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RFC 4/Noch 1信号反馈环促进NSCLC转移和干细胞

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发表时间:2021-05-14 09:33作者:武汉新启迪Xinqidbio

摘要

Notch信号是介导肿瘤转移和干细胞的关键机制。为了了解Notch信号是如何被过度激活来耦合NSCLC细胞中的肿瘤转移和自我更新的,我们进行了本研究,发现在40%以上的NSCLC组织中扩增出的DNA复制因子RFC 4直接结合到Notch 1细胞内结构域(NICD 1),竞争性地抑制CDK 8/FBXW 7介导的NICD 1降解。此外,RFC 4Noch 1是Noch 1信号转导的功能转录靶基因,在高RFC4和NICD 1之间形成一个正反馈环,Notch信号持续过度激活,不仅导致NSCLC肿瘤发生和转移,而且使NSCLC细胞对NICD 1合成的药物DAPT产生耐药性。此外,结合我们的研究,对涉及1500多名非小细胞肺癌患者的两个公共数据集的分析表明:RFC 4基因扩增、高RFC4和NICD 1水平与非小细胞肺癌的转移、进展及不良预后密切相关。因此,我们的研究描述了RFC 4和NICD 1之间的正反馈回路在NSCLC转移和干细胞特性耦合中的关键作用,并提出了其在NSCLC治疗中的治疗和诊断/预后潜力。

导言

肺癌是全世界最常见的癌症类型,也是癌症相关死亡的主要原因。1。非小细胞肺癌(NSCLC)约占所有肺癌病例的85%,主要由腺癌、鳞状细胞癌和大细胞癌亚型组成。据估计,近三分之二的非小细胞肺癌患者在诊断时有局部或远处转移的迹象,只有大约15%的转移性非小细胞肺癌患者在诊断转移后5年或更长时间内存活。2。除了淋巴结(Lns)和对侧肺的局部转移外,非小细胞肺癌细胞还经常扩散到不同的远距离器官,通常累及骨头、大脑和肝脏,无论是单独的还是同时的。3。尽管目前已有的治疗方法取得了重大进展,但转移性非小细胞肺癌患者对最初的抗癌治疗的不良反应率和治疗后相当高的肿瘤复发频率仍然是临床上最严峻的挑战。4,5。因此,了解这些临床困难的原因并确定有效的治疗靶点或预后的生物标志物对于早期诊断转移性非小细胞肺癌是非常重要的。

众所周知,非小细胞肺癌预后不良和临床治疗困难主要是由于某些非小细胞肺癌细胞的转移和干细胞特性所致。6。转移过程涉及串级事件。7。癌细胞干细胞使肿瘤细胞具有自我更新的能力,能够从极少数的细胞中发展出可见的肿瘤,它不仅有助于肿瘤的发生,而且还有助于治疗耐药性、肿瘤的复发和扩散。8。值得注意的是,在癌症的发展和发展过程中,干细胞和转移是相互耦合的。9。例如,Mani等人。10报道了转移诱导程序可以诱导肿瘤干细胞样状态的发生。10。肿瘤细胞在自我更新侧种群中所占的比例较高,其增殖速度通常较快。11,12。然而,肿瘤干细胞和转移特性发展的机制基础,以及这两种特性之间的内在联系,仍然缺乏了解。

在分子水平上,肿瘤干细胞和转移的特性可以通过单一的、常见的信号通路来调节,其中Notch通路被发现是广泛且构成性过度激活的,尤其是在转移性NSCLC中。13,14。典型的Notch信号是由特定配体(如信号发送细胞上的JAG家族成员与信号接收细胞上的Notch家族成员)之间的相互作用、ADAM 10在胞外副膜部位的Notch蛋白水解以及γ-分泌酶在Notch跨膜结构域的断裂而启动的,进而导致Notch蛋白胞内结构域的释放。镍镉转运到细胞核并与dna结合的转录因子rbp-jκ结合,导致rbp-jκ从转录抑制因子转化为转录激活因子,从而导致转录下游的关键靶点(如HES 1、HES 5和HEY 1)的转录,这些是抑制分化促进基因转录的转录抑制因子。15,16,17,18。值得注意的是,一些γ-分泌酶抑制剂已经在I/II期临床试验中测试过,包括难治性转移或局部晚期非小细胞肺癌患者,这些患者几乎以治疗失败而告终。19。因此,研究Notch信号是如何被过度激活来耦合转移和干细胞特性是非常重要的。

