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患者血液中的体内外免疫图谱可量化天然免疫效应物的功能

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发表时间:2021-06-09 13:52作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

在许多临床情况下,评估患者的免疫功能是至关重要的。在脓毒症等复杂的临床免疫功能障碍中,由于微生物感染导致免疫稳态的丧失,大量的促炎和抗炎刺激可能是连续发生或同时发生的。因此,任何免疫调节治疗都需要深入了解患者在特定时间的免疫状况。然而,基于实验室的免疫图谱通常只依赖于细胞数量的量化,我们采用了一个非活体全血感染模型和生物数学模型来量化心脏手术患者血液中天然免疫细胞的功能参数。这些患者经历了一次明显的炎症性侮辱,从而减轻了病原体特异性的反应模式。金黄色葡萄球菌白色念珠菌这是健康人和我们的病人在基线时的特征。这不仅干扰了从血液中清除这些病原体,而且选择性地增加了C.白念珠菌从吞噬。总之,我们的模型可以作为一种有价值的功能免疫试验来记录和评估对感染的先天反应。

导言

危重疾病可能与免疫功能的显著改变有关,包括低炎症状态和超炎症状态。免疫功能受损显著增加了感染的风险,而全身炎症促进了多器官功能障碍综合征的发展。因此,评估患者的免疫功能在临床实践中是可取的。然而,大多数实验室测试完全依赖于免疫细胞数量的量化。例如,通过测定外周血中性粒细胞的数量来评估中性粒细胞减少期间的感染风险。1。同样的,CD4+T细胞计数被用来量化HIV感染的免疫抑制程度。2。虽然这些检测在临床上非常有用,但它们使用的是定量阈值,没有提供任何有关免疫细胞功能的信息。3。为了提高对患者免疫状态的认识,人们尝试将释放的蛋白质定量作为间接标记物,如IL-6、IL-8、降钙素原和C反应蛋白。4。所有这些来源于不同的免疫细胞,大多是多向性的,可能相互拮抗,所有这些都限制了它们的临床应用。脓毒症引起的免疫抑制可以通过减少单核细胞上主要组织相容性(Mhc)Ⅱ类分子HLA-DR的表达来衡量,这与抗原提呈能力下降和从亲细胞因子向抗炎细胞因子的转变有关。5,6)。类似地,嗜中性粒细胞表面高亲和力的fcγ受体i(Cd 64)在细菌感染的早期免疫反应和全身炎症反应综合征中的表达也有增加。7,8,9。多项研究表明,作为一项指标,CD 64可用于新生儿重症监护病房和成人医院病人的脓毒症和细菌感染的检测和管理。10,11。然而,虽然表面标记物反映了免疫细胞的激活状态,但它们并没有提供直接的功能读数。因此,在更复杂的环境下,用LPS体外刺激全血和定量细胞因子释放已经被用来量化免疫功能。LPs诱导的单核细胞在全血中释放的肿瘤坏死因子-α与正常人相比,在免疫抑制的患者中有减少的趋势。12,13。然而,这种方法依赖于一种分泌的细胞因子作为细胞免疫功能的间接标志。到目前为止,描述的最有功能的读取是通过测量中性粒细胞清除胞浆聚糖颗粒的能力来评估危重病人的中性粒细胞功能障碍。3,14。然而,这些检测有选择地涉及中性粒细胞,需要事先分离细胞,这可能改变它们的功能,特别是在活化的中性粒细胞患者中。15.

在先前的研究中,我们采用系统生物学的方法来研究健康人血液中病原体的免疫反应。16,17,18。利用体内外全血感染与生物数学模型相结合,可以计算出血液免疫细胞的功能参数,如细胞迁移和病原体吸收的动力学率。基于这些结果,我们进行了一项试点研究,以研究系统生物学方法是否允许在临床环境中量化免疫功能。我们选择了接受体外循环心脏手术的患者。这些患者接受标准化的麻醉方案和手术程序,并有明显的炎症反应(例如,血脂多糖和β-D-葡聚糖水平的增加),从而能够分析受虐前后的免疫功能。19,20,21。通过测定体外全血细菌后天然免疫细胞群的功能参数(金黄色葡萄球菌)和真菌(白色念珠菌)感染,我们显示术后炎症导致患者间和病原体间免疫反应模式差异的减弱。此外,我们的模型揭示了增强的免疫逃逸C.白念珠菌没有被观察到金黄色葡萄球菌指示病原体对免疫状态改变的特异性适应。

