您好,请问有什么可以帮到您的。 点击这里给我发消息
武汉新启迪生物科技有限公司
新启迪-您的生物科研好伙伴!2008-2021
Wuhan Xinqidi Biotech Co.Ltd
本企业通过iso9001质量体系认证

抑癌基因p53对肠2型免疫的调节

 二维码
发表时间:2021-06-08 11:09作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

P53在肿瘤抑制中的作用已经得到广泛的研究和证实。然而,p53在寄生虫感染和肠道2型免疫中的作用尚不清楚。在这里,我们报告说p5 3对于肠道2型免疫系统对寄生虫的感染是至关重要的,例如毛细滴虫巴西圆线虫。机械地说,p53在簇状细胞-IL-25型2型固有淋巴细胞回路的激活中起着关键作用,其部分机制是通过转录调控丛生细胞中的LRMP。LRMP调节Ca2+内流和IL-25释放是2型先天淋巴细胞反应的关键触发因素.因此,我们的结果揭示了p53在调节肠道2型免疫以防止寄生虫感染方面以前未被认识到的功能,突出了p53作为免疫完整性的守护者的作用。

导言

作为基因组的守护者,p5 3在肿瘤抑制中的作用已被公认。1,2。P53是人类肿瘤中最常见的突变基因。P53作为一种转录因子,通过选择性地诱导靶基因的组织和应激反应,调节许多重要的生物学过程,包括细胞周期阻滞、凋亡、衰老等,从而维持基因组的稳定性,从而预防癌症,从而对各种内源性和外源性刺激作出反应。3,4。虽然p53在肿瘤抑制中的关键作用已经被证实,但最近的研究表明,p53调控着其他重要的生物学过程,如生育、干细胞、代谢等。2.

P5 3最初被认为是一种细胞蛋白,与猿猴病毒40(SV 40)的大T抗原相互作用,提示p5 3在抗病毒反应中起着重要作用。5,6。进一步的研究表明,p5 3被病毒感染(包括Epstein-barr病毒、腺病毒和hiv-1)激活,从而诱导细胞凋亡,从而限制病毒复制,消除受感染的细胞。7。这些发现支持p53在抗病毒天然免疫中的作用。此外,一些研究表明p5 3在寄生虫感染中具有潜在的作用。8,9,10,11,12。疟原虫在人类和小鼠中引起疟疾。一项对恶性疟原虫(PF)感染儿童的研究显示,感染前的特征包括p53的激活。P5 3的激活与pf感染后疟疾和寄生虫血症的控制有关,而且p5 3在单核细胞中的表达增强可减轻pf所致的炎症反应。8。另一项研究表明,抑制宿主p5 3对小鼠肝期疟原虫感染至关重要;p5 3水平升高的小鼠肝期寄生虫负担减少,p5 3基因敲除小鼠肝期负担增加。9。血吸虫的寄生扁虫引起血吸虫病。据报道,日本血吸虫可溶性卵抗原可激活肝星状细胞中的p53蛋白,促进其凋亡或衰老。10,11。此外,据报道利什曼原虫利什曼原虫可增加p5 3的表达,并诱导宿主淋巴细胞凋亡。12。虽然研究表明p5 3在免疫学中的作用(回顾,见13),其确切功能和潜在机制尚不清楚。目前还不清楚p53是否在寄生虫感染的情况下调节2型免疫反应。

全世界估计有20亿人受到寄生虫感染,这是一个重大的公共卫生问题。14。当寄生虫感染时,丛状细胞(一种罕见的细胞群(<1%)出现在肠道,感觉到寄生虫并隐匿细胞因子IL-25)。Il-25是一种主要的激活信号,可诱导肠固有层内2型固有淋巴样细胞(Ilc2s)和2型辅助T细胞(Lp)向分泌的2型细胞因子(包括IL-4、IL-5和IL-13)增殖,从而驱动2型免疫应答。15,16,17。反过来,IL-13刺激肠干细胞分化为丛生细胞和杯状细胞,与丛生细胞形成正反馈环,促进粘液分泌,将寄生虫驱逐出肠道。18,19(无花果)1A).

图1:寄生虫感染引起的2型免疫反应在P53−/−老鼠。
figure1

a丛状细胞用来启动对寄生虫感染的2型免疫的信号通路的原理图。bk p53+/+P53−/−小鼠感染毛细滴虫 (TM)口服灌胃(P.O)在21点做了检查。bf或与巴西圆线虫 ()皮下(S.c)注射检查于5d.流式细胞仪和7D.P.I。其他化验gk. bg采用Dclk 1-IHC染色法对感染小鼠和纯种小鼠小肠中的簇状细胞进行扩增。左:有代表性的图片。右图:绒毛毛细胞数的量化。ch采用阿西恩蓝染色法检测感染小鼠和天真小鼠小肠杯状细胞增生。左:有代表性的图片。右:酒杯面积的量化。di固有层嗜酸性粒细胞和白细胞介素2的流式细胞术分析。流式细胞术门控策略和有代表性的图像如图S所示11. ej采用实时定量聚合酶链反应(β-actin)方法测定感染小鼠和单纯感染小鼠小肠中IL-13的相对mRNA水平。f TM盲肠的号码是21。在……里面p53+/+P53−/−老鼠。k粪便中的卵子数和肠道中的蠕虫负担。在……里面p53+/+P53−/−老鼠。为be, gj,回肠和十二指肠组织从TM-感染和-感染小鼠,分别进行分析。bk数据为平均值±扫描电镜。每个点代表一个单独的鼠标。n=5-7/组。为bg计数≥30只/鼠。为ch、≥50杯状细胞/小鼠。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; NS: non-significant, two-tailed Student’s t-测试。

