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溶酶体巨噬细胞复合体通过激活肌球蛋白Ⅱ在白细胞的转运中起着至关重要的作用

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发表时间:2021-06-08 10:03作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

溶酶体通过雷帕霉素复合物1(MTORC 1)的机制靶点参与营养感知。MTORC 1与溶酶体被Ragator复合体(Lamtor1包绕Lamtor2-5)连接在溶酶体上。虽然Ragator复合物是细胞迁移所必需的,但其参与细胞运动的机制尚不清楚。在此,我们发现溶酶体在运动细胞中向尿荚移动,提供了一个平台,使Lamtor 1与肌球蛋白磷酸酶Rho相互作用蛋白(MPRIP)独立于mTORC 1相互作用,并干扰MPRIP与肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)亚基MYPT 1的相互作用,从而增加肌球蛋白II介导的actomyosin收缩。另外,白血球迁移和病理生理免疫反应需要形成完整的Ragator复合体。我们的研究结果表明,溶酶体Ragator复合物通过与MPRIP相互作用而激活肌球蛋白Ⅱ,从而在白细胞迁移中发挥重要作用。

导言

溶酶体是膜结合的细胞器,降解大分子以回收其组成的代谢物.这一过程中的功能障碍会导致溶酶体储存障碍和原发性免疫缺陷综合征。1, 2。最近的研究表明,溶酶体作为营养敏感信号平台发挥作用,mtorc 1与ragator-rag gtp酶复合物结合。3。Ragator复合物是包含两种异二聚体的五聚体:Lamtor 1/p18包裹Lamtor2/p14-Lamtor3/mp1和Lamtor 4/p10-Lamtor5/HBXIP,并将Ragator复合物锚定在溶酶体膜上,而RAGGTPase杂二聚体raga/b和ragc/D依次被拉格GTPase异源二聚体raga/B和ragC/D锚定。4, 5。在营养丰富的条件下,mTORc 1通过Ragator复合物被固定在溶酶体膜上,从而激活下游信号因子,如p70S6激酶1(S6k),促进各种细胞类型的蛋白质合成、细胞增殖和自噬。6, 7。Ragator复合物在免疫细胞中也有表达,而巨噬细胞中Lamtor 1的缺乏导致mTORC 1依赖性的M2巨噬细胞极化功能受损,这是由于脂质代谢异常所致。8。Lamtor 1的缺乏导致S6K磷酸化降低,LXR配体25-羟基胆固醇水平降低,导致LXR依赖基因的表达,这些基因对M2巨噬细胞的分化具有重要意义。此外,促炎细胞因子的产生在兰托尔1/–巨噬细胞核转录因子EB易位增加9.

溶酶体及其定位已被证明与细胞运动有关。10, 11。在白细胞中,一种进行免疫监视的特殊运动细胞。12,溶酶体通过提供钙来促进细胞运动。2+便利细胞骨架组织13,以及通过外生细胞降解细胞外基质(ECM),使细胞从ECM中分离出其后缘。14。白细胞不使用整合素,而是使用促肌球蛋白收缩,特别是在三维环境下。15, 16。树突状细胞(树突状细胞)是一种专业的抗原提呈白细胞,它通过将外周抗原传递到次级淋巴器官来连接天然免疫和获得性免疫,从而促进抗原特异性T细胞的启动。17, 18,可以通过采用适合于2D或3D环境的迁移模式来跨越许多物理障碍。19,20。在受限的三维环境中,它们主要使用肌球蛋白Ⅱ激活所产生的actomyosin收缩力。15, 16,19。肌球蛋白轻链磷酸化受钙平衡的调节2+钙调素介导的MLC激酶(MLCK)和MLC磷酸酶(MLCP)。MLCP是由肌球蛋白磷酸酶靶向亚基1(MYPT 1)、20 kDa小亚基(M20)和Ⅰ型蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶家族催化亚基(PP1cδ)组成的一种异三聚体。16。MLCP由肌球蛋白磷酸酶-rho相互作用蛋白(mprip,又称p 116)锚定在肌动蛋白-肌球蛋白束上。拉皮)21,通过抑制MYPT 1磷酸化来调节MLCP的活性,从而使PP1cδ的催化活性丧失。22。然而,DC中肌球蛋白Ⅱ通过溶酶体激活的分子机制尚未完全阐明。

在本研究中,我们发现在溶酶体膜上表达的Ragator复合物通过调节肌球蛋白II依赖性的腺球蛋白收缩而在白细胞迁移中起关键作用。在DC运动过程中,溶酶体定位于泌尿系,Ragator复合体与MPRIP相互作用,干扰MPRIP与MYPT 1的相互作用,导致MLCP活性下降。此外,由于MPRIP相互作用的缺陷,Lamtor 1突变体无法形成Ragator复合物,无法恢复MLC磷酸化和细胞迁移。此外,DC-和中性粒细胞特异性Lamtor 1缺陷小鼠由于体内迁移受到损害而减少了皮肤DLN中的迁移DC亚群和炎症腹膜中浸润的中性粒细胞,从而产生了致病性免疫应答。

