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基于抗体的CCR 5阻断保护猕猴免受粘膜志贺病毒的传播

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发表时间:2021-06-08 11:02作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

在没有预防性疫苗的情况下,使用抗逆转录病毒疗法(ART)作为暴露前预防(PrEP)来预防未受感染的个人感染艾滋病毒是减缓艾滋病流行的一种很有希望的方法,但其有效性受到患者不完全坚持和抗逆转录病毒变异的影响。在此,我们报告,通过ccr 5特异性抗体leronlimab竞争性抑制hiv env-ccr 5结合,可保护恒河猴免受ccr 5-嗜性志贺病毒多次直肠内攻击后的感染。SF162P3。每周注射Leronlimab 10 mg/kg可提供显著但部分的保护,而双周50 mg/kg的注射可提供完全的保护。组织活检显示保护猕猴在攻击后完全占据CCR 5受体和缺乏病毒核酸。Leronlimab洗净后,受保护的猕猴仍然是无菌的,而将血液学细胞过继转移到纯正猕猴体内并不会传播病毒感染。这些数据表明CCR 5阻断Leronlimab是预防HIV和支持临床试验的一种有希望的方法。

导言

暴露前预防(Prep)对艾滋病的预防是有效的,因为血液中的药物浓度与防护密切相关。1,2。然而,不完全的药物依从性阻碍了PrEP的疗效。3以及全球抗逆转录病毒治疗(ART)耐药率的上升4,导致多药耐药的hiv感染事件,尽管高度遵守prep。5,6。强效的广泛中和抗体(Bnbs)代表了一种潜在的替代品,以艺术为基础的PrEP。然而,bnbs仍然容易感染抗抗体的hiv毒株,因此需要具有互补作用机制的替代预防模式。7,8,9,10.

HIV可以利用ccr 5或cxr 4共受体进入CD4+T细胞,而ccr 5是HIV传播过程中的主要辅助受体。11,12,13。因此,在CCR 5中存在天然遗传缺陷的个体,通过基因的纯合性32碱基对的缺失。CCR 5(CCR 5)Δ32/Δ32)对HIV感染有很高的抵抗力14,15。进一步强调CCR 5在体内病毒传播中的中心作用,仅有两例有文献记载的HIV治愈病例发生在使用CCR 5的同种异体干细胞移植中。Δ32/Δ32供体细胞16,17。因此,ccr 5是预防hiv的理想靶点,然而像maraviroc这样的小分子ccr 5抑制剂作为prep药物产生了令人失望的结果。18,19另外,还需要其他CCR 5特有的策略。

Leronlimab是一种抗CCR 5人源化IgG 4抗体,目前作为一次每周一次的皮下注射,在多项研究中对1000多名志愿者进行了临床试验。20。与Maraviroc不同,Maraviroc通过变构调节干扰HIV Env对CCR 5的附着,Leronlimab与HIV Env所用的CCR 5胞外环-2和N-端结构域结合,从而直接竞争HIV与CCR 5的结合(参考文献)。21)。Leronlimab单剂量10 mg/kg可使HIV阳性者的血浆病毒载量降低约100倍,持续2周。22,23,24。Leronlimab作为每周一次的自我皮下单次治疗,在两年多的时间里一直保持着HIV感染者无法检测到的血浆病毒载量。25,最长的成功单药患者现在已经连续使用了6年以上(Chang等人,手稿正在编写中)。在家中自我管理Leronlimab作为皮下注射的能力预示着它作为PrEP剂的依从性很好。最后,在单剂量和多年的单药治疗研究中,没有发生病毒共受体转换,这表明Leronlimab抗性的发生具有很高的遗传障碍。基于这些抗病毒、安全和用户友好的特点,我们假设Leronlimab可以作为一种有效的PrEP策略,具有较高的患者使用率,并开始在HIV猕猴模型中建立基于Leronlimab的PrEP的有效性。

