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用单链RNA佐剂有效灭活老年人流感疫苗

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发表时间:2021-06-09 14:05作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

对新的流感疫苗战略的需求还没有得到满足,这些战略可以弥补老年人疫苗反应受损的影响。在此,我们评估了单链RNA(SsRNA)作为佐剂提高灭活流感疫苗(IIV)在小鼠模型中的有效性。用ssRNA和IIV联合免疫可降低老年小鼠流感攻击后肺部的病毒滴度及病理和炎症评分。SsRNA诱导Th1/Th2平衡反应,随着IgA滴度的增加而增加。此外,ssRNA佐剂能显著提高流感病毒HA特异性T细胞的频率和IFN-γ的产生,并增加与先天和适应性免疫系统相关的基因的表达,从而克服老年小鼠的免疫功能障碍。我们的研究结果表明,ssRNA是一种有效的疫苗佐剂,能增强老年小鼠的细胞免疫和体液免疫,是一种新型的老年人流感病毒疫苗佐剂。

导言

由甲型和乙型流感病毒引起的流感是发生在人类人群中的一种常见的传染性呼吸道疾病。据世界卫生组织(世卫组织)称,流感病毒每年感染世界人口的2-10%,造成25万至50万人死亡。1,2。与在其他呼吸道疾病中观察到的情况类似,免疫缺陷患者,如老年人、儿童和患有其他慢性疾病的人,尤其容易受到流感相关死亡的影响。据报道,约70-85%的流感死亡病例和50-70%的流感相关住院病例发生在65岁以上的患者身上。3。因此,流感在老年人中是不可忽视的疾病。

虽然接种疫苗是预防传染病发展的最有效方法,但由于免疫老化的发生,老年人流感疫苗的反应性明显降低。4,5。免疫衰老的主要特征之一是免疫反应的发生,这是一个影响先天免疫反应和适应性免疫反应的复杂过程。除循环单核细胞和树突状细胞数量减少外,吞噬活性降低和抗原提呈受损与衰老有关。T细胞和B细胞也受衰老的影响。6,7。T细胞老龄化中最显著的变化是胸腺萎缩导致幼稚T细胞收缩。此外,T细胞活化受损、效应T细胞失效和长寿命记忆T细胞生成与衰老有关。8,9。T细胞的这些缺陷与共同刺激分子的表达和细胞因子的产生减少有关。B细胞也有类似的现象。骨髓净B细胞生成减少导致B细胞库收缩10。因此,这种减少限制了能够对新抗原作出反应的B细胞克隆的数量。11。此外,老化记忆B细胞分化为抗体分泌细胞的能力降低,抗原特异性抗体产生和生发中心形成减少。12.

伴随衰老而来的另一个重要的免疫学特征是持续的、无菌的、低度的炎症,也称为炎症。13。在组织微环境和老年人血液中检测到较高水平的促炎细胞因子、趋化因子和C-反应蛋白。13。这种现象被认为是对病原体或疫苗产生适当免疫反应的障碍,因为它阻碍了机体识别刺激的能力。因此,老年人可能需要比年轻人更高的阈值来激活免疫细胞。14,15.

佐剂是一种提高疫苗免疫原性的物质。虽然一些佐剂,如铝盐、MF 59和AS 03,目前在流感疫苗中被用来增强免疫应答,但它们不能诱导足够的Th1/2应答。16,17。此外,他们的效果是次优,尤其是在老年人。65岁以上的人中只有30-40%的人经历过流感疫苗诱导的免疫原性,尽管疫苗和循环病毒是抗原配对的。5,18。相比之下,疫苗在65岁以下的个体中的效力在70%到90%之间。因此,探索一种新的流感疫苗策略,对流感疫苗产生保护性反应,克服免疫衰老问题,具有十分重要的意义。

我们以前开发了一个新的单链RNA(SsRNA)平台,它起源于蟋蟀麻痹病毒(CRPV)内部核糖体进入位点(IRES)。我们证明,当用灭活流感疫苗(IIV)或mers-cov尖峰蛋白疫苗在幼鼠体内配制时,ssRNA可以作为一种有效的佐剂。19,20。此外,ssRNA佐剂对异源流感病毒具有交叉保护作用。20。在本研究中,我们扩展了我们先前的研究,并通过对老龄小鼠进行实验,验证了ssRNA佐剂是否能提高IIV对老年人的疗效。