在生理条件下,负调控抑制Notch信号的过度激活。20。例如,cdk 8可以被招募到nicd-rbp-jκ复合物以磷酸化nicd,e3连接酶fbxw 7随后会识别磷酸化nicd导致其在细胞核中的泛素依赖性降解。21,22。相反,负调控的缺失导致nicd的稳定和nicd在细胞核中的大量积聚,这是Notch信号过度激活的一个重要标志,已被广泛地牵涉到肿瘤的发展和进展中。23,24。在此背景下,在急性T淋巴细胞白血病(T-all)患者中,常发现Noch 1异二聚体和PEST结构域的突变,这些突变导致Noch 1与配体无关,并对CDK 8/FBXW 7介导的磷酸化和NICD 1降解产生抗性。25,26。此外,FBXW 7的失活突变导致NICD 1的稳定和Notch信号的过度激活,在结直肠癌、胃癌、胰腺癌、子宫内膜癌和血液癌中也存在。27,28,29。然而,在非小细胞肺癌中,Notch信号的重要调节因子的基因改变很少出现。30,31,32。因此,Notch信号的负调控如何被破坏,从而在NSCLC中诱导和维持高水平的NICD,需要进一步研究。

在本研究中,RFC 4是复制因子C复合体的几个亚基之一,它作为聚合酶辅助蛋白在DNA复制和修复中起着重要作用,在NSCLC中经常被扩增,并作为Noch 1信号的下游转录靶点。此外,RFC 4与竞争性废除CDK 8/FBXW 7介导的磷酸化和泛素化紧密结合,稳定NICD 1蛋白,并以正反馈方式过度激活Notch信号,赋予NSCLC细胞转移、干细胞特性和对γ分泌酶抑制剂的抗性,提示高RFC 4和NICD 1的正反馈环具有治疗、诊断和预后潜力。

结果

Rfc 4在Notch活化诱导的非小细胞肺癌的转移和干细胞中起重要作用。

为探讨Notch信号在NSCLC进展过程中是否起作用,采用基因集富集分析(GSEA)方法对从TCGA肺癌数据集下载的有无淋巴结转移的NSCLC患者的基因表达谱进行了分析。我们的结果表明Notch信号在LN转移患者中被异常激活。1A)。此外,在219例NSCLC患者中,有LN转移的原发肿瘤表达的NICD 1蛋白水平高于无转移肿瘤,NICD 1蛋白水平高与无转移生存期相关(图一)。1B,c)。NICD 1的高表达始终赋予NSCLC细胞强大的转移和干细胞特性,因为NICD 1高表达细胞分别在心内注射和静脉注入时表现出明显的全身转移和肺转移,并且在只有5×10的情况下能够形成肿瘤。3细胞皮下接种。1D-h)。为了确定NICD 1诱导的恶性肿瘤发生的关键因素,对NICD 1高表达的A 549细胞和相应的载体对照细胞进行了全局基因表达的比较研究(GSE 137106)。在被NICD 1显著上调的基因中(图1)。1I和补充数据1Rfc 1、Rfc 2、RFC 3、RFC4和RFC 5是复制因子C(RFC)复合物的一个亚单位,RfC 1、RFC 2、RFC 3、RFC4和RFC 5作为聚合酶辅助蛋白参与DNA复制和修复,不仅显著逆转NICD 1促进肿瘤细胞增殖和存活的作用,而且显著逆转NICD 1促进肿瘤细胞侵袭和形成肿瘤球的能力,增加侧群体(SP)细胞的比例,增加侵袭和促进干细胞的基因(Fig)的表达。1J和补充图。1A-g)。此外,沉默的RFC4明显损害NICD 1高表达的NSCLC细胞的侵袭和自我更新能力,即使细胞增殖受到丝裂霉素C(DNA合成抑制剂)的抑制或顺铂诱导的细胞死亡(补充图)。1H,I)。Rfc 4沉默的A 549-Luci-NICD 1细胞在静脉注入时会产生微弱的生物发光转移信号,只有在5×10以上时才能产生小肿瘤。4细胞皮下接种,而A 549-Luci-NICD 1细胞表现出强大的转移和致瘤能力。1K,l和补充图。1J,k)。这些数据表明,NICD 1上调的RFC4可能不仅促进细胞增殖,而且在NSCLC的发生发展过程中,过度激活Notch信号所引起的转移和干细胞特性也起着关键作用。

