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C5a/C5a受体1轴通过血小板释放控制组织新生血管

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发表时间:2021-06-08 10:36作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

血小板有助于组织新生血管的调节,尽管这种功能的具体因素尚不清楚。在此,我们发现补体过敏毒素C5a介导的C5a受体1(C5aR1)在血小板上的激活是血管形成的负调节机制。我们发现,表达C5aR1的血小板对内皮细胞的迁移、二维和三维管形成等功能有抑制作用。细胞生长因子和缺氧诱导血管生成明显增加。C5ar1−/−老鼠。血小板特异性缺失C5aR1导致血管生成表型增加,毛细血管化增加,周细胞覆盖率提高。我们发现C5a诱导血小板中CXC趋化因子配体4(CXCL 4,PF4)优先释放,是一种重要的抗血管生成旁分泌效应分子。干扰C5aR1-CXCL 4轴可逆转体外和体内血小板的抗血管生成作用。

总之,我们通过C5a/C5aR1轴激活血小板并诱导抗血管生成因子CXCL 4来控制组织新生血管的机制。

导言

组织内稳态和愈合过程在生物体中具有根本的重要性。补体系统是天然免疫反应的核心,它既能促进组织内平衡,又会导致功能障碍。1。最近的临床和临床前试验表明,补体系统可能是修复脑卒中等不同病理状态下组织功能的有希望的治疗靶点。2、哮喘3,以及心肌梗死4,5.

补体系统包括一组>30的血浆和细胞结合蛋白,这些蛋白质由三条途径之一规范地激活,或通过血浆或细胞结合蛋白酶非规范地激活。6。补体系统作为一种重要的哨兵系统,在天然免疫防御中发挥着重要的作用。7。它与天然免疫的其他体液和细胞臂紧密结合,相互干扰,如接触系统、模式识别受体和免疫球蛋白G(IgG)FC受体。补体系统的功能包括微生物侵入体的辅酶化,免疫复合物的清除,以及通过C3和C5的小裂解片段(称为过敏毒素)诱导和调节炎症反应。8。叶栅末端通路的激活导致c5b-c9的组装,从而使膜攻击复合物成核,介导靶细胞的渗透裂解。1。以前,补体级联的成分已经被证明在不同的病理生理环境中调节血管生成。9,10,11,12,靶向补体受体的治疗价值目前正在临床试验中探索。13。然而,补体系统干扰促血管生成或抗血管生成细胞或受体的确切机制仍有待确定。

血小板在以血栓形成为特征的疾病中起着决定性的作用,因此针对血小板相关功能是治疗这些疾病的既定治疗原则。14,15。血小板除了具有止血的经典功能外,还可引起炎症。16、免疫调节17,18,动脉粥样硬化19。越来越多的证据指出止血和补体级联激活之间的功能交集。20。以前的研究报告说,补体受体可能在血小板上表达。21,22。我们最近发现血小板上表达的补体C3a受体调节血小板聚集。23,24。有趣的是,血小板将促血管生成和抗血管生成因子储存在不同的颗粒中,并在刺激后释放出来。例如,血小板α-颗粒含有促血管生成血管内皮生长因子(Vgf)和抗血管生成cxc趋化因子配体4(cxcl 4,pf 4)。25,26,27)。然而,有关血小板在体内对血管生成的调节作用以及调控这一复杂过程的具体因素的知识是有限的。18,27.

在此,我们研究了体内缺血再血管化背景下补体系统与血小板之间的串扰,发现在血小板上表达的C5a受体1(C5aR1)调控血小板的血管生成相关功能。

结果

血小板在缺血再血管化环境中表达补体型过敏性毒素受体C5aR1

据报道,血小板含有促血管生成因子和抗血管生成因子。27,关于低氧驱动的血管化的调节功能以及这些旁分泌介质的释放是如何被调控的信息非常少。为了探讨血小板在体内血管形成和补体激活中的作用,我们进行了后肢缺血实验。28。在该模型中,股动脉结扎可引起后肢远端组织缺血,引发血管重建。

有趣的是,我们能够检测到补体激活在缺血,而不是在非缺血对照的后肢组织,如C3b的沉积,这种沉积与血管结构的形成共同定位(图一)。1A)。此外,我们发现补体过敏毒素受体的表达显著增加。C5ar1缺血后肢肌肉组织mRNA水平与非缺血对侧后肢比较(图1)。1B)。我们还评估了CD42b的存在。+血小板在肌肉组织和发现明显增加血小板丰度在缺血与非缺血对照后肢(图一)。1C和补充图。1A,b)。相应地,血小板谱系特异性标记物Cd42bMRNA和镉41缺血组织中mRNA水平明显升高(图二)。1D)。体外实验表明,在静态条件下,二磷酸腺苷(ADP)诱导的血小板对内皮细胞的粘附作用随着内皮细胞的缺氧而增加。1E)。对缺血后肢肌肉的分析显示,C5aR1与血小板标志物CD42b在后肢血管重建术的不同阶段共定位(图1)。1F)。因此,血小板在时空上与补体激活共同定位,并在血管生成组织中表达C5aR1。

图1:缺血性组织中存在大量与血小板相关的补体过敏毒素受体C5aR1。
figure1

如“方法”一节所述,WT小鼠发生后肢缺血。a诱导后肢缺血一周后,缺血肌肉表现出大量补体激活(左侧),C3裂解产物C3b(红色)的存在证明了这一点。IB4染色(绿色)显示血管结构,DAPI(蓝色)表示细胞核。非缺血侧对照肌仅显示少量补体C3b沉积(右侧)。放大倍数×200倍,标尺代表200米,图像代表至少四块分析肌肉。b此外,缺血导致过敏原毒素受体mRNA水平显著升高。C5ar1与非缺血侧后肢肌肉作对照。数据为平均值±扫描电镜(n=4项独立实验),并以控制百分比表示。对侧对照肌mRNA水平为100%。*p < 0.05. c在缺血后肢组织中,CD42b(红色)可检测到较多血小板。显示的是一幅有代表性的图像,IB4染色(绿色)描绘血管结构,DAPI(蓝色)描绘细胞核。比例尺代表10公分,图像代表每组11-12条肌肉.dRT-PCR分析发现血小板标记物mRNA水平显著升高。Cd42b以及血小板标记物镉41与对侧未受影响的肌肉相比。数据表示为平均值±扫描电镜(n=4项独立实验),并以控制百分比表示。对侧对照肌mRNA水平为100%。*p < 0.05. e在静态血小板对内皮细胞(MHEC)的粘附实验中,ADP诱导的内皮细胞在缺血预处理条件下的粘附量明显高于正常内皮细胞(P<0.05)。数据表示为平均值±扫描电镜(n=4项独立实验),并以控制百分比表示。ADP诱导的血小板对正常血管内皮细胞的粘附率为100%。*p < 0.05. f缺血后第4天和第14天小鼠后肢肌肉免疫荧光共染色显示血小板标记物CD42b(红色)和C5aR1(绿色)在×630放大镜下(左侧)共定位。有代表性的图像证实细胞是无核的(DAPI阴性,蓝色)。肌肉的对照染色C5ar1−/−小鼠(右侧)证实C5aR1染色的特异性。标度条代表5m,图像代表至少四个被分析的肌肉。双面学生t试验b, d, e.

C5a介导的血小板C5aR1激活抑制血管生成的内皮功能

血小板和补体系统都有调节血管生成的作用。12,29我们进一步质疑血小板上表达的C5aR1是否调节血管生成的内皮功能。我们能够在未受刺激的洗涤血小板中检测到C5aR1(如图所示)。2A,b),胶原相关肽(CRP)刺激后明显增强。2C),ADP刺激后稍升高(图1)。二维空间),C5a刺激后未发生改变(图1)。2E).