结果

溶酶体表达的Lamtor 1在dc迁移过程中定位于泌尿系。

我们首先用酸性荧光橙可视化溶酶体23,在酸性细胞器中形成更多的荧光,以确定溶酶体在DC迁移过程中的定位。在本实验中,我们研究了一种模拟体内三维环境的2毫克/毫升Ⅰ型胶原基质内的直流运动。15, 24。与以前的报告一致15, 25迁移的DC细胞体由于前缘突出而呈拉伸状。随后,由于泌尿系的收缩,细胞体向前推进。在收缩期,酸性荧光阳性溶酶体定位于细胞体以及伸长的DC的后部(如图所示)。1A,补充电影1)。此外,抗LAMP 1抗体检测到的溶酶体优先定位于非极化细胞的核周区域,而定位于极化细胞的周边区域和尿囊(图1)。1B)。由于在溶酶体膜上表达的Ragator复合体参与了细胞的运动。26, 27我们将重点放在Lamtor 1上,研究Lamtor 1在极化和非极化细胞中的定位。Lamtor 1蛋白的分布与LAMP 1的分布相似(图1)。1C),而Lamtor 1和LAMP 1无论细胞极化与否都是共同定位的(如图所示)。1D)。此外,磷酸化的MLC同时存在于极化细胞的前缘和尿荚上,Lamtor 1与磷酸化的MLC在尿荚中共定位(图1)。1E)。因此,我们推测Lamtor 1在溶酶体膜上的表达是通过调节肌球蛋白II介导的尿囊收缩来调节细胞运动的。

图1:溶酶体和Lamtor 1在迁移DC后方的定位。
figure1

a在有限的三维环境中DC迁移过程中溶酶体的定位。用1μM酸性荧光橙标记BMDC,用LPS刺激2 h,采用延时视频成像技术,在Zigmond腔内,以CCL 19(5μg/ml)作为I型胶原凝胶(2mg/ml),每隔1 min,观察DC(左)和酸性荧光阳性溶酶体(洋红)的运动。b, cLAMP 1的本地化+溶酶体(b)和Lamtor1(c)在非极化和极化的DC中。用抗LAMP 1(绿色)染色b),反Lamtor 1(红色)(c),用共聚焦显微镜观察。形态学上鉴定了极化细胞和非极化细胞。显示了具有代表性的图像。标尺,10μm(左)。测定了核周和周边区域的ROI百分比。n=30)(右)。核周区被定义为核膜5μm以内的区域,周边区域被定义为细胞核周围区域以外的细胞区。dLamtor 1和LAMP 1在非极化(上)和极化(下)DC中的共定位。用抗LAMP 1(红色)、抗LAMP 1(绿色)、DAPI(白色)染色,共聚焦显微镜观察。显示了具有代表性的图像。标度棒,10μm。数据代表三个实验。eLamtor 1和磷酸化MLC的共定位。THP 1染色可见Lamtor 1和磷酸化的MLC,以抗p-MLC(绿色)表达Lamtor 1标志(红色)。具有代表性的极化细胞共焦图像(左);标度棒,10μm(上)。Lamtor 1(红色)和p-MLC(绿色)的强度(较低)。Lamtor 1和p-MLC在极化细胞体部或尾部的共定位百分比(n=25个细胞)(右)。数据是三个实验的代表。用双面钢Dwass试验进行统计分析。b, c)或曼恩-惠特尼U试验(e)[中位数;第25和75百分位数;以及不包括异常值的人口的最低和最大百分比;*p < 0.0001].

Lamtor 1缺陷下三维环境中DC迁移的失效

为了评估lamtor 1在dc迁移中的参与程度,我们生成了dc特定的兰托尔1-缺乏小鼠(CD11c)-Lamtor1浮标/浮标)通过交叉兰托尔1浮标/浮标CD11c-CRE小鼠(附图)。1),用Transwell进行趋化试验。对.的反应兰托尔1−/−骨髓来源的DC(BMDC)对CCL 19或CCL 21的表达水平低于WT DC,但CCR 7的表达水平相当(图1)。2A,补充图。2A)。对单细胞运动的时移视频成像分析表明,纤维连接蛋白包被物上随机直流迁移的平均速度和DC对ccl 19的响应方向和速度在WT和ccl 19上是相当的。兰托尔1−/−补充图2B-d,补充电影2, 3)。纤维连接蛋白包被板的贴壁细胞百分比在WT和wt之间没有差异。兰托尔1−/−补充图2E)。另一方面,兰托尔1−/−DCS在CCL 19的作用下,在由2mg/mlⅠ型胶原组成的三维胶原基质中迁移,模拟DC的生理三维环境,由于尿道缩回功能受损和前缘正常突出而形成拉长的形状,导致DC迁移受损(图1)。2B-f,补充电影4, 5)。此外,mlc磷酸化程度较低。兰托尔1−/−即使在非刺激条件下,DCS也要比WT中的DC要好(见图)。2G),表明Lamtor 1在3D环境中是DC运动所必需的,而不是2D环境中所必需的,Lamtor 1调节肌球蛋白II的活性。此外,溶酶体在非极化状态下倾向于分布于周边区域。兰托尔1−/−以前在成纤维细胞中观察到的DCS26, 28,同时也定位于极化的泌尿系。兰托尔1−/−DCS(图1.2H)。细胞内LAMP 1蛋白表达水平的研究兰托尔1−/−DCS与WT DC相当(图1)。2I)。这些结果表明,DC迁移受损并不是由于溶酶体的产生或向泌尿囊的分布受到损害所致。