图1:RFC4对Notch活化诱导的非小细胞肺癌的转移和干细胞是必不可少的。
figure1

a用Kolmogorov-Smirnov试验分析TCGA肺癌数据集中有无淋巴结转移的NSCLC患者的基因表达谱。b在219例有无LN转移的NSCLC患者中,IHC检测了NICD 1在原发肿瘤中的表达。列举了两个具有代表性的案例。标尺:20μm。c采用对数秩检验对219例非小细胞肺癌患者LN无转移生存率进行Kaplan-Meier分析,按NICD 1表达中位数分为低、高亚组。d, e将A 549-Luci载体或A 549-Luci-NICD 1细胞经心室注入裸鼠体内。n=每组5人)。有代表性的全身转移和体内外器官转移的生物发光图像。d,H&E组织学证实骨和脑组织中的肿瘤细胞(e)。列举了两个具有代表性的案例。标尺:100μm。f, g裸鼠静脉注射A 549-Luci载体或A 549-Luci-NICD 1细胞。n=每组5人)。有代表性的生物发光图像(f)、苦味酸染色、H&E染色及肺组织转移灶数。g)。列举了两个具有代表性的案例。标尺:100μm。h给出了不同细胞数和不同肿瘤形成频率下皮下移植瘤的生长曲线。i基因表达谱分析表明,NICD 1过表达诱导的10个基因表达上调最多。j沉默RFC4对NICD 1-高表达细胞表达的影响。k, l高表达NICD 1或与RFC 4-沉默的A 549细胞一起在肺内定植或产生异种肿瘤的能力n=每组5人)。列举了三个具有代表性的案例。标尺:100μm。误差条表示三个独立实验的平均值±SD。用双尾未配对学生进行统计分析t-测试(g),双向方差多重比较分析(h, jl)。源数据作为源数据文件提供。

Rfc 4是Noch 1信号转导的一个新的直接转录靶点。

有趣的是,我们进一步发现,通过过表达NICD 1或通过JAG 1处理激活Notch信号,可显著增加低水平NICD 1表达的A 549细胞的RFC 4表达,而通过沉默Noch 1或用γ-分泌酶抑制剂dapt处理抑制Noch 1的激活,可降低RFC 4在H1975、LLC(Lewis肺癌)和原代培养的肺癌细胞(LC1)中的表达,后者均高表达NICD 1和RFC4(Fig)。2A,b和补充图。2A,b)。此外,激活或抑制Noch 1信号分别促进和消除活化组蛋白H3K27ac在启动子区的富集。RFC 4这些非小细胞肺癌细胞中的基因。2C,d和补充图。2C)。同时,沉默RBP-Jκ可显著抑制RBP 4的表达,逆转NICD 1诱导的RFC 4表达上调,抑制Noch 1的激活同样可逆转RBP-Jκ-诱导的RFC 4水平升高(图一)。2E,f和补充图。2D,e)。然后,我们研究了NICD 1、RBP-Jκ和Notch信号通路如何在转录上上调RFC 4的表达。通过分析RFC 4在转录起始位点下游1147 bp的ENCODE H3K4me1位点上,利用ECR浏览器(RBP-Jκ的潜在结合位点)鉴定了唯一的典型Notch信号转录因子(ENCODE H3K4me1)。2G)。此外,芯片分析还发现rbp-jκ与该基因上游启动子区域的预测位点结合。RFC 4各种非小细胞肺癌细胞中的基因。2H和补充图。2F)。另外,分别在荧光素酶报告基因上游克隆含有推测RBP-Jκ结合位点或突变序列的500 bp序列片段时,NICD 1过表达和RBP-Jκ基因敲除均能显著提高NICD 1报告基因的荧光素酶活性,沉默RBP-Jκ也明显抑制NICD 1过表达的上述转录增强效应(Fig)。2I和补充图。2G),建议RFC 4基因确实受到RBP-Jκ的直接转录诱导,从而成为Notch信号转导的下游靶基因。

图2:RFC 4是Noch 1信号的新的直接转录靶点。
figure2

a, b过表达NICD 1、JAG 1或γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制Notch信号转导激活Notch信号对A 549、H 1975和LC1细胞RFC4蛋白和mRNA水平的影响。展示了三个独立的可重复实验的代表性图像。c, dH3K27ac免疫沉淀后的芯片分析表明,H3K27ac与RFC 4基因启动子区之间存在相互作用,这与NICD 1的过度表达或DAPT的治疗有关。以IgG免疫沉淀为阴性对照。e沉默RBP-Jκ或过表达RBP-Jκ与DAPT联合作用对A 549、H 1975和LC1细胞RFC4蛋白水平的影响。展示了三个独立的可重复实验的代表性图像。f沉默RBP-Jκ,过表达RBP-Jκ,配合DAPT处理对A 549、H 1975和LC1细胞RFC4基因表达的影响。gRBP-Jκ在RFC 4启动子区域的潜在结合位点示意图。h芯片富集实验显示RBP-Jκ与刺激JAG 1的RFC 4启动子区的预测结合位点结合。以IgG免疫沉淀为阴性对照。i过量表达NICD 1和RBP-Jκ缺失对报告人荧光素酶活性的影响跨越野生型或突变体,预测RBP-Jκ在RFC 4启动子区域的结合位点。面板中的数据bd, f, hi作为三个独立实验的平均±SD。采用双向方差多因素比较分析法进行统计分析。源数据作为源数据文件提供。