结果

因为细胞相关病毒在粘膜传播中起着重要的作用。26在体外扩散实验中,我们首先评估了Leronlimab对HIV细胞间传播的抑制作用。在中和试验中,Leronlimab用IC抑制不同的HIV分离物。50与HIV bNAb类似的值,如10E8、PGT 128和3BNC 117(参考文献)。27,28)。然而,与以前关于细胞间传输中和活性降低的发现一致。29100μg/mL Leronlimab在纯化的高活性CD4+T细胞体外培养体系中,可充分防止CCR 5嗜性HIV细胞向细胞间的扩散(附图)。1)。在传播试验中用这种浓度的leronlimab处理后,来自ccr 5野生型供体的CD4+T细胞靶点对ccr 5嗜性hiv感染完全耐药,同时仍支持cxr 4和双嗜hiv的复制,这与从ccr 5中观察到的CD4+T细胞靶点所观察到的感染模式相同。Δ32/Δ32捐献者(图1.1A)。使用来自多个类别的25个HIV分离物组成的面板(补充表)1),我们证实了Leronlimab能够模仿CCR 5赋予的抗性。Δ32/Δ32表型的CD4+T细胞从CCR 5野生型供体,从而保护这些细胞不感染CCR 5热带分离物从多个地理来源(图)。1B).

图1:Leronlimab阻断CCR 5利用菌株的体外传播。
figure1

a有代表性的流式细胞仪图显示未经处理的CCR 5野生型(WT)、Leronlimab处理的CCR 5 WT和未处理的CCR 5细胞内gag p24染色。Δ32/Δ32人CD4+T细胞在HIV-1感染试验中采用CCR 5-嗜蓝(蓝)、CXCR 4-嗜红(红色)和双嗜病毒(黑色)检测.b10 0μg/mL Leronlimab(TOP)和未处理CCR 5处理CCR 5 WT人CD4+T细胞的HIV-1平均GAG p24水平总结Δ32/Δ32人CD4+T细胞(底部)。每个数据点表示CCR 5 WT人的平均gag p24水平(n=3)或CCR 5Δ32/Δ32人(n=1;两次复制)CD4+T细胞。每个病毒向性群代表10个CCR 5向性、10个CXCR 5向性和5个双向病毒感染的平均gag p24水平。将CCR 5 WT人CD4+T细胞的GAG p24水平归一化为“不治疗”。cShiv扩散试验SF162P3,一种利用CCR 5的病毒。猕猴CD4+T细胞(n(3)Leronlimab感染和治疗后,Leronlimab含量增加。(右)Gagp 27水平测量纵向感染的平均值(平均±SEM),所有值均在第6天标准化为“不治疗”。源数据作为源数据文件提供。

CCR 5在人类和恒河猴之间高度保守。30,相应地,Leronlimab在猕猴CD4+T细胞表面特异结合CCR 5(补充图)。2A、b)。然而,虽然人和猕猴外周血CCR 5+CD4+T细胞的频率相似,但猕猴CD4+T细胞在每细胞基础上表达的CCR 5分子较多,中央记忆CD4+T细胞表达的总体水平最高(补充图1)。2C)。这种CCR 5在猕猴CD4+T细胞上的高表达表明,抑制猴CD4+T细胞中的Shiv感染可能需要更高浓度的CCR 5靶向竞争性抑制剂,如Leronlimab,而不是抑制人CD4+T细胞中的HIV感染。事实上,要实现对Shiv的完全抑制,需要高出10倍浓度的leronlimab。SF162P3猕猴细胞感染与人类细胞HIV感染比较(图一)。1C和补充图。1A).

粘膜传递过程中使用的初级共受体是CCR 5(参考文献5)。11,12,13)。因此,我们探讨了Leronlimab是否可以作为PrEP保护猕猴免受重复低剂量直肠内(IR)Shiv的侵害。SF162P3挑战。研究设计,如图所示。2A,由三组猕猴组成(n=每组6只猕猴资料列于补充表内2)作为对照组(第1组),每周10 mg/kg Leronlimab治疗组(第2组)或双周50 mg/kg Leronlimab治疗动物(第3组)。猕猴的10毫克/千克剂量为350毫克Leronlimab的人体临床剂量。由于抗药物抗体(ADA)的出现,人类临床剂量的700 mg Leronlimab被调整为50 mg/kg的猕猴,由于区域耐受性高,这一剂量可能不会引起ADA。31随着剂量从人类每周剂量改为每两周一次,更接近于血浆水平。因此,这两种猕猴的Leronlimab剂量是目前临床试验中使用的最低剂量和最高剂量。动物第一次皮下注射Leronlimab前一周就开始了IR挑战。在研究的第零周,所有的动物都接受了第一次使用3.2 TCID的IR挑战。50希夫SF162P3这种情况持续了八个星期。我们选择了ShivSF162P3由于以下两个原因:(1)来自hiv-1的父母环境病毒。SF 162CCR 5-是嗜性的,但对CCR 5-靶向剂特别有抵抗力。27和(2)ShivSF162P3可以通过在env V3环中定义氨基酸替换来切换到cxrr 4共受体在猕猴体内的使用。32。未感染动物在第7周接受最后一次IR挑战和Leronlimab注射。感染10周后,被感染动物在确诊感染后10周被安乐死,而被保护动物在失去外周血CD4+T细胞上的Leronlimab受体占用(RO)后8周被纵向监测和安乐死。