图2:血小板表达C5aR1,血小板C5aR1抑制多种内皮功能。
figure2

a免疫荧光显微镜观察小鼠血小板表达C5aR1。C5aR1(红色)与α-颗粒标记物P-选择素(Green)仅部分共定位。放大倍数×630倍,标度条代表5m,图像是四个独立实验的代表。b直方图显示C5aR1在血小板上的表达(灰度曲线);黑色曲线显示用IgG亚型获得的直方图。直方图代表四个独立血小板样本的分析。c流式细胞仪显示C5aR1在血小板上的表达是动态的。CRP刺激后,WT血小板C5aR1表达增加。在……里面ce,数据显示为平均值±SEM(n=4项独立实验),并以控制百分比表示。未受刺激WT组的表达率为100%。*p < 0.05. dADP刺激后,WT血小板在高浓度时C5aR1表达上调。eC5a在一定浓度下处理后,血小板上C5aR1的表达无明显变化。f将原代肺内皮细胞(MLECs)培养成汇合的单层,用塑料吸管划伤并与其共同孵育。C5ar1−/−或者是WT血小板。C5aR1缺失后17h内皮细胞迁移增加。n=6项独立实验)。实验开始时未植入细胞的区域减去与WT血小板共孵育17h后未被细胞填充的区域,占100%。*p < 0.05. g体外培养的MHEC-5T细胞与体外分离的血小板孵育后,内皮管的形成明显增强。C5ar1−/−小鼠比较从WT小鼠中分离的血小板。数据显示为平均值±扫描电镜(n=4个独立实验),6.5h后显示为总管长,与WT对照血小板孵育后的内皮管累计长度为100%。*p < 0.05. h同样,MLECs暴露于内皮细胞后,内皮管的形成也增加了。C5ar1−/−血小板与WT血小板比较。数据显示为平均值±扫描电镜(n=4项独立实验)。与WT对照血小板共孵育后成管率为100%。*p < 0.05. iMHEC-5T与WT或WT共同孵育后内皮管形成的典型图像C5ar1−/−血小板。j小鼠WT血小板上清液与培养上清相比,明显抑制内皮球体的管状形成。C5ar1−/−血小板。数据表示为平均值±扫描电镜(n=3项独立实验),以对照组24 h后总管长的百分比表示。与WT对照血小板上清液孵育后成管率为100%。*p < 0.05. k两组血管内皮球体形成芽的典型图像。标尺表示100μm。l人血小板与C5aR1拮抗剂(PMX 53)或对照肽共同孵育。随后在Matrigel上与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共同孵育血小板。与对照组相比,PMX 53预孵育可明显促进内皮管的形成。数据显示为平均值±扫描电镜(n在6.5h后与单独供体进行4次独立实验),与对照组肽孵育血小板后的内皮管累积长度为100%。*p < 0.05. m在静态条件下,WT与C5aR1缺陷血小板在常氧条件下对内皮细胞的粘附无显着性差异。数据显示为平均值±扫描电镜(n=4-5个独立实验)和控制百分比。贴壁WT血小板表达为血小板特异性染色的面积分数除以内皮细胞的数量,以DAPI计数的单位面积为100%。*p < 0.05 compared to control-stimulated platelets. nWT和WT静态血小板粘附的典型图像C5ar1−/−血小板转化为内皮细胞。标尺条代表200米双面学生的标尺t试验b, fh, j, l。阿诺瓦ce, m.

随后,我们将内皮细胞与野生型(Wt)或C5ar1−/−老鼠。用小鼠内皮细胞株MHEC-5T,在C5aR1存在或不存在的情况下,加入血小板对内皮细胞的增殖无明显影响。2A,b)。然而,内皮细胞的迁移通过与C5ar1−/−用原代小鼠肺内皮细胞(MLECs)与WT血小板共同孵育血小板的比较;2F)。CD 102、CD 144和CD 31染色证实原代细胞纯度至少为90%。3)。同样,在体外二维和三维(3d)管形成实验中,内皮管的形成在与C5ar1−/−血小板或C5ar1−/−在MHEC-5T细胞和原代MLECs中,血小板上清液与WT血小板或上清液共同孵育(见图)。2G-k)。其次,我们用C5aR1特异性拮抗剂PMX 53或对照肽预孵育人血小板,然后在C5a存在下加入人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。结果表明,PMX 53抑制C5aR1活性可明显促进内皮管的形成。2L)。为了更好地描述体外血小板与内皮的相互作用,我们评估了WT还是WT。C5ar1−/−血小板与内皮细胞的静态粘附程度不同。ADP诱导粘附显著增加,但WT与C5aR1缺乏症血小板无明显差异(图二)。2m,n).

C5aR1缺陷小鼠缺血再血管化作用的研究

其次,通过对小鼠胚胎血管生成和后肢缺血再血管化的评估,探讨C5aR1在体内血管形成中的作用。在E11.5WT或C5ar1−/−胚胎后脑。未检测到C5aR1对发育性血管生成的影响(附图)。4)。相反,我们观察到C5aR1缺乏症对缺血驱动的血管生长的影响。当我们用重复激光多普勒成像(LDI)监测股动脉结扎后14天的血管重建时,我们发现血流灌注明显增强。C5ar1−/−动物,表明更快和更明显的血管化时,与WT对照动物(图一)。3A,b)。然后,14天后从缺血后肢取出腓肠肌,用免疫荧光法测定异链菌素B4(IB4;Green)和4,6-二氨基-2-苯环吲哚(DAPI;蓝色;图)的血管密度。3C)。后肢肌肉血管密度C5ar1−/−诱导后肢缺血后,小鼠与WT对照组比较,差异有显着性(图1)。3C,d)。随后,我们给WT和WT都注射了消耗血小板的血清。C5ar1−/−诱导小鼠后肢缺血14天以上。血小板耗竭是有效的,在小鼠外周血中显示血小板消耗效率>90%(附图)。5在血小板耗竭时,我们观察到两种菌株在血管化方面没有明显差异,提示C5aR1活化在缺血诱导的血管生成中起关键作用(图一)。3E)。因此,两组血管密度是相当的(图)。3F).

图3:C5aR1缺乏症在体内促进缺血诱导的血管重建。
figure3

WT或C5ar1−/−小鼠后肢缺血2周后进行分析。a应用激光多普勒血流仪(LDI)观察股动脉结扎后后肢血管重建情况。我们发现在C5ar1−/−动物。数据显示为平均值±扫描电镜(n每组动物7只),以对侧对照肢体灌注的百分比表示。*p < 0.05. b股动脉结扎后小鼠后肢的典型LDI图像显示C5ar1−/−动物与WT对照。c免疫荧光法测定缺血肢体腓肠肌血管密度。采用异链菌素B4(IB4为绿色,细胞核为蓝色)显示血管,取全肌肉切片图像进行扫描和分析。在缺血后14天,C5ar1−/−小鼠血管密度明显高于WT对照组。放大倍数×200倍,标尺代表200米。d肌切片中IB4阳性面积分数的定量显示缺血时血管丰富程度较高。C5ar1−/−后肢。数据显示为平均值±扫描电镜(n=10整个肌肉切片(每组),并显示为控制的百分比。在WT对照后肢中,IB4阳性面积分数为100%.*p<0.001。e此外,WT或C5ar1−/−小鼠自缺血诱导后第1天开始,注射血小板耗竭血清,造成小鼠后肢缺血,血小板系统衰竭。我们无法发现明显的差异(p < 0.05) in revascularization. Data are shown as the mean ± SEM (n每组动物7只),以对侧对照肢体灌注的百分比表示。f用免疫荧光法测定缺血肢体腓肠肌血管密度。c。在缺血后14天,WT和C5ar1−/−血小板耗竭小鼠血管密度无显着性差异。放大倍数×200倍,标尺代表200 m,图像代表每组10条肌肉切片。与Bonferroni后特设试验的双向方差分析a, e。双面学生t试验d.