RFC 4在体内外促进非小细胞肺癌的转移和干细胞

与上述Notch信号过度激活在NSCLC中的发现相一致,我们的数据显示,在105个NSCLC肿瘤组织中,81个组织中RFC 4的表达与TCGA肺癌数据集中相应的相邻非癌肺组织(折叠变化>2)以及8对新切除的非小细胞肺癌组织标本相比明显上调(补充图)。3A-d)。然后我们研究了RFC 4在非小细胞肺癌的发展和进展中的潜在作用。如图所示。3A;补充图。3e-hRFC 4在LUAD(A 549)和肺鳞状细胞癌(LUSC)(H 1703)细胞株中的过表达诱导了侵袭和干细胞促进基因的表达,增强了这些非小细胞肺癌细胞通过Matrigel侵入的侵袭能力和自我更新能力,并生长成更大尺寸的非贴壁细胞球,增加了SP细胞的比例。相比之下,NSCLC细胞对内源性RFC 4表达的沉默显示,与其相应的置乱控制细胞相比,NSCLC细胞的侵袭能力大大降低,自我更新能力减弱(图一)。3B和补充图。3E,i)。在我们体内的研究中,类似于NICD 1的作用,RFC4过表达的细胞在不同的器官组织,尤其是脑和骨骼中形成明显的转移,并分别在心内注射和静脉注入时表现出明显的肺定植。3C,d和补充图。3J,k)。令人印象深刻的是,无论是心内注射还是静脉注射RFC-4沉默的NSCLC细胞,几乎都没有出现转移的生物发光信号。3C,d和补充图。3J,k)。同时,只有5×103Rfc 4-高表达细胞发生皮下肿瘤,而超过5×10。4矢量控制细胞和5×105RFC 4-沉默的细胞是肿瘤形成所必需的(如图所示)。3E)。此外,我们用免疫活性小鼠(C57BL/6N)建立了RFC 4沉默LLC细胞和载体对照LLC细胞的转移和致瘤性模型。一贯地,沉默的RFC4显著抑制高转移小鼠肺癌细胞在静脉注射时形成肺转移的能力,或在注射5×10的各种细胞时发展为皮下肿瘤的能力。3至5×105C57BL/6N小鼠。3F,g和补充图。3L)。综上所述,这些数据有力地表明,高水平的RFC 4与NICD 1一样显著地促进了NSCLC的转移和干细胞特性。

图3:RFC4促进非小细胞肺癌的体内外转移和干细胞生长。
figure3

a过量表达RFC4对A 549细胞通过基质细胞侵袭或形成肿瘤球的能力的影响。展示了三个独立的可重复实验的代表性图像。标尺:50μm。b沉默的RFC4对H1975、LLC和LC1细胞通过基质细胞侵袭或形成肿瘤球的能力的影响。展示了三个独立的可重复实验的代表性图像。标尺:50μm。c将RFC 4-高表达A 549-Luci细胞经心室注入裸鼠体内。n=每组5人)。有代表性的全身转移和体内外器官转移的生物发光图像(左面板)。H&E组织学证实肿瘤细胞在脑和骨组织(右面板)。列举了两个具有代表性的案例。标尺:100μm。d将RFC 4基因敲除的H1975-Luci细胞经心室注入裸鼠体内(n=每组5人)。有代表性的全身转移和体内外器官转移的生物发光图像(左面板)。H&E组织学证实肿瘤细胞在脑和骨组织(右面板)。列举了两个具有代表性的案例。标尺:100μm。e本文给出了RFC 4-高表达A 549细胞移植瘤的生长曲线,观察了不同细胞数和肿瘤形成频率对细胞数的影响。fC57BL/6N小鼠(n每组5只)静脉注射RFC4沉默的LLC细胞。本文对2例有代表性的肺组织进行了微CT成像和H&E染色。标尺:100μm。g在RFC 4沉默的LLC细胞皮下植入不同细胞数的异种移植瘤,肿瘤形成频率为指示细胞数。n=每组5人)。列举了三个具有代表性的案例。标尺:2毫米。面板中的数据e作为三个独立实验的平均值±SD。采用双向方差多因素比较分析法进行统计分析。源数据作为源数据文件提供。

值得注意的是,与RFC 4在DNA复制和修复中的作用相一致,RFC 4的过度表达明显促进NSCLC细胞的增殖、细胞周期进程和对顺铂诱导的细胞凋亡的抗性(附图)。4A-E)。然而,当丝裂霉素C处理抑制NSCLC细胞增殖或顺铂诱导细胞死亡时,RFC 4对NSCLC细胞侵袭能力和自我更新能力的促进作用没有改变。4F,g)。此外,RFC 3和RFC 5在NSCLC组织中的表达水平与癌旁正常肺组织相比很少上调(补充图)。RFC 3和RFC 5与RFC 4结合形成核心聚合酶副复合物。5A),沉默Rfc 2或RFC 5或沉默必要的DNA复制辅助基因PCNA,可逆转RFC 4对NSCLC细胞增殖的促进作用,但不能干扰RFC 4诱导的Noch 1信号激活或RFC 4增强肿瘤的体外侵袭和干细胞性或体内肿瘤转移和致瘤性(补充图1)。5B-I)。这些数据表明,rfc 4的强促转移和自我更新作用可以独立于其在DNA复制和修复中的作用,以及其促进NSCLC细胞增殖、细胞周期和存活的能力。