在此,我们发现p5 3是肠道2型免疫系统对寄生虫感染所必需的,P5 3缺乏症会导致肠道2型天然免疫受损,从而导致原生动物和蠕虫寄生虫的感染。机械地说,p53转录上调LRMP,LRMP是以前未被识别的p53靶基因。LRMP在确保肠道丛生细胞对寄生虫感染的应答中触发第2型免疫反应中起着重要的作用。本研究揭示了p53在寄生虫感染背景下天然免疫中的重要作用。

结果

P53缺乏症损害寄生虫诱导的2型免疫应答

为了研究p53是否调节对寄生虫感染的2型免疫反应,p53+/+P53−/−小鼠感染了一种非致病性原生动物。毛细滴虫 (TM)(图1.斯1A)通过口头灌胃。本文分析了感染后21d感染小鼠肠道内2型免疫反应的特点,即肠绒毛和杯状细胞的增生情况。用免疫组织化学(IHC)方法检测成簇细胞Dclk 1的表达,Dclk 1是一种细胞标记物。20,用阿西恩蓝染色法检测杯状细胞。21分别。TM感染可明显引起小肠内簇状细胞和杯状细胞的增生。p53+/+老鼠,它被明显地削弱了P53−/−老鼠(图1.1B,c). TM感染还可导致ILC2s的激活和扩展,后者是第2型免疫应答的另一个特征。p53+/+用流式细胞仪测定小鼠。1D)。此外,在Lp中观察到嗜酸性粒细胞。TM-感染p53+/+用流式细胞术和H&E染色分别测定小鼠。1D、图1.斯1B)。相比较p53+/+小鼠白细胞介素2(ILC 2)数量增加不明显,嗜酸性粒细胞(EOS)在小鼠Lp中的表达非常有限。TM-感染P53−/−老鼠(图1.1D、图1.斯1B)。ILC2s是IL-13强有力的肠道来源。22,23。相比较p53+/+小鼠肠道组织中IL-13 mRNA表达水平显著升高(P<0.0 5)。TM-感染p53+/+用实时定量PCR法测定小鼠。1E)。值得注意的是,与p53+/+小鼠肠道组织中IL-13 mRNA水平的增加在TM-感染P53−/−老鼠(图1.1E)。此外,TM感染可显著提高血清中另一种2型细胞因子IL-4的水平。TM-感染p53+/+小鼠用ELISA法测定。斯1C)。相比较p53+/+小鼠,血清IL-4水平的升高在TM-感染P53−/−老鼠。值得注意的是,P53−/−小鼠有明显的高水平TM盲肠的负担p53+/+老鼠在21点。(无花果)1F)。此外,未受感染的人p53+/+P53−/−小鼠肠道中的绒毛和杯状细胞、嗜酸性粒细胞、白细胞介素2和白细胞介素13水平相当,血清白细胞介素4水平也相当(图一)。1B-e、图1.斯1B,c).

TM是一种非致病性原生动物,是微生物的稳定成分。在这里,我们进一步研究了p5 3是否调节2型免疫反应对感染的影响。巴西圆线虫 (),一种致病性蠕虫。斯1D). 诱导强烈的2型免疫反应,清除肠道蠕虫7-10 d.p.i。17。观察到小肠绒毛和杯状细胞明显增生。-感染p53+/+老鼠在7d.p.,这是显着地变钝在-感染P53−/−老鼠(图1.1g,h)。Lp和肠系膜淋巴结(MLN)中嗜酸性粒细胞和白细胞介素2(ILC2s)的数量显著增加(图1)。1I、图1.斯1E,f),IL-13和IL-4水平显著升高(图二)。1J、图1.斯1g)被观察到-感染p53+/+老鼠比P53−/−老鼠。值得注意的是,-感染P53−/−小鼠驱逐能力受损; P53−/−与肠道相比,小鼠粪便中的卵子数明显增多,肠道中的蠕虫负担也显著增加。p53+/+老鼠在7点。(无花果)1K)。这些结果表明,P53是第2型天然免疫反应所必需的,以保护小鼠免受原虫和蠕虫寄生虫的感染。