图2:Leronlimab预暴露预防对恒河猴直肠内SHIVSF162P3获取的保护作用。
figure2

a学习大纲。用3.2 TCID对18只恒河猴进行了挑战50希夫SF162P3每周经直肠内接种,连续8周。第一组未接受Leronlimab(黑色,n=6)而第2组每周服用10毫克/千克雷利玛(红色),n第3组每两周或每两周接受一次Leronlimab(蓝色,n=6)。bKaplan-Meier曲线与Shiv未感染率的比较SF162P3挑战,用邓恩修正的对数秩检验分析。c流式细胞仪检测Leronlimab处理猕猴外周血CCR 5+CD4+T细胞的CCR 5受体纵向占位水平(见“方法”)。dLeronlimab处理猕猴血浆中的纵向抗Leronlimab IgG水平。e第2组和第3组平均(±SEM)纵向Leronlimab浓度,经持续抗Leronlimab IgG抗体水平(ADA抗药物抗体;橙色)分离。f纵向ShivSF162P3血浆病毒载量。水平虚线表示定量的测定限度(50拷贝/毫升);a, cf表示Leronlimab处理过的猕猴的Leronlimab治疗阶段。右边的图例显示面板中使用的符号。c, d, f识别单独的恒河猴。恒河猴的持续抗Leronlimab抗体水平(37032)被显示为贯穿整个面板的虚线。cf。组色和个别动物符号在整个手稿中是一致的。源数据作为源数据文件提供。

在所有动物中,Leronlimab耐受性好,没有不良临床效应,类似于先前在多个临床试验中报道的高安全性。20,22,23,24,25。血清化学和全血计数参数在组间没有显着性差异,在研究期间也没有显著变化(补充图)。3)。虽然没有发现外周血T细胞计数或频率的显著变化,但我们观察到在Leronlimab治疗期间,外周血CCR 5+T细胞频率和绝对计数呈剂量依赖性增加,随后随着Leronlimab的清除而恢复到基线水平,很可能反映了Leronlimab干预CCR 5介导的趋化作用的能力。21(补充图。4).

第1组所有未经治疗的对照猕猴均受到第7次IR挑战的感染,而第2组的6只猕猴中有2只(每周10 mg/kg)被感染。p=0.001)。相反,第3组(每周50毫克/千克)未感染(p=0.0005),表明Leronlimab以剂量依赖性的方式保护猕猴免受Shiv获取(图1)。2B)。为了追踪CCR 5 RO,我们建立并验证了体外Leronlimab RO实验(补充图)。5)。第3组的所有6只猕猴在整个挑战阶段都对外周血CD4+T细胞保持完整的CCR 5 RO(图1)。2C)。正如预期的高剂量,这些猕猴没有发展ADA(图一)。二维空间),维持足够的血浆水平,半衰期为7.5周后,在第7周的学习周注射Leronlimab(图)。2E)。在清除血浆Leronlimab和外周血CD4+T细胞丢失CCR 5 RO后,我们监测动物8周后出现隐匿性Shiv感染。所有第3组猕猴在死亡前都保持无菌状态,这表明它们有消毒保护作用。2F)。在4个保护组(每周10 mg/kg)中,我们观察到Leronlimab剂量后CCR 5 RO的早期丢失,低水平ADA的发育,以及与所有3组动物相似,Leronlimab冲洗后未出现隐匿性Shiv感染和CCR 5 RO丢失,再次表明获得无菌保护作用(图1)。2C-f)。两组动物,37032和34487,但确实被感染。37032开发了强大的ADA,导致CCR 5 RO的快速丢失,血浆Leronlimab的清除,以及Shiv的获取(见图)。2C-f)。34487例获得性感染,尽管维持外周血CD4+T细胞CCR 5、RO和Leronlimab水平,但与第2组受保护动物相似。有趣的是,在最后一次挑战之后,这只动物的结肠Leronlimab水平是所有没有ADA治疗的动物中最低的(图一)。3B),提示直肠CCR 5 RO不完全,在病毒攻击期间,其保护效果不佳。感染后,34487只感染动物的血浆病毒血症最低,是唯一控制Shiv的动物。SF162P3到了无法检测的水平,提示Leronlimab的抗病毒作用在艾滋病病毒阳性个体的单药治疗的临床试验中也有类似的表现。20,22,23,24,25(无花果)2F和补充图。6)。然而,我们不能排除自发控制Shiv复制的潜力。我们对v3循环进行了排序。环境变化并发现血浆中的病毒子对两种动物来说都是CCR 5向的,排除了CXCR 4-嗜性Shiv变异体感染的可能性(补充图)。7).