RFC 4促进NICD 1蛋白稳定性,形成正反馈环。

然后我们研究了RFC 4诱导NSCLC细胞侵袭性的机制。有趣的是,RFC 4的过度表达明显增加,而沉默的RFC 4则降低了NICD 1蛋白的水平,而不影响Noch 1的mRNA水平或各种NSCLC细胞株和原代NSCLC细胞中的全长Noch 1蛋白的数量(图一)。4A和补充图。6A)。此外,过表达或沉默的RFC 4改变了细胞核中NICD 1蛋白的数量,但改变了细胞质中的NICD 1蛋白的数量。4B),表明rfc 4可能调节nicd 1蛋白的稳定性,据报道,nicd 1蛋白的稳定性是由核内一系列分子事件引起的泛素依赖性降解。33。事实上,沉默的RFC 4使NICD 1的K48连接的多泛素化显著增加,从而使RFC 4的过度表达明显延长,而沉默的RFC 4则大大缩短了NSCLC细胞株和原代NSCLC细胞的NICD 1蛋白的半衰期(如图1所示)。4C,d和补充图。6B,c)。因此,RFC 4的过表达促进了Notch信号的转录活性,从而抑制了NSCLC细胞中几个典型下游基因的表达,而沉默的RFC4则抑制了RFC 4的转录活性。4E和补充图。6d)。同样,沉默的RFC4可逆转NICD 1或JAG 1诱导的NSCLC细胞中Notch信号的激活,而RFC 4沉默前NSCLC细胞的Notch信号对刺激HUVECs中JAG 1过表达不敏感(补充图)。6e-g)。此外,尽管RFC 4基因敲除不影响NICD依赖的转录,但沉默的RFC 4可在不同程度上逆转NICD 1诱导的一组Noch 1下游基因的表达(补充图)。六小时)。这些结果提示,NICD 1诱导的RFC 4高水平表达促进NICD 1蛋白稳定性形成正反馈环,导致NSCLC Notch信号的本构过度激活。

图4:RFC4促进NICD 1蛋白稳定性,形成正反馈环。
figure4

a, bNICD 1全长Noch 1、NICD 1的WB分析及NICD 1在指示细胞中的亚细胞分布。c通过标记标记的NICD 1在A 549、H 1975、LC1和LLC细胞中的免疫共沉淀,观察了沉默RFC 4对NICD 1 K_(48)连接多泛素化水平的影响。以显性阴性突变型HA标记泛素(UbK48R-HA)为阴性对照.dRFC 4过表达对A 549细胞NICD 1半衰期的影响及RFC 4沉默对H1975细胞NICD 1半衰期的影响,以及环合宁(CHX)对LC1细胞半衰期的影响。e双荧光素酶检测显示,在指示细胞中有Notch信号活性。f对TCGA肺癌数据集的GSEA分析显示RFC 4和Notch信号增强信号之间存在相关性。g对TCGA肺癌数据集中971例NSCLC组织的RNA-seq数据进行Pearson相关分析,结果表明RFC 4的表达与HES 1、HEY 1、HEY 2和NRARP水平相关。h在同一组连续的NSCLC组织切片中,RFC 4、NICD 1和HES 1的代表IHC染色图像,以及219例NSCLC组织中RFC 4的表达与核NICD 1和HES 1水平的相关性。标尺:20μm。三个独立的可重复实验的代表性图像。ad)。面板中的数据e, f, h作为三个独立实验的平均±SD。双向方差多元比较分析(e),双尾学生的t-测试(g),并采用双尾卡方检验(h)进行统计分析。源数据作为源数据文件提供。

值得注意的是,根据TCGA肺癌数据集中971例非小细胞肺癌患者肿瘤组织的RNA-seq数据,RFC 4的表达水平不仅与细胞增殖标志物呈正相关,而且与Noch 1信号过度激活呈正相关,特别是与其几个典型下游基因如HES 1、HEY 1、HEY 2和NRARP的表达水平呈正相关。4F,g和补充图。6I)。与这些发现相一致,我们证实了在本研究收集的219例非小细胞肺癌组织中,RFC 4的表达与NICD 1和HES 1水平呈正相关(图1)。4H),提示NSCLC发展和进展过程中由活化Notch和高RFC4水平组成的正反馈环的临床相关性。