结果

用ssRNA配制的iV诱导了平衡的IgG 1/IgG2a免疫应答,并引起年轻和老年小鼠产生较高的中和抗体滴度。

为了评估单链RNA对体液反应的辅助作用,对6周龄幼鼠和21月龄小鼠进行了肌肉注射,分别用含或不含单链RNA(20μg)的iIV进行了肌肉注射,并按最佳/加速程序采集了他们的血样,如图所示。1A.有趣的是,ssRNA佐剂显著增加了幼龄小鼠和老年小鼠的体液反应。IIV单独诱导幼鼠产生IgG 1(平均OD值:1.6±0.4)和IgG2a(O.D值:0.75±0.2),但对老龄小鼠(G5)产生IgG 1(OD值:0.3±0.2)和IgG2a抗体(OD值:0.15±0.12)的诱导作用较小(Fig)。1b)。而用ssRNA免疫老年小鼠(G6)配制的IIV则在第2周出现IgG 1(O.D值:0.38±0.21)和IgG2a抗体(OD值:0.78±0.28)升高(图二)。12周后IgG 1(OD值:1.1±0.31)和IgG2a抗体(OD值:2.1±0.42)显著升高。1周后观察到类似的变化(补充图)。沙一)。值得注意的是,ssRNA佐剂能显著诱导IgG2a抗体的产生。在幼鼠体内,单用IIV(G2)不能在第一时间诱导IgG2a抗体,而IIV在第一周期后的单抗免疫小鼠(G3)中检测到IgG2a抗体。在老年小鼠中,血清IgG2a水平仅在所有观察时间点用ssRNA免疫组(G6)配制的IIV中检测到(如图所示)。1b)。

图1
figure1

用ssRNA配制的流感灭活疫苗(IIV)增强了IIV诱导的体液反应。BALB/c小鼠肌肉注射0.6μg IIV,加或不加ssRNA佐剂,间隔2周。2周后,小鼠接受A/California/04/2009病毒攻击。为进行IgG、IgG2a、血凝抑制和微球化试验,于高峰后2周采集血清。数据表示为平均值±SD。数据采用单因素方差分析。各组间差异的显着性表现为:*p<0.001;**p<0.01;*p<0.001;*p<0.0001。(a)免疫小组和免疫和挑战时间表。N=5只小鼠G1~G6。(bIIV特异性IgG 1和IgG2a水平采用ELISA法测定。N=5只小鼠G1-G6。(c)血凝抑制试验测定疫苗株血凝抑制效价。数据表示重复结果的几何形状。N=3只小鼠G1-G6。(d)微球化滴度(A/California/04/2009)。N=5只小鼠G1-G6。

此外,甲型H1N1流感疫苗株A/密歇根/45/2015(NYMC X-275)、A/H3N2疫苗株A/H3N2、B/Phuket/3073/2013、B/Yamagata、B/马里兰/15/2016和A/California/04/2009(H1N1)疫苗株的血凝抑制(HI)效价显著增加。此外,在用ssRNA免疫组(G3和G6)配制的IIV中检测到抗A/California/04/2009(H1N1)的微整化抗体滴度(图3和G6)。1C,d,附图。S2).

用ssRNA配制的iv抑制病毒复制,减少流感所致的幼龄小鼠和老龄小鼠的发病

随后,我们确定了单链RNA佐剂应用是否能增强IIV的保护作用,减少病毒攻击后病毒所致的病机。如图所示。2A、b、IIV免疫组(G2和G5)与对照组(G1和G4)相比,体重减轻和临床疾病的发展略有延迟或减轻。相反,用ssRNA免疫组(G3和G6)配制的IIV在幼龄小鼠和老年小鼠进行攻击后,没有显示出任何明显的体重减轻或临床疾病的发展(图1)。2a,b)。与上述结果相一致的是,用ssRNA(G3和G6)免疫IIV后1周收集到的肺和支气管肺泡灌洗液(BALF)中的病毒滴度明显降低。IIV免疫的幼龄小鼠和老年小鼠肺部病毒滴度(拷贝数)均为2×10。99×109拷贝数/毫升;此外,这些数字减少到2×108(年轻)和8×108用单链RNA(G3和G6)配制的IIV免疫组(G3和G6)复制(AGE)拷贝数/mL。2c)。

