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CRISPR/Cas9介导腺苷A2A受体缺失增强CAR T细胞效应

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发表时间:2021-06-03 14:46作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

腺苷是一种免疫抑制因子,通过激活腺苷A来抑制包括T细胞在内的多种免疫亚群,从而限制抗肿瘤免疫。2A受体(A)2Ar)。利用小鼠和人嵌合抗原受体(CAR)T细胞,我们证明了靶向A。2AR与临床相关的CRISPR/Cas9策略显着地提高了它们在体内的有效性,从而提高了小鼠的存活率。CRISPR/Cas9介导的A基因缺失的影响2AR优于shRNA介导的基因敲除或药物阻断A。2AR.机械,人体A2AR编辑的CAR T细胞对腺苷介导的转录变化具有明显的抗性,导致细胞因子(包括干扰素γ和肿瘤坏死因子)的产生增加,JAK-STAT信号通路相关基因的表达增加。一个2AR缺失的CAR T细胞耐受性好,不引起小鼠明显的病理改变,支持CRISPR/Cas9应用于靶标A。2A改善临床CAR T细胞功能。

导言

嵌合抗原受体(Car)T细胞治疗涉及患者T细胞通过小链可变片段识别特定肿瘤抗原的体内外转导,这种小链可变片段与胞内信号域相连,大多数是CD3ζ和4-1bb或CD 28。1,2。针对CD 19抗原的CAR T细胞目前已被FDA批准用于治疗复发的B细胞急性淋巴细胞白血病和侵袭性淋巴瘤。3。然而,在实体肿瘤环境中,这些效应还没有被重新研究过。在这种情况下,car T细胞面临着额外的障碍,如肿瘤抗原异质性、向肿瘤部位输送的要求以及免疫抑制性的低氧肿瘤微环境。1,2。低氧肿瘤微环境中免疫抑制的主要介质是腺苷,腺苷是由外生酶CD 73、CD 39和CD 38产生的代谢物。4,5。Sitkovsky小组的形成性研究表明,细胞外腺苷-a2AR-cAMP轴在控制免疫反应、炎症组织损伤和抗肿瘤免疫方面具有至关重要的作用。6,7。腺苷有四个已知的G蛋白偶联受体,A。1R,A2AR,A2BR和A3R,同时激活两个A2BR和A2AR有诱导免疫抑制作用,抑制T细胞活性主要是由A介导的。2AR,这导致腺苷酸环化酶的激活和细胞内cAMP水平的提高。8。一个2AR缺乏的小鼠诱导T细胞反应显著增强,尤其是这A。2AR-cAMP轴是无冗余的,因为其他cAMP升高的G蛋白偶联受体不能补偿A的丢失。2AR6。这些开创性的发现随后得到了多个实验室的证实,突出了A的靶向性。2AR可增强T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。9,10,11以及对A的封锁2AR与几个小分子拮抗剂目前正在临床试验,以治疗一系列固体癌症。12。此外,这项工作为针对这一途径的替代策略奠定了基础,包括针对上游外显酶CD 73、CD 39和CD 38的治疗学,或针对上游缺氧-hif-1α轴本身的治疗。8,10表明临床对靶向这一途径的兴趣13.

鉴于A2AR激活能抑制T细胞功能,一种天然的延伸是研究靶向这一途径增强过继性T细胞治疗的潜力,包括CAR T细胞治疗。以前的工作已经证明了A的转染2AR/A2B靶向siRNA制备抗cms_4 CD8+T细胞增强其抗肿瘤作用,从而呈现A。2AR作为一个有吸引力的靶点,证实了A的免疫抑制作用。2AR至少部分是T细胞内禀的。7。多个群体随后证明了以A为目标2A小分子拮抗剂可增强传统tcr过继细胞治疗引起的治疗反应。5,14,15,而我们先前的工作表明,针对A2AR还能增强在实体肿瘤环境中的car T细胞反应。16.

本研究的一个关键观察是,A的药理拮抗作用2AR使CAR T细胞功能增强,从A生成CAR T细胞效果更为显著。2AR−/−受体功能完全丧失的供体小鼠。这导致了一种假设,即设计一种基因编辑策略来使A沉默。2AR信号(相对于药物拮抗剂介导的部分和/或暂时抑制)在CAR T细胞治疗中是有利的。因此,我们试图调查CRISPR/Cas9或shRNA介导的A的靶向性。2AR可增强CAR T细胞功能。这些技术非常适合与CAR T细胞生产相结合,因为基因编辑程序可以与CAR传导并行引入。特别是,crispr/ca 9介导的pd-1、β受体Ⅱ或ptpn 2的缺失曾被证明能增强car T细胞功能,从而促进T细胞增殖和促炎细胞因子的产生。17,18,19.

在这项工作中,我们展示了目标A2A通过shRNA基因敲除R可以促进小鼠CAR T细胞通过CAR刺激后的效应功能,增强CAR T细胞在体内的效应功能,但也与持续性降低有关。相反,CRISPR/Cas9介导的A缺失2AR在小鼠和人源性CAR T细胞中均能消除腺苷的免疫抑制作用,增强效应功能,但对CAR T细胞的记忆表型和持久性无不良影响。此外,人A诱发的体内抗肿瘤作用增强。2AR编辑的CAR T细胞与肝毒性酶读数和组织切片分析所确定的毒性无关。这些结果提示A的完全敲除2AR应用CRISPR/Cas9是增强CAR T细胞功能的一种更好的治疗方法,而不是shRNA介导的基因敲除或与受体的药物拮抗剂联合使用。鉴于CRISPR/Cas9编辑的CAR T细胞正在使用与本文所述方法相同的方法在进行中的试验中,这种方法很容易被翻译到临床。20。此外,瞄准A2AR通过crispr/ca 9-介导的编辑适用于多种肿瘤类型的car T细胞治疗,在这些肿瘤类型中,腺苷信号被证明能抑制抗肿瘤免疫,包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、急性髓细胞白血病、多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。21,22,23,24,25.