P53缺乏症对琥珀酸盐诱导的2型免疫应答的影响

最近的研究表明,微生物代谢物琥珀酸酯分泌的。TM是肠丛状细胞的活化配体24,25。琥珀酸受体(SUCNR 1)是在肠丛状细胞中特异表达的,它检测琥珀酸盐,并导致丛集-ILC 2回路的激活。24。据报道,饮用水中的琥珀酸盐可引起肠丛状细胞和杯状细胞增生、嗜酸性粒细胞增多以及小肠中ILC 2数量的增加。24,25。事实上,在饮用水中提供琥珀酸盐会引起肠道2型免疫反应。p53+/+小鼠;琥珀酸盐诱导的簇状细胞和杯状细胞增生,引起嗜酸性粒细胞增多,白细胞介素2增多,白细胞介素13和白细胞介素4水平升高。p53+/+老鼠(图1.2A-C、图1.斯2)。值得注意的是,p53的丢失严重损害了琥珀酸盐引起的肠道2型免疫反应(图1)。2A-C、图1.斯2)。与琥珀酸酯相比p53+/+琥珀酸盐处理小鼠,小鼠丛生细胞和杯状细胞增生,白细胞介素2(ILC 2)数量增加,嗜酸性粒细胞增多(P<0.05)。P53−/−老鼠(图1.2A,b、图1.斯2A,b)。此外,琥珀酸治疗对白细胞介素-13和白细胞介素-4水平无明显影响。P53−/−老鼠(图1.2C、图1.斯2C)。这些结果进一步证实了p5 3是肠2型天然免疫所必需的。

图2:p53缺乏症损害丛状细胞的功能,触发2型免疫。
figure2

ac p53+/+P53−/−小鼠在分析前给予含或不含150 mm琥珀酸盐(SC)的饮水7天。a。分别用Dclk 1 IHC染色和AlcianBlue染色法测定小鼠小肠中成群(左)和杯状细胞(右)的数量。b流式细胞术测定Lp中嗜酸性粒细胞和白细胞介素2的含量。c小肠IL-13的相对mRNA水平。在……里面c, D,g,用实时定量聚合酶链反应(β-actin)检测mRNA水平.d感染小鼠肠上皮细胞IL-25的相对mRNA水平TM,小鼠用琥珀酸处理。eg p53+/+P53−/−用rl-25(0.5g/d)处理小鼠;I.p)或PBS分析前7天。e小肠绒毛(左)和杯状细胞(右)的定量。fLp中嗜酸性粒细胞和白细胞介素2的定量。g小肠IL-13的相对mRNA水平。hRIL-13诱导小鼠丛生细胞增殖p53+/+P53−/−肠道器官也有类似的程度。肠器官p53+/+P53−/−用rl-13(10 ng/ml)或PBS处理小鼠,用Dclk 1的IF染色法检测细胞。左:有代表性的图片。右:成群细胞数量。为ah,数据为平均±扫描电镜。为ag,每个点代表一个单独的鼠标。n=5-8/组。为h,每个点表示一个图像字段。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; NS: non-significant, two-tailed Student’s t-测试。

P53缺乏症损害丛生细胞释放IL-25的功能

针对寄生虫感染,丛生细胞释放IL-25,引发2型免疫。15,16,17。在这里,我们调查了对寄生虫感染的2型免疫反应是否受损。P53−/−小鼠是由于丛生细胞功能受损所致。感染TM或琥珀酸盐治疗可使肠上皮中IL-25水平升高。p53+/+老鼠比.P53−/−老鼠(图1.二维空间、图1.斯3A)。此外,用重组白细胞介素25(rl-25)模拟簇状细胞释放白细胞介素-25(IL-25),检测了rl-25对小鼠2型免疫反应的影响。p53+/+P53−/−老鼠。服用rl-25(I.p,0.5g/d/d)对小鼠诱导的簇状细胞和杯状细胞增生,增加嗜酸性粒细胞和白细胞介素2的数量,升高IL-13和IL-4的水平。p53+/+P53−/−老鼠(图1.2e-g、图1.斯3B-d),提示p5 3缺失对寄生虫感染可使丛生细胞功能受损,rIL-25可使之恢复。IL-25促进ILC2s的扩增,ILC2s是IL-13的关键来源,IL-13是一种主要的2型细胞因子,在簇状细胞增生中起着关键作用。18,19。在这里,我们比较了IL-13驱动的簇状细胞增生p53+/+P53−/−重组IL-13(rIL-13)对肠类细胞器进行治疗,从而重建所有肠上皮细胞类型的肠类细胞器。RIL-13诱导小鼠丛生细胞增殖的实验研究p53+/+P53−/−肠道器官的相似程度(图一)。2H)。总的来说,这些数据表明,丛状细胞需要p53才能在寄生虫感染的情况下触发第2型免疫;p53的丢失会损害对寄生虫感染和琥珀酸治疗的第2型免疫,这种免疫可以通过在小鼠体内注射rl-25来恢复。