图2
figure2

用ssRNA配制的灭活流感疫苗(IIV)可以减少病毒的复制和发病,并诱导对流感病毒的保护。Balb/c小鼠在治疗后2周用A/California/04/2009病毒进行攻击,并在1周后处死,如图所示。11周后取肺,固定、处理、H&E染色,进行肺组织病理学检查。攻击后1周收获Balf。实验小组如图所示。1A.数据用均值±sd表示,用单因素方差分析和学生统计分析。t-测试。各组间差异的显着性表现为:*p<0.001;**p<0.01;*p<0.001;*p<0.0001。N=5只小鼠G1~G6。幼龄小鼠体重百分比(a)和临床疾病评分(b)接受A/California/04/2009挑战后一周的学习。临床疾病评分详见“材料和方法”. (c)用实时PCR法测定幼龄小鼠和老年小鼠在A/California/04/2009攻击后1周肺和支气管肺泡灌洗液中的病毒滴度。(d)用苏木精和伊红(H&E)染色。B,支气管或支气管;V,血管;P,肺气肿;箭头,炎症细胞(中性粒细胞和淋巴细胞);箭头,出血;星号,渗出。(E)病理病变面积百分比和炎症积分。(f)用磁光筛选试剂盒测定BALF中IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α水平.

此外,用ssRNA(G3和G6)制备的IIV免疫组,肺(支气管或血管)、实质和血管炎症以及毛细支气管炎中炎性细胞的生成明显减少(图3和图6)。2D,e)。最后,在病毒攻击的G3和G6组的BALF中观察到白细胞介素(IL)-4、IL-6、IL-10、干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(α)等细胞因子水平的显著下降(图1)。2f)。

用ssRNA配制的iv能促进流感特异性T细胞的产生和病毒攻击后的体液反应。

由于预防流感的作用还与产生细胞毒性T细胞反应和抗体反应有关,我们确定了使用ssRNA佐剂所引起的流感症状的缓解是否与抗原特异性CD8的增加有关。+T细胞如图所示。3甲,乙,医管局的百分比533-特异性CD8+在攻击后1周,应用ssRNA佐剂可显著增加小鼠脾脏T细胞。SsRNA佐剂对HA的表达无明显影响。533-特异性CD8+年轻小鼠的肺中有T细胞,但在老年小鼠中观察到了这种增加(图一)。3c,d)。此外,单链RNA佐剂的应用增加了青年和老年小鼠脾脏中由血凝素(HA)蛋白和HA肽触发的IFN-γ产生T细胞的数量(图)。3e)。因此,这些结果表明ssRNA佐剂增强的保护作用与T细胞特异性免疫反应的产生有关。

图3
figure3

用ssRNA配制的灭活流感疫苗(IIV)能增加流感病毒HA特异性T细胞的生成和体液反应。攻击后1周取脾细胞和肺淋巴细胞。采用ELISPOT法,用或不加IIV或流感HA特异性T细胞表位肽刺激细胞2天。详细的肽序列列在“材料和方法“检测免疫后1周血清IgG 1、IgG2a和IgA水平。实验小组如图所示。1A.数据用均值±SD表示,用单因素方差分析进行统计学分析.各组间差异的显着性表现为:*p<0.001;**p<0.01;*p<0.001;*p<0.0001。HA特异性四聚体在脾脏中的百分比(a,b(n=5只小鼠G1至G6)和肺(c,d(n=4只G3小鼠,5只G1、G2、G4、G5和G6小鼠)。(e)用ELISPOT法测定了流感病毒特异性干扰素γ产生细胞在脾细胞中的斑点。N=5只小鼠G1-G6。(fIIV特异性IgG 1、IgG2a和BALFIgA水平在攻击后1周用ELISA法测定。N=5只小鼠G1-G6。

刺激后(G3)小鼠血清IgG2a和BALFIgA水平明显升高(P<0.05),用ssRNA(G6)免疫老年小鼠血清IgG 1、IgG2a和BALFIgA水平明显升高(图6)。3f)。

SsRNA能促进小鼠脾脏树突状细胞的生成,促进T细胞活化

为了阐明ssRNA佐剂的促进作用的潜在机制,在Boost计划后1周,从用或不含ssRNA的IIV免疫的幼龄和老年小鼠中分离出脾细胞和肺淋巴细胞,如图所示。4如图所示。4应用ssRNA对幼龄小鼠和老年小鼠脾脏树突状细胞的百分率和绝对值均有显著或非显着性的提高(图一)。4b)。虽然CD 25和CD 154是典型的T细胞活化标志,但在肺CD8中的表达水平似乎并无统计学意义。+用ssRNA(G3和G6)配制的IIV免疫幼龄和老年小鼠的T细胞,在刺激后1周与IIV单独免疫小鼠的T细胞进行比较(图1)。4c)。此外,单链RNA佐剂的应用提高了干扰素-γ-和肿瘤坏死因子-α-产生CD4的百分比。+青年和老年小鼠脾脏T细胞(G3和G6)(图3和图6)。4(d-g)此外,HA蛋白刺激(G3和G6)后,青年和老年小鼠脾脏和肺中产生IFN-γ的细胞数量增加。此外,ssRNA的应用还略微增加了年轻和老年小鼠脾脏中产生IL-4的细胞数量(见图)。4h)。与上述结果相一致,用由青年和老年小鼠(G3和G6)组成的单链RNA免疫组获得的HA蛋白刺激的脾细胞培养上清(G3和G6)显示,IFN-γ和IL-2的产量显著增加,IL-6的产量略有增加(图1)。4i)。