结果

细菌和真菌全血感染过程中病原体特异性免疫应答模式的研究

已用活菌对全血进行了事先的分析。16。然而,要量化患者血液中的免疫细胞功能,就需要使用灭活的刺激来避免患者血液中抗生素对病原体灭活的影响。因此,我们量化了两种灭活病原体的免疫细胞功能参数,金黄色葡萄球菌(细菌)及白色念珠菌(真菌)。在4小时的时间过程中,中性粒细胞是与这两种病原体相互作用的主要免疫细胞类型(见图)。1(A)。两种病原体在血液感染60 min后均与中性粒细胞有相似的相关性。然而,早期的10分钟时间点显示出更快的关联S. 金黄与中性粒细胞和单核细胞比较,分别为70.8±10.2%和7.6±1.8%。C. 白念珠菌(45.0±13.3%,3.1±0.5%)。1a,b)。与不同的缔合动力学一致,C. 白念珠菌被清除的速度比S. 金黄(10分钟)P.I.:胞外C. 白念珠菌52.9±13.6%,胞外S. 金黄21.6±10.5%。1c)。值得注意的是,感染后4小时,更多的人群C.白念珠菌S. 金黄(胞外C. 白念珠菌细胞外13.0±4.3%S. 金黄4.0±1.5%。将这些数据与以前的研究和一组使用可行的新实验进行比较C. 白念珠菌总体上显示出相似的模式,但也显示与单核细胞相关的灭活真菌细胞的数量显著增加(60分钟)。P.I.*可行C. 白念珠菌4.9±2.3%,灭活C. 白念珠菌13.4±2.5%P < 0.001) (Fig. 1F和16)。与淋巴细胞的关联不能检测到这两种病原体,无论其生存能力如何。全血感染C.白念珠菌在一种活跃或不活跃的状态下,单核细胞源性细胞因子(TNF-α,IL-1β和IL-6)的分泌能力很强,而在模拟感染的血液中只能检测到较低的细胞因子水平(图一)。1g)。

图1
figure1

年内寄主与病原相互作用动态的比较C.白念珠菌金黄色葡萄球菌健康血液中的感染。(ac)状态模型(SBM)和基于Agent的模型(ABM)与实验数据的拟合结果。通过将SBM(暗色)和ABM(浅色)与实验测量的缔合动力学(虚线)拟合,得到了组合单元(固体线)的模拟动力学。实验数据是从全血感染检测中得到的。C.白念珠菌(绿色,n=10)或金黄色葡萄球菌(红色,n=7)。SBM:线厚度表示通过50次模拟得到的SD,并在相应的SD中采样转换速率值。ABM:线厚度表示从30个随机模拟得到的标准偏差,估计扩散系数。(a)和(b),组合单元的动态PNPM与中性粒细胞和单核细胞相关病原体的实验数据相对应。(c)组合单元的动力学PE与细胞外空间中真菌或细菌细胞的动力学实验相结合。(d)用模拟退火法将SBM与实验数据拟合得到的转换速率值的平均值(±SD)。中性粒细胞吞噬率(N}))和单核细胞((菲涅姆))以及免疫逃逸率((Rho))的感染场景。C.白念珠菌(绿色圆)或金黄色葡萄球菌(红色圆圈)。(E)中性粒细胞的扩散系数(({D}{N})\)单核细胞(({D}{M})\)通过将ABM与实验数据进行拟合来估算C.白念珠菌(绿色圆)和金黄色葡萄球菌(红色圆),分别。在最优参数集的SD范围内,从具有平均LSE的所有参数集中计算均值和SD。(f)生存和灭活协会C.白念珠菌用流式细胞仪测定60 min后的单核细胞和中性粒细胞。使用未配对的双面学生估计了显着性。t试验(*)P < 0.001). (g)在全血感染实验4h产生的血浆中释放单核细胞源性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6),以响应存活和灭活。C.白念珠菌细胞被调查。BAR显示为至少3个独立实验的平均值±SD,来自不同献血者的全血。