LRMP是p5 3靶基因在丛生细胞中的高表达

P5 3作为一种转录因子,主要通过与靶基因调控区的p5 3结合而发挥其功能。3,4。在此,我们研究了p53是否通过对其目标基因(S)在丛生细胞中的转录调控来调节丛生细胞-ILC 2轴中的丛生细胞功能。P53mh算法是一个通过识别基因中可能的p5 3结合元件,为全基因组扫描潜在的p5 3靶标而开发的计算程序。26,它已经成功地识别了许多p5 3靶基因。27,28。本文利用p53mh对小鼠小肠上皮单细胞rna(ScRNA)表达数据集(Gse 92332)定义的100多个团簇细胞标志基因进行分析,以寻找p53mh在肠丛状细胞中表达的潜在的p5 3靶基因。29。这个LRMP该基因是一种潜在的p53靶基因,在小鼠第1内含子中有两个可能的p5 3结合元件。LRMP基因(图1.3A)。有趣的是,先前的一份使用隐变量动态建模(HVDM)方法的报告也预测LRMP是一个可能的p53目标基因。30。对含有温度敏感突变型p53载体的小鼠Val5成纤维细胞进行染色质免疫共沉淀(芯片)试验,在32℃表达野生型p53蛋白,37°C表达失功能突变型p53蛋白。LRMP只有在32°C处表达WT p53蛋白时,才能观察到具有抗p53抗体的基因,说明WT p53在体内与这两个潜在的p53结合元件结合。3B)。此外,含有这两个潜在的p53结合元件的pGL 2荧光素酶报告载体显示了p5 3依赖的转录激活。p53-空MEFs共转染WT,p53或对照载体。3C)。值得注意的是,32°C培养细胞可诱导Val5细胞表达WT p53蛋白。LRMP在Val5细胞中表达,而在10(1)个细胞中不表达,p53-Val5的无效亲本细胞(图5)。三维空间)。此外,LRMPMRNA水平显著升高。p53+/+MEF比P53−/−表明p5 3对基底细胞有显著影响。LRMP转录水平(图1.三维空间)。这些数据表明LRMP是p5 3的靶基因,p5 3对p5 3的基础转录和诱导转录均有调节作用。LRMP.

图3:LRMP是一种在丛生细胞中高表达的p53靶基因。
figure3

aP53结合元件LRMPP53MH程序预测的基因。提出了一种一致的p53结合元件。PU,嘌呤;Py,锥体;N,任何核苷酸。bP5 3与p5 3结合的两个元件LRMP由芯片分析确定。cP53异位表达激活p53结合元件LRMP用荧光素酶报告法测定P53−/−MEFs。dP53转录上调LRMP表情。用实时定量聚合酶链反应(β-actin)检测mRNA水平.e LRMP通过分析scRNA-seq数据集(GSE 92332)在小鼠肠上皮细胞中的表达。f肠类细胞器IF染色检测LRMP和Dclk 1在丛生细胞中的共定位。g LRMPMRNA和蛋白水平p53+/+, P53−/−LRMP−/−荧光定量PCR法和Westernblot法分别检测簇状细胞。为b, c, d,和g,数据以平均值±SD表示。**p < 0.01; ***p < 0.001, two-tailed Student’s t-测试。无法察觉。

LRMP在肠丛状细胞中高表达。小鼠小肠上皮scRNA表达数据挖掘(GSE 92332)29显示LRMP在1522个上皮细胞中,用全长scRNA-seq检测到116个细胞表达。3E)。值得注意的是,87%的LRMP-表达细胞为丛生细胞(n=101),占此数据集中排序的丛生细胞的99%(102个细胞中的101个)。平均LRMP这些簇状细胞的表达水平(2100±1188)比其余15个细胞高出5~100倍。LRMP-非丛生细胞(14±19),n=3;在Paneth细胞中为20±23,n在干细胞中=8;22±29,n=2;杯状细胞411±555,n=2)(图2。3E)。Dclk 1是一种成熟的丛生细胞标记。20。免疫荧光染色显示LRMP在Dclk 1阳性上皮细胞中有特异性表达。3F),证实LRMP在丛生细胞中有高水平的特异性表达。Dclk 1染色阳性率为98.3%(299个细胞中有294个细胞),而溶菌酶染色阳性的Paneth细胞(400个细胞中有0个细胞)未见明显的LRMP染色。斯4A)。众所周知,分选EpCAM可以丰富丛生细胞。+西格莱克+肠道单细胞悬液16。EPCAM法分析富集簇细胞中LRMP的表达+西格莱克+从肠道单细胞悬液中可以看出,p53+/+丛生细胞表现出更高的LRMP水平(如图所示)。第三代)但与Dclk 1相比较,Dclk 1的水平与P53−/−丛生细胞斯4B)。肠类细胞器的IF染色显示LRMP的平均荧光强度(MFI)明显升高。p53+/+丛生细胞P53−/−丛生细胞斯4C). TM感染,以及琥珀酸盐治疗,通过Dclk 1和p53在肠道组织中的共染色,可以提高成群细胞中p53蛋白的水平(如图所示)。斯4D)。此外,经γ照射后,p5 3可诱导肠上皮中p2 1和mdm 2的表达,而p2 1和mdm 2的表达在小鼠肠上皮细胞中未见明显升高,但对p2 1和mdm 2的表达无明显影响。TM由IF染色确定的感染或琥珀酸治疗(如图所示)。斯4E)。综上所述,这些结果表明p5 3选择性地上调了LRMP转录以维持其在丛生细胞中的高表达,p53的缺失降低了簇细胞中LRMP的水平。