图2:Lamtor1缺乏症下收缩区DC迁移的损害。
figure2

aWT的趋化性(白条)和兰托尔1−/−在Transwell检测系统中,BMDC向CCL 19(上)或CCL 21(下)的指示浓度(孔径为5μm)方向移动。数据是三个实验的代表。bfDC在三维胶原基质中对CCL 19的反应WT(上)和兰托尔1–/–采用延时视频成像技术,观察Zigmond腔内Ⅰ型胶原凝胶(2mg/ml)对CCL 19(5μg/ml)的影响。用ImageJ手动跟踪软件测定DC的速度。直流运动的连续图像:时间(h:min)显示在每个面板上。标尺,30μm(b)。前缘平均速度(c)和泌尿系(d),单个单元格的最大长度(e),以及泌尿类动物静止期的百分比(f) (n=40 WT细胞和n=40 KO细胞)。gMLC磷酸化在WT和兰托尔1−/−BMDC用抗P-MLC抗体Westernblotting(上)检测MLC磷酸化.数据是三个实验的代表。用ImageJ法测定SDS-PAGE凝胶带中的蛋白质浓度,并进行统计学分析(下)。n=3)。hLAMP 1的本地化+非极化和极化DC的溶酶体。兰托尔1−/−用抗LAMP 1(绿色)、phalloidin(蓝色)、DAPI(白色)染色,共聚焦显微镜观察。非极化细胞(左)和极化细胞(右)的代表图像。标尺,10μm(左)。非极化细胞和极化细胞的核周和周边区域感兴趣区域(ROI)的百分比(n=30)(右)。iWT和LAMP 1蛋白水平兰托尔1−/−BMDC用免疫印迹法检测LAMP 1蛋白的含量,并与抗LAMP 1抗体(上)进行比较。数据是三个实验的代表。用ImageJ法测定SDS-PAGE凝胶带中的蛋白质浓度,并进行统计学分析(下)。n=3)。由双面学生进行统计分析t-测试(a, g, i)[指±S.D.;*p < 0.05, **p < 0.01, *p < 0.005] or two-sided Mann–Whitney U试验(cf, h)[中位数;第25和75百分位数;以及不包括异常值的人口的最低和最大百分比;*p < 0.001, **p < 0.0001; NS, not statistically significant].

独立于mTORC 1的DCS迁移

Lamtor 1是mTORC 1的一种支架蛋白。7。一些研究报告说,雷帕霉素是一种mtorc 1特异性抑制剂,能干扰白细胞的转运,尽管这些发现仍有争议。29,30,31,32。雷帕霉素和Torin 1(mTORC 1/mTORC2抑制剂)在完全抑制S6K磷酸化的剂量下,DC对CCL 19的反应不受影响。3A,b),无论氨基酸浓度如何(补充图。3A,b)。此外,迁移的DC在三维胶原基质中的运动和形态是相似的。3C),雷帕霉素处理的DC和未处理的DC的MLC磷酸化水平也是相当的。三维空间)。有趣的是,S6K在脾脏DC和BMDC中磷酸化,而不考虑Lamtor 1的存在(补充图1)。3C,d)。这些结果提示S6K磷酸化对DC迁移是可有可无的,Lamtor 1在DC中的S6K磷酸化并不是必需的。此外,由于Lamtor2/3复合物是MEK的支架,所以Ragator复合物参与了MEK通路。26, 33。然而,MEK抑制剂U 0126处理的DC即使在较高的药物浓度下也不会降低CCL 19诱导的细胞运动(图1)。3E)。此外,U 0126处理的DC与未处理的DC之间的MLC磷酸化没有差别(图1)。3F)。这些结果表明,MEK依赖的途径对于DC迁移是不可缺少的。

图3:mTOR抑制不影响DC迁移。
figure3

a, bMTORC 1抑制剂对CCL 19的趋化作用雷帕霉素对CCL 19(500 ng/ml)的趋化作用a)和Torin 1(b),用Transwell法测定(孔径为5μm)(上)。数据代表三个实验(平均±S.D.)。雷帕霉素处理S6K的磷酸化a)和Torin 1(b)用Westernblotting(下)法测定。c雷帕霉素作用下三维胶原基质的DC迁移采用延时视频成像技术,观察了含10 nm雷帕霉素的Ⅰ型胶原凝胶(2mg/ml)对CCL 19(5μg/ml)的影响,并利用ImageJ手动跟踪软件分析了尿荚(上)的速度和下尿囊的静止期百分比。n=40)。d雷帕霉素处理DC的MLC磷酸化。分别用抗p-MLC和抗p-S6K抗体进行Westernblotting,评价10 NM-雷帕霉素作用下MLC磷酸化和S6K磷酸化的变化(左)。数据是三个实验的代表。用ImageJ法测定SDS-PAGE凝胶带中p-MLC的浓度,并进行统计学分析(右)。n=3)。eU 0126处理的DC对CCL 19的趋化作用。TRWBMDC对CCL 19(500 ng/ml)的趋化作用,用Transwell法(孔径为5μm)测定MEK抑制剂U 0126的浓度(上)。数据代表三个实验(平均±S.D.)。fU 0126处理DC的MLC磷酸化用抗p-MLC和抗p-ERK抗体(左)进行Westernblotting检测MLC和ERK在20μMU 0126存在下的磷酸化。数据是三个实验的代表。用ImageJ法测定SDS-PAGE凝胶带中p-MLC的浓度,并进行统计学分析(右)。n=3)。由双面学生进行统计分析t-测试(a, b, df)[意为±S.D.]和双边Mann-WhitneyU试验(c)[中位数;第25和75百分位数;人口的最小和最大;NS没有统计意义]。

Lamtor 1独立于mTOR与MPRIP交互

接下来,为了鉴定Lamtor 1相关分子,我们对wt和wt的裂解物进行了lcms分析。兰托尔1−/−BMDC用抗Lamtor 1抗体进行拔出。Ragator复合体Lamtor 2的组成蛋白被降下来(补充表)1)。我们将重点放在mprip上,因为它已经被证明锚定mrcp亚基MYPT 1在actin-myosin束上,以促进mrcp的活动。34, 35。为了确定Lamtor 1是否与MPRIP相互作用,我们建立了稳定表达V5标记MPRIP(MPRIP-V5-HEK293T)和共表达标志标记Lamtor1(Lamtor 1-标志)的HEK293T细胞。在免疫沉淀实验中,Lamtor 1和MPRIP共沉淀(图1)。4A)。此外,Lamtor 1和MPRIP共同定位于泌尿科(图1)。4B)。此外,无论雷帕霉素治疗,Lamtor 1与MPRIP之间的相互作用都会发生。4C)。这些结果表明,Lamtor 1和MPRIP在泌尿系中相互作用,不依赖于mTORC 1。