结果

A2AR表达以基因剂量依赖的方式限制car T细胞效应功能

我们以前的研究表明2AR活化可抑制T细胞效应功能和抗肿瘤活性.分析A的全基因组影响2AR激活CAR T细胞--特别是,根据我们以前的工作,我们利用逆转录病毒转导途径生成了靶向人Her2的小鼠CAR T细胞。16,26,27,28。CAR T细胞在NECA(一种腺苷模拟物)和SCH 58261(一种选择性A)存在或不存在的情况下,用抗CAR抗体刺激。2AR拮抗剂3‘rna-seq分析揭示了car激活后T细胞效应功能相关基因的预期上调,如IFNG,TNF,和格兹姆(无花果)1A)。重要的是,在通过CAR激活的细胞中,NECA诱导的转录改变与A完全可逆2AR拮抗剂SCH 58261,证明腺苷对CAR T细胞效应的作用主要通过A。2AR活化(图1.1B)。NECA介导的A基因-剂量关系的研究2AR活化,比较A上产生的抗HER2CAR T细胞2AR+/+,A2AR+/−,和A2AR−/−背景。三种基因型的CAR和CD8:CD4比值均有相似的表达(图一)。1C,D)。这些CAR T细胞与E 0771(乳腺癌)或24JK(肉瘤)肿瘤细胞共培养,在NECA存在或不存在的情况下表达Her 2。A介导的主要免疫抑制表型2AT细胞抑制细胞因子的产生,而对细胞毒活性的影响较小。7,16,29,30,31。如所料,NECA对CAR T细胞的直接杀伤活性无显著影响(附图)。1A),明显抑制野生型A型干扰素γ和肿瘤坏死因子的产生。2AR+/+但不是A2AR−/−与E 0771-Her2共培养的CAR T细胞(图2)。1英、法或24 JK-Her2肿瘤细胞(补充图1)。1B、C)。这些细胞因子在间接杀伤肿瘤细胞中的作用已被证实。32,33,34,特别是NECA的加入导致细胞因子介导的对这些共培养上清液的杀伤活性显著降低(补充图)。1D,E)。杂合子A2AR+/CAR T细胞在产生干扰素γ方面对NECA介导的抑制有部分抗性,但与A相比,这种抗性相对较小。2AR−/−汽车T细胞。此外,NECA对TNF产生的抑制作用与A的抑制作用相当。2AR+/+和A2AR+/−汽车T细胞。加在一起,这些数据表明A的水平有很大的冗余。2AR由CAR T细胞表达,这意味着击倒法需要达到A水平降低50%以上的目的2AR表达式有效。

图1:a2AR刺激以部分基因剂量依赖性的方式显著调节CAR T细胞转录组.
figure1

A, B在NECA(1M)或SCH 58261(1M)存在或不存在时,用平板结合的抗myc标记(anti-car)抗体刺激IL-2(100 U/ml)和IL-7(200 pg/ml),培养7天后产生抗Her2 CAR T细胞,再用3‘RNA-Seq分析细胞。A差异基因表达分析,颜色表示基因在通过CAR激活后显著上调(红色)或下调(蓝色)。对“方法”中所述的R包进行了统计测试。B主成分分析的基础上,前100最易变表达的基因。CE从A中产生抗HER2CAR T细胞。2AR+/+(野生型;WT),A2AR+/−,或A2AR−/−小鼠按(A). C, D表达(C)CD8,CD4,和(D)反她的车。E, F1×105抗HER2CAR T细胞与E 0771-HER2在SCH 58261(1M)和(或)指示浓度的NECA存在或不存在时共培养16h。E的一项有代表性的实验,数据代表了三份/四份培养的平均±sd值。n=3.统计结果表明,与0 M NECA条件相比,具有显着性意义。F干扰素、γ和肿瘤坏死因子的产生率与各基因型的对照条件有关。的计算结果。n3实验为均值±扫描电镜。非线性回归分析E, F统计数据显示相对于单因素方差分析和图基的后特别检验(经多次比较调整后)计算的野生型值的显着性。源数据作为源数据文件提供。

ShRNA介导的A2AR基因敲除增强CAR T细胞执行器功能

为了进一步评估这一点,我们生成了表达四种针对A的独立shRNAs的逆转录病毒。2AR.这些逆转录病毒还编码截短神经生长因子受体(NGFR)的表达,NGFR是一种常用的标记基因,用于分离shRNA介导的CAR T细胞。由于缺乏A2A适用于流式细胞术的R抗体,A的效率2AR基因敲除是通过测定NECA刺激后cAMP的产生来评估的,因为A的激活2AR导致cAMP的积累,cAMP是负责A的信号分子。2AR介导的抑制35。为了验证这一分析,野生型或A型的cAMP反应。2AR−/测定CAR T细胞对NECA或腺苷的影响。正如预期的那样,野生型CAR T细胞在A处理时会产生更强的cAMP信号。2AR激动剂(图1.2A)。此外,A的加入2A受体拮抗剂SCH 58261显著降低NECA介导的cAMP诱导,进一步证实此作用为A。2AR-调解(图1.2B)。评价shRNA转导细胞的敲除效率及对car T细胞功能的影响。+细胞经转导后纯化,用于下游功能检测。所有四个A2A相对于干扰的shRNA控制,R靶向shRNA显著抑制了NECA介导的CAR T细胞cAMP的产生,导致cAMP信号的抑制约为30-50%(图一)。2B)。此外,我们进一步验证了A2A通过定量逆转录-聚合酶链式反应在mRNA水平敲除两种最有效的shRNAs(补充图)。2A)。在确认了有效的击倒后,我们接下来评估了A的影响2A与Her 2共培养时对CAR T细胞效应的抑制作用+肿瘤细胞。在功能分析方面,我们使用两个发夹进行了研究,这两个发夹介导了对A最有力的敲除。2AR.这些shRNAs介导的CAR T细胞在各组间形成相同的CAR表达(补充图)。2B)与NGFR的积极选择+细胞导致高度纯化(~90%)群体(补充图)。2C)。尽管对A有有效的抑制作用2AR信号传导(通过降低cAMP水平来评估),shRNA介导的A基因敲除2AR在减少NECA介导的干扰素γ和肿瘤坏死因子产生的抑制作用方面仅起一定的作用(图1)。2C)。这表明部分A2AR功能足以诱导腺苷介导的免疫抑制作用。然而,在没有NECA刺激的情况下,A2AR基因敲除可显著促进细胞因子的产生,但对E 0771-Her 2和MC38-Her2(结肠腺癌)肿瘤细胞的杀伤作用较小(P<0.0 5)。2C-E)。更广泛地说,A2AR基因敲除增强了通过CAR刺激后多种效应相关基因的转录表达(如图所示)。2F),并增加了激活的Tim-3的出现。+颗粒酶B+与Her2的串行共文化子集+肿瘤细胞模拟肿瘤微环境中的分化(图)。2G)。这表明A2AR敲除调制的CAR T细胞分化向更有效的表型方向分化,可能是通过减少残余A来实现的。2AR信号在缺乏急性NECA刺激的情况下存在。接下来我们评估了shRNA介导的A的能力。2AR-敲除CAR T细胞诱导体内抗肿瘤活性增强。这些研究是在我们先前描述过的同基因人Her2转基因小鼠身上进行的,它允许在免疫活性环境中评估car T细胞的功能,包括产生腺苷的免疫抑制亚群。16,26,28,36。小鼠注射2×105E 0771-Her2肿瘤细胞进入第四乳脂肪垫,肿瘤形成后,用4 Gy照射预处理,1×10处理。7连续两天的CAR T细胞。击倒A2A与对照的CAR T细胞相比,R对肿瘤生长的抑制作用略有增强(图1)。3A见图示补充图。3A)。A提高体内药效2Aγ-敲除car T细胞与肿瘤浸润CD8中效应相关基因的表达增加有关。+NGFR+CAR T细胞如干扰素γ、肿瘤坏死因子、IRF 4、颗粒酶B。3B、C)。CD4表型的进一步分析+NGFR+CAR T细胞提示A2AR基因敲除增强了他们的干扰素γ和ki-67的表达,类似于CD8。+CAR T细胞(图1.三维空间)。因此,我们的数据清楚地表明2AR基因敲除增强了CAR T细胞效应器的功能.然而,最近的研究表明,增强的car T细胞效应功能可能与降低T细胞持久性有关。37因此,我们评估了CAR T细胞在A之后的持久性。2A击倒。脾脏分析表明A2AR基因敲除可显著降低治疗后第9天CAR T细胞的数量(图1)。3E)。综合起来,这些数据表明2AR基因敲除增强了CAR T细胞效应功能,也降低了持续性,很可能限制了观察到的疗效。