LRMP与ITPR 2相互作用并调节Ca2+细胞通量

肠丛状细胞编码一种化学感应途径,这是以前在味觉传导方面的特征。31。肠丛状细胞的化学感应调节团簇-ILC 2回路24,25,32。表面表达的G蛋白偶联味觉受体被配体激活,激活β2,产生第二信使肌醇1,4,5-三磷酸(IP3),它与内质网中的受体ITPR 2结合,触发Ca。2+从急诊室释放(如图所示)。1A)32。ITPR 2是IP3受体家族的主要受体,表达于肠丛状细胞中。32。胞内钙升高2+水平打开瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员5(Trpm 5),这导致IL-25释放从丛状细胞,以调节肠道2型免疫反应(图1)。1A)32。LRMP是一种跨膜蛋白,定位于细胞内ER的细胞质表面。33。为了阐明LRMP在肿瘤-ILC 2回路中的作用,我们采用抗国旗抗体共沉淀(co-IP)和色谱-串联质谱(LC-MS/MS)相结合的方法,寻找具有异位LRMP-标志表达的MEF中潜在的LRMP-相互作用蛋白。3种IP3Rs,包括ITPR 1、ITPR 2和ITPR 3,被KEGG图谱分析为潜在的LRMP结合蛋白。4A,b)。应用scRNA-seq数据集(GSE 92332)分析肠丛状细胞中IP3Rs的表达水平29证实ITPR 2是主要的IP3R在肠丛状细胞中的表达(图一)。斯5)。因此,分别将表达LRMP-标志和ITPR 2-HA的载体转染MEFs后,分别用抗国旗抗体进行共IP,然后分别进行LC-MS/MS和Westernblot检测。两种试验均观察到LRMP-ITPR 2相互作用。4B,c)。为确定LRMP与ITPR 2相互作用所需的区域,分别将表达LRMP-FLAG和WT ITPR2-HA缺失突变体的载体共转染人H 1299细胞进行共IP分析(图1)。4D)。以H 1299细胞为载体进行高效转染。我们发现,含有线圈结构域(AA 264-291)的中间区域(AA 200-340)是LRMP与ITPR 2结合的必要条件;ITPR 2与全长LRMP(FL-LRMP)和含有中间区域的LRMP片段(AA 200-340)相互作用,但不需要无中间区的片段(ΔM)(图1)。4D)。LRMP与ITPR 2在WT小肠组织中的直接相互作用通过近距离连接试验(PLAs)得到进一步证实,该方法广泛用于检测体内直接蛋白质相互作用。34LRMP-ITPR 2相互作用在wt中的簇状细胞(通过dclk 1的if染色确定)中被观察到,而不是在wt中。LRMP−/−小肠组织4E)。ITPR 2在钙调节中的关键作用2+通量,通过对lrmp-ITPR 2相互作用的观察,提出了lrmp调节Ca的可能性。2+细胞内的通量。LRMP基因敲除(LRMP−/−)通过杂交LRMP产生小鼠。Tm1a(EUCOMM)WTSI/wtsioulu小鼠(EUCOMM)与E2A-CRE小鼠,CRE在生殖细胞系中表达。35,并与C57BL6/J回交至少5代。斯6A-c). LRMP−/−小鼠存活,无明显异常。LRMP在肠丛状细胞的mRNA和蛋白水平上均有表达缺陷(图一)。第三代、图1.斯4F). LRMP−/−用WT MEFs法测定钙。2+钙诱导的ER释放2+离子载体离子霉素,它需要IP3Rs的正常功能。36。胞内钙2+用时间推移共聚焦显微镜用Fluo-4AM测量内流.放线菌素处理显著增加了WT MEFs中氟-4 AM的相对强度,这一效应在wt MEFs中显著降低。LRMP−/−MEFs(图1.4F-h、图1.斯7)。值得注意的是,受损的离子霉素诱导的钙。2+流入LRMP−/−MEFs在很大程度上是通过FL-LRMP在MEFs中的异位表达而获救的(如图所示)。4F-h、图1.斯7)。此外,与p53+/+离子霉素诱导的钙2+大量流入P53−/−MEFs表达的LRMP水平要低得多(如图所示)。4F-h、图1.斯7)。人FL-LRMP的异位表达P53−/−MEFs明显增强离子霉素诱导的钙2+内流,但对离子霉素诱导的钙的影响要小得多。2+流入p53+/+MEFs(图1.4F-h、图1.斯7)。相反,不与ITPR 2相互作用的ΔM-lrmp的异位表达对离子霉素诱导的钙无明显影响。2+流入p53+/+,p53−/−,或LRMP−/−MEFs(图1.4F-h、图1.斯7)。综上所述,这些结果表明p5 3可以确保Ca。2+通过上调LRMP水平在丛生细胞中的通量。