图4:Lamtor 1独立于mTORC 1与MPRIP交互。
figure4

aLamtor 1与MPRIP的相互作用。将标记标记的Lamtor 1表达载体或对照载体转染V5标记-MPRIP-表达的HEK293T细胞。用抗V5抗体(左)或抗旗抗体(右)溶解、沉淀细胞,用抗V5和标志抗体进行Westernblotting检测。用抗β-actin抗体检测全细胞裂解物.数据是三个实验的代表。bLamtor 1和MPRIP的共定位。用抗MPRIP和抗标志抗体共聚焦显微镜观察MPRIP在Lamtor1标记表达THP 1中的定位。给出了极化电池中MPRIP(绿色)和Lamtor 1(红色)的代表图像。标度条,10μm(上),以及mprp(绿色)和Lamtor 1(红色)信号的强度(左下)。Lamtor 1和MPRIP在极化细胞体或尾区共定位的百分比(n=40)(右)。cLamtor 1与MPRIP的交互独立于mTORC 1。将旗标-Lamtor1表达载体或对照载体转染表达V5-MPRIP的HEK293T细胞48小时后,用10 NM雷帕霉素处理细胞2h,用抗V5(左)或抗旗抗体(右)沉淀裂解液,免疫沉淀用抗V5和标志抗体进行免疫印迹。用抗β-actin、抗S6K和抗膦-S6K抗体对WCL进行免疫印迹。数据是三个实验的代表。统计分析由双边的Mann-Whitney进行。U试验(b)[中位数;第25和75百分位数;以及不包括异常值的人口的最低和最大百分比;*p < 0.0001].

Lamtor 1与MPRIP的相互作用干扰MPRIP与MYPT 1的结合

为了进一步研究Lamtor 1是否干扰MPRIP与MYPT 1的结合,我们首先建立了人单核细胞样细胞系THP 1的Lamtor 1缺陷衍生物,兰托尔1-KO-THP 1,使用CRISPR/Cas9系统。然后我们在这些细胞中重新表达标记标记的全长Lamtor 1(兰托尔1-KO-全-THP 1)(附图4)。我们用免疫共沉淀的方法研究了MPRIP与MYPT 1的相互作用。兰托尔1-KO-THP 1,和兰托尔1-KO-全-THP 1,抗MPRIP抗体。在WT-THP 1中,MYPT 1和MPRIP的共沉淀量较低,但较高。兰托尔1-KO-THP 1,而兰托尔1-KO-THP 1在兰托尔1-KO-全-THP 1(图1.5A)。此外,我们还用共聚焦显微镜比较了MPRIP和MYPT 1在WT和Lamtor1-KOTHP 1细胞中的定位。有趣的是,在WT THP 1中,MYPT 1在泌尿架上的定位降低,而在兰托尔1-KO THP 1、MYPT 1在泌尿系中均有表达,且与MPRIP在尿荚中的共同定位程度大于WT THP 1(图1)。5B)。通过敲除Lamtor1-KO-THP 1内源性MPRIP,进一步评价Lamtor1-MPRIP相互作用在细胞迁移中的作用。MLC磷酸化和趋化性兰托尔1-KO-THP 1,被MPRIP击倒后恢复到与WT-THP 1相同的水平。5C)。这些结果表明Lamtor 1与MPRIP之间的相互作用是细胞运动的重要因素。

图5:Lamtor 1与MPRIP的相互作用干扰了MPRIP与MYPT 1之间的相互作用。
figure5

aMPRIP和MYPT 1在Lamtor 1存在或不存在时的相互作用。亲本THP 1细胞(WT-THP 1),Lamtor1缺陷型THP 1(兰托尔1-KO-THP 1)兰托尔1-KO-THP 1细胞,在其中重新表达全长Lamtor 1标志(兰托尔1-KO-Full-THP 1裂解,用抗MPRIP抗体沉淀,用抗MYPT 1抗体和抗MPRIP抗体(左)进行Westernblotting检测.数据是三个实验的代表。用ImageJ法测定与MPRIP共沉淀的MYPT 1在SDS-PAGE凝胶带中的浓度,并进行统计学分析(右)。bMPRIP和MYPT 1的共定位。MPRIP和MYPT 1在WT和兰托尔1-KO-THP 1用抗MPRIP抗体和抗MYPT 1抗体进行共聚焦显微镜观察。给出了MYPT 1(绿色)和MPRIP(红色)在极化细胞中的代表图像。标尺,10μm(左)。MPRIP和MYPT 1在极化细胞尾区共定位的百分比(n=40)(右)。cMPRIP敲除THP 1细胞的MLC磷酸化和趋化性。WT-THP 1或兰托尔1-KO-THP1细胞经对照shRNA(WT-sh-ctrl-THP 1,兰托尔1-KO-sh-ctrl-THP 1或MPRIP-shRNA(兰托尔1-KO-sh-MPRIP-THP 1)用Westernblotting(右)法检测MPRIP、MYPT 1和MLC磷酸化水平。WT-sh-ctrl-thp 1(白条),lamtor1-ko-sh-ctrl-thp 1(黑条)的趋化性兰托尔1-KO-sh-MPRIP-THP 1(网吧)对CCL 2(25 ng/ml)的反应用Transwell法(孔径为5μm)(左)进行评价。数据是三个实验的代表。用图基(Tukey‘s)后特设检验进行双面方差分析(P<0.01)。a, c)[指±S.D.;*p < 0.05, **p < 0.01], or two-sided Mann–Whitney U试验(b)[中位数;第25和75百分位数;以及不包括异常值的人口的最低和最大百分比;*p < 0.0001].