图2:a2AR基因敲除增强了CAR T细胞效应器的功能.
figure2

如图所示,产生抗HER2CAR T细胞。1并且,在指示的情况下,与指向A的shRNAs共转导2AR或非目标(扰)的shRNA控制。NGFR+在下游检测前,通过MACS分离分离CAR T细胞。A, B用一定剂量的NECA或腺苷刺激CAR T细胞后cAMP的积累。添加SCH 58261(SCH,1M)作为对照。有代表性的实验n=2。B数据表示为平均±SD的三份副本。统计检验显示,与其他组相比,杂乱的shRNA是单向的变异数。C, D1×105用1×10培养CAR T细胞5E 0771-Her2细胞C16小时或(D)4h及上清液用CBA法检测IFN、γ和TNF。的一个有代表性的实验数据显示为三份/四份培养的平均±sd值。n=3。E抗HER2CAR T细胞与1×10共培养4所示51铬标记肿瘤细胞在指示的效应物:靶比4小时。铬的释放是由自动伽马计数器(沃尔拉克向导1470)检测的。数据显示为三份培养的平均±SD值。统计数据:双向方差分析。AE ****p < 0.0001, ***p < 0.01, *<p < 0.01 *p < 0.05. F纳米链分析确定的指示基因表达热图。GCAR T细胞如图所示。1,在转染后第2天,维持在IL-7和IL-15(10 ng/ml)中。2×105然后用1×10培养CAR T细胞。5E 0771-HER2肿瘤细胞1×10作用72h5肿瘤细胞每24小时更换一次,然后分析CAR T细胞中Tim-3和颗粒酶B的表达情况。n=2.源数据作为源数据文件提供。

图3:a2AR基因敲除促进了体内效应型CAR T细胞表型的形成.
figure3

C57BL/6 HER2小鼠注射2×105E 0771-Her2肿瘤细胞进入第四乳脂肪垫,用抗HER2CAR T细胞在IL-7和IL-15中转导和培养,如图所示。2G。一旦肿瘤形成,1×1074Gy全身照射后2天静脉注入CAR T细胞.小鼠于术后第0~4天给予白细胞介素-2(IL-2)50,000 U处理.A肿瘤生长表现为平均±扫描电镜n每组5只(CAR T细胞处理)或6只(未处理)小鼠:n=2,*p < 0.05, two-way ANOVA. BE治疗后第9天切除脾脏和肿瘤,观察NGFR的数量和表型。+流式细胞仪检测CAR T细胞。B, D连接样本的表达式(n=每组7人)来自一个有代表性的实验。C, E数据代表平均±扫描电镜n=11-19只小鼠+从2(E)或3(C)复制实验(见+(详见下文)。每个数据点表示单个鼠标。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, unpaired t测试一下。+干扰素γ肿瘤坏死因子Tim-3对照n=15,shRNA A2AR n=18,颗粒酶B和Ki-67,对照n=15,shRNA A2AR n=19,IRF 4,控制n=16,shRNA A2AR n=18,脾脏对照数n=11,shRNA A2AR n=13.参考文献中也列出了一些对照样本的数据。36。源数据作为源数据文件提供。