RFC 4通过废除CDK 8/FBXW 7诱导的降解来稳定NICD 1

接下来我们询问RFC4是如何促进NICD 1蛋白稳定性的。值得注意的是,通过免疫共沉淀和质谱(MS)分析,NICD 1被确定为RFC 4的潜在结合伙伴,经内源性或外源性RFC4、纯化的重组RFC4蛋白和内源性Not 1或外源NICD 1的免疫沉淀进一步验证。5A和补充图。7A-c)。同时,RFC 4与NICD 1之间的相互作用在RFC 4和Noch 1分别被沉默时减弱(图1)。5B)。此外,表面等离子共振(SPR)分析表明,RFC 4和NICD 1的纯化蛋白之间存在着高度的结合亲和力(图1)。5C)。我们进一步发现,RFC4与含有NICD 1结构域的C端尾相互作用。7D)。由于CDK 8在NICD 1 PEST结构域的丝氨酸磷酸化和E3连接酶FBXW 7对磷酸化NICD 1的识别是NICD 1泛素依赖性降解的关键,因此我们不得不研究RFC 4是否影响NICD 1与CDK 8或FBXW 7的相互作用,从而影响NICD 1的降解。首先,SPR动力学分析表明,RFC 4与NICD 1的结合亲和力约为CDK 8与NICD 1的5倍。5C)。第二,当HA标记的NICD 1蛋白被免疫沉淀时,CDK 8或其结合伙伴Cyclin C的数量逐渐减少,甚至完全减少;有趣的是,虽然NICD 1与RFC4的结合可能因CDK 8的数量增加而受到剂量依赖性的影响,但似乎需要大量的CDK 8蛋白来显著消除NICD 1和RFC4之间的相互作用(见图)。5D)。第三,沉默RFC 4轻度增强NICD 1与CDK 8之间的相互作用,沉默CDK 8显著增强NICD 1与RFC4的相互作用;同时,过表达的RFC 4显著抑制NICD 1与CDK 8的结合,而CDK 8过表达则轻度削弱NICD 1与RFC4的结合(如图4所示)。5E)。值得注意的是,从TCGA肺癌数据集来看,NSCLC组织中CDK 8和Cyclin C的mRNA水平与正常肺组织相比略有升高;事实上,CDK 8蛋白水平在8对NSCLC组织中很少上调,而RFC 4蛋白水平则显著上调(补充图)。5A)。这些结果表明,RFC 4与NICD 1的结合亲和力较高,且RFC 4在NSCLC组织中的表达增加,使RFC 4在与NICD 1结合方面比CDK 8具有更强的竞争能力。

图5:RFC 4通过废除CDK 8/FBXW 7诱导的降解来稳定NICD 1。
figure5

aMS肽测序免疫沉淀组分,利用抗标记亲和纯化,从转染标志标记rfc 4的A 549细胞的裂解液中提取。b免疫沉淀实验显示RFC4与NICD 1的相互作用。cSPR分析测定RFC4与NICD 1和CDK 8与NICD 1相互作用的亲和力和动力学。将NICD 1固定在CM5芯片上。d转染NICD-HA的293 FT细胞裂解液经抗HA亲和凝胶免疫沉淀,与纯化的RFC4或CDK 8蛋白共同孵育,再加入一定剂量的纯化CDK 8、RFC4蛋白。用免疫印迹法对结果进行分析。eNICD 1和CDK 8或RFC4在RFC 4或CDK 8存在或沉默时的相互作用通过NICD 1的免疫沉淀来评价。f, gWB分析过表达或沉默RFC4或联合CDK 8沉默对NICD 1免疫沉淀的丝氨酸和苏氨酸磷酸化水平的影响。hNICD 1与CDK 8或FBXW 7在RFC 4-标志存在或不存在时的相互作用用Noch 1免疫沉淀法进行评价。i用NICD 1-HA在A 549 WT和FBXW 7基因敲除细胞中的免疫共沉淀方法,研究了NICD 1和FBXW 7在RFC 4-标志存在或不存在时NICD 1和FBXW 7的相互作用。j, k通过标记NICD 1在A 549、H 1975、LC1和LLC细胞中的免疫共沉淀,检测NICD 1的K48连锁泛素化水平。除图所示外,源数据作为源数据文件提供。5C.