图3:纵向Leronlimab组织水平和CCR 5受体占用率。
figure3

10 mg/kg处理动物(红色)和50 mg/kg处理动物(蓝色)。a在左侧,有代表性的流式细胞仪显示抗CCR 5(克隆3A9)和Leronlimab(由抗人IgG 4、HP-6025克隆)在PBMC、腋窝淋巴结、支气管肺泡灌洗和十二指肠CD4+T细胞上的共染色。组织取自三个时间点:第0周(第一次Leronlimab治疗后一周;第一次病毒攻击周)、第8周(最后一周Leronlimab治疗后一周;最后一次病毒攻击后一周)和尸检(对所有动物都不同)。流式细胞仪对所有三个时间点和组织进行了跟踪50 mg/kg处理的动物,35153。右侧为单个CCR 5 RO,分别来自腋淋巴结、支气管肺泡灌洗和十二指肠的CD4+CCR 5+T细胞。虚线显示CCR 5 RO为37032,是开发ADA的动物。bLeronlimab对5只10 mg/kg处理动物和3只50 mg/kg处理动物的组织浓度在第8/9周和尸检两个时间点进行。3只受保护的10 mg/kg受保护动物的组织浓度(±SD)值,感染10 mg/kg处理动物的个体值(34487和37032),以及3种受保护的50 mg/kg动物的平均(±SD)值。组色和个别动物符号在整个手稿中是一致的。源数据作为源数据文件提供。

为了确定CCR 5 RO对组织和粘膜内CD4+T细胞的保护作用是否相关,我们收集了淋巴结和内镜十二指肠活检和支气管肺泡灌洗(BAL),分别在第一次IR刺激和最后一次IR Shiv攻击后1周。我们观察到在整个IR刺激阶段,这些组织的CD4+T细胞上有完整的CCR 5 RO,除了因ADA而失去CCR 5 RO的动物37032(图1)。3A)。为了评估Leronlimab组织的穿透性,我们在最后的Shiv挑战后对不同的解剖位置进行了活检。正如预期的那样,第3组的Leronlimab水平高于第2组动物,34487的结肠水平最低(图1)。3B)。最后,我们对尸检期间采集的组织进行了检测,并证实这些组织中的CD4+T细胞缺乏Leronlimab和CCR 5 RO,表明受保护动物血浆中缺乏病毒血症并不是由于组织中残留的Leronlimab所致。

为了评估Leronlimab是否介导无菌保护免受挑战,我们在最后一次挑战(研究8~9周)和尸检(图1)后,通过组织活检测定了细胞相关的Shiv DNA和RNA在多个解剖位置的水平。4A,b)。正如预期的那样,志贺病毒核酸很容易在带有血浆病毒血症的猕猴身上检测到,包括所有未经治疗的对照组和2组感染动物,分别为34487和37032。然而,34487例尸检患者的许多组织低于定量限度,提示Leronlimab在获得病毒后可能存在有限的病毒传播。相反,我们发现4只动物和6只3组动物均未检测到志贺病毒DNA或RNA的阳性。因为gag-和vif-特异性CD8+T细胞是隐匿性SIV感染的敏感读物。33,我们对它们在所有猕猴中的出现进行了纵向监测。符合纵向血浆和细胞相关病毒载量的结果(图)。2F和4A,b),虽然所有猕猴体内都存在CMV特异性CD8+T细胞,但在所有动物中,Shivgag-和Vif-特异性CD8+T细胞反应均为阴性(图1)。4C和补充图。8)。最后,在确认Leronlimab和CCR 5 RO在尸检组织中不存在后(见图)。3),我们将混合的血液学细胞转移到每组一只Shiv-天真的接受者猕猴中。6只感染1组动物、4只保护组2动物和6只3组动物的淋巴结(腋窝、腹股沟和肠系膜)、骨髓和脾细胞,按7.8×10的最终细胞数混合注入。8,6.9×108,9.7×108(补充表格)3)。Shiv的转移SF162P3感染发生在被感染的对照动物身上,而在第2组或第3组中,没有从受保护动物中分离出细胞(图2或3)。4D)。这些结果表明,Leronlimab介导的无菌保护对Shiv的粘膜习得有保护作用。SF162P3在无菌动物身上。