Lamtor1介导的运动是由肌球蛋白Ⅱ的活性所驱动的。

接下来,我们研究了肌球蛋白II依赖性促肌球蛋白对Lamtor1介导的运动是否重要。MLC磷酸化,在兰托尔1-KO-THP 1,通过对Lamtor1的加法,恢复到与WT-THP 1相同的水平(图1)。6A)。此外,对CCL 2的趋化作用在兰托尔1-KO-THP 1,但已恢复到与WT-THP 1相同的水平兰托尔1-KO-全-THP 1,和恢复的运动兰托尔1-KO-全-THP 1被博比司他汀(一种肌球蛋白II抑制剂)治疗后减弱(如图所示)。6B)。此外,在兰托尔1-KO THP 1,通过强制表达MLC的构成活性形式(MLC-DD,携带Thr18Asp和Ser19Asp突变)而恢复。36在……里面兰托尔1-KO-THP 1(图1.6C)。另一方面,wt和mypt 1的gtp结合区RhoA含量和磷酸化水平相当。兰托尔1−/−虽然mprip已被证明通过使RhoA-Rock通路失活而影响MYPT 1的磷酸化。35(无花果)6d,e)。这些结果提示Lamtor 1介导的细胞运动是由Lamtor 1对MPRIP-MYPT 1相互作用的干扰所诱导的肌球蛋白Ⅱ活性所驱动,而不是通过激活RhoA-Rock途径来实现的。

图6:Lamtor1介导的运动是由肌球蛋白Ⅱ的活性驱动的。
figure6

a在Lamtor 1存在或不存在时MLC磷酸化。WT-THP 1,兰托尔1-KO-THP 1,和兰托尔1-KO-全THP 1细胞裂解,用抗p-MLC抗体Westernblotting检测MLC磷酸化(左)。WT-THP 1(白条)的p-MLC浓度兰托尔1-KO-THP 1(黑酒吧),及兰托尔1用ImageJ法测定SDS-PAGE凝胶带中的-KO-Full-THP 1(网格条),并进行统计学分析(右)。b, c肌球蛋白II依赖性Lamtor1介导的运动。WT-THP 1(白棒)的趋化性兰托尔1-KO-THP 1(黑酒吧),兰托尔1-KO-全-THP 1(网吧),bbbistatin处理WT-THP 1(对角线棒)和白比司他丁处理兰托尔1-KO-全-THP 1(暗网吧)对25 ng/ml CCL 2的反应用Transwell法测定(孔径为5μm)。b)。WT-THP 1(白棒)的趋化性兰托尔1-KO-THP 1(黑酒吧),及兰托尔1-KO-THP 1表达MLC-DD-HA(MLC-DD-HA),这是MLC(网状结构)对CCL 2反应的活性形式,用Transwell法(孔径为5μm)(左)进行评价。MLC-DD-HA在兰托尔1-KO-THP 1用抗HA抗体进行Westernblotting检测(右)c). dRhoA在WT和兰托尔1−/−BMDC细胞溶解后,用GST-Rhotekin-RBD将GTP结合的RhoA拉下,用抗小鼠RhoA抗体进行Westernblotting检测.eMYPT 1磷酸化在WT和兰托尔1−/−DCSWT和兰托尔1−/−以抗p-MYPT 1抗体进行Westernblotting,对BMDC进行裂解,磷酸化MYPT 1。用图基(Tukey‘s)后特设检验进行双面方差分析(P<0.01)。ac)[指±S.D.;*p < 0.05, **p < 0.01, *p < 0.001]. Data are representative of three experiments.

Ragator复合体的形成和与MPRIP的相互作用是细胞运动所必需的。

Lamtor 1是异戊二烯拉格器复合物的一个组分。4, 5。因此,为了确定Lamtor 1的区域对于Ragator复合体的形成和与mprip的相互作用至关重要,我们根据Ragator复合体的结构将Lamtor 1划分为四个部分。4:Lamtor 1的C端尾,面向细胞质侧的部分(α3-α4螺旋),面向溶酶体侧的部分(α1-α2螺旋),以及靠近茎的部分,将Ragator复合体锚定于溶酶体(N-末端-α1螺旋)(附图)。5A)。我们生成了三种标记标记的Lamtor 1的截短形式:ΔT1(MET1-Ser144)、ΔT2(MET1-Gln 114)和ΔT3(MET1-His41)(补充图)。5B)。所有截断的Lamtor 1变体都无法形成Ragator复合体(补充图1)。5C),证实Lamtor 1的C端尾对于Ragator复合体的形成是必不可少的。当我们将ΔT1-突变体导入MPRIP-V5-HEK293T细胞时,ΔT1突变体与MPRIP-V5-HEK293T细胞的相互作用被完全消除。7a,b)。因为α4e突变体(α4螺旋中的三个氨基酸被谷氨酸取代)4我们将α4e-Lamtor1的标记突变体导入MPRIP-V5-HEK293T细胞,以确定Lamtor 1的C端区或Ragator复合体的形成对与MPRIP的相互作用是否重要。有趣的是,我们没有观察到MPRIP和α4e突变体之间的相互作用。7A,cα4e突变体具有完整的C端尾,而ΔT1突变体有完整的α4螺旋区(图1)。7A)。事实上,Lamtor2-5的蛋白质水平在兰托尔1−/−DCS,兰托尔1-KO-THP 1,和兰托尔1-KO-THP 1表达突变型Lamtor1(附图1)。6a,b),这意味着复杂系统的每个组成部分都是其他组件的稳定所必需的。此外,MPRIP与MYPT 1的相互作用增强,MLC磷酸化兰托尔1-KO-THP 1,在兰托尔1-KO-全-THP 1,但不是在兰托尔1-KO-α4E-THP1(图1.7D,e)。此外,兰托尔1-KO-完全-THP 1对CCL 2的响应与WT-THP 1一样移动,但两者都没有。兰托尔1-KO-α4e-THP 1 NOR兰托尔1-KO-ΔT1-THP 1移动(图1。7F)。这些结果表明,Ragator复合体的形成通过调节肌球蛋白Ⅱ的活性而在细胞迁移中起重要作用,这种作用是通过干扰MPRIP与MYPT 1之间的相互作用来实现的。