结果表明,RFC 4过表达显著降低,而沉默RFC 4则增加了核NICD 1蛋白的丝氨酸和苏氨酸磷酸化,而沉默CDK 8则逆转了沉默RFC 4对核NICD 1丝氨酸和苏氨酸磷酸化水平和总蛋白水平以及Notch信号转录活性的相应影响(图1)。5F,g和补充图。7E,f)。有趣的是,过高表达的RFC4仍然明显降低了NICD 1(S2514A)或NICD 1(S2517A)的丝氨酸和苏氨酸磷酸化,而RFC4几乎没有降低NICD 1(S2514A/S2517A)的总丝氨酸和苏氨酸磷酸化(S2514A/S2517A);相反,RFC4过表达显著降低了NICD 1(T2512A)、NICD 1(T2542A)或NICD 1(T2512A/2542A)的丝氨酸磷酸化,仅降低了NICD 1(T2512A)或NICD 1(T2542A)的总苏氨酸磷酸化(T2512A/2542A)。7g)。值得注意的是,过表达的RFC 4显着地取消了NICD 1与MEKK 1或GSK-3β的结合(补充图)。7H),是分别在T 2512和T 2542上磷酸化NICD 1的潜在激酶。34,35。基于这些数据,我们推测RFC 4与NICD 1的PEST结构域的结合可能排斥其他NICD 1相互作用的蛋白质,包括各种NICD 1激酶,从而使NICD 1在多个丝氨酸或苏氨酸氨基酸(如S 2514、S 2517、T 2512和T 2542)上的磷酸化消失。此外,RFC 4的过表达也极大地抑制了FBXW 7和NICD 1在载体控制A 549细胞中的相互作用,而在FBXW 7-缺失的A 549细胞中则不然。5H,i)。同时,当FBXW 7或CDK 8被预沉默或耗尽时,沉默的RFC 4不能引起NICD 1的K48连接的多泛素化(图1)。5J,k和补充图。7I)。综上所述,这些数据表明RFC 4与NICD 1的C-末端紧密结合,竞争性地抑制CDK 8介导的磷酸化和FBXW 7介导的多泛素化,从而导致NICD 1的降解和NICD 1蛋白的稳定。

Rfc 4诱导NICD 1的稳定促进非小细胞肺癌的侵袭性和抗γ分泌酶抑制剂的治疗

为了了解rfc 4诱导的NICD 1在促进非小细胞肺癌转移和干细胞特性中的意义,使用了NICD 1突变体(NICD 1 Mut)质粒,该质粒表达NICD 1蛋白,该蛋白具有抵抗CDK 8介导的磷酸化的能力,从而导致Notch信号的持续激活。18。事实上,沉默的RFC 4可以显著逆转过表达野生型NICD 1的NICD 1,而不是NICD 1 mut对NICD 1蛋白水平和Notch信号激活的影响(图1)。6a,b)。此外,沉默的RFC4没有引起NICD 1对NSCLC细胞自我更新和侵袭能力及SP增加的显著诱导作用(附图)。8A-c)。此外,表达稳定突变体NICD 1的非小细胞肺癌细胞在静脉注射时会产生过度的肺转移,即使在5×10的情况下也能形成可检测的肿瘤。3细胞皮下接种,沉默的RFC4不能损害这些NICD 1突变型NSCLC细胞的潜在转移能力和致瘤能力。6C和补充图。8D)。与载体对照细胞相比,NICD 1突变型NSCLC细胞形成的皮下肿瘤RFC 4、CCND 1和PCNA水平显著升高,隧道阳性肿瘤细胞比例降低,而RFC 4沉默的NICD 1突变型NSCLC细胞所形成的皮下肿瘤RFC 4蛋白水平显著降低,NICD 1、CCND 1或PCNA表达或凋亡肿瘤细胞比例略有改变(Fig)。6d)。因此,这些体外和体内数据支持了我们的假设,即RFC 4诱导的NICD 1的稳定在促进NSCLC的转移和干细胞特性中起着关键作用。

图6:RFC 4诱导的NICD 1的稳定化促进了NSCLC的侵袭性,并抵抗了γ-分泌酶抑制剂的治疗。
figure6

a, b沉默RFC4对转染HA标记野生型或稳定NICD 1的A 549、H 1975、LC1和LLC细胞Notch信号活性的影响。展示了三个独立的可重复实验的代表性图像。cA 549细胞高表达稳定的NICD 1或与RFC 4沉默联合静脉注射到裸鼠体内(n=每组5人)。以苦味酸染色、H&E染色及所示肺组织转移灶数为代表。标尺:100μm。d标记细胞移植瘤CCND 1、PCNA、NICD 1和RFC 4的典型隧道和IHC染色图像(n=每组5人)。e沉默A 549细胞中Noch 1对肿瘤转移能力和致瘤能力的影响。标尺:100μm。f, gDAPT治疗A 549和H 1703细胞过表达Noch 1、野生型NICD 1或RFC4对其形成肿瘤球或通过基质侵袭能力的影响。标尺:50μm.面板中的数据b, c, eg作为三个独立实验的平均±SD。采用双向方差多因素比较分析法进行统计分析。源数据作为源数据文件提供。

有趣的是,与RFC 4中Noch 1沉默或在Noch 1中高表达NSCLC细胞中DAPT对其在体外和体内的转移和干细胞特性的抑制作用不同,DAPT治疗稍微逆转了RFC 4-或NICD 1-高表达细胞的这些特性(图1)。6e-g和补充图。8e-gRFC 4以Noch 1信号依赖的方式促进非小细胞肺癌的转移和干细胞特性,而含有高水平RFC 4和NICD 1的非小细胞肺癌细胞作为正反馈环,对γ分泌酶抑制剂治疗不敏感。