C5aR1缺陷小鼠血管化的增加是由血小板C5aR1刺激的胶原化以及毛细血管和周细胞的生长介导的。

为了进一步确定血小板C5aR1在体内的作用,我们杂交了GFP-C5ar1Fl/fl30小白鼠PF4-cre+小鼠31生成PF4-cre+ C5ar1Fl/fl小鼠,缺乏C5aR1在血小板(补充图。6)。当我们诱导后肢缺血,并在14天内重复进行LDI测量时PF4-cre+ C5ar1Fl/fl小鼠,我们发现血小板特异性的更强的血管化。C5ar1-击倒老鼠PF4-cre C5ar1Fl/fl较少的控制(如图所示)。4A,b)。类似于C5ar1−/−小鼠,我们检测到缺血肌肉组织中血管密度增加。PF4-cre+ C5ar1Fl/fl老鼠(图1.4C,d)。为了排除缺血组织中C5aR1缺乏症时血小板沉积的差异,我们评估了缺血后全肌切片中血小板的丰度和微血栓大小。PF4-cre+ C5ar1Fl/fl老鼠和PF4-cre C5ar1Fl/fl控件(图1.4E)。我们发现两组之间没有显着性差异(图1)。4F)。众所周知,cxcl 4(Pf 4)也是由单核细胞表达的,而单核细胞是缺血诱导血管重建术的重要媒介。32,我们下一次评估是否PF4-cre+ C5ar1Fl/fl与单核细胞或巨噬细胞相比,小鼠C5aR1表达改变。PF4-cre C5ar1Fl/fl但没有发现任何差异(附图)。7).

图4:血小板特异性C5a受体缺失抑制血管重建,但不改变体内血小板沉积。
figure4

PF4-cre+ C5ar1Fl/fl小鼠按“方法”一节中的描述生成。造成后肢缺血,PF4-cre C5ar1Fl/fl小鼠作为对照组。a血小板特异性C5a受体1基因敲除小鼠的血管再血管化增强。数据表示为平均值±扫描电镜(n=5只动物(每组5只),以对侧对照肢体的灌注百分比表示。*p < 0.05. b股动脉结扎后小鼠后肢的典型LDI图像显示PF4-cre+ C5ar1Fl/fl小鼠与小白鼠对照。c缺血肢体腓肠肌代表节段血管密度(血管标志IB4为绿色,细胞核为蓝色)PF4-cre+ C5ar1Fl/fl血管密度明显高于PF4-cre C5ar1Fl/fl控制。标尺代表200米。d肌切片中IB4阳性面积分数的定量显示缺血时血管丰富程度较高。PF4-cre+ C5ar1Fl/fl后肢放大倍数为×200。数据显示为平均值±扫描电镜(n=10整个肌肉切片(每组),并显示为控制的百分比。Ib4阳性面积分数PF4-cre C5ar1Fl/fl后肢占100%。*p < 0.05. e用CD42b(红色)染色,测定大鼠全肌切片血小板沉积量。PF4-cre+ C5ar1Fl/fl或.的PF4-cre C5ar1Fl/fl鼠标,如“方法”部分所述。每个面积血小板数和微血栓大小无差异。显示这两种基因型的有代表性的图像,IB4染色(绿色)显示血管结构;DAPI(蓝色)显示细胞核。标尺代表100公厘。fCD42b阳性的单个血小板采用自动数字图像分析方法对单个血小板的大小进行量化,如全肌肉切片中的“方法”部分所描述的那样。无显着性差异PF4-cre+ C5ar1Fl/flPF4-cre C5ar1Fl/fl小鼠每肌肉面积的血小板数以及血小板/微血栓的大小。数据显示为平均值±扫描电镜(n=6整个肌肉切片(每组),并显示为控制的百分比。读数PF4-cre C5ar1Fl/fl在这两张图中,后肢占100%。*p < 0.05. Two-way ANOVA with Bonferroni’s post hoc test in a。双面学生t试验d, f.

中观察到的血管再血管化增加的机制PF4-cre+ C5ar1Fl/fl在小鼠体内,我们对血小板特异性进行了微电脑断层扫描(Microct)分析。C5ar1-在第9天造成小鼠后肢缺血模型。三维重建后,与对侧对照后肢相比较,可以识别出闭塞血管(图1)。5A,b、箭头)。此外,还可以观察到侧支动脉的形成。5A,b和补充电影1A-d)。通过虚拟重建,从图像中提取血管树并进行分析(附图)。8a,b)。两组血管大小分布(PF4-cre+ C5ar1Fl/flPF4-cre C5ar1Fl/fl)评估。分析结果显示,在后肢近端段,由动脉侧支组成的中、小型血管数量增加(图1)。5C)。我们还考虑了血小板c5ar1影响预先存在的侧支血管形成的可能性,这对于缺血诱导血管重建的初始阶段是很重要的。33。因此,对两种基因型非缺血后肢的血管树进行了量化。平均血管大小无差异(附图)。8C).

图5:血小板C5aR1缺乏症导致侧支动脉形成、毛细血管化和周细胞覆盖增加。
figure5

以血小板特异性C5aR1缺陷小鼠为实验对象,观察其对后肢缺血的影响。为观察侧支动脉,在缺血诱导后于D9灌注造影剂,并按“方法”一节所述进行显微CT分析。a动脉三维重建PF4-cre C5ar1Fl/fl小鼠出现侧支动脉形成,股主动脉(箭头)不再灌注。a, bC5aR1缺陷或能行血小板的小鼠侧支动脉形成的比较显示血小板特异性胶原化增加。C5ar1-击倒老鼠。图像以3~4只小鼠为代表,即3~4只被分析的血管树.c缺血后肢血管的大小分布PF4-cre+ C5ar1Fl/fl老鼠和PF4-cre C5ar1Fl/fl小鼠在内收肌区膝关节近端的微CT数据中进行了量化(有关方法的详细信息,请参阅“方法”一节和补充图。8). PF4-cre+ C5ar1Fl/fl老鼠在小血管范围和中型血管范围内都显示出更大的血管。数据显示为所分析的3-4棵船树中每一棵树的叠加单次测量,以及在每个大小区域内量化的所有船只的平均±95%置信区间。n=3-4只动物,即每组的容器树)。数据以像素/体素表示,1个体素代表21.6m。此外,缺血后肢近端血管的平均直径有明显的增大趋势。PF4-cre+ C5ar1Fl/fl与对照组(右)相比,小鼠的血管重建效果更好。d大鼠远端缺血后肢腓肠肌动脉的特征PF4-cre+ C5ar1Fl/flPF4-cre C5ar1Fl/fl小鼠大动脉大小和小动脉丰度无显着性差异(SMA红色,IB4绿色)。放大倍数×200倍,鳞片代表200 m,箭头标记肌肉大动脉,SMA和IB4双阳性。e用X 200放大率(左)测量整个肌肉切片中5条最大动脉的周长,以评估远端大动脉。此外,在×200放大率下,对SMA阳性血管肌段的面积分数进行了量化。数据显示为平均值±扫描电镜(n=10整个肌肉切片(每组),并显示为控制的百分比。每段最大五条动脉的动脉周长之和或SMA染色面积的总和。PF4-cre C5ar1Fl/fl后肢肌肉切片为100%对照。注:=无显着性差异。f血小板特异性C5ar1-敲除小鼠缺血后第14天,缺血肌肉组织血管周细胞覆盖率增加。(周细胞标记NG2为红色,血管标记IB4为绿色)。放大倍数×200倍,标尺代表200米。g用X 200倍镜(左)测量瓷砖扫描获得的全肌片NG2阳性染色的面积分数来评估周细胞密度。此外,通过计算NG2和IB4染色的空间共定位来评估周细胞覆盖率。数据显示为平均值±扫描电镜(n=10整个肌肉切片(每组),并显示为控制的百分比。NG2染色的面积分数或周细胞覆盖率PF4-creC5ar1Fl/fl后肢肌肉切片占100%。*p < 0.05 or <0.01. Two-sided Student’s t试验e, g.