CRISPR/Cas9-介导的A缺失2AR增强CAR T细胞效能

我们以前对A的研究2AR−/−载瘤A背景下的CAR T细胞或内源性T细胞2A基因敲除小鼠表明A的完全丢失2AR信号对T细胞持久性和记忆无不良影响。16,31。此外,最近的一项研究表明,2AR缺失增强LCMV感染T细胞持久性38。鉴于这些观察结果与我们目前使用shRNA介导的A基因敲除结果之间的差异2AR,接下来我们研究目标A2AR使用CRISPR/Cas9方法,这将导致A的完全损失。2A编辑细胞R功能,可增强CAR T细胞效应功能,而不影响T细胞持久性.CRISPR/Cas9-介导的A缺失2AR,重组Cas9和靶向A的单导RNA(SgRNA)2A在我们的传统T细胞活化和转导方案之前,R(或非靶向控制)以核糖核酸蛋白(RNP)的形式通过电穿孔传递到幼稚脾细胞。重要的是,我们利用电穿孔介导的rnp向T细胞传递的方法与最近临床试验中的方法相似。20,39,并能接受汽车T细胞制造协议。为了在我们的手中验证这一方法,我们首先利用针对Thy1的指南应用这一方法,Thy1是一种在T细胞上广泛表达的蛋白质。利用这一方法,我们能够确定在car T细胞中Thy1的表达完全丧失,在CD8中的表达效率与car T细胞相似。+和CD4+CAR T细胞(附图)4A)。在验证了该方法之后,我们接下来将其应用于目标A2AR.A类的交付2AR靶向RNP既不影响CD8:CD4 CAR T细胞的比值,也不影响CAR转导的效率(附图)。4B、C)。成功删除A2A通过基因组DNA测序和CRISPR编辑(ICE)平台的干扰分析,验证了基因敲除的有效性(87.3%±5.7%SEM)。4A)。评估A的功能后果2AR编辑,接下来我们研究cAMP信号对NECA刺激CAR T细胞的反应。与shRNA介导的A基因敲除形成对照2AR,CRISPR/Cas9介导的A基因敲除2AR几乎完全减弱cAMP信号(图1)。4B)。此外,A2A以CRISPR/Cas9为靶点,与HER2阳性肿瘤细胞共培养,对NECA介导的干扰素γ和肿瘤坏死因子产生的抑制几乎完全耐受(图二)。4C-E)。然而,CRISPR/Cas9介导的A基因敲除2AR没有增强在4或16小时测量到的CAR T细胞的细胞毒性,这与我们先前观察到的短期A相一致。2AR活化可调节CAR T细胞因子的产生,但不影响体外细胞毒性作用(附图)。4D,E)16。用3‘rna-Seq进行全基因组分析,然后通过CAR进行刺激,如图所示。1A,我们研究了CRISPR/Cas9介导的A的靶向作用。2AR关于NECA-介导的转录变化。利用FDR<0.05的截止值,我们确定了NECA刺激后最受调控的基因,我们将其命名为“腺苷信号”(补充数据)。1)。正如预期的那样,构成腺苷信号的基因的调制在A之后明显减弱。2AR缺失(图1.4F;补充数据1)。我们接下来研究了A的体内抗肿瘤作用。2AE 0771-Her 2荷瘤小鼠的R编辑CAR T细胞。引人注目的是,CRISPR/Cas9-介导的A缺失2AR能显著增强转移的CAR T细胞的抗肿瘤作用(图1)。4G,H见图示补充图。3B)。值得注意的是,这些治疗效果比用shRNA介导的A基因敲除所观察到的效果更为明显。2AR或与药物介导的A2AR封锁(图1.4I,补充图。4F)。此外,A类药物治疗后小鼠已痊愈。2AR编辑的CAR T细胞对E 0771-Her2在相反的乳腺脂肪垫上抵抗第二次挑战,表明A2AR编辑的CAR T细胞能够唤起记忆回忆反应(补充图).4G).

图4:CRISPR/Cas9-介导的A2AR缺失可提高CAR T细胞的疗效。
figure4

如图所示,产生抗HER2CAR T细胞。1CRISPR/Cas9介导的CAR T细胞编辑与A2ARsgRNA或非靶向sgRNA控制。A由ICE分析确定的INDEL频率。数据代表了三个复制实验的平均±扫描电镜。B如图所示,NECA对cAMP的累积反应。2A。数据表示为三组的平均±SD。代表实验n=2。C, D1×105CAR T细胞与(C)1×105E 0771-HER2或(D)1×105MC38-Her2肿瘤细胞在NECA(1M)或SCH 58261(1M)存在或不存在的情况下培养8h,上清液用CBA分析。具有代表性的实验数据表示四份培养物的平均±sd值。n=3.*p < 0.05, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, one-way ANOVA. E数据来自C, DNECA介导的干扰素γ和肿瘤坏死因子产生对对照组和A的抑制率计算2AR编辑的CAR T细胞。****p < 0.0001 paired t检验,数据显示为平均±SD的四份培养(n=4)来自一个具有代表性的实验n=3。F在NECA(1M)存在与否的情况下,用平板结合的抗myc标记抗体刺激抗HER2CAR T细胞8h,用3‘rna-seq进行分析。小鼠腺苷信号相关基因的热图显示。GIE 0771-Her2荷瘤小鼠按图进行治疗。3带着控制,A2AR击倒,或A2AR CRISPR/Cas9-编辑的CAR T细胞。G数据代表平均±扫描电镜n=5(非靶向sgRNA)或6(未处理,A)2ARsgRNA(RsgRNA)n=4。I数据代表平均±扫描电镜n=6(未处理、非靶向的sgRNA,A)2ARsgRNA)、5(非靶向sgRNA+shRNA 2)或4(非靶向sgRNA+sch 58261)n=2(I). G, I肿瘤生长*p < 0.0001, *p < 0.05. Two-way ANOVA. H生存率定义为肿瘤超过100毫米时2, ****p < 0.0001 Log-Rank test. Data indicative of 17 mice per group combined from 3 experiments. Source data are provided as a Source Data file.

CRISPR/Cas9-A的编辑2AR增强CD8+和CD4+CAR T细胞功能

因为腺苷可以同时调节CD8。+和CD4+T-细胞功能,接下来我们研究了A的影响。2ACD8缺失+和CD4+CAR T细胞亚群及其对治疗反应的影响。分类CD8的RNA-Seq分析+和CD4+通过CAR激活后的CAR T细胞表明阿多拉a a基因在CD8上也同样被上调。+和CD4+通过CAR激活后的CAR T细胞(如图所示)。5A)。NECA的加入对两种CD8的转录谱均有显著的调节作用。+和CD4+CAR T细胞,CRISPR/Cas9介导的A缺失后完全消融的效应2AR(图1.5B、C)。基因分析(fdr≤0.05,log)2≥0.75或≤−0.75)在每种细胞类型中均受neca调控,表明neca显著抑制CD8中323个基因的表达。+T细胞和309个CD4基因+T细胞,其中117个基因对两者都是共同的。+和CD4+CAR T细胞(图1.5D)。在两种CD8中通常被抑制的基因+和CD4+CAR T细胞包括多种细胞因子,如IFNG, 肿瘤坏死因子, IL2, Ccl 3,和Xcl 1。特别是在CD4+Car T细胞群,NECA抑制肿瘤坏死因子家族多个成员的表达(LTA,Tnfsf 14)与NFκB信号相关的基因((IKBKE和REL)或向TCR/CAR下游发出信号(1,2)(无花果)5E)。评估A的相对重要性2ACD8中r缺失+和CD4+由于CAR T细胞的体内效应,我们纯化了CD8。+Car T细胞在CRISPR/Cas9编辑A之后从散装汽车T细胞产品中获得2AR受体(图1.5F)。A的增强治疗活性2A用体积法或CD8法观察car T细胞的变化。+-浓缩汽车T细胞产品(图1.5G),表示删除A2AR从CD8+CAR T细胞足以引起增强的治疗反应。