图4
figure4

用ssRNA配制的流感灭活疫苗(IIV)能增加T细胞的抗原提呈细胞、活化标记物和细胞因子的产生.BALB/c小鼠肌肉注射0.6μg iIV,加或不加ssRNA佐剂,间隔2周。1周后取脾细胞和肺淋巴细胞。用流式细胞仪(FACS)检测细胞因子,ELISPOT法刺激细胞16h,ELISPOT法检测细胞因子,ELISA法检测细胞因子。数据以均值±SD表示,用单因素方差分析进行统计学分析.各组间差异的显着性表现为:*p<0.001;**p<0.01;*p<0.001;*p<0.0001。N=5只小鼠,分别为G1、G2、G3、G5和G6。N=G4小鼠4只或5只。(a)免疫组和时间表。(b)小鼠脾细胞中巨噬细胞和树突状细胞的百分率和绝对值。(c)CD 25和CD 154在青年和老年小鼠肺淋巴细胞中的表达。百分比d,e)干扰素-γ和(f,g)TNF-α对幼龄小鼠脾细胞和老年小鼠脾细胞的影响。(h用ELISPOT法测定了流感病毒HA特异性IFN-γ-和IL-4产生细胞在脾细胞和肺淋巴细胞中的斑点。(i)ELISA法测定脾细胞培养上清液中流感HA特异性干扰素-γ、IL-2和IL-6的浓度.

免疫幼鼠和老龄小鼠应用ssRNA后mRNA表达的变化

为探讨应用ssRNA佐剂对老年小鼠脾细胞基因表达的影响,采用NanoString分析方法,比较了免疫小鼠脾细胞在免疫后1周的转录谱。并与生理盐水免疫组(青年小鼠G1组和老年小鼠G4组)进行基因表达定量比较。差异表达基因(DEGS),p<0.0 5和折叠变化≥2,数据用维恩图(图1)表示。5a)。我们证实老年组(G5和G6)的DEGS数低于年轻组(G2和G3),分别用ssRNA免疫组(G3组)和老年组(G6组)检测出377和13个上调或下调基因。其中8个基因表达上调[补体因子D前体(CFD)、整合素α6(Itga 6)、MAF和非受体酪氨酸蛋白激酶(TYK 2)]或下调[分化79b簇(CD79B)、分化80簇(CD 80)、低亲和力免疫球蛋白γFc区受体IV(Fcgr4)和干扰素可激活蛋白204(Ifi204)]。5a)。为探讨其功能联系,我们分析了各组小鼠脾脏中基因表达模式。如图所示。5B.ssRNA佐剂诱导多个免疫应答相关基因簇。老年小鼠的基因表达模式与幼鼠相似。先天和适应性免疫系统相关基因,如Klrd 1, 干扰素α,伊-6, CD 74,和MAPK 11被ssRNA上调。此外,ssRNA还可能通过增加趋化因子CCR 7、CCR 5、CXCR 2和Ccl 19等趋化因子,影响免疫细胞的迁移和抗原提呈细胞的功能,以及吞噬和1、2型IFN信号。SsRNA佐剂还能增强B细胞受体信号传导。SYK, 芬恩, NFatc 2,和IKBKG)和Th1和Th2分化相关基因(GATA 3, IL2RG, 释放, STAT 5b,和雅克)(图1.5B和补充图。S3).