在后肢远端,我们检测平滑肌肌动蛋白(SMA)和NG2的表达,表示动脉血管。然后我们量化了腓肠肌最大动脉的大小和小动脉密度(图)。5D,e)。不过,两者之间并无显著差异。PF4-cre+C5ar1Fl/fl老鼠和PF4-cre C5ar1Fl/fl远端肌肉中的老鼠。NG2染色可以测定血管的周细胞丰度和周细胞覆盖率。血小板特异性C5aR1缺陷小鼠缺血后肢肌肉的比较PF4-cre C5ar1Fl/fl对照组小鼠在诱导缺血后第14天,观察血小板特异性C5aR1缺陷小鼠周细胞密度的增加和周细胞覆盖率的提高(图一)。5F,g)。这一效应可能解释了放大后的血管密度。PF4-cre+ C5ar1Fl/fl老鼠(图1.4C,d).

我们观察到血小板c5aR1抑制内皮细胞功能,这些功能在体外与血管生成相关,我们的发现是血小板特异性的。C5ar1−/−动物表现出明显的缺血诱导的血管重建,这促使我们研究这一过程的调控机制。

血小板C5aR1介导抗血管生成、血小板源性cxcl 4的释放

为了阐明血小板C5aR1介导的抑制血管生长和内皮功能的机制,我们用C5a或载体对照刺激离体血小板。一个基于膜的抗体阵列是通过收集的上清液来获得对分泌的抗血管生成因子的调节的洞察(图)。6A)。有趣的是,血小板α-颗粒组分CXCL 4在C5a刺激后被强烈诱导。6B)。Bonferroni的后专案分析显示,与除Angi授精-1(C5a引起下调)及内皮抑素(补充图)外的所有因素相比,差异均有显着性。9).

图6:血小板C5aR1以Akt和PKC依赖的方式介导旁分泌效应物CXCL 4的释放。
figure6

a用C5a刺激血小板活化抑制剂,仔细分离水洗小鼠WT血小板。用膜抗体阵列分析上清液。C5a(下)刺激C5a后,CXCL 4(红色圆圈)等特定介质的表达较对照(顶部)升高。b对4个重复序列的结果进行了量化。在大多数因素中,C5a刺激(灰色)与车辆控制(黑色)相比有轻微的上调。CXCL 4的增幅最大。数据显示为平均值±扫描电镜(n=4项独立实验),并显示为强度值。*p < 0.05. Bonferroni’s post hoc analysis was performed; results are displayed in Supplementary Fig. 9. c单细胞染色显示小鼠血小板在C5a刺激下被激活并释放出CXCL 4。在ADP和C5a刺激下,观察到一种环样染色模式,显示血小板活化(箭头)。而C5a刺激的血小板在C5a刺激后CXCL 4含量降低,ADP刺激组不能观察到同样程度的CXCL 4含量。放大倍数×630倍,标度条代表5m,图像是四个独立实验的代表。d各血小板P-选择素强度的定量显示血小板表达上调,提示ADP和C5a刺激后血小板活化。ADP与C5a之间无显着性差异。数据显示为平均值±扫描电镜(n=5图像分析),并显示为控制的百分比。在车辆控制刺激的WT血小板中P-选择素强度为100%.*p < 0.05 eCXCL 4强度与血小板P-选择素强度的定量显示,与ADP相比,CXCL 4在C5a刺激下的分泌相对较强。数据显示为平均值±扫描电镜(n=5图像分析),并显示为控制的百分比。在车辆控制刺激的WT血小板中,CXCL 4强度与P-选择素强度的相关性为100%.*p < 0.05. f用C5a或车辆对照刺激小鼠单个血小板。通过计算血小板(P-选择素为主)、以红色为主(CXCL 4-为主)和重叠黄区(P-选择素-CXCL 4双阳性)的主要绿色染色面积来定量颗粒。放大倍数×630倍,标度条代表1m,图像代表>100只分析的单片血小板。g如附图所述。10,测定颗粒面积分数。我们观察到颗粒有明显的分布模式,CXCL 4为主和P-选择素-CXCL 4双阳性颗粒数量相似,P-选择素为主颗粒数量明显减少,其中P-选择素含量明显低于CXCL 4。数据显示为平均值±扫描电镜(n单血小板分析=112),并显示为面积分数。p(CXCL 4对双阳性)<0.001,p(CD62P对双阳性)=0.0022。hC5a刺激后,CXCL 4为主颗粒减少,双阳性颗粒面积比例不变,P-选择素颗粒相对面积分数增加,说明C5a诱导α-颗粒的分泌,其中P-选择素上含有CXCL 4。数据显示为平均值±扫描电镜(n166个单血小板分析),并显示为面积分数。p(CD62P对CXCL 4)<0.001。i常规ELISA证实C5a刺激后人血小板CXCL 4分泌量明显增加。C5a浓度为2000 ng/ml时,CXCL 4的释放达到最大值。n=8个包含独立供体的独立实验),并显示为控制的百分比。载体刺激血小板上清液的CXCL 4蛋白水平为100%.*p < 0.05. j野生型小鼠巨核细胞与正常小鼠巨核细胞的比较C5ar1−/−观察小鼠CXCL 4优势颗粒(红色)的分布情况。显示的是有代表性的图像,原子核以绿色显示。放大倍数×630倍,标尺代表10米。k如附图所述。10,对WT和Wt的巨核细胞中颗粒面积分数进行了定量分析。C5ar1−/−老鼠。CXCL 4为主颗粒无显着性差异。数据显示为平均值±扫描电镜(n=10-12个单个巨核细胞(分析),并显示为面积分数。lRT-PCR分析检测到Wt巨核细胞中CXCL 4 mRNA水平与Wt细胞相似。C5ar1−/−老鼠。数据表示为平均值±扫描电镜(n=5个独立实验),并显示为与GAPDH相关的相对表达式。m枸橼酸全血C5ar1−/−用不同浓度的C5a(20,200,2000 ng/ml)刺激小鼠,用流式细胞仪检测血小板活化指标。有关选通策略,请参阅“方法”一节。活化血小板检测为CD62PJONA++,而Jona检测到激活的GPIIbIIIa。C5a诱导WT血小板活化C5ar1−/−血小板。数据显示为平均值±扫描电镜(n=4个独立实验),并显示为控制的百分比。门限CD62PJONA++车辆刺激组血小板占100%.*p < 0.05. n为了揭示C5aR1信号下游导致CXCL 4分泌的机制,在载体控制或C5a刺激后产生WT血小板裂解物,在相同蛋白浓度下对磷脂蛋白和非磷酸化对照样品进行检测。血小板C5aR1结扎诱导可重复的PKC底物磷酸化(PKC荧光粉Ser)。作为对照,我们使用PKC激活剂PMA。通过将磷酸化信号除以总蛋白信号和未磷酸化的PKCα(补充图)来定量PKC的激活。23)。显示的是至少四个独立实验的代表性图像。o我们还检查了PKC的激活是否也导致CXCL 4释放,用C5a和PMA刺激洗过的血小板。C5a和PMA均能诱导CXCL 4的释放。数据显示为平均值±扫描电镜(n=5-16个独立实验),以ELISA法测定血小板上清液中CXCL 4浓度的控制百分比。车辆刺激组血小板的平均荧光强度(MFI)为100%.*p < 0.01. pC5a诱导磷酸化Akt(Ser473)、PI3K(Ser 47)、GSK-3β(Ser 9)、P44/42 MAPK(Thr 202/Tyr 204)、PLCβ3(Ser537)上调。显示的是至少四个独立实验的代表性图像。关于磷酸化的定量,请参阅补充图。23. q有趣的是,C5a对磷酸化的γ2(Tyr 1217)和pKa(α/β/γ催化亚基膦T 197)均无调节作用。RAP1-GTP(ActivatedRap-1,Rap1-GTP)采用RAP1拉下法进行分析。未发现RAP1-GTP明显改变。显示的是至少四个独立实验的代表性图像。单因素方差分析与Bonferroni后特别试验b, d, e, gi, m。双面学生t试验k, l, o.