图5:瞄准A2ACRISPR/Cas9增强CD8的效应功能+和CD4+汽车T细胞。
figure5

如图所示,产生抗HER2CAR T细胞。4CRISPR/Cas9介导的CAR T细胞编辑与A2ARsgRNA或非靶向sgRNA控制。AE1.2×106在nECA(1M)存在或不存在的情况下,用抗myc标记(抗car)刺激CAR T细胞5 h,然后通过流式细胞术(FACS)将细胞分离成CD4。+和CD8+子集。基于log的阈值定义了显著调制的基因。2≥0.75或≤−0.75的Fc(折叠变化)和fdr<0.0 5>对数20.75倍变化,FDR<0.05。如“方法”所述,对指示的R包进行了统计检验。ACPMS阿多拉a aCD8基因+和CD4+CAR T细胞激活前(对照)和(抗CAR)激活后。数据显示为技术副本的平均±SD值。B基于前100位变量基因的主成分分析。C在所指示的亚组中,NECA对基因的Ma图有增加或减少的作用。显着基因以绿色(NECA增加)或蓝色(NECA降低)突出。DVenn图显示了NECA在每个子集中显著调控的基因数目。ENECA显著抑制CD8基因的热图+,CD4+,或者两者都是CD8+和CD4+汽车T细胞。F, G。如图所示,产生抗HER2CAR T细胞。4G和CD8+在指定的情况下进行浓缩。小鼠一剂2×107抗HER2CAR T细胞。FCD8前后CAR T细胞中CD8和CD4表达的流式细胞术分析+浓缩。G肿瘤生长表现为六种(未处理,A)的平均±扫描电镜。2ARsgRNA CD8+-富集CAR T细胞),7细胞(非靶向sgRNA,大量CAR T细胞,和非靶向sgRNA,CD8)。+-富集的CAR T细胞,或8个(A)2ARsgRNA,散装CAR T细胞)每组小鼠,n=1项实验。***p < 0.001. Two-way ANOVA. Source data are provided as a Source Data file.

CRISPR/Cas9-介导的A缺失2AR增强CAR T细胞效应功能,但对外周T细胞持久性无不良影响。

CRISPR/Cas9介导的A靶向治疗提高疗效的机制探讨2A我们接下来分析了治疗小鼠CAR T细胞的表型和数量。CRISPR/Cas9-介导的A缺失2AR不影响治疗后小鼠脾脏和外周血中CAR T细胞的持久性(图1)。6A,B)。然而,肿瘤内CD8的表型分析+CAR T细胞显示CRISPR/Cas9介导的A缺失2AR增强了许多效应相关基因的表达,包括颗粒酶B、Ki-67、IRF 4和免疫检查点PD-1和Tim-3,这与CD62L的表达下降相当。综上所述,这些数据表明在CRISPR/Cas9介导的A缺失后肿瘤内向更多的效应样表型转变。2AR(图1.6C-E,选通策略补充图。5A)。值得注意的是,头对头的比较显示,在CRISPR/Cas9介导的A缺失后,治疗后第9天从脾脏中恢复的CAR T细胞的数量显著增加。2AR与A比较2AR介导的基因敲除通过shRNA(图1)。6f)。此外,shRNA介导的A基因敲除2AR与CD8上CD62L表达降低有关。+脾脏内的CAR T细胞,可能解释了CRISPR/Cas9编辑的CAR T细胞的持久性降低的原因(见图)。6g).

图6:CRISPR/Cas9-介导的A2AR缺失在不影响CAR T细胞持久性的情况下,促进了CAR T细胞效应功能.
figure6

E 0771-Her2荷瘤小鼠经CRISPR/Cas9介导编辑后产生抗HER2CAR T细胞,如图所示。4. ACD8数+NGFR+治疗后第7天,小鼠脾脏CAR T细胞恢复正常。n=8(未处理、非靶向性sgRNA)或n=9(A)2ARsgRNA)。BNGFR数+治疗后第9天每l血CAR T细胞计数。n=6(未经处理,模拟sgRNA(或n=7(A)2ARsgRNA)。 C肿瘤内CD8的门控策略+NGFR+汽车T细胞。D, ECD8标记物的表达+NGFR+汽车T细胞。有代表性的FACS图显示在个别老鼠身上。对于合并的数据,n=8(非靶向性sgRNA)或7(A)2ARsgRNA)。FCD8数+NGFR+治疗后第7天,小鼠脾脏或血液中的CAR T细胞恢复正常。n=7(非靶向sgRNA,8A)2ARsgRNA,或5 shRNA A2Ar)。GA的表型比较2AR击倒和A2AR CRISPR/Cas9-在治疗后第9天编辑CAR T细胞。GCD8比例+NGFR+CD62L阴性的CAR T细胞。n=7(非靶向sgRNA,8A)2ARsgRNA,或5 shRNA A2Ar)。对于集合数据,数值表示平均值±扫描电镜。***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05, one-way ANOVA. Source data are provided as a Source Data file.