为了比较量化免疫细胞的功能特性,我们根据实验数据校准了基于状态的虚拟感染模型(Sbm)。方法“节,表1、图1.1d)。结果转变率的变异系数很小(<7%),三个组合单元的相应动力学与相应实验数据的平均值相似,表明与实验数据很好地吻合(见图)。1(a-c)通过比较结果的转换率值,我们观察到更高的吞噬率。金黄色葡萄球菌比.C.白念珠菌(用于中性粒细胞){N}}/{N}=2.2)带着(P<0.001}),用于单核细胞{}}/{}}=4.2)带着(P<0.001}))。免疫逃逸率(\(Rho)\), (({S.A.}/{{C.A.}=0.7)带着(P<0.001}))。这些参数差异导致了对金黄色葡萄球菌细胞从细胞外间隙和更多的免疫逃避C.白念珠菌感染后240分钟。1(C)。

表1 SBM的转换速率值C.白念珠菌金黄色葡萄球菌健康志愿者或HLM患者在心脏手术前(术前)、术后即刻(术后)和入院后1天(术后1d)的血液样本感染。

根据sbm的估计参数,我们还在基于代理的模型(Abm)中模拟了这两种病原体的感染场景。方法“分段)。与SBM动力学相似,ABM的动力学结果与实验数据一致(见图)。1(a-c)中性粒细胞和单核细胞的扩散系数是中性粒细胞和单核细胞扩散系数的2至4倍。金黄色葡萄球菌感染(({D}{N},{D}{M})=(1500亩){2}/\\matrm{min},1800亩{m}{2}/\matrm{min}\)相比较C.白念珠菌 (左({D}{N},{D}{M}\右)=(700 mU{2}/\matrem{min),450 mU{matrm{2}/matrm{min})。此外,中性粒细胞的扩散系数高于单核细胞。C.白念珠菌感染,反之亦然金黄色葡萄球菌感染(图1.1e)。

心脏手术导致中性粒细胞动员和免疫激活

迄今为止产生的数据清楚地表明,将体内外血液感染和虚拟感染模型结合起来,就可以量化免疫细胞的功能。为了探讨这种方法在临床上的可行性,我们使用了心脏手术患者的血液样本,用于二尖瓣关闭不全(心肺机,HLM)患者。6例(女4例,男2例),年龄52~74岁。所有患者均经体外循环(CPB)侧方开胸术接受微创二尖瓣置换术或重建手术。麻醉采用异丙酚、舒芬太尼、罗库溴铵诱导,苏芬太尼、七氟醚维持麻醉。3例行三尖瓣手术、冷冻消融、心耳关闭术和房间隔缺损修补术。转流时间为99~220 min,术后平均累积液量为3316±2486 ml(见补充表)。沙一病人个人资料)。所有患者均于手术当天拔管,无严重并发症发生。术后唯一的感染是术后两周以上的尿路感染。知情同意后,分别于心脏手术前(术前)、直接手术后(术后)和入院后1天(术后+1d)采血。这些确定的时间点,加上手术时间和体外循环持续时间的低差异,以及时间界定的、强烈和均匀的炎症刺激,使我们能够清楚地区分个体间的差异和炎症的影响。术后血中IL-6、IL-8、MIP-1、α、MIF及抗炎细胞因子IL-10水平升高(图1)。2(A)术前、术后血浆标本中均未检出TNF-α和IL-1β。IL-6和IL-8的升高持续到术后1天.术后白细胞总数平均增加(术前:4.70±1.37×10)。9/L,术后:9.87±2.05×109/L,术后+1D:10.89±2.45×109/L)(图1。2B,见补充表沙一病人个人资料)。白细胞定量分析显示,中性粒细胞(术后和术后+1d)和单核细胞(术后+1d)显著增加,而淋巴细胞计数保持稳定。心脏手术后嗜中性粒细胞增多是由粒细胞集落刺激因子(G-CSF)诱导的骨髓中性粒细胞释放介导的。22。与术前相比,直接和术后1天采集的血浆中G-CSF明显升高(图2)。2a)。此外,术前血的特征是中性粒细胞表达丰富,CD 16表面表达较高(成熟中性粒细胞),术后中性粒细胞亚群CD 10阴性,CD 16减少,L-选择素(CD62L)表达增加,提示未成熟中性粒细胞增多(图1)。3a)。术后CD 10内格中性粒细胞亚群占中性粒细胞总数的49.3±4.1%,1天后基本稳定(46.7±2.6%)。术前、术后各时间点单核细胞计数无明显变化,术后1d单核细胞总数明显增加(术前为0.24±0.16×10)。9/L,术后+1D:0.54±0.21×109/L,P < 0.05) (Fig. 2B,见补充表沙一病人个人资料)。MHCⅡ类抗原HLA-DR在单核细胞上的表达在术后明显降低(图二)。3b)。随着CD62L表达的增加,这表明手术诱导了一种不成熟的单核细胞状态。