为了进一步探讨C5a诱导CXCL 4分泌的机制,我们对α-颗粒组分P-选择素和CXCL 4的受刺激血小板进行了染色。6C)。小剂量的ADP和C5a刺激诱导血小板活化,如P-选择素上调和P-选择素向细胞周围的动员所示(环状染色模式,箭头;图)。6C,d)。与ADP相比,C5a可引起分泌反应的改变,C5a刺激C5a后CXCL 4相对于P-选择素的强度降低(如图1所示)。6E).

有趣的是,使用共焦显微镜(补充图。10)我们发现α-颗粒在P-选择素上主要含有CXCL 4,同时含有CXCL 4和P-选择素(图1)。6f,g)。当我们用C5a刺激血小板时,我们观察到这些以CXCL 4为主的颗粒从血小板中释放出来,测量的是面积分数的减少(如图所示)。六小时)但不含CXCL 4和P-选择素的颗粒或含有P-选择素的颗粒,但不含CXCL 4。这些发现强烈地提示C5a可以诱导α颗粒细胞的分泌,而C5a主要是由CXCL 4介导的。

用人细胞,常规酶联免疫吸附试验(ELISA)测定C5a刺激的血小板上清液中CxCL 4的浓度,证实与车辆对照血小板相比有剂量依赖性和显着性增加。6I)。其次,评估小鼠血小板的时间和剂量依赖性,以寻找最佳的刺激条件(补充图)。11)。C5a浓度为200 ng/ml时,小鼠和人细胞的最大CXCL 4释放量分别为200 ng/ml和2000 ng/ml。6I和补充图。12A)。在25℃刺激10 min,37℃刺激10 min时,CXCL 4分泌作用呈剂量依赖性(附图)。12)。分析大核细胞C5ar1−/−小鼠CXCL 4颗粒面积分数无显着性差异(图1)。6J,k)与WT细胞比较。此外,在CXCL 4WT与WT之间的mRNAC5ar1−/−巨核细胞的实时PCR分析(见图)。6L),表明CXCL 4对血小板而非巨核细胞水平有调节作用。

为了比较C5a诱导的CxCL 4释放与经典血小板激动剂诱导的CxCL 4分泌,我们用不同的血小板激活剂刺激血小板,并比较了WT和CxCL 4的分泌反应。C5ar1−/−小鼠(附图)13)。我们发现,而WT和C5ar1−/−小鼠对经典激动剂诱导的CXCL 4释放反应无显着性差异,C5a刺激小鼠C5a后CxCL 4分泌无显着性差异(P>0.05)。C5ar1−/−血小板(附图)13B)。在WT小鼠中,200 ng/ml C5a刺激后的CXCL 4水平可与25 mADP刺激相媲美(附图)。13A)。WT和C5ar1−/−血小板聚集行为没有显着性差异(补充图)。14a,b)。进一步排除止血缺陷是其新生血管表型的原因。C5ar1−/−小鼠,我们进行了额外的体内实验,三氯化铁诱导的血管损伤.我们观察到在没有C5aR1的情况下,血栓形成的时间与WT小鼠相比没有显着性差异(补充图)。14C)。此外,C5aR1缺乏症对体内出血时间无明显影响(附图)。14D)。然而,如图所示。6C,d已经证实,C5a诱导血小板活化。我们用流式细胞术对c5aR1依赖的血小板活化进行了定量分析,发现c5a刺激后WT血小板中血小板活化明显增加,但未见明显增加。C5ar1−/−血小板(图1.6米)。此外,C5a诱导了一个剂量依赖性钙信号(补充图)。14E)。而C5a对GPVI、CD40L、CD 61等血小板活化指标及血小板-白细胞聚集形成无影响(附图)。14F)。最后,C5a对经典血小板功能如与血管性血友病因子的粘附或聚集无影响(附图)。15)。C5aR1缺乏症不影响血小板C3aR蛋白含量(附图)。16)。C3aR最近被证明可以调节血小板聚集。24。同样,在没有C5aR1的情况下,血小板的C3aR受体表达谱也没有明显改变(补充图)。17).

接下来,我们用传统的ELISA方法评估了C5a对其他血管生成因子分泌的影响,这些因子已知储存在血小板中。与其他激动剂和车辆对照相比,C5a不诱导血小板反应素1(附图1)的分泌。18A),内皮抑素(附图)。18B),或血小板衍生生长因子(PDGF;补充图)。18C)来自人类血小板。此外,C5a刺激对血小板δ颗粒物质的分泌没有影响(补充图)。19)。小波变换前后血小板颗粒含量的比较C5ar1−/−PF4-cre C5ar1Fl/fl对决PF4-cre+ C5ar1Fl/fl小鼠分别无显着性差异(补充图)。20)。然后分析C5缺乏对血小板C5aR1依赖的CXCL 4分泌的影响。从C5缺陷小鼠中分离出的血小板表达C5aR1(补充图)。21A)但刺激后C5a浓度较高(500 ng/ml;补充图)显示C5a依赖于CXCL 4的分泌。21b)的激活响应没有发现重大差异。C5−/−血小板与WT血小板的比较(附图)。21C,d)。C5aR2可以在许多不同的细胞类型中调节C5aR1的功能。34。然而,我们不能检测到相关的C5aR2在血小板上的表达,也不能检测到C5aR2特异性刺激对血小板释放CXCL 4的影响(附图)。22).

此外,我们还分析了几种通过C5aR1连接C5a与CXCL 4分泌的潜在途径。我们检测了Akt、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)、P44/42丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、PLCβ3、PLCγ2、蛋白激酶A(PKA)和RAP 1的磷酸化。有趣的是,我们发现信号是通过C5aR1的Gβγ亚基传递的,而不是GαI,因为我们发现PI3K和Akt的C5a依赖磷酸化,而不是PKA(图1)。6N-Q以及补充图中的统计分析。23)。PKC的激活似乎是C5a诱导的CXCL 4分泌的核心,因为我们发现C5a依赖于PKC磷酸化,而且PKC的激活也能诱导CXCL 4的分泌(如图所示)。6N,o).

血小板C5aR1驱动的cxcl 4对血管形成的抑制作用

为了证实C5a诱导的CXCL 4分泌的相关性,我们用C5a刺激的血小板上清液处理内皮细胞。C5a处理的WT血小板上清液加入内皮细胞后,对内皮管的形成有抑制作用。7A)。这种作用是C5aR1特异性的,因为C5a的血小板上清液是受刺激的。C5ar1−/−血小板无影响(阴性对照;图1)。7A)。C5a条件下CXCL 4的添加C5ar1−/−上清液恢复C5a条件的WT上清液和上清的作用。C5ar1Cxcl4-双基因敲除小鼠的结果与C5ar1−/−上清液(图1.7A)。此外,C5a刺激的WT血小板上清液可抑制内皮细胞的迁移(附图)。24A),而不影响增殖(附图)。24b)。接下来,我们用抗CXCL 4抗体包被Sepharose珠从C5a刺激的WT血小板上清液中去除CXCL 4.从C5a条件的血小板上清液中去除CXCL 4可显著增加内皮管的形成,提示C5a驱动的CXCL 4释放是介导血小板抗血管生成作用的核心因素之一。7b)。在……里面C5ar1−/−血小板上清液、CXCL 4耗竭均无影响。7b)。AS C5a可诱导PI3K、Akt和PKC磷酸化。6N-Q用相应的激酶抑制剂与C5a刺激后的血小板预孵育,是否能抑制C5a条件血小板上清液对内皮管形成的抑制作用。事实上,我们发现与车辆控制刺激的血小板上清液和C5a条件的血小板上清液与Akt、PI3K和PKC激酶抑制剂预孵育的血小板上清相比,导管形成没有显着性差异(见图)。7C).