图4:LRMP与ITPR 2相互作用并调节Ca2+细胞内的通量。
figure4

abLRMP与包括ITPR 2在内的IP3R蛋白相互作用,由共同IP和LC-MS/MS测定。aLRMP-在KEGG“化学感应通路”中定位的相互作用蛋白(带红色标签)。b联合IP法检测LRMP和IP3Rs计数,然后用LC-MS/MS法检测MEF中的LRMP和IP3Rs。c转染表达LRMP-标志和ITPR2-HA载体的MEF中,共ip试验和Westernblot检测证实了LRMP-ITPR 2相互作用。d分别转染表达不同LRMP标记片段的H 1299细胞和ITPR2-HA载体,用共IP法检测LRMP与ITPR 2的结合区,并进行Western blot分析。上面板:表示LRMP-旗的全长(FL)或序列缺失突变体的载体的示意图表示.eLrmp-IPTR2相互作用用聚乳酸测定法在WT和LRMP−/−小肠组织。红色:解放军信号的LRMP-ITPR 2相互作用;绿色:Dclk 1;DAPI:核。fh2+对离子霉素(2M)在WT中的作用,P53−/−LRMP−/−有或不转染FL-或ΔM-LRMP-旗帜载体的MEFs.f钙的平均痕迹2+答复。gCa的相对荧光2+高峰时刻(48秒)。h有代表性的荧光图像。计算了离子霉素处理前荧光强度为1。f,每条曲线平均代表至少90个细胞。每个单元的曲线如图S所示7. ***p < 0.001; **p < 0.01; NS: non-significant, two-tailed Student’s t-测试。

肠道2型免疫反应受损LRMP−/−小鼠

我们进一步研究了LRMP是否介导p53在肠道丛状细胞-IL-25-ILC2回路激活中的作用。与它们的wt小分子相比,肠丛状细胞-IL-25-ILC2通路的激活受到严重损害。LRMP−/−小鼠感染TM。在WT小鼠中观察到小肠绒毛和杯状细胞的增生,但在感染的小鼠中未见或明显减轻。LRMP−/−老鼠(图1.5A,b、图1.斯8a,b)。在wt感染小鼠中,嗜酸粒细胞和白细胞介素2数量明显增加,IL-13和IL-4水平明显升高,但在感染小鼠中未观察到或不明显。LRMP−/−老鼠(图1.5C-E、图1.斯8C-e)。此外,小鼠LRMP缺乏导致驱逐能力明显受损。从肠子里;LRMP−/−7 d时,小鼠粪便中的卵数和肠道中的蠕虫负担均显著高于WT小鼠。(无花果)5F).

图5:由寄生虫感染和琥珀酸盐引起的肠道2型免疫反应LRMP−/−老鼠。
figure5

afWT和LRMP−/−小鼠感染TM在21点做了检查。(为TM)和5或7 d.p.(为)分别。ab丛数(a)和高脚杯(b)Dclk 1和AlcianBlue染色的IHC染色法检测小鼠小肠中的细胞。cd嗜酸性粒细胞的定量(c)和国际法委员会2s(d)在Lp中用流式细胞术进行分析。e实时定量PCR法检测小肠IL-13 mRNA水平。f粪便(左)蛋数和肠道蠕虫负担(右)-受感染的老鼠。gi琥珀酸钠(150 mm,7天)致2型免疫反应受损Lmrp−/−老鼠。g小肠绒毛和杯状细胞的定量。hLp中嗜酸性粒细胞和ILC-2s的定量。i小肠相对IL-13 mRNA水平。数据为平均值±扫描电镜。每个点代表一个单独的鼠标。n=5-8/组。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; NS: non-significant, two-tailed Student’s t-测试。

我们进一步研究了2型免疫应答对琥珀酸盐治疗的影响。LRMP−/−老鼠。LRMP−/−小鼠对琥珀酸盐治疗表现出2型免疫反应受损;与WT小鼠相比,琥珀酸盐对小鼠簇状细胞和杯状细胞增生的促进作用较弱,增加了嗜酸性粒细胞和白细胞介素2的数量,诱导了IL-13和IL-4在小鼠体内的表达。LRMP−/−老鼠(图1.5G-I、图1.斯9A-c)。这些结果表明,小鼠LRMP缺乏对原生动物和蠕虫寄生虫感染的2型免疫应答和琥珀酸盐治疗均有明显的抑制作用。

重组白细胞介素-25拯救2型免疫应答LRMP−/−P53−/−小鼠

2+通量对于细胞因子IL-25从丛生细胞释放而触发2型免疫反应至关重要。32。LRMP在钙调节中的重要作用2+我们检测了细胞内白细胞介素-25的水平LRMP−/−小鼠对寄生虫感染和琥珀酸盐治疗的反应。与WT小鼠比较,TM或琥珀酸盐治疗导致肠上皮细胞IL-25水平明显升高。LRMP−/−老鼠,类似于P53−/−老鼠(图1.6A、图1.斯10A)。目的探讨毛细胞对寄生虫感染产生的白细胞介素-25(IL-25)释放受损是否导致2型免疫应答受损。LRMP−/−小鼠,2型免疫反应检测LRMP−/−小鼠给予rl-25。有趣的是,rl-25治疗(I.p,0.5g/d,7天)有效诱导2型免疫应答LRMP−/−小鼠与WT小鼠相似,包括簇状细胞和杯状细胞增生,嗜酸性粒细胞、白细胞介素2(IL-13)和白细胞介素-4(IL-4)水平增加。6B-d、图1.斯10b-d)。与这些结果相一致的是,rl-13处理在wt和wt中诱导了类似程度的丛生细胞增殖。LRMP−/−有机化合物(图1.斯10E).