图2
figure2

术后血液显示细胞因子谱和外周差异细胞计数的变化。对6例心脏手术前(术前)、术后即刻(术后)和入院后1天(术后+1d)的HLM患者的血样进行分析。a)细胞因子水平(MIP-1α,MIF,IL-8,IL-6,IL-10,G-CSF)b)白细胞(WBC)以及中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞计数使用自动血液学分析仪。白细胞的参考范围用红色表示。除IL-8外,血浆细胞因子浓度均以PG/ml计.术后和术后+1d血中IL-8的水平与每名供者术前血液中的血浆水平(设定为100%)标准化,计算百分比的平均值为±SD。使用未配对的双面学生估计了显着性。t测试并显示为*P < 0.05, ***P < 0.001.

图3
figure3

手术后单核细胞和中性粒细胞表面表型显示,HLM患者血液中未成熟细胞增多。CD66b的流式细胞术分析+中性粒细胞(a)和CD 14+单核细胞(b)心脏手术前(术前)、术后即刻(术后)和入院后1天(术后+1d)的HLM患者全血。(a)CD66b的不成熟表型+用CD 10、CD 16和CD62L的表面表达分析血中性粒细胞。有代表性的斑马图显示,随着群体向右下象限(CD 10和CD 16)和右上象限(CD62L)转移,表面表型发生了变化。(b)手术诱导的CD 14改变+血液单核细胞表现为HLA-DR和CD62L表达模式的斑马图.左图显示适当的栅极设置,由等型控制染色定义。

体外循环期间的促炎刺激减轻了患者间和病原体间免疫反应模式的差异。

为了量化体外循环后全血的功能免疫指标,我们用灭活的方法完成了全血感染。S. 金黄C. 白念珠菌如上文所述。这些分析揭示了先天免疫反应模式的明显变化。C.白念珠菌金黄色葡萄球菌。在术后采集的血液中,病原体与中性粒细胞和单核细胞的关联较术前时间点增加,且发生的速度更快(图1)。4)。例如,感染后10分钟,35.1±8.8%C. 白念珠菌和53.7±7.2%S. 金黄细胞,分别与术前血液中的中性粒细胞有关(图一)。4(a,d),与之相比,为78.5±5.1%。C. 白念珠菌81.1±6.7%金黄色葡萄球菌术后一天。4C,f)。为了检验变化的关联动力学是否可以用白细胞数量的变化或表明功能差异来解释,我们将SBM与关联动力学进行拟合,并以所测免疫细胞计数的方法作为模型模拟的输入。这些分析清楚地表明,手术后更快的结合动力学只能由中性粒细胞和单核细胞吞噬率的显著增加而不仅仅是免疫细胞计数的增加来解释。4g)。重要的是,在健康献血者的血液和手术前采集的样本中可以清楚地看到病原体特异性的反应模式。更具体地说,金黄色葡萄球菌与中性粒细胞和单核细胞的关联比C.白念珠菌手术前采集的血液(图1)。4A,d)。中性粒细胞吞噬率的比较((Pi)_{N})和单核细胞(((菲涅姆))在这两种病原体之间显示出更高的价值金黄色葡萄球菌 ({N}}/{N}=2.4), {}}/{}}=2.7))(图1.4g)。相反,缔合动力学C. 白念珠菌S. 金黄在手术后血液中,中性粒细胞和单核细胞的吞噬率以及相应的吞噬率几乎相似(例如术后+1d):{N}}/{N}=1.1), {}}/{}}=1.2);图1.4g)。