图7:血小板C5aR1抑制新生血管依赖于CXCL 4的分泌。
figure7

aMHEC-5T与C5a刺激的WT血小板上清液共同孵育,C5ar1−/−,和C5ar1−/−CXCL 4−/−老鼠。此外,上清C5ar1−/−血小板添加CXL4(2μg/ml)。C5a刺激的WT血小板上清液抑制内皮管的形成,C5ar1−/−C5ar1−/−CXCL 4−/−血小板。使用CXCL 4在C5ar1−/−与WT组相比,组的管腔形成水平相似。数据显示为平均值±扫描电镜(n=5项独立实验)。车辆刺激血小板上清液治疗后的总管长为100%.*p < 0.05. bCxcl 4在C5a刺激的WT和C5ar1−/−观察血小板上清液对内皮管形成的影响。数据显示为平均值±扫描电镜(n=5项独立实验)。对照组C5a刺激上清液的总管长C5ar1−/−血小板代表100%。*p < 0.05. c新鲜分离的水洗小鼠WT血小板在C5a刺激前与载体控制或激酶抑制剂SH-6、Wortmannin和G 976共同孵育。上清液与MHEC-5T共同孵育,计数内皮管形成。预先用SH-6、Wortmannin和G 976孵育血小板,可使管状形成水平与车辆控制刺激的WT血小板上清液无显着性差异。数据显示为平均值±扫描电镜(n=4-8个独立实验)。对照组的总管长为100%。*p < 0.05. d原代小鼠肺内皮细胞CXCR 3−/−小鼠(内皮细胞质量控制参考补充图3)。与C5a刺激的血小板上清液共孵育后,在划痕创面实验中,WT内皮细胞的内皮细胞迁移减少。CXCR 3−/−内皮细胞迁移率明显低于WT细胞。数据显示为平均值±扫描电镜(n=6项独立实验)。车辆刺激WT血小板上清液消减后的WT内皮细胞组迁移率为100%。*p < 0.05. e同样,内皮管形成的减少也明显较小。CXCR 3−/−内皮细胞与C5a刺激的血小板上清液共同孵育后与对照上清液比较,与水平相当。C5ar1−/−C5a刺激血小板上清液。数据显示为平均值±扫描电镜(n=5项独立实验)。用车辆刺激的WT血小板上清治疗组的总管长为100%.*p < 0.05. f类似于后肢缺血模型。1A补体激活(C3b,红色)与血管结构(IB4,Green)在植入后7天内与Matrigel塞子共定位。×400放大率标尺代表100μm,显示的是四个独立实验的代表性图像。g为了研究C5a刺激后血小板的旁分泌效应,我们采用Matrigel模型分析了血小板和可溶性介质的加入后的血管形成情况。Matrigel加入bFGF,注入WT或C5ar1−/−老鼠。7天后对新生血管进行量化,可显著提高生长因子诱导血管生成的水平。C5ar1−/−动物比WT对照。数据显示为平均值±扫描电镜(n=每组6-8件)。WT小鼠体内新生血管面积分数为100%。*p < 0.05. h新分离的WT或C5ar1−/−血小板被重新悬浮在Matrigel中,Matrigel被植入C5ar1−/−7天后观察动物和血管形成情况。数据表示为平均值±扫描电镜(n=每组7-8件)。新血管面积分数C5ar1−/−补饲小鼠C5ar1−/−血小板代表100%表达为核染色的面积分数。*p < 0.05. iWT血小板或CXCL 4−/−血小板与Matrigel共注射C5ar1−/−动物。注射CXCL 4−/−血小板或车辆控制产生类似水平的生长因子诱导血管形成。然而,注射WT血小板显着地逆转了新血管形成的表型。C5ar1−/−老鼠。数据显示为平均值±扫描电镜(n=每组6马氏)。新血管面积分数C5ar1−/−再次输注车辆控制的小鼠代表100%的值,表示为核染色的面积分数。*p < 0.05, WT platelets versus CXCL 4−/−血小板。j用Matrigel共注射WT血小板C5ar1−/−用抗CXCL 4抗体或IgG对照系统治疗小鼠和动物.而接受WT血小板和IgG对照的动物则显示生长因子诱导的血管生成水平降低,而接受WT血小板和抗CXCL 4抗体的动物与未接受血小板再输血的对照组相比,血管形成水平没有显着性差异。数据显示为平均值±扫描电镜(n=每组7-9件)。未经血小板注射和车辆控制处理的WT小鼠材料中新生血管面积分数为100%表达为核染色的面积分数。*p < 0.001, anti-CXCL4 antibody versus IgG control. k加入碱性成纤维细胞生长因子(BFGF),加入PMX 53或PMX对照,注入WT小鼠体内。PMX 53组7d后新生血管定量显示生长因子诱导的血管生成水平明显增高。数据显示为平均值±扫描电镜(n=每组7马氏)。补充PMX对照的WT小鼠体内新生血管面积分数为100%。*p < 0.05. l在×400放大镜下,Matrigel插头切片的典型免疫荧光染色表明,添加PMX 53后,Matrigel新生血管(绿色的IB4,蓝色的细胞核)增加。标尺代表100米,图像代表至少四个分析插头。m脑缺血后肢肌肉组织C5ar1−/−缺血1周后,小鼠出现CXCL 4沉积(红色)。IB4染色(绿色)显示血管结构,DAPI(蓝色)细胞核。放大倍数为630倍,标尺为2m。n在×400放大率下,通过测量全肌肉切片中CXCL 4阳性染色的面积分数来定量CXCL 4的丰度。数据显示为平均值±扫描电镜(n=10整个肌肉切片(每组),并显示为控制的百分比。CXCL 4染色在WT小鼠后肢肌切片中的面积分数为100%。*p < 0.01. o对后肢缺血实验中的缺血肌肉组织进行匀浆,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测等蛋白含量的标本中CXCL 4的浓度。均质C5ar1−/−小鼠CXCL 4水平明显低于WT小鼠。数据显示为平均值±扫描电镜(n=6~8块肌肉加工)。ELISA法测定WT肌匀浆中CXCL 4的浓度为100%。*p < 0.05. p新鲜分离的水洗小鼠WT血小板,用PMX 205或车辆对照进行预孵育。ELISA法检测C5a诱导的CXCL 4分泌。PMX 205抑制C5a诱导的CXCL 4分泌。数据显示为平均值±扫描电镜(n=5-25个独立实验)。车控刺激的WT血小板上清液中CXCL 4浓度为100%。*p < 0.05. q用C5aR1抑制剂PMX 205处理WT小鼠和对照组,2周后进行后肢缺血模型分析。我们观察到PMX 205处理后动物的血管重建增加。数据显示为平均值±扫描电镜(n每组动物7只),以对侧对照肢体灌注的百分比表示。*p < 0.05 Two-sided Student’s t试验gk, n, o。单因素方差分析与Bonferroni后特别试验ae, p。与Bonferroni后特设试验的双向方差分析q.

为了进一步评价CXCL 4在血小板C5aR1介导的抑制血管生成中的作用,我们从小鼠肺内皮细胞中分离出原代小鼠肺内皮细胞。CXCR 3−/−老鼠。CXCR 3被认为是介导CXCL 4抗血管生成作用的内皮受体。35。C5a刺激的WT血小板上清液不抑制内皮细胞迁移。7D)和管的形成(图。7E)在CXCR 3−/−细胞与车辆控制刺激的WT血小板上清液比较,而这一作用是通过WT内皮细胞来表现的。7D)。此外,我们观察到内皮管的形成没有增加。CXCR 3−/−C5a条件与车控刺激上清液对内皮细胞的影响C5ar1−/−血小板(图1.7E).