图6:rl-25给药恢复2型免疫应答。LRMP−/−老鼠与拯救受损的驱逐能力在……里面P53−/−LRMP−/−老鼠。
figure6

a感染小鼠肠上皮细胞IL-25mRNA水平的研究TM和琥珀酸处理的小鼠。bd用rl-25恢复小鼠2型免疫应答LRMP−/−老鼠。块状细胞和杯状细胞的扩张(b)、嗜酸性粒细胞和白细胞介素2(c),以及相对的IL-13 mRNA水平(d给药后测定rl-25(0.5g/d);I.p)7天LRMP+/+LRMP−/−老鼠。eRl-25晋升清除P53−/−LRMP−/−老鼠。小鼠感染第0天给予rl-25,每2天一次。鸡蛋计数(左)和肠道蠕虫负担(右)在7d.fP53-LRMP信号在肠道2型免疫中对寄生虫感染作用的示意图。数据为平均值±扫描电镜。每个点代表一个鼠标。n=5-8/组。*p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; NS: non-significant, two-tailed Student’s t-测试。

我们进一步研究rl-25治疗是否能挽救受损的驱逐能力。在……里面P53−/−LRMP−/−老鼠。小鼠感染注射rl-25(I.p.每2天一次0.5微克,为期7天)7 d时测定粪便卵数和肠道蠕虫负担。Rl-25治疗极大地提高了小鼠的抵抗力。感染,并在很大程度上挽救了受损的驱逐能力在……里面P53−/−LRMP−/−小鼠;p53+/+, P53−/−,和LRMP−/−用rl-25处理的小鼠在7 dp.i时,粪便中的卵子数和肠道中的蠕虫负担的水平相似。(无花果)6E)。这些数据表明,p53靶基因LRMP对团簇细胞对原生动物和蠕虫寄生虫的感染起重要作用,并触发肠道2型免疫,提示LRMP是p53在寄生虫感染中调节2型免疫的重要介质(图1)。6f).

讨论

1979年,p53被发现是与SV 40病毒癌蛋白SV 40大T抗原结合的一种细胞蛋白。5,6。此后,对p53的广泛研究明确确立了p53在肿瘤抑制中的核心作用。P53的缺失常常是许多人类肿瘤发生和发展的先决条件。2,3,37,38。P5 3基因是人类癌症中最常见的突变基因;大约50%的人类癌症中含有一种突变。p53基因。P5 3感知多种应激相关刺激,选择性地调节其靶基因的转录,以细胞、组织和应激类型特异性的方式诱导不同的生物学结果,包括凋亡、细胞周期阻滞、衰老、dna修复、细胞代谢和抗氧化防御,以维护基因组的完整性。2,3,39.

虽然对p53的研究大多集中在肿瘤生物学上,但越来越多的证据表明p53参与了免疫功能。针对多种不同病毒的感染,p5 3被激活,进而杀死病毒感染的细胞,限制病毒复制,这表明p5 3在对病毒感染的先天免疫反应中起着重要作用。7。因此,p5 3可以被许多病毒灭活,以防止宿主细胞介导的凋亡,并允许病毒的复制,这一点也就不足为奇了。40,41。P5 3可诱导Toll样受体(tLR 3、tLR 9)部分成员的转录。42,43。TLRs识别病原体相关和损伤相关的分子模式,促进蛋白激酶级联,诱导炎症细胞因子和干扰素的表达。P53诱导的这些TLRs的表达增加可引起激动剂诱导的凋亡细胞死亡。42,43。P53还通过调节细胞衰老来连接天然免疫。细胞衰老是在应激和受损细胞中诱导的一种防止受损细胞增殖和维持组织完整性的策略。44。P53是衰老的重要诱因。45。衰老除了能阻止细胞生长外,还会引发一系列趋化因子和细胞因子的产生和分泌,从而吸引自然杀伤(NK)细胞、CD-8杀伤T细胞和单核/巨噬细胞来杀死衰老细胞,清除细胞碎片,即衰老相关分泌表型(Ssp)。44。虽然我们开始了解p53与免疫系统之间的联系,但p53在不同条件下的免疫应答中的确切作用尚不清楚。