图4
figure4

HLM患者全血标本中病原体与免疫细胞关联的时间过程。分别于心脏手术前(术前)、术后即刻(术后)及入院后1天(术后+1d)采血。时间分辨实验数据(虚线)通过全血感染检测C.白念珠菌 (ac)或金黄色葡萄球菌 (df)。数据点和误差栏指的是6个HLM患者血液样本的均值和SD。将基于状态的模型(SBM,暗色)和基于Agent的模型(ABM,浅色)与实验数据进行拟合,得到了组合单元(固体线)的模拟动力学。SBM结果的厚度表示通过50次模拟得到的SD,并在相应的SD中采样了过渡速率值。ABM结果的厚度表示从30次随机模拟中得到的SD,该模型具有估计的扩散系数。(g)将模型与实验数据拟合得到的SBM的转换速率值。C.白念珠菌金黄色葡萄球菌HLM患者血液标本中的感染。给出了吞噬率的转换率值。(N})中性粒细胞和吞噬率(菲涅姆)单核细胞。(二)h)给出了中性粒细胞的扩散系数。(D){N}单核细胞(D)。均值和SD是从所有参数集中计算的,其均值LSE位于最优参数集的SD内。

此外,我们还观察了术后血液中免疫细胞的迁移情况,并与手术前的时间点进行了比较。在健康供体中,单核细胞和中性粒细胞的扩散系数金黄色葡萄球菌感染超过扩散系数C.白念珠菌感染2到3倍(无花果)。4h,5)。术后血液感染C.白念珠菌导致(D){N}以.因子({D}{N}^{预OP}/{D}{N}^{POP}=3.0)并且增加了(D)以.因子{({D}{M}^{预OP}/{D}{M}^{POP}\约0.7)(无花果。4h,5)。同样,(D){N}减少了一倍({D}{N}^{预OP}/{D}{N}^{POP}=3.5)期间金黄色葡萄球菌感染。与对抗相反C.白念珠菌, (D)没有增加金黄色葡萄球菌-术后感染血液,但略减(无花果)。4h,5).此外,(D){N}手术后两种动物术后1天的时间无明显变化。但是,在.的情况下,(D)我们观察到这两个物种的数量减少了大约1倍。{后OP}/{D}{M}^{后OP+1D}=1.5。比较(D){N}(D)各样品时间点之间的扩散常数均较高。金黄色葡萄球菌相比较C.白念珠菌所有的时间点。与免疫细胞结合率和吞噬率相似,真菌和细菌病原体在中性粒细胞和单核细胞扩散方面的差异在手术后减少(图1)。4h)。

图5
figure5

基于Agent的模型(Abm)与实验数据的拟合结果C.白念珠菌金黄色葡萄球菌采用自适应规则网格搜索方法进行感染。实验数据显示了ABM的参数空间,其中健康献血者和HLM患者术前(术前)、术后即刻(术后)和入院后一天(术后+1d)的血液样本都感染了。C.白念珠菌(左栏)或金黄色葡萄球菌(右栏)。点的颜色指加权最小二乘误差。\(e\左(\过右){p}\右)对于每个参数集\(过右){p}=左({D}{N},{D}{M}\右)。最优参数集用白点标记。所有平均LSE位于最优参数集sd内的参数集都标记为一个黑点。

除了减少对这两种病原体的反应差异外,炎症刺激还减少了病原体与免疫细胞之间的个体差异。例如,与中性粒细胞相互作用的病原体的百分比标准差从32%下降到10%。C. 白念珠菌(无花果)4A,c)和13.5%至8%S. 金黄感染(图1.4D,f)术前和术后1天采集的标本。

结合在一起,免疫反应的动力学后,促进炎症刺激独立于微生物触发。这不仅是由于免疫细胞数量的大量增加,而且也是由于转移率的增加(见图1)。4g)。其结果是,病原体特异性和个体间的差异在手术后不那么明显.