我们继续通过小鼠模型研究血小板对C5a刺激后血管生成的调控机制,使我们能够选择性地加入C5aR1。+或C5aR1-血小板。为此,我们采用体内Matrigel塞塞法,在内皮生长因子的刺激下,将血管进入小鼠皮下注射的细胞外基质样凝胶中。12。类似于缺血后肢组织。1A我们观察到补体在诱导血管生长时激活,C3b沉积证实了这一点(图1)。7F)。在确认补体活化后,我们认为Matrigel塞子法是进一步确定血小板在血管形成中的功能作用的合适模型。与我们对C5aR1缺乏症导致的后肢缺血后血管重建的发现相一致(图1)。3),Matrigel插头C5ar1−/−7天后小鼠出现较大面积的新生血管,表明血管生成因子诱导的血管生长水平较高(图1)。7g)。为了进一步阐明C5aR1在血小板上的特异性作用,我们在补充碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)的Matrigel中重新悬浮新鲜分离的小鼠血小板。WT血小板抑制生长因子诱导的血管生成C5ar1−/−老鼠,这是不能观察到的C5ar1−/−血小板(图1.7H)。接下来,我们把Matrigel注射到C5ar1−/−小鼠,并补充WT血小板或从CXCL 4−/−动物。相比较CXCL 4−/−血小板、WT血小板抑制生长因子诱导的血管生成C5ar1−/−老鼠(图1.7I)。在另一组实验中,我们系统地通过静脉注射抗cxcl 4阻断抗体或控制IgG来抑制cxcl 4。36。火柴塞C5ar1−/−与对照组相比,添加WT血小板的小鼠在CXCL 4被抑制时,生长因子诱导的血管生成增加。C5ar1−/−小鼠补充WT血小板+IgG注射液;7J)。最后,我们研究了C5a-C5aR1轴在血管生长过程中是否会受到药物上的影响。Matrigel加入C5aR1拮抗剂PMX 53或相应的对照肽。与对照组相比,C5aR1抑制导致生长因子诱导的血管生成增加(图1)。7K,l).

在后肢缺血模型中,我们检测缺血后1周肌肉组织中CXCL 4的沉积,CXCL 4在血管外沉积。7米)。有趣的是,我们检测到CXCL 4在后肢肌肉匀浆中的水平明显降低。C5ar1−/−小鼠后肢缺血比WT小白鼠对照组(图1)。7O)。这些发现有力地支持了我们的假说,即C5a诱导的CXCL 4是体内缺血再血管化的一个重要的负调节因子。通过组织切片分析,我们发现CXCL 4沉积量明显减少。C5ar1−/−老鼠(图1.7m,n)。当我们用C5aR1特异性拮抗剂PMX 205在体外特异性靶向C5aR1时,C5a诱导的血小板CXCL 4分泌完全消失(图一)。7P)。此外,在体内使用C5aR1拮抗剂PMX 205,我们观察到在C5aR1被抑制的第4~10天,血管化明显增加(如图1所示)。7q),而PMX 205对尾出血时间无影响(附图)。25).

总之,我们为止血细胞与天然免疫系统在组织再血管化过程中的功能串扰提供了证据。更具体地说,我们证明,血小板C5aR1在体外抑制内皮功能,减少生长因子诱导的血管生成和缺血诱导的体内血管化。我们机械地鉴定了血小板来源的CXCL 4在C5a/C5aR1轴下游的产生和分泌是一种分泌途径,血小板通过此途径控制血管的形成。

讨论

虽然补体成分和血小板衍生介质都有助于血管形成的调节。9,10,11,12,18,25,26,27,29,37,38,39,40,41,42,43在血管重建的背景下,血小板与补体系统之间的功能交叉尚未被研究。在此,我们描述了血小板上的过敏毒素受体C5aR1在缺血和血管再生组织中的作用。我们发现:(1)血小板通过C5aR1调节与血管生成相关的内皮功能;(2)血小板C5aR1介导缺血再血管化对侧支动脉形成的抑制作用;(3)毛细血管形成和周细胞覆盖;(Iv)血小板在C5a刺激下释放CXCL 4;(V)血小板C5aR1介导的血管形成作用是由CXCL 4在体外和体内的优先释放介导的。

C5a受体1在免疫细胞、上皮细胞和内皮细胞上表达。8。有趣的是,据报道,补体过敏毒素受体在血小板上表达。21,24,这些细胞是止血系统的细胞,它们的表达与动脉粥样硬化(一种以血管炎症为特征的疾病)中的血小板活化标志有关。22。血小板表达多种补体调节蛋白。44)。在本研究中,我们观察了血管化组织中血小板的增加,并在血管生成组织中检测到了血小板上的过敏毒素受体C5aR1。未来的研究应该探讨血小板或血小板衍生因子是否可以作为生物标记物来检测或表征血管生成组织。45。重要的是,我们通过血小板重建和药物抑制的方法,证明了血小板C5aR1对体外内皮功能和体内新生血管的重要性。此外,我们建立了血小板特异性C5aR1缺陷小鼠模型,专门评估血小板C5aR1介导的作用。

血小板或血小板衍生介质在肿瘤血管生成中的抗血管生成作用已被认为是肿瘤血管生成的重要途径。在肿瘤生长的早期阶段,观察到血小板衍生的血小板反应素1是血管生成的负调节因子。38。在这里,我们确定了补体驱动的释放机制的血小板衍生趋化因子CXCL 4作为血管形成的抑制剂,在体内,以及内皮功能在体外。意大利等。另一些研究表明,不同的促血管生成因子和抗血管生成因子储存在血小板α颗粒的不同亚群中,这些因子在特定刺激下可以被不同程度地释放出来。25,27。然而,我们对这种量身定做的分泌机制的理解很差。例如,在血栓形成过程中,血小板释放血管抑素的动力学与血管内皮生长因子的分泌不同。46。此外,蛋白酶激活的受体1和4可以逆转内皮抑素和血管内皮生长因子从人血小板中的释放。47。在此,我们发现C5a/C5aR1轴不仅是血小板活化的一种强有力的诱导剂,而且还证明了该途径驱动了α-颗粒组分CXCL 4的释放,而C5a/C5aR1与其他α-颗粒组分(如P-选择素)仅部分协同作用。

血小板含有促血管生成因子和抗血管生成因子。27。因此,血小板在卵巢癌等条件下也被描述为促血管生成介质。48。事实上,临床医生使用血小板衍生产品来促进骨科病人的愈合。48,49,部分原因是由于它们的血管生成特性。在此,我们观察了血小板C5aR1在缺血再血管化中的特异性抑制作用。此外,血小板对于防止新形成的血管过度出血也很重要。39。血小板对血管形成的净影响可能取决于周围的微环境或其他因素,这些因素在未来的研究中应该得到进一步的研究。

补体激活在缺血再灌注损伤(IRI)中有很好的特点(文献综述)。50)。然而,这项工作显示补体沉积在无再灌注的后肢缺血组织中。通过经典途径,活性氧(ROS)的产生被认为是IRI中补体激活的主要驱动因子。最有可能的是,这种机制也适用于后肢缺血模型,在这种模型中,即使在没有再灌注的情况下,ros的生成也起着关键作用。51。此外,缺血组织中激活的内皮细胞可能与gC1qR结合,从而激活经典的补体通路。52,53.

补体系统被认为参与了血管生成的调节。8,12,18。C5aR1对血管重建术的抑制作用与以前的报道一致。10,12。在早期的研究中,我们发现C5aR1通过分泌巨噬细胞分泌的可溶性VEGF受体1(SVEGFR 1)来抑制血管生成。补体介导的sVEGFR 1释放被认为与胎盘功能障碍有关。10。这与我们目前关于补体介导的抑制新生血管也依赖于血小板的发现是如何一致的?血管形成和生长是生物体中普遍存在的机制,需要不同细胞的促血管生成和抗血管生成刺激的平衡。54。因此,几种细胞类型可以利用补体系统作为调节血管生成和血管重建的手段。补体系统是个体遗传上最古老的血浆蛋白系统之一,在免疫和组织修复过程中介导各种细胞系统之间的相互干扰。1.