图4:被保护的Leronlimab处理过的恒河猴的验证。
figure4

未处理对照动物(黑色)、10 mg/kg处理动物(红色)和50 mg/kg处理动物(蓝色)。a, b细胞相关ShivSF162P3DNA(A)和RNA(B)在最后挑战后病毒载量(封闭符号,第8或9周的活检)和身体检验(开放符号)。水平虚线ab表示7份/10份的定量限6细胞。c细胞内细胞因子染色法检测Shiv特异性CD8+T细胞的纵向反应。用布尔门控法检测CD 69+/TFN-α+和/或CD 69+/IFN-γ+CD8+T细胞的阳性率。灰色框表示Leronlimab处理后的猕猴的治疗阶段。d纵向ShivSF162P3过继转移受者的血浆病毒载量,每组在安乐死时注入从猕猴中提取的细胞(每组一名)。每个过继转移接受者接受6只感染的对照猕猴、4只10毫克/千克禽流感处理的猕猴或6只经50毫克/千克禽流感处理的猕猴的细胞联合输注(见补充表)。3用于注入细胞的破裂)。水平虚线表示定量限(50拷贝/mL)。组色和个别动物符号在整个手稿中是一致的。源数据作为源数据文件提供。

讨论

每天基于ART的PrEP的效率在很大程度上取决于患者的依从性。3无耐药变异体6。即使是像长效注射卡博特格勒这样的新的预防方法,也会导致耐药性变异的出现,特别是在未确诊的急性感染期间。34。因此,需要替代和降低成本的方法,包括使用基于抗体的PrEP.Leronlimab是在家庭皮下使用的,与基于bNAb的PrEP相比,PrEP需要静脉输液和由保健提供者在诊所进行的肌肉内注射。鉴于人类的Leronlimab血浆半衰期要比猕猴长得多,再加上人类CD4+T细胞上CCR 5的低表达,每月一次的Leronlimab可能足以防止HIV的感染。Fc抗体工程提高血浆半衰期的研究进展35小的序列修改可以将Leronlimab扩展到一次季度注射,通过降低给药频率来进一步提高依从性。

因为ccr 5是病毒在传播过程中所使用的主要的hiv辅助受体。11,12,13,病毒抗药性的发展是很困难的,如先前文献记载的CCR 5中的抗感染保护所证明的那样。Δ32/Δ32个人14,15。事实上,没有观察到长期使用leronlimab单药治疗hiv+个体,而不是使用bnbs治疗。8,9。这很可能是因为bNAb将主要的CCR 5共受体作为靶点,而不是由bNAb选择抗bNAb变异体在Env上的表位。感染cxr 4或双嗜hiv病毒是可能的,但由于黏膜中cxr 4嗜性病毒的多层限制,这些事件只代表了一小部分传播。9,35。此外,leronlimab完全保护动物免受Shiv直肠传播的能力与以前的一项研究形成鲜明对比,之前的研究中,小分子ccr 5抑制剂maraviroc未能保护受到10 tcid挑战的动物。50希夫SF162P3尽管直肠组织中药物浓度足够高18。因此,CCR 5环境相互作用的竞争性抑制是PrEP的一种强有力的途径。最后,除了针对CCR 5进行预防外,我们还致力于基因工程方法,在艾滋病治疗策略中淘汰CCR 5。36。本文的结果表明,使用Leronlimab可以模拟CCR 5中所看到的相同的保护措施。Δ32/Δ32个体通过一种可逆的药物治疗,这种疗法不需要基因修饰就可能产生非靶点效应。鉴于CCR 5Δ32/Δ32表型对寿命没有风险。37而且多年来Leronlimab的使用已经被安全地证明,未来的研究是有必要的,以探索Leronlimab在艾滋病治疗和预防中的作用。


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