图5
figure5

免疫青年和老龄小鼠脾细胞免疫相关基因表达模式的研究。差异表达的基因(DEGS)用Venn图和热图来说明。N=3只小鼠G1~G6。(a)基因表达水平上调或下调2倍以上,与年轻小鼠G1和老年小鼠G4相比,差异有显着性(P<0.05)。(b)与免疫学相关的基因表达模式用热图显示。

讨论

接种疫苗是对付传染病的最有效的预防措施。虽然对老年人来说疫苗是必需的,但由于免疫和炎症的发生,这些人对疫苗的反应明显不如年轻的个体。15。因此,研制能提高老年人疫苗效力的新型佐剂具有十分重要的意义。在本研究中,我们评价了ssRNA对老龄和年轻小鼠季节性IIV的佐剂作用。虽然ssRNA佐剂能显著提高老年和幼鼠IgG 1和IgG2a水平,但对IgG2a水平的影响更为显著。由于IgG2a抗体反应代表Th1偏倚,因此ssRNA可能有效地增强Th1反应。事实上,单链RNA的应用不仅显着地提高了年轻小鼠和老年小鼠的干扰素-γ的产量。此外,ssRNA的应用显著增加了单独免疫IIV的老年小鼠中未检测到的中和抗体的滴度。因此,我们认为ssRNA可能影响滤泡Th细胞反应的产生或生发中心的形成,因为它与产生功能性中和抗体有关。21。有趣的是,ssRNA的应用甚至提高了老年小鼠的BALFIgA水平。我们认为IgA水平的升高对老年小鼠呼吸道流感病毒的感染有保护作用。因此,ssRNA的使用可以扩大产生的抗体反应的数量和质量,并且随着年龄的增长而下降,它不仅可能引起平衡的Th1/Th2反应,而且还可能诱发幼鼠和老年小鼠的粘膜免疫反应。

除了体液反应增加外,ssRNA应用还能增强细胞免疫反应。据报道,老年小鼠产生的效应T细胞表达较低水平的活化和分化标志,如CD 154、CD 25和CD62L,并产生数量减少的细胞因子。22。此外,CD4的辅助活性明显下降。+本文报道了从老年个体获得的T细胞。老年CD4+T细胞对诱导体液反应的作用不大,导致B细胞增殖、GC分化和IgG生成减少。23。值得注意的是,我们的ssRNA佐剂的应用增加了CD 25和CD 154在CD8中的表达。+肺部的细胞,以及干扰素-γ-和肿瘤坏死因子-α-产生CD4。+脾脏中的细胞。此外,老年小鼠对流感蛋白的干扰素-γ、IL-2和IL-6的产生也明显增加,与幼鼠相似。结果表明,ssRNA佐剂能刺激T细胞的活化,这些活化的T细胞可能改善了病毒引起的衰老小鼠的病理改变。

在本研究中,我们不确定ssRNA佐剂是否能提高老年小鼠的存活率。然而,ssRNA佐剂的应用减轻了幼鼠和老年小鼠的体重下降、临床疾病和BALF细胞因子的产生以及肺和BALF中病毒滴度的下降。这些数据表明ssRNA的应用有助于快速清除病毒和减轻肺部炎症。24,25。此外,ssRNA佐剂的应用减少了攻击后肺部炎症细胞的浸润,用ssRNA佐剂和疫苗免疫小鼠的肺无论在幼鼠还是老年小鼠的肺泡结构基本正常。因此,我们认为ssRNA可以有效地改善流感病毒的致病机制,从而提高存活率。

在我们之前的研究中,我们证明了ssRNA佐剂的应用可以诱导天然免疫应答生成和T细胞活化相关基因的表达。26。因此,我们研究了其对流感疫苗免疫老年小鼠mRNA表达模式的影响。众所周知,由于免疫功能的增强,老年小鼠体内IFN的产生和信号转导能力降低。6,27。然而,在本研究中,ssRNA佐剂的应用增加了老年小鼠TYK 2和MAF的表达。TYK 2参与IFN信号转导28而maf激活IL-4的产生。29我们预计,这些基因表达的增加可能会减轻衰老小鼠的免疫缺陷。此外,我们还证实,用ssRNA免疫老年小鼠后,与先天和适应性免疫系统、细胞因子信号、淋巴细胞活化、Th1和Th2分化、TNF家族信号、1型和2型IFN信号有关的基因表达模式与幼鼠相似。说明ssRNA佐剂可提高小鼠天然免疫系统相关基因和适应性免疫系统相关基因的表达。

总之,使用ssRNA佐剂可补偿衰老引起的细胞和体液反应受损,不仅促进Th1/Th2反应平衡,而且促进粘膜免疫和中和抗体的产生,从而促进保护性免疫的发展。此外,它的应用似乎是极好的简单性,因为配方可以简单地添加到商业上可获得的灭活疫苗。我们相信,我们的研究结果可以加速发展更有效的流感疫苗,特别是针对老年人的流感疫苗,而且可能也适用于其他疫苗。


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