其他的研究也报道了血管生成水平的下降。C5ar1−/−小鼠9缺乏补体因子3的小鼠55。这些研究探讨了补体系统在激光诱导的脉络膜新生血管中的作用,这是一种老年性黄斑变性的模型,其中视网膜色素上皮发挥着独特的病理生理作用。56。鉴于补体系统的多功能性,它有可能以一种上下文依赖的方式调节血管生成,例如刺激眼部血管生成,但在其他组织和实验模型中产生不同的作用。

在本研究中,我们确定了血小板C5aR1在血管重建中抑制作用的机制。抗血管生成因子CXCL 457,58用C5a刺激血小板释放,并以受体特异性的方式介导这种作用,体外和体内实验证实了这一点。在这一点上,我们不能排除除C5a刺激释放的CXCL 4以外的其他血小板因子介导所观察到的血管化调节作用。在今后的调查中,必须查明和研究这些因素。

CXCL 4是一种促凝血剂,它与肝素结合和中和,不仅影响止血,而且起到血管生成抑制剂的作用。CXCL 4在血管稳态中的作用是复杂的。在体内,使用各种转基因小鼠模型的研究表明,CXCL 4在血栓形成中起着重要作用。CXCL 4的中和作用确定了其在肝素抗凝作用中的中心作用59。其他人则在灵长类动物模型中证明,与生理相关的CXCL 4能刺激活化蛋白C(APC)的生成,这表明CXCL 4在可溶性凝血级联中起着先前被低估的作用。60。Cxcl 4与凝血酶调节蛋白和蛋白C的结合具有较高的特异性和亲和力,这可能增强凝血酶-凝血酶调节蛋白复合物对蛋白C的亲和力,从而促进APC的产生。61。有趣的是,CXCL 4可以改变纤维蛋白的结构,从而有助于血凝块的密封。62.

先前的研究发现c3a和c5a是血小板活化、凝胶过滤的人血小板聚集和5-羟色胺释放的激活剂。63,64。对于C5a,我们检测到血小板活化增加,但没有发现明显的致密颗粒从小鼠血小板释放。在这一点上,我们不能完全解释为什么C5a诱导2b/b3整合素激活而不是聚集。需要进一步深入的研究来描述这一观察。众所周知,C5缺乏症能保护小鼠免受致命性血栓形成的影响。在组蛋白肝损伤模型中,缺乏C5的小鼠较C5能胜任的小鼠有较轻的血小板减少、消耗性凝血病和肝损伤。65。我们发现C5缺陷血小板在C5a刺激下分泌CXCL 4。有趣的是,在我们的研究中,C5aR1的缺失对体内止血或出血时间没有影响,这与活化血小板的止血功能不同。

引人注目的是,我们观察到靶向CXCL 4足以阻断血小板C5aR1对血管形成的影响。这些发现提示C5aR1的传递作用可能被药物阻断,CXCL 4是C5a刺激血小板时释放的主要血管生成因子。然而,在这一点上,我们不能完全排除,除了CXCL 4以外,其他血小板因子在C5a刺激下被释放,并有助于观察到的血管化调节作用。

C5a受体1是一个七跨膜的G蛋白偶联受体,它通过Gβγ亚基传递信号,该亚基诱导PI3Kγ依赖的Akt磷酸化和Gαi亚基,导致pKa活化。66。总体而言,C5aR1依赖信号转导途径复杂,包括PI3K和Akt依赖通路、pkc和MAPKs、iκBα、NFκB和鞘氨酰肌醇1磷酸(S1P)。67。在T细胞中,C5aR1通过PI3K和Akt传输信号。68,69。在中性粒细胞中,C5a诱导的PI3K信号被证实。70,在巨噬细胞PI3K、Akt、MEK 1/2和ERK 1/2信号转导中71。此外,pcβ还参与了c5ar1信号传递,特别是在pkc参与的情况下。72。本实验证实了PI3K、Akt、PLCβ3、PKC和ERK 1/2的信号通路,没有检测到γ2、pKa和Rap-1与血小板C5a相关的信号。这一点很重要,因为C3aR最近已经在血小板上通过Rap1显示了信号。23,24。已经观察到p1k和akt依赖的途径导致pkc活化,例如par-1驱动的cxcl 12释放。73.

我们发现C5aR1缺乏的小鼠缺血肌肉组织中CXCL 4的丰度增加。血小板是生物体中CXLC 4的主要来源。74。在体外,我们发现C5a刺激后血小板释放的主要成分是CXCL 4,C5a介导了对内皮功能的抑制作用,如管状形成和迁移。CXCL 4的这一效果与以前的研究结果一致。75。在体内,动脉生成或侧支动脉生长被认为是股动脉结扎后后肢血管重建术的主要机制。76。事实上,我们观察到血小板特异性C5aR1缺陷小鼠的侧支动脉形成增加,与其增强血管化的表型有关。我们观察了评估基因型(WT与WT)在后肢血管重建方面的差异。C5ar1−/−PF4-cre+/C5ar1Fl/fl)缺血后。虽然我们已经量化了非缺血对照肢体的血管网络,但在这一点上,我们不能完全排除血小板C5aR1对小鼠后肢中预先存在的络的形成也有影响。而在远端后肢,动脉的大小和数目不存在差异,但我们注意到血管密度的差异,表明血管生成相关的过程。这与最近的报告一致,该报告将血管生成在后肢血管重建中发挥了重要的补充作用。77.

了解血小板特异性C5aR1缺乏症小鼠的表型的一个关键可能是周细胞血管的存在和扩增,我们在血小板特异性C5aR1缺陷动物中观察到了这一点。周细胞表达CXCR 3,CXCL 4的受体78。探讨C5aR1-cxcl 4轴对周细胞生物学的影响可能是今后研究的一个非常有趣的途径,因为周细胞也被认为是急性缺血事件(如心肌梗死)后组织损伤的媒介。79.

我们的观察可能具有临床意义,因为靶向血管生成已经成为治疗癌症和心肌梗塞等血管疾病的重要治疗方法。54,80。补体系统的调制被认为是一种很有前途的药物发现策略。81。补体系统已被证明是治疗越来越多的临床疾病,包括阵发性夜间血红蛋白尿症(PNH)的一个有希望的治疗靶点。82,83非典型溶血性尿毒症84。C5阻断单克隆抗体(MAb)已成功应用于PNH超过10年,一种特异性C5aR1拮抗剂(Avacopan)已被食品和药物管理局批准用于治疗抗中性粒细胞胞浆抗体相关血管炎。翻译研究表明,C5a和C5b-9复合物抑制体外循环中的白细胞和血小板活化。85。在可溶性凝血系统方面,C5a被认为是治疗脓毒症的药理学靶点,因为它可以对抗凝血和纤溶之间的稳态损伤。86。此外,目前有大量针对补体系统的额外治疗方法正在进行中。87。最后,补体系统在临床前的一些免疫和心血管疾病,如关节炎,被评价为一种治疗方法。88、脓毒症89、IRI90抗磷脂综合征胎儿损伤91,以及腹主动脉瘤92。在这些临床环境中,针对C5aR1的血管重建策略是否有益,还有待于进一步的研究。在这里,我们成功地利用C5aR1拮抗剂在体内靶向C5aR1,导致血管形成增加。应用抑制C5a/C5aR1轴的补体系统抑制剂可能是将血小板介导的缺血性疾病(如冠状动脉或外周动脉疾病)的反应转移到血管再血管化的一种很有前途的方法。

总之,我们的发现强调血小板和补体系统在血管形成中的作用,并将C5aR1-CXCL 4轴确定为这三个系统之间的交点。


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