图7:Ragator复合体是与MPRIP交互所必需的,MPRIP在细胞迁移中起着重要作用。
figure7

a突变型Lamtor 1(α4e和ΔT1)的原理图。全长Lamtor 1(TOP)和α4E突变体(中间)为MET1-Pro161。箭头表示氨基酸替换的位置(Leu129Glu,Ile135Glu,Leu143Glu在α4螺旋中的位置)。ΔT1为MET1-Ser144(底部)。b, cLamtor 1突变体(ΔT1,α4e)不能与MPRIP相互作用。标志标记的全长Lamtor 1,Lamtor 1的截短形式(ΔT1)(a)、Lamtor 1(α4e)的替代形式(b),或对照载体转染V5-MPRIP-表达HEK293T细胞。细胞裂解,用抗V5(左)或抗旗(右)抗体沉淀,并用抗标志和抗V5抗体进行Westernblotting。d, eLamtor 1-α4e突变体不干扰MPRIP与MYPT 1的相互作用,不能恢复MLC的磷酸化。父母THP 1(WT),兰托尔1-KO-THP 1(KO),及兰托尔1-KO-THP 1细胞稳定转染全长Lamtor 1或α4e突变体(Lamtor 1标志,α4e标志)。用抗mprip抗体沉淀细胞裂解液,用抗MYPT 1和抗旗标抗体(上)进行Westernblotting。d)。用抗p-mlc抗体(上)进行Westernblotting检测MLC磷酸化。e)。MPRIP共沉淀MYPT 1的浓度d)和p-MLC(e)从WT-THP 1(白条),兰托尔1-KO-THP 1(黑酒吧),兰托尔1-KO-全-THP 1(网格条),和兰托尔1-KO-α4e-THP 1(对角线BAR)用ImageJ法测定,并进行统计学分析。f趋化性兰托尔1-突变型THP 1WT-THP 1(白棒)的趋化性兰托尔1-KO-THP 1(黑酒吧),兰托尔1-KO-全-THP 1(网格条),兰托尔1-KO-α4e-THP 1(对角线棒)和Lamtor1-KO-ΔT1-THP 1(暗网吧)对CCL 2(25 ng/ml)的反应采用Transwell法(孔径为5μm)。数据是三个实验的代表。用图基(Tukey‘s)后特设检验进行双面方差分析(P<0.01)。df)[指±S.D.;*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001].

受损害的DC贩运兰托尔1 −/−集散

然后我们评估了Ragator复合物在DC贩运和免疫反应中的生理意义.CD11c-Lamtor1浮标/浮标小鼠CD11c数量减少+MHCIIDCS和CD11c+CD 103+在皮肤滤过性lns(Dlns)中,两者都代表着迁移的dcs(Dcs)。20, 37(无花果)8A),尽管它们的皮肤本身含有丰富的树突状细胞(如图所示)。8B)。此外,我们还在背部皮肤上涂fc-异构体进行了dc动员实验。38。CD11c降低FITC皮肤致敏后皮肤-DLN中FITC阳性DC的数量兰托尔1浮标/浮标老鼠(图1.8C)。然后,我们进行皮下注射伊文思蓝染料,以评估淋巴系统,并排除了FITC-异构体传递受损的可能性。此外,我们还进行了FITC微珠注射实验,以更严格地评价体内DC迁移的能力,因为微球不能通过淋巴流传递。CD11c-兰托尔1浮标/浮标小鼠无淋巴系统解剖异常(附图)。7A),DLN中含FITC微珠的DC数量低于WT小鼠(图1)。8D). 兰托尔1−/−DCS还显示FITC-右旋糖酐的吸收可与WT细胞的摄取相媲美(补充图).7b)。此外,我们皮下注射cfse标记的wt或兰托尔1−/−DCS进入WT脚垫。Cfse阳性兰托尔1–/–注射CFSE标记的DC后48h,DLNS中DCS含量较低(如图所示)。8E)。此外,要确定是否向兰托尔1−/−Dcs可以恢复体内的dc运动,我们进行了换能器。兰托尔1-IRES-EGFP进入兰托尔1−/−使用慢病毒系统的BMDC。虽然每个实验的效率都很低,~7-18%,但我们用细胞示踪紫染料标记了整个BMDC,并将它们注射到WT小鼠的脚垫中。然后,我们分析了绿色荧光蛋白的丰度。+DCS,代表LNS的Lamtor1-恢复的DC。便血LNS中GFP+DC与紫罗兰+DC的比值高于足垫(图1)。8F),建议在兰托尔1−/−DCS恢复体内DC运动。综上所述,这些结果表明Lamtor 1对体内DC贩运至关重要。

