞脱落和α1-油酸摄取显著相关(图1)。6d)但不能达到肿瘤级别。在接受治疗的患者的健康组织活检中,TUNEL染色较低。安慰剂组肿瘤未见TUNEL染色增强,提示肿瘤细胞凋亡可能是由α1-油酸治疗引起的(图一)。6C).

图6:肿瘤细胞对α1-油酸和细胞摄取的凋亡反应。
figure6

用TUNEL法测定肿瘤活检组织中细胞凋亡的数量。在TUNEL阴性健康组织标本减去背景染色后,计算任意单位。a肿瘤组织TUNEL染色的代表图像(绿色=TUNEL,蓝色=DAPI)。标尺=200μm。b安慰剂患者肿瘤组织TUNEL染色的代表性图像。标尺=200μm。c散点图显示,与安慰剂相比,接受α1油酸酯注射的肿瘤活检组织中TUNEL染色强度提高。接受α1油酸酯注射或安慰剂的健康组织活检组织中TUNEL染色没有明显改变(n=40例肿瘤和38例健康活检,由于患者的健康状况,两个数据点被进一步移除,并经格鲁布斯离群点检验证实)(两尾未配对的Mann-Whitney)U-测试)。线代表中间值。dTUNEL染色强度与细胞脱落的相关性(英文)P=0.03,95%CI 0.0220~0.6010)和α_1-油酸摄取(P=0.01,95%CI 0.0957-0.6461)(Spearman相关,双尾,近似P-价值,n=20表示字母1-o和n=19(安慰剂)。e反染细胞核(蓝色)摄取α1-油酸(红色)的典型图像。肿瘤细胞摄取α1-油酸,用多克隆抗α1-油酸抗体染色尿脱落细胞。鳞片=20μm。f接受α1-油酸盐的个体患者细胞摄取的散点图。每个点代表每个接受α1-油酸治疗的病人滴注后6个样本的平均荧光强度。尿中细胞摄取α_1-油酸的比较(Pre=White)和接种后(POST=黑色)α_1-油酸在第1-6次(重复测量双向方差与Sidak‘s校正)的比较,P=0.0049次访问,1,0.1913次访问,2,0.0067次访问,3,0.0025次访问,4,0.3807次访问,0.0043次访问,n=每组20次,时间点为20次)。线代表中间线,棒子代表平均值±扫描电镜。

用α1特异性抗体免疫组织化学方法测定尿脱落细胞中α1-油酸的含量。治疗组70%的接种后标本中检出α1染色。6E,f和补充图。9)。摄取与细胞脱落和集落分级相关,但与肿瘤分级或分期无关(附图)。9).

用rna-seq进一步评估对α1-油酸的反应,使用来自肿瘤活检的RNA,并将治疗与安慰剂组进行比较。检测到了较强的治疗效果(图一)。7A-c和补充图。10)。在接受治疗的患者中,与癌症相关的基因约占显着调控基因的80%(切断折叠变化>2.0,P < 0.05), confirming the effect of alpha1–oleate on the tumor environment. Genes regulating tumor growth and invasion were inhibited and Ras signaling was suppressed, consistent with known effects of the complex on Ras family members24(无花果)7D和补充图。10)。膀胱癌基因受到特别的调控,包括金属蛋白酶、溶质载体、wnt复合物和凝血酶素,它们影响血管生成。25(无花果)7E)。此外,脂肪酸去饱和酶6(FADS 6)和转录激活剂CREB3L4受影响,表明肿瘤对α1-油酸复合物的成分有反应。FADS 6调节油酸生物合成CREB3L4一种未折叠的蛋白质对构象流体蛋白质的反应,如α1肽。令人感兴趣的目标还包括间隙连接α1蛋白,这种蛋白被抑制,有可能促进细胞脱离(GJA 1/CXA 1编码连接蛋白43,补充图。10)。根据WHO 1973和2004/2016标准,治疗组和安慰剂组肿瘤分级无差异(补充表)9)。没有报告关于两个二级端点的数据。由于这是一个中期分析,长期治疗效果将在整个研究完成后进行评估。尿液蛋白质组学数据集尚未得到充分分析。

图7:基因表达的重编程。
figure7

RNA测序用于比较治疗组或安慰剂组肿瘤组织活检中基因表达谱。a治疗后调控基因的饼形图(切断FC>1.5,P < 0.05 compared to the placebo group). In the treatment group, 82% of all regulated genes were cancer-related and 14% were bladder cancer-related. Gene categories were identified by biofunction analysis. b治疗组肿瘤活检中特异性癌和膀胱癌相关基因的热图(红色=上调,蓝色=下调,切断FC>1.5,P <0.05 compared to placebo group). About 60% of all regulated genes were inhibited in the treatment group. c详细分析(a, b)。顶级调控,癌症相关功能显示。抑制被表示为阴性。z-得分(蓝色)和显着性P数值(橙色)肿瘤侵袭、肿瘤增生、肿瘤生长和泌尿系肿瘤相关基因的表达受到强烈抑制。d与安慰剂组比较,治疗组RAS信号传导受到抑制。e与安慰剂相比,在接受α1-油酸治疗的患者中,膀胱癌基因网络受到了特殊的调控。