本研究揭示了p53在调节肠道2型天然免疫反应以防止原生动物和蠕虫寄生虫感染方面以前未被认识到的一种功能。我们发现p53对肠道丛生细胞在寄生虫感染中触发2型免疫的功能至关重要。丛状细胞是一种上皮系,具有典型的瓶状和顶端微绒毛形态,使用味觉受体信号级联的关键成分。46。自从最近的报道揭示了肠丛状细胞在感知寄生虫和诱导2型免疫反应以保护宿主免受寄生虫感染方面的关键作用,它们的功能在50多年前一直不清楚。15,16,17。肠道丛生细胞可以通过代谢和味觉激活的GPCRs来感知寄生虫感染.例如,SUCNR 1可以感知由TM一些寄生虫和味觉激活的gpcr可以感觉到旋毛虫,蠕虫寄生虫24,32。配体与GPCRs的结合可诱导三聚体G蛋白复合物释放Gα蛋白,进而激活β2介导的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP 2)裂解为IP3。IP3与ER上的IP3Rs结合释放胞内钙2+储存在胞浆中,反过来触发Trpm 5介导的IL-25释放.Il-25是一种确定细胞因子的簇细胞系。15,16,17。簇状细胞释放的il-25通过激活ILC2s引发2型炎症;IL 2的缺失在很大程度上取消了IL-25介导的2型免疫和抗蠕虫反应。17。我们发现P53−/−小鼠表现出释放白细胞介素-25的能力受损TM或者琥珀酸盐治疗。值得注意的是,给rl-25治疗2型免疫反应受损。P53−/−提示p5 3在肠道丛生细胞对寄生虫感染的反应中启动2型免疫反应中起着重要的作用。

我们发现p53对丛生细胞功能的调节是由LRMP介导的,LRMP是以前未被发现的p53靶基因。通过对小鼠肠上皮细胞scRNA表达数据的分析,采用IF染色方法对不同类型肠上皮细胞共染LRMP,发现LRMP在肠丛状细胞中有特异性表达。这个LRMP基因编码1型跨膜蛋白,定位于ER膜。33。LRMP的生物学功能尚不清楚,尤其是其在2型免疫应答中的作用。在本研究中,我们发现LRMP与IP3Rs相互作用,其中ITPR 2是肠道细胞中主要的IP3R。此外,LRMP确保Ca2+细胞内的通量,这是至关重要的丛状细胞-IL-25-ILC 2回路激活对寄生虫感染的反应。LRMP−/−小鼠对寄生虫感染表现出受损的2型天然免疫反应,rl-25可以挽救。我们进一步发现p53转录调控LRMP的表达。P53可确保LRMP在肠丛状细胞中的高表达。值得注意的是,作为对感染的反应TM无论是琥珀酸盐治疗,P53蛋白水平在肠团簇细胞中升高,p53选择性调节LRMP的表达,而不是其他我们检测到的经典的p53靶点,包括p21和MDM 2。我们不能排除p5 3对p21和mdm 2有微弱上调的可能性。TM感染或琥珀酸治疗不能检测到的IF染色。未来还需要进一步的研究,以了解p53是如何在寄生虫感染的反应中被调控的,以及p53如何选择性地调节LRMP在肠道丛生细胞中的表达。值得注意的是,我们发现p53缺乏症损害了钙。2+细胞内的通量,可以通过恢复LRMP的表达来挽救。此外,肠道2型免疫反应受损TM或琥珀酸盐治疗观察到LRMP−/−老鼠。我们注意到与P53−/−小鼠的某些上皮表型,尤其是丛生细胞的增殖,以及某些细胞因子的产生,特别是白细胞介素-13(IL-13)的增加,在小鼠中有较严重的损害。LRMP−/−小鼠对感染的反应TM或者琥珀酸盐治疗。这些差异可能是由于p53缺乏症降低了LRMP在丛生细胞中的表达,但并不导致LRMP的完全丢失。LRMP−/−老鼠。同样值得注意的是TM感染P53−/−小鼠仅轻度升高ILC 2水平,IL-13水平显著升高。有充分的文献证明ILC2s是IL-13的一个强有力的肠道来源。据报道,除白细胞介素2外,白细胞介素13还可由Th2细胞、粒细胞和单核/巨噬细胞分泌。47,48。目前尚不清楚IL-13水平的显著升高是否是由较小数量的ILC 2对其作出反应而分泌的。TM感染或其他类型的细胞感染。未来还需要进一步的研究,以确定这些小鼠白细胞介素-13的来源。综上所述,本研究结果提示p5 3对2型免疫功能有调节作用,p5 3对LRMP有转录调节作用,从而保证细胞内钙的含量。2+树丛细胞的通量和IL-25的释放是一个重要的基础机制.此前的一项研究报道,LRMP在小鼠味觉组织中表达,特别是在表达味觉受体的细胞中,有趣的是,LRMP与这些细胞中的另一种IP3R ITPR 3有关。49。我们发现LRMP调节Ca2+通量增加了LRMP在味觉细胞味觉信号转导中发挥重要作用的可能性。

综上所述,本研究揭示了p53在确保肠道2型天然免疫反应中的作用,这对于快速有效地抵抗寄生虫感染是非常重要的。鉴于2型先天免疫在气道上皮修复、伤口愈合、代谢稳态和过敏性炎症中也起着至关重要的作用。50本研究的发现为研究p53在这些重要的生物学过程和疾病中的作用开辟了潜在的途径。


武汉新启迪生物科技有限公司联系邮箱:
service@qidibio.com  techsupport@qidibio.com  
武汉新启迪生物科技有限公司咨询客服:周一至周五8:30-17:30
联系我们
服务保障                        支付方式
武汉新启迪生物科技有限公司联系电话:
027-87610298
027-87610297