单核细胞活化C.白念珠菌金黄色葡萄球菌体外循环后受潮

我们进一步研究了体外循环手术引起的炎症对感染期间天然免疫细胞激活的影响。通过早期活化抗原CD 69的表面表达和细胞因子的分泌来分析单核细胞在微生物对抗下的活化情况,并在心脏手术后减少。.的存在C. 白念珠菌S. 金黄与相应的模拟治疗样本相比,HLM患者血液中所有三个时间点的单核细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的释放增加(如图1所示)。6a)。然而,在这两种情况下,术后血液中的诱导水平明显降低。C. 白念珠菌S. 金黄感染(C.白念珠菌肿瘤坏死因子-α:术前1456±1248 pg/ml,术后355±428 pg/ml,P=0.068;S. 金黄肿瘤坏死因子-α:术前1730±903pg/ml,术后380±427pg/ml,P < 0.01). The reduced pro-inflammatory cytokine release suggests down-regulation of monocyte activity, which could have been mediated by increased IL-10 levels detected in blood obtained directly after surgery (see Fig. 2a)。两样C. 白念珠菌也不S. 金黄与模拟处理的术后标本相比,感染能进一步诱导IL-10分泌(图1)。6a)。在ICU治疗一天后,血浆IL-10浓度几乎恢复到术前水平,相应地,由于这两种病原体的作用,单核细胞因子的释放再次增加(肿瘤坏死因子-α:C. 白念珠菌1229±1234 pg/ml,S. 金黄1507±852 pg/ml。根据细胞因子数据,接种细胞后4h,单核细胞表面CD 69水平明显升高。C. 白念珠菌(MFI 1276±598)或S. 金黄(MFI 1447±597)与术前血中的模拟感染(MFI 488±298)比较,两者之间无定量差异(图1)。6b)。手术后血液反应不太明显(S. 金黄术后MFI 524±202,术后+1D MFI 580±212)。随着单核细胞因子的减少,这些数据表明术后血液感染后单核细胞刺激减少。对中性粒细胞表面表型的分析显示,在手术前后和ICU一天后采集的模拟感染对照样本中,CD 16和CD66b的表达有显着性差异,这可以用未成熟中性粒细胞的炎症依赖性征集来解释(图一)。6b)。这些中性粒细胞在很大程度上仅限于吞噬细胞。C. 白念珠菌S. 金黄,并对此作出了更强的反应。C. 白念珠菌,CD 69明显增加(术前:模拟感染MFI 141±82,C. 白念珠菌-感染MFI 730±178,S. 金黄-感染MFI 427±211,CD 16下调(术前:模拟感染MFI 7359±2962,C. 白念珠菌-感染MFI 1721±998,S. 金黄-感染MFI 3812±2108)。然而,表面CD 16的下降和脱颗粒标记CD66b对病原体相关中性粒细胞(CD66b)在所有三个感染时间点上的调节是相同的,尽管这两种活化标记物在术前和术后血液中性粒细胞表面的水平是不同的。CD 69表达的比较结果。

图6
figure6

HLM患者手术后全血细胞因子分泌和天然免疫细胞活化的变化。在心脏手术前(术前、非填充棒)、手术后直接采血(术后,浅灰色棒)和入院后一天(术后+1d,深灰色棒)采集HLM患者血样,并进行模拟感染治疗。C.白念珠菌金黄色葡萄球菌4小时a血浆TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平以均值±SD表示.结果以pg/ml表示;N/A表示不可得的数值。(b)流式细胞仪检测单核细胞总数和病原体相关中性粒细胞表面标记的表达。数据显示平均荧光强度(MFI)±SD。意义显示为*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001, unpaired, two-sided Student t测试一下。