讨论

膀胱癌是美国第四大最常见的恶性肿瘤,在欧洲位居第五,发病率约为1/4000。26。由于高复发率和缺乏治疗方法,“膀胱癌是所有癌症患者中终生治疗费用最高的,其次是结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌。”27。第一次肿瘤完全切除后,80%以上复发,15%进展为肌肉浸润性疾病。28。膀胱内化疗和卡介苗(Bcg)免疫治疗疗效有限,副作用显著。29,30。只有在经验有限的卡介苗患者中,才考虑全身注射PD-1和PD-L1抑制剂。由于全球免疫治疗和化疗药物供应不足,治疗选择也受到限制。31。在本研究中,我们将构象流体肽-脂肪酸复合物作为肿瘤治疗的补充工具,表明膀胱内接种α1-油酸对膀胱癌患者是安全有效的。

对α1-油酸盐的肿瘤反应进行了深入分析,利用细胞和分子工具检测了该复合物引起的肿瘤的变化。治疗触发细胞和组织碎片脱落到尿液中,α-油酸被肿瘤细胞内化,证实了复合物与肿瘤的亲和力。组织活检的进一步分析表明,α1-油酸的注入具有持久的效果,因为几个肿瘤样本从膀胱腔开始呈梯度状的凋亡模式。功能失调的细胞凋亡被认为是肿瘤发展的关键,特别是在诸如MYC等癌基因驱动肿瘤细胞增殖的环境中。32。人们曾多次尝试开发具有肿瘤选择性的诱导凋亡疗法,但事实证明这具有挑战性,这可能是由于单个肿瘤的异质性及其对激活细胞死亡途径的内在抵抗力所致。因此,α1-油酸在大多数膀胱肿瘤中刺激凋亡的能力是令人鼓舞的,并且与膀胱组织明显缺乏毒性相一致。

RNA测序显示,处理后的组织中分子发生了深刻的变化,可归因于α1-油酸。与安慰剂组相比,经典的癌症基因网络在接受治疗的患者中受到了强烈的抑制,其中包括之前被认为是哈姆雷特靶点的RAS;α-乳清蛋白全蛋白形成的油酸复合物。24。哈姆雷特在肿瘤细胞质膜上结合激活的RAS,并抑制RAS信号通路,部分机制是通过b-Raf磷酸化作用。未检测到对适应性免疫的显著影响,天然免疫在很大程度上被抑制,包括粒细胞激活途径。值得注意的是,参与油酸代谢和未折叠蛋白反应的基因受到影响,可能反映出对α1-油酸复合物的直接反应。此外,治疗抑制GJA 1,这是一种缝隙连接蛋白,被认为能促进肿瘤的发展和转移。33,34。这种效应特别发生在肿瘤组织中,可能为α1-油酸复合物提供了一种触发细胞脱落的机制,正如本文所观察到的。推测细胞脱落可能是肿瘤生物学发生深刻变化的“冰山一角”,包括激活程序性细胞死亡、转录重编程和抑制肿瘤进展,这是很有趣的。

NMIBC患者,特别是卡介苗治疗后复发的患者,正在积极开发和测试替代治疗工具。35,36,37。设备辅助热疗可以提高膀胱内化疗的疗效,但治疗伴随着副作用,降低了顺应性。38,39,40。最近报道了一种以肿瘤病毒为基础的膀胱内疗法,在第三阶段的试验中,53.4%的bcg无反应的原位癌患者获得了完全的疗效。41。作者讨论了副作用的评估和生物标志物的发展,以帮助选择适合这种治疗的患者。在卡介苗无反应疾病患者中,使用全身泛素利苏单抗治疗,有41%的有效率报告,但副作用普遍存在,限制了依从性(Keyt-676试验)。35)。本研究确定α1-油酸为低毒活性药物。进一步的剂量发现,临床研究和辅助治疗方案将是确定这一复杂的治疗窗口至关重要。

癌细胞具有侵略性,强于健康细胞,破坏组织完整性。人们普遍认为,治疗必须具有同等的侵略性,而且往往使用剧毒物质,尽管它们缺乏选择性,而且造成严重的副作用。这里研究的蛋白质-脂质复合物对癌细胞很有吸引力,癌细胞会主动地将它们内化,但最终会被杀死。健康的细胞反应较弱,广泛的毒性研究未能检测到膀胱内的副作用。13。这种低毒反应在这里得到证实,因为治疗组没有观察到与药物有关的副作用。因此,研究结果表明NMIBC的α1-油酸治疗是一种有趣的治疗方法。鉴于到目前为止观察到的低毒,在NMIBC早期宽松的膀胱内给药可能是推迟引进更具毒性和侵袭性的治疗方案的一种有趣的方法。


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