CRISPR/Cas9-介导的A缺失2AR增强人CAR T细胞效应功能

确定CRISPR/Cas9介导的A2AR缺失增强了小鼠CAR T细胞的效应功能,我们在人类CAR T细胞靶向于临床相关肿瘤抗原的背景下对此进行了研究。为了做到这一点,我们通过逆转录病毒将人的carar T细胞与目前正在ib期临床试验中使用的抗leisisycar进行了转换。40,41(NCT 03851146),然后使用非靶向的sgRNA或A进行CRISPR/Cas9介导的编辑。2AR-靶向sgRNA。在小鼠CAR T细胞中观察到CRISPR/Cas9介导的A缺失2AR导致了超过75%的成功编辑ADORA2A基因等位基因7A),从而有效地减弱了NECA诱导cAMP积累的作用(见图)。7b)。一个2AR缺失不影响CAR T细胞产物的CD8:CD4比值(补充图)。6A,B)和CD8的比例+具有干细胞记忆表型的CAR T细胞(CD45RA)+CD62L+CD 27+),这已经被证明与CAR T细胞持久性和临床结果有关(图一)。7C)42。此外,还分析了该方法引起的潜在离目标效应。2AR靶向sgRNA表明,只有三个预测的非目标位点不能被检测到编辑(补充图)。7A-C)。类似于以前使用针对Her 2、间皮素或CD 19的人CAR T细胞的研究16,43,44抗Lewis Y car T细胞与Lewis Y共培养时,γ和肿瘤坏死因子的产生受到明显抑制。+OVCAR-3肿瘤细胞,这种作用通过A的加入是可逆的2AR拮抗剂SCH 58261(图1.7D)。我们接下来评估CRISPR/Cas9介导的A的靶向作用。2A与Lewis Y共培养后CAR T细胞产生细胞因子的研究+肿瘤细胞。CRISPR/Cas9-A的编辑2AR使CAR T细胞在与OVCAR-3细胞或MCF 7细胞(另一个Lewis Y)共培养时分泌IFNγ、TNF和MIP 1α(CCL 3)的能力对NECA产生抗性。+肿瘤细胞系7E)。多重供体产生抗Lewis Y CAR T细胞,A缺失2AR显著降低NECA对干扰素γ和肿瘤坏死因子的抑制作用(图1)。7F)。相反,NECA和A都没有2AR缺失在与OVCAR-3肿瘤细胞共培养4 h(短期)或16 h(长期)铬释放试验(补充图)时,对CAR T细胞的细胞毒性能力有显著的调节作用。6C-E)。值得注意的是,这与我们先前观察到的A2A在短期试验中,r信号主要通过影响细胞因子的产生而不是通过细胞毒性作用来介导car T细胞的免疫抑制。16。评估A的效果2A在全基因组水平的R刺激下,我们评估了A之后CAR T细胞的转录谱。2AR刺激在一个类似于我们以前的实验的设置中,我们用老鼠的CAR T细胞(图1)。1A、B和4E)在3‘RNA-seq分析之前,我们利用一种抗独特型抗体刺激抗Lewis Y CAR。如预期,刺激控制或A2AR编辑的带有抗独特型抗体的CAR T细胞导致许多效应相关基因的显著上调。主成分分析表明,NECA的加入对对照CAR T细胞的表型有显著的调节作用,但对A的转录谱影响最小2AR编辑抗刘易斯Y汽车T细胞(图一。7g)。通过对正常人CAR T细胞(FDR<0.0 5,折叠变化>2或<−2)中NECA显著调控基因的分析,为人CAR T细胞产生“腺苷信号”。这些基因的表达分析表明,A2AR编辑的CAR T细胞对NECA刺激的反应减弱(补充图)。6f,补充数据2)。A转录组的无偏分析2AR编辑的CAR T细胞相对于控制CAR T细胞在NECA存在下激活CAR T细胞揭示了几个KEGG基因的显著富集,特别是与细胞因子和JAK/STAT信号有关的通路(补充图)。6g)。这些通路在对照组中被显著下调,但没有A。2AR编辑抗刘易斯Y汽车T细胞后,添加NECA(图)。7g-i)。这些基因列表包括几种促炎细胞因子和IL2RA,编码IL-2的受体CD 25,对NECA介导的抑制敏感,因此在对照组中明显下调,但A不受抑制。2A加NECA后R编辑的CAR T细胞(补充图.)六小时;补充数据2).

图7:瞄准A2ACRISPR/Cas9增强人抗Lewis Y CAR T细胞的效应功能。
figure7

制备人抗Lewis Y CAR T细胞,用CRISPR/Cas9和针对人A的sgRNA进行处理。2AR或非目标控制。CAR T细胞在下游试验前培养6-9天。A由ICE分析确定的INDEL频率。数据代表四种不同供体的平均±扫描电镜。B用指示剂量的NECA刺激后cAMP的积累。添加SCH 58261(SCH,1M)作为对照。数据表示三份样品的平均±SD值。的一个有代表性的实验的数据n=2。CCD8比例+CAR T细胞表达T细胞供应链管理CD45RA+CD62L+CD 27+表型左代表实验,右侧数据表示为4例个体供体的平均±扫描电镜.使用配对方法确定的统计数据t测试一下。D, E。2×105抗Lewis Y Car T细胞与mda-MB-435共培养(Lewis Y阴性,Ley)。在NECA(10 M)或SCH 58261(10 M)存在或不存在时,OVCAR-3或MCF 7细胞。8h后取上清液,测定IFNγ、TNF或MIP 1α的含量。数据显示的是三份/四份培养物的平均±sd值。n=6个实验,*p < 0.0001, ***p < 0.001, **p < 0.01, two-way ANOVA. F抗Lewis Y CAR T细胞与OVCAR-3肿瘤细胞共培养后,NECA介导的干扰素、γ和肿瘤坏死因子产生的抑制率。***p < 0.001, *p < 0.05 paired t测试,n6例(肿瘤坏死因子)或7例(干扰素γ)独立供者。G, H用抗独特型抗体(抗Ley Car)刺激抗Lewis Y Car T细胞8h,用3‘RNA-Seq分析10μM NECA和RNA。G基于前100位变量基因的主成分分析。H非靶向sgRNA和A在NECA(10 M)存在或不存在时抗CAR激活的CAR T细胞所指示通路的基因集富集分析2ARsgRNA-编辑的CAR T细胞。G, H如“方法”所述,对指示的R包进行了统计检验。I基因表达热图显示于(H)。NT sgRNA-非靶向sgRNA。源数据作为源数据文件提供。

CRISPR/Cas9-介导的A2AR缺失增强人CAR T细胞的体内效应

接下来我们研究了CRISPR/Cas9A的容量。2AR介导编辑抗Lewis Y CAR T细胞增强其体内抗肿瘤作用。为了验证这一点,我们对携带OVCAR-3肿瘤的NSG小鼠进行了治疗,这些肿瘤表达高水平的CD 73(附图)。8A),与A2A编辑或控制反刘易斯Y汽车T细胞。令人吃惊的是,A2AR缺失可显著增强CAR T细胞对肿瘤生长的抑制作用。8A,见图示补充图。3C),导致小鼠的存活时间明显延长(如图所示)。8B),利用三个独立供体产生的CAR T细胞进行复制(补充图)。8B)。值得注意的是,A2AR编辑导致两种CD8的数量增加。+和CD4+治疗后第8天外周血CAR T细胞相对于对照CAR T细胞(图1)。8C),并没有明显影响CD8的记忆表型。+(无花果)8D)或CD4+(补充图。8C)汽车T细胞。瘤内CAR T细胞分析发现CRISPR/Cas9介导的A编辑2AR显著提高两种CD8的比例。+和CD4+CAR T细胞表达干扰素γ和肿瘤坏死因子,而CAR T细胞总数未受影响(图1)。8E、F,补充图。8D,选通策略补充图。5B)。为了确定这种方法的安全性,我们评估了正在接受治疗的小鼠血清中的肾和肝毒性酶读数(图一)。8g)并在实验终点取肺、肝和脾脏切片(如图所示)。8H)。重要的是,无论是控制还是控制2AR编辑的CAR T细胞调节丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)或尿素的浓度,苏木精和伊红染色也未诱导明显的病理改变。综合来看,这些结果表明目标A2AR应用CRISPR/Cas9方法显著提高小鼠和人CAR T细胞的疗效,优于shRNA介导的基因敲除或药理A。2AR封锁