体外循环期间炎性刺激增强C.白念珠菌免疫逃逸

尽管白细胞数量和功能变化在数量上有所增加,但仍有一小部分C. 白念珠菌S. 金黄感染4h后,细胞仍未被中性粒细胞或单核细胞吞噬,仍为胞外细胞(见图)。7)。比较不同时间点,观察到两种病原体术后细胞外病原体的百分比降低,反应曲线的斜率在初始阶段增大。特别是接种后60分钟(下午34.5下午17.5%)占总数C. 白念珠菌细胞与术前血液中的免疫细胞无关(见图)。7a)。然而,在即刻(术后)和术后一天采集的血样中,只有(晚上9.9分7.8%)(10.1pm 3.7%) C. 白念珠菌感染后60 min,细胞与免疫细胞无关联。7B,c).虽然这些结果表明,手术后从细胞外间隙清除病原体更有效,但在三种试验条件下,血液中存在病原体特异性差异。在每一种情况下,细胞外细胞的百分比C. 白念珠菌比.金黄色葡萄球菌感染240分钟后(如图所示)。7(a-c)我们的模型预测,在240分钟,这两种病原体的所有细胞外细胞将经历免疫逃逸。({IE}))。有趣的是,尽管术后采集的血液中中性粒细胞数量和中性粒细胞吞噬率增加,但估计获得免疫逃逸的过渡率((Rho))高出两倍C. 白念珠菌在手术后与术前相比,这与S. 金黄,几乎相等(Rho)不同样本时间点的值(图)。7D,表1)。事实上,这导致了(Rho)介于金黄色葡萄球菌C.白念珠菌术后血液感染。当(Rho)值与C. 白念珠菌S. 金黄在手术前的血液中({{S.A.}/{{rho}=0.96)在手术后采集的血样中可以发现更大的差异(术后:{{S.A.}/{{C.A.}=0.48手术后+1d:({S.A.}/{rho}=0.5)).

图7
figure7

HLM患者全血标本细胞外病原体的时间历程观察。抽取血液样本(a)心脏手术前(术前),(b)手术后立即(术后)和(c)入院后1天(术后+1d)。时间分辨实验数据(虚线)通过全血感染检测C.白念珠菌(绿色)或金黄色葡萄球菌(红色)。数据点和误差栏指的是6个HLM患者血液样本的均值和SD。将基于状态的模型(SBM,暗色)和基于Agent的模型(ABM,浅色)与实验数据进行拟合,得到了组合单元(固体线)的模拟动力学。SBM结果的厚度表示通过50次模拟得到的SD,并在相应的SD中采样了过渡速率值。ABM结果的厚度表示从30次随机模拟中得到的SD,该模型具有估计的扩散系数。(d)免疫逃逸的转换率值(Rho)将模型与实验数据进行拟合而得到的SBMC.白念珠菌金黄色葡萄球菌HLM患者血样感染。

讨论

本研究采用系统生物学方法,将实验性全血感染试验与虚拟感染模型相结合,研究免疫激活对全血病原体免疫防御的影响。为了分析处于不平衡状态的患者的免疫反应,我们使用了心脏手术患者的血液样本进行体外循环。外科手术和体外循环可引起全身炎症反应。虽然这种暂时性炎症通常与感染或脓毒症无关,但可导致术后并发症,如器官功能障碍或出血。23。病理生理学上,包括手术创伤、缺血再灌注损伤、内毒素血症和葡萄糖贫血在内的多种触发因素导致了急性时相反应,但并不完全是由NF-κB激活介导的。20,24。尤其是炎症刺激导致补体蛋白C5a过剩,C5a是几种天然免疫细胞(包括中性粒细胞和单核细胞)的重要趋化因子。25,26。C5a分子激活中性粒细胞,诱导中性粒细胞脱颗粒和超氧物生成26,27,28,29,30,31。由于这种促炎刺激,患者在心脏手术后出现白细胞增多,包括从骨髓中动员中性粒细胞。此外,他们的单核细胞表达HLA-DR水平降低,CD62L升高。32。因此,选择性心脏旁路手术患者可较好地研究短暂性炎症反应。