图8:体内dc在体内的贩运受损兰托尔1−/−老鼠。
figure8

a腹股沟LNS移行DC亚群。用流式细胞仪(左)对大鼠腹股沟淋巴结单个细胞悬液进行CD11c和MHCⅡ染色,流式细胞术(左)计数移行DC(红色矩形)。CD11c人口(上)和绝对数(下)+MHC IIDCS(中间)和CD11c+CD 103+Wt(白条)和CD11c的DCS(右)-兰托尔1浮标/浮标(黑棒)老鼠显示。b耳朵里有真皮DC。耳朵来自WT(上)和CD11c-兰托尔1浮标/浮标(下)小鼠分裂,固定在4%多聚甲醛中,用抗PECAM(绿色)和抗CD11c(红色)染色,共聚焦显微镜观察。标尺,100μm(左)。CD 45的百分比(上)和绝对数(下)+CD11c+真皮DC(中)和CD11c+CD 103+在WT(白棒)和CD11c中的真皮DC(右)-兰托尔1浮标/浮标(黑条形)耳,用流式细胞仪测定(右)。c异硫氰酸荧光素(FITC)阳性树突状细胞在Wt(白条)和CD11c-兰托尔1浮标/浮标(黑棒)老鼠。FITC致敏48小时后,从宫颈LNS中分离出的细胞进行CD11c和MHCⅡ.fITC染色。+用FACS(红矩形,左)和计数(右)评价DCS。d犬LNS中含珠DC的数量。在Wt(白色棒材)和CD11c的脚垫内注射FITC-珠后48小时-兰托尔1浮标/浮标(黑棒)小鼠,从犬LNS中分离细胞,CD11c和MHCⅡ染色,用流式细胞仪(FACS)进行分析。FITC+DCS计数。e脚垫给药后到达LNS的DC比较。Cfse标记WT(白条)和兰托尔1−/−分别在WT受体小鼠左右足垫内注射DC。注射48 h后,从LNS中分离出单细胞,并进行CFSE检测。+细胞计数。计算荧光标记DC与WT的比值。f体内DC-贩运兰托尔1−/−恢复Lamtor 1表达的DCS。兰托尔1-IRES-GFP载体被引入兰托尔1−/−BMDC采用慢病毒系统,用细胞示踪紫染色。将紫罗兰标记的树突状细胞(DC)注射到WT小鼠足垫上,从LNS中分离出细胞。采用流式细胞术(FACS)测定LNS中GFP+DC(Lamtor1恢复DC)与紫+DC(包括Lamtor 1恢复DC和非恢复DC)的比值。数据从四个集合而成(ad)或三(e, f)独立实验。由双面学生进行统计分析t-测试(ae)[指±S.D.;*p < 0.05, **p < 0.01] and by two-sided paired sample t-测试(f) [*p < 0.05].

减少CD11c中的CHS反应兰托尔1 浮标/浮标小鼠

接下来,我们研究了OT-ⅡT细胞转移后体内抗原特异性T细胞启动以及完全弗氏佐剂(CFA)在足底注射OVA蛋白的情况。CD11c可显著抑制DLN的T细胞增殖兰托尔1浮标/浮标老鼠(图1.9A)。由于dc成熟对T细胞启动很重要,我们评估了共刺激分子的水平,包括mhc-ii、cd 80、cd 86和cd 40。18。这些蛋白的表达并没有受到影响。兰托尔1−/−BMDC有无LPS刺激,但略高于WT BMDC(附图)。7C),表明DC的成熟并没有受到损害。兰托尔1−/−DCS为了评价DC的体外T细胞启动能力,我们对OVA蛋白或OT-Ⅱ肽脉冲DC和OT-ⅡT细胞进行了共培养.卵蛋白或OT-Ⅱ肽兰托尔1−/−虽然溶酶体参与内吞和抗原提呈,但DCS在体外对OT-ⅡT细胞增殖的促进作用与WT DC相同。39(补充图。7D)。这些结果表明,受损的直流传输兰托尔1−/−DCS,而不是受损的T-DC相互作用或DC激活,导致体内抗原特异性T细胞启动受损.此外,在半抗原诱导的接触性超敏反应(Chs)实验中,小鼠在腹部皮肤上被二硝基氟苯(Dfb)致敏,并在耳皮上受到二硝基氟苯(Dfb)的攻击。40,CD11c的耳肿胀程度较低-兰托尔1浮标/浮标而非WT小鼠(图1)。9B).

图9:Lamtor 1缺乏症患者体内T细胞启动和中性粒细胞贩运受损。
figure9

aOVA蛋白皮下注射后在体内OT-ⅡT细胞增殖。静脉输注cfse标记的CD4+T-II T细胞进入WT(蓝线)或CD11c-兰托尔1浮标/浮标(红线)受体小鼠,将完全弗氏佐剂中的OVA蛋白皮下注射到受体小鼠的足垫内。采用流式细胞仪(FACS)分析LNS中OT-ⅡT细胞的CFSE-稀释度.数据是三个独立实验的代表。b半抗原诱导的接触性超敏反应(CHS)在WT和CD11c-中的应用兰托尔1浮标/浮标老鼠。用丙酮致敏5d后,将DNFB应用于耳内。在DNFB攻击后48小时进行组织学分析(左)和耳厚评估(右)。n=10)。有代表性的图像是WT(顶部)和CD11c-兰托尔1浮标/浮标(下)老鼠。标尺,100μm。cLamtor 1在WT和LysM中性粒细胞中的表达兰托尔1浮标/浮标老鼠。从WT和LysM的骨髓中分离出中性粒细胞-兰托尔1浮标/浮标裂解小鼠(KO),Westernblotting检测Lamtor 1的表达。数据是三个实验的代表。d中性粒细胞对fMLP的趋化作用。WT的趋化性(白条)和兰托尔1–/–用Transwell法(孔径为3μm)检测中性粒细胞(黑条)对fMLP(5μM)的反应。数据是三个实验的代表。eLPS诱导的体内中性粒细胞动员。LPs注入WT(WT,White bar)和LysM-兰托尔1浮标/浮标小鼠(KO,黑棒)。给药后6小时,取腹腔内细胞进行CD11b、Ly6C、Ly6G染色及CD11b计数。+Ly6G+用流式细胞仪(上)计数中性粒细胞(红矩形)。CD11b人口(左)和绝对数(右)+Ly6G+中性粒细胞显示(较低)(n=3)。由双面学生进行统计分析t-测试(d, e)[指±S.D.;*p < 0.05, **p < 0.01] or two-sided Mann–Whitney U-测试(b)[中位数、25百分位数和75百分位数,以及不包括异常值的人口的最低和最大百分比;***p < 0.001].