图8:瞄准A2ACRISPR/CaS 9可增强人抗Lewis Y CAR T细胞的体内效应。
figure8

NSG小鼠皮下注射5×106OVCAR-3肿瘤细胞。一旦肿瘤形成(15-20毫米)2),照射小鼠(1Gy),并给予9×10剂量的照射。6反刘易斯Y汽车T细胞产生如图所示。6在接下来的两天里。小鼠于术后0~4d用50,000 U的白细胞介素-2(IL-2)处理。A肿瘤生长,数据显示为每组6-7只小鼠的平均±扫描电镜,*p < 0.0001 per group, two-way ANOVA. B生存期确定为肿瘤超过80 mm时2. ****p < 0.0001 Log-Rank test. C, D小鼠治疗后第8天放血。C测定每升血中人T细胞数。数据显示的是平均值±扫描电镜,**p < 0.01, ****p < 0.0001 paired t测试一下。AC n=6(未处理)或7(模拟sgRNA或A)2A(RsgRNA)小鼠每组。DCD8表型+CD62L和Pd-1表达的CAR T细胞。显示的数据是从n=每组7人。E, F。治疗后第14天,肿瘤切除,(E)CD8+和(F)CD4+检测表达干扰素γ、肿瘤坏死因子(TNF)和Ki-67的CAR T细胞。数据为每组9只小鼠的平均±扫描电镜。*p < 0.05 paired t测试一下。G治疗后40d采集血清,确定血清因子浓度。数据显示为平均值±扫描电镜n=6(未经处理,模拟sgRNA)或7(A)2A(RsgRNA)小鼠每组。H实验终点取肺、肝、脾,用苏木精和伊红染色进行切片分析。每组一只有代表性的老鼠,每组三只。示出了指示200 m大小的缩放条。源数据作为源数据文件提供。

讨论

腺苷介导的免疫抑制是肿瘤浸润T细胞的主要免疫检查点,限制了常规化疗和免疫治疗方法的疗效。4,8,13。分泌腺苷的外生酶CD 73和CD 39在几种癌症类型中过度表达,在许多情况下,这与预后不良有关。21,45,46,47,48,49。针对这一轴心已经开发了许多策略,包括抗CD 73、CD 39和CD 38的抗体以及A的小分子拮抗剂。2AR和A2BR在临床发展中的作用13,50,51。由于T细胞表达高水平的A2AR,这种受体负责腺苷对T细胞的抑制作用,小分子A的应用引起了人们的极大兴趣。2AR拮抗剂可提高ACT和CAR T细胞的疗效。A类小分子拮抗剂2AR已被证明能增强过继转移的T细胞诱导增强抗肿瘤免疫的能力,包括SCH 58261。15,43、KW 600214,及消费物价指数-4445。我们以前使用小鼠CAR T细胞的研究表明,而A2ASCH 58261阻断剂对CAR T细胞的体内效应增强,从A衍生的CAR T细胞的作用更为明显。2AR缺乏小鼠16。因此,我们假设基因靶向方法是为了击倒/击倒A。2A与药理学A相比,r能显著提高药效和选择性。2AR封锁到目前为止,使用基于遗传的方法对CAR T细胞中腺苷信号进行了有限的研究。以前的两项研究,包括我们自己的研究,都描述了shRNA在调节A中的作用。2AR介导对CAR T细胞的抑制作用16,44但这些研究仅限于细胞因子产生和杀伤能力的体外评估。重要的是,以前没有任何研究涉及CRISPR/Cas9的使用-A的编辑2AR,这很可能是基因中断进入临床的首选途径。因此,为了进一步研究这一点,我们开发了目标A的方法2AR使用shRNA或CRISPR/Cas9技术。

我们的初步研究使用从A衍生的CAR T细胞。2AR+/+,A2AR+/,或A2AR−/−小鼠表明2AR+/−CAR T细胞对腺苷类似物NECA具有较高的敏感性,即使在低剂量时也是如此。这表明T细胞效应功能对低水平A是高度敏感的。2AR的表达和推测,无论是基于基因的还是药物的方法,都是针对A的。2AR的目标应该是达到50%以上的抑制作用,从而显著降低腺苷的敏感性。因此,尽管靶向A的shRNAs有很高水平的转导2AR,以及对A的显著抑制2AR信号转导、shRNA介导的基因敲除不能阻断NECA介导的CAR T细胞功能的抑制.这与CRISPR/Cas9介导的A缺失形成鲜明对比。2A,这是一种高效的方法,导致了A的完全损失。2AR信号表现为缺乏cAMP积累和全基因组转录分析。我们的结果与以前的研究结果一致。2AR是T细胞上腺苷的主要靶点,也是其他腺苷受体(如A)的主要靶点。2BR不赔偿A的损失2AR52。这可能在一定程度上是由于观察到2AR是A的表达所必需的2B细胞表面R53。然而,这些概念支持了我们的观点,即以A为目标2ACRISPR/CaS 9的R可以减弱腺苷介导的对CAR T细胞的抑制作用。