据此,我们观察了手术后白细胞的吸收情况。特别是,由于CD 10的加入,中性粒细胞的数量增加了两倍多。内格不成熟的中性粒细胞。此外,单核细胞在第一天增加,但已显示未成熟的表型,在血液中直接采取了手术。尽管未成熟的中性粒细胞和单核细胞丰度较高,但与术前血样相比,术后病原体与免疫细胞的关联更快,程度更大。通过将基于状态的虚拟感染模型校准为手术前后采集的样本的关联动力学,我们发现这不仅仅是由于免疫细胞数量的增加。相反,中性粒细胞和单核细胞的吞噬率在手术后增加了两倍,表明激活状态增强。这些定量结果表明,通过选择性定量表面活化标记物(如中性粒细胞脱颗粒标记物CD66b)无法检测到免疫细胞活性的增加。尽管有大量未成熟的中性粒细胞对短暂性炎症反应,但这些细胞对真菌吞噬功能的表面CD 16表达与术前血液中成熟中性粒细胞的表达水平相同,CD66b和CD 69的表达水平与成熟中性粒细胞的表达水平相同。未成熟的中性粒细胞含有三种颗粒,可产生活性氧。33,34,指示这些单元格是在特定条件下释放的功能子集。Leliefeld等人的研究.以及van Grinsven等人。应用细菌内毒素诱导健康人急性炎症的实验研究表明,不同的中性粒细胞亚群不仅在表型上存在差异,而且在功能上也存在差异。35,36。未成熟的中性粒细胞在体外具有比成熟的中性粒细胞更高的抗菌能力,并且表现出有效的迁移,这就导致了这样的假设:未成熟的中性粒细胞不是作为旁观者释放,而是作为更有效地杀死病原体的细胞,这与我们在本研究中观察到的免疫细胞活性的增加相一致。此前的其他研究报告称,通过评估免疫细胞特异性活化标记物的表达和细胞因子谱,单核细胞和中性粒细胞的免疫细胞活化程度有所提高。37,38,39。然而,他们没有研究免疫细胞功能在作为刺激的不同病原体的反应中的数量变化。观察到的功能激活也减轻了病原体特异性的免疫激活模式。在炎症性侮辱之前,从健康对照供体的样本中观察到,金黄色葡萄球菌感染引起的免疫反应比C. 白念珠菌感染。相比之下,手术后,病原体间的差异明显减少.

此外,我们还分析了HLM患者手术前后血液中促炎细胞因子和抗炎细胞因子的浓度。有趣的是,促炎细胞因子IL-1β和TNF-α在手术后没有出现在较高水平,而其他细胞因子(如IL-6)则有所增加。此外,抗炎细胞因子IL-10在手术结束时也明显增加,提示抗炎通路激活。这些发现与几项研究一致,这些研究报告称,手术诱导释放的促炎和抗炎介质都是由手术引起的。27,40,41,42,43。在体外感染过程中,单核细胞因子的释放和早期活化抗原CD 69的上调在术后血液中明显降低。与未成熟的单核细胞表型一起,这表明手术后血液中IL-10水平的升高具有调节作用。在手术期间释放的中介分子中,IL-10已经被证明有助于降低HLA-DR在CD 14上的表达。+细胞44。白细胞介素-10(IL-10)水平在1天后下降,导致单核细胞部分恢复HLA-DR,同时分泌细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α。C.白念珠菌金黄色葡萄球菌感染。

与我们以前对全血样本免疫反应的研究结果相似。C.白念珠菌感染16我们观察到一群特定的病原体,这些病原体不能被免疫细胞吞噬,但在感染后4小时仍存在于细胞外空间。因此,这些病原体必须逃避免疫防御。虽然在手术前后的每个时间点,在模拟血液样本中都能检测到逃避病原体,但我们发现逃避的量。C.白念珠菌细胞和金黄色葡萄球菌手术后细胞减少,而这一过程的比率增加C.白念珠菌感染,几乎保持不变金黄色葡萄球菌感染。在先前的研究中,我们研究了C.白念珠菌用数学模型测试潜在的逃逸机制,从而在全血中免疫逃逸。通过模拟中性粒细胞条件下的全血感染,我们可以提出未来的实验测量方法,使我们能够接受或拒绝这两种机制中的一种,即自发逃避或中性粒细胞介导的免疫逃避。45。由于我们观察到更大的逃避率,在手术后,免疫细胞是更活跃的吞噬,我们的研究提供了线索,病原体的逃逸可能依赖于免疫细胞的活动。此外,手术后免疫回避率的变化是描述炎症刺激患者全血中免疫反应变化的另一个特征性特征。

综上所述,我们表明,结合活体血液样本的实验检测和生物医学监测是一种可行的方法,可用于患者的免疫分析。显然,在现阶段,这不能用于诊断目的,需要进一步优化和标准化。然而,在目前的情况下,使用这种方法,我们已经可以揭示控制微生物毒性的重要病理生理学特性,例如在免疫逃逸的情况下。C.白念珠菌.


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