受损害的贩卖人口兰托尔1 −/−中性粒细胞

最后,为了研究DC以外白细胞的运动能力,我们合成了LysM-cre×。兰托尔1浮标/浮标小鼠,其中Lamtor 1在中性粒细胞和巨噬细胞中被特异性地敲除(图1)。9C)。而fmlp诱导的中性粒细胞迁移率较低。兰托尔1−/−从骨髓中分离出的中性粒细胞比在WT中分离的中性粒细胞(图1)。9d)。此外,我们还在WT和LysM的腹膜内注射了LPS-兰托尔1浮标/浮标流式细胞术检测小鼠腹腔液中浸润中性粒细胞的数量。CD11b占腹膜细胞总数的百分比+Ly6G+中性粒细胞的绝对数量显著减少(图一)。9E)。这些结果表明Lamtor 1不仅对DC细胞的运动是必不可少的,而且在中性粒细胞中也是不可缺少的。

讨论

白细胞迅速改变其运动方式以适应环境要求:血管内壁的间充质运动以面对剪应力,或收缩区域的阿米巴样运动通过狭窄的空间。19。在受限的三维环境中,它们主要使用肌球蛋白Ⅱ活动所产生的肌球蛋白收缩力。15, 16。MLC的磷酸化受mlcp的调控,MLCP是一种由MYPT 1、M20和PP1cδ组成的异源三聚体。16。MrA通过促进MYPT 1磷酸化而调节MLCP活性,从而使PP1cδ的催化活性失活。22。然而,MYPT 1磷酸化水平和GTP-RhoA水平是相当的,无论是否存在Lamtor 1。外周转运溶酶体已被认为是重要的白细胞迁移。也就是说,由突触素介导的溶酶体外吞作用所释放的蛋白酶可以使尿囊脱离ECM。14黏液磷脂-1是一种溶酶体瞬时受体电位阳离子通道,调节时空细胞骨架动力学。13。在本研究中,我们揭示了周围转运溶酶体在运动细胞中的意义,其中Ragator复合物通过与MPRIP相互作用而使MLCP失活。这种相互作用干扰了MPRIP与MYPT 1之间的结合,最终促进了肌球蛋白II的活性。也就是说,在不动细胞中,Ragator复合物定位于溶酶体,优先分布于核周区域,MPRIP锚通过与MLCP的一个亚基MYPT 1结合,使MPRIP锚定在肌球蛋白-肌动蛋白束上,从而抑制MLC磷酸化。在运动细胞中,带有Ragator复合体的溶酶体向泌尿系移动,在那里Ragator复合体与MPRIP相互作用。这种相互作用干扰了MPRIP与MYPT 1的相互作用,降低了MLCP的活性,从而增加了MLC的磷酸化。因此,细胞运动被促进(图)。10)。这是一种调节MLC磷酸化水平的机制。

图10:Ragator复合体调节肌球蛋白Ⅱ活性的机制原理图。
figure10

在不动细胞(上)中,位于溶酶体上的Ragator复合物优先分布在核周区域(左),MPRIP锚通过MLCP的一个亚单位MYPT 1结合在肌球蛋白-肌动蛋白束上,从而抑制MLC磷酸化(右)。在受趋化因子(下)作用的运动细胞中,带有Ragator复合体的溶酶体移动到尿荚(左侧),在那里Ragator复合体与MPRIP相互作用。这种相互作用干扰了MPRIP与MYPT 1的相互作用,降低了MLCP的活性,从而增加了MLC的磷酸化。因此,细胞运动是便利的(右)。

我们发现,不能恢复Lamtor1缺陷的表型,不能通过添加失败的Ragator复合体的Lamtor 1突变体来恢复。在没有Lamtor2/3的情况下,Ragator复合物的所有其他组分都会通过泛素-蛋白酶体途径迅速降解。41。我们还发现Ragator复合物的组成蛋白在Lamtor1-KO细胞和Lamtor 1-突变体恢复细胞中的表达较低,说明Ragator复合物的组成分子不能稳定和单独存在,只有当Ragator复合物以适当的结构形成时,它才能在白细胞中存在。与我们的研究结果一致兰托2−/−小鼠皮肤dln中迁移的dc数量较少,而Ragator复合体的所有组分在兰托2−/−集散42.

我们发现,雷帕霉素在有效抑制s6k磷酸化的水平上,并不能抑制dc迁移、mlc磷酸化或Lamtor1-mprip相互作用,尽管mTORc1参与了Lamtor 1介导的巨噬细胞极化。8。因为DC移动太快了(DC,5-20μm/min,而间充质细胞,0.1-0.5μm/min)19Ragator复合物与MPRIP之间的相互作用必须涉及细胞骨架的时空调控,而不是通过mTORC 1激活转录和蛋白质合成。

Lamtor 2 3‘区的突变导致人类免疫缺陷综合症,患者表现出细菌退化延迟和记忆反应受损。2。我们的观察表明,Ragator复合体不仅对发展中国家不可或缺,而且对于中性粒细胞贩运也是不可或缺的,这可能有助于深入了解人体免疫机能丧失综合症的原因。此外,Ragator复合物与MPRIP的相互作用是抑制白细胞运动的自身免疫性疾病和炎症的治疗靶点。今后的研究应设法确定和表征Ragator-MPRIP相互作用位点,以及抑制相互作用的化合物。


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