奇怪的是,shRNA介导的A基因敲除2AR促进效应T细胞分化,特别是通过CAR对刺激的反应。这就增加了肿瘤部位的效应功能,包括促进细胞因子的产生和颗粒酶B和Ki-67的表达。然而,现在人们认识到,增加CAR T细胞激活会导致终末效应样分化的增强,这可能会损害持久性。事实上,与此一致的是,我们观察到shRNA介导的A在体内恢复的CAR T细胞的数量显著减少。2A击倒。相反,CRISPR/Cas9-介导的A缺失2AR对小鼠和人CAR T细胞的CAR T细胞记忆表型的影响最小,相对于对照CAR T细胞具有相似的持久性。这一结果与A2AR缺失促进CD8的持续存在+LCMV背景下的T细胞38和我们以前用CAR T细胞从A中提取出来的观察2AR缺乏的小鼠,可获得与野生型小鼠相当的植入量。16。这些差异的原因尚不完全清楚;然而,先前的一项研究已经表明了A的作用2AR信号在促进T细胞记忆、增强IL-7R表达中的作用11一个关键的有利于生存的因素。我们的数据表明2AR基因敲除增强了CAR T细胞效应器的功能,牺牲了长期的CAR T细胞反应,而完全敲除了A。2AR通过未知的机制绕过对T细胞持久性的影响。其原因将是有趣的,以确定在未来的研究结合分析记忆相关基因的敲除和敲除汽车T细胞。然而,一种不能完全折扣的可能性是,shRNAs会产生非特定方式影响CAR T细胞记忆反应的非目标效应。然而,由于这些效应是用具有不同序列的独立的shRNAs来验证的,这似乎不太可能。值得注意的是,shrna和crispr/ca 9之间的比较表明,即使这两种技术都已被证实为目标,仍有相当比例的shRNA能够在crispr/ca 9编辑中产生一个独特的基因签名。54.

我们的数据清楚地表明CRISPR/Cas9编辑的A2AR是增强CAR T细胞功能并使其对腺苷(一种主要免疫抑制因子)产生抗药性的一种非常有效和有效的方法。我们首先证明了这一点,使用抗人Her2导向的小鼠CAR T细胞过继转移到人Her2转基因小鼠中。该模型在小鼠大脑(小脑)和乳腺组织中表达人Her 2,使小鼠能够耐受外源Her 2抗原。55。因此,这些研究突出了A的能力。2AR编辑的CAR T细胞在免疫活性模型中诱导抗肿瘤免疫反应,该模型包含免疫抑制亚群,如MDSCs和Tregs,它们产生腺苷,限制了car T细胞在实体肿瘤中的功能。56。我们还证明了该方法对临床相关的抗Lewis Y car T细胞构建的人CAR T细胞是有效的。40(NCT 03851146)2AR编辑的CAR T细胞能产生更好的治疗效果。删除A2ACRISPR/Cas9编辑可显著增强CAR T细胞对多种促炎细胞因子的转录。其中,我们证实了干扰素γ、肿瘤坏死因子和MIP 1α在A组中的分泌增强。2AR编辑的CAR T细胞在蛋白质水平。有趣的是,而A2AR缺失完全减弱了NECA对干扰素γ和MIP 1α产生的抑制作用,NECA对A区TNF仍有部分抑制作用。2AR编辑的细胞,虽然程度较小。这可能意味着A的角色2B腺苷介导的抑制肿瘤坏死因子产生或残留A的r2AR在CAR T细胞亚群上的表达。后者与TNF对A敏感性的增加相一致。2AA杂合子中R介导的表达2AR+/汽车T细胞。值得注意的是,我们和其他人之前已经确认,干扰素γ和肿瘤坏死因子在体内对car T细胞效应的功能都是至关重要的。16,32,57,强调增加这些细胞因子产生的重要性。这可能与干扰素γ和肿瘤坏死因子在非car T细胞直接靶向的肿瘤细胞上激发“旁观者”活性有关。33,调节肿瘤微环境中的其他免疫细胞和(或)其调节肿瘤基质和抑制新生血管的倾向,正如以前在A中观察到的那样。2AR缺乏T细胞7。有趣的是,我们观察到2AR缺失同样促进了两种CD8细胞因子的产生。+和CD4+体内的CAR T细胞。鉴于新出现的数据显示CD4的重要性,这具有重要意义。+T细胞在CAR T细胞治疗中的抗肿瘤作用。在我们的研究中,我们观察到A的缺失2AR/CD8+CAR T细胞足以介导治疗反应的增强。然而,这些结果并不排除A的作用2ACD4 R缺失+当使用更高比例的CD4时,CAR T细胞可能变得更加明显。+我们的同基因模型中所用的CAR T细胞。此外,腺苷还能抑制两种CD8的效应功能。+和CD4+常规T细胞13,最近的一项研究表明2A肌苷激活R能增强TH1分化58。肌苷是否能调节CAR T细胞的分化尚不清楚,但仍是一个值得进一步研究的课题。

当我们观察到2AR活化抑制CD8细胞因子的产生+和CD4+CAR T细胞,我们没有观察到A的作用2AR抑制抗Lewis Y CAR T细胞的直接细胞毒活性。然而,我们不能低估长期A的可能性2AR的激活导致体内细胞毒性功能受损,特别是在A2A在离体肿瘤组织中,r编辑的CAR T细胞中颗粒酶B的表达明显高于对照CAR T细胞。

因此,我们的数据支持利用CRISPR/Cas9-介导的A编辑的概念。2AR增强CAR T细胞功能。我们的数据支持CRISPR/Cas9策略可能比shRNA介导的靶向或药物封锁更有效,这可能与A的高度亲和力有关。2AR代表腺苷,意思是任何残留的A2AR受体的表达仍能发挥有效的免疫抑制作用。然而,将此方法与其他针对组织缺氧的策略(如补充氧合或低氧敏感的前药)相结合可能是有意义的。59,60。从安全的角度来看,虽然可能对永久的A有潜在的担忧2AR缺失和对宿主的过度免疫反应,我们观察到2AR编辑的CAR T细胞是安全和耐受性好的,这表现在未改变的酶的稳态浓度,表明肝或肾毒性和组织切片的小鼠接受治疗。事实上,以A为目标2A鉴于低氧腺苷轴在肿瘤微环境中更为突出,相对于其他免疫抑制途径,r可能具有良好的安全性。因此,这种方法的临床翻译效率很高,值得注意的是,在本研究中使用的sgRNA/ca 9 rnp的瞬时传递是非常有效的,并且导致有限的非目标编辑。20。因此,鉴于支持使用ACT和CAR T细胞的临床试验和旨在克服肿瘤免疫抑制的免疫疗法(NCT 03287817、NCT 03296137、NCT 03310619和NCT 02070406)的出现,这种方法具有很高的翻译潜力。此外,crispr/ca 9-介导的car T细胞编辑优先,因为crispr/ca 9介导的各种抑制基因的缺失,包括pd-1、转化生长因子βR和ptpn 2,已经被证明是有效的,pd-1编辑的T细胞现在已经应用于患者。17,19,20,39。鉴于A2A我们相信,在未来的研究中,使用CRISPR/Cas9来进一步保护CAR T细胞免受肿瘤诱导的免疫抑制是有意义的。


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