RFC 4在非小细胞肺癌中扩增,并与非小细胞肺癌的进展相关。

为了揭示在非小细胞肺癌中RFC 4诱导的转移和干细胞特性是否与临床相关,对TCGA肺癌数据集的RNA-seq谱进行分析表明,RFC 4的表达水平与肿瘤转移和干细胞相关的分子特征之间存在显著的相关性(图一)。7A和补充图。9A)。在219例NSCLC患者中,淋巴结转移患者原发肿瘤的RFC4表达水平高于非转移性原发肿瘤(图一)。7b)。此外,在这一队列中,RFC 4的表达与NSCLC患者的临床分期和T-、N-、M-分级呈正相关(补充表)。12)。此外,与低表达组相比,RFC 4高表达组无淋巴结转移生存时间明显缩短(图1),且RFC 4和NICD 1高表达组LN无转移生存期明显短于单纯RFC 4或核NICD 1组(如图1所示)。7C和补充图。9B)。此外,还分析了联机kmart数据库(Http://kmplot.com/analysis/由1432例非小细胞肺癌患者和177例非小细胞肺癌患者组成的MSKCC数据集显示,较高的RFC 4水平与患者的总生存期、无进展生存期和无淋巴结转移生存期有关(补充图)。9C,d),进一步验证RFC 4在NSCLC患者预后中的潜在重要作用。

图7:RFC 4在非小细胞肺癌中扩增,并与非小细胞肺癌的进展相关。
figure7

a用Kolmogorov-Smirnov试验对TCGA肺癌数据集进行GSEA分析,结果表明RFC 4与肿瘤转移相关信号和干细胞相关特征相关。b219例有无LN转移的NSCLC原发肿瘤组织切片中RFC 4和NICD 1的IHC染色图像,以及这些NSCLC患者RFC 4低表达或高表达的百分比。列举了两个具有代表性的案例。标尺:100μm。c用对数秩试验对219例NSCLC患者的LN无转移生存率进行Kaplan-Meier分析,将其分为低、高RFC4和低或高NICD 1表达亚组。以RFC 4和NICD 1表达的中间表达为截止值。d百分比RFC 4来自TCGA肺癌数据集LUAD和LUSC患者的基因改变。e这个RFC 410对非小细胞肺癌组织及癌旁肺组织DNA含量。f百分比RFC 4用双尾卡方检验交叉表法分析tcga肺癌数据集中是否有转移的基因改变。g鱼类染色图像RFC 4非小细胞肺癌淋巴结转移患者原发肿瘤基因组扩增状况的研究列举了两个具有代表性的案例。标尺:10μm。hKaplan-Meier的相关性分析RFC 4非小细胞肺癌患者DNA水平、扩增状态及无转移生存率的对数秩检验。RFC 4以DNA水平作为截止值。iKaplan-Meier的相关性分析RFC 4非小细胞肺癌患者从TCGA肺癌数据集进行对数秩检验的扩增状况和总体生存率。面板中的数据b, e作为三个独立实验的平均±SD。采用双向方差多因素比较分析法进行统计分析。源数据作为源数据文件提供。

与以前报道的3q27染色体区扩增相一致,在3q27RFC 4基因位于各种癌症中,包括肺癌。36,37,38,39,40我们发现在TCGA肺癌数据集中,516例LUAD患者和501例LUSC患者中,有2.3%和40.3%。RFC 4LUAD和LUSC的扩增和RFC4mRNA水平平均分别提高了2.93倍和9.42倍(图1)。7D和补充图。9E)。此外,人类基因组DNA水平的提高RFC 410对NSCLC组织中有6例与邻近正常肺组织相比较,RFC4mRNA的表达与其DNA水平相关。7E和补充图。9F)。重要的是,高拷贝数RFC 4DNA主要存在于有局部转移或远处转移的NSCLC患者的原发肿瘤中。7F,g)。此外,非小细胞肺癌患者RFC 4放大或高RFC 4在他们的肺部肿瘤中dna拷贝数比那些没有rfc 4扩增或低转移的肿瘤的整体或无转移生存期要短。RFC 4DNA拷贝数(图1.7H,i),建议扮演.的角色。RFC 4基因扩增在非小细胞肺癌进展及预后中的作用。

讨论

生物学和临床证据已经证明,过度激活的Notch信号在包括NSCLC在内的各种癌症的发展和进展中具有重要的致癌作用。与许多其他类型的癌症不同,常见的基因改变,如NOTCH 1, JAG 1,Fbxw 7NICD 1合成和Notch信号通路在非小细胞肺癌肿瘤中很少存在。30,31,32。虽然近30%的LUAD组织中已经报道过一种能促进胞质中Noch 1降解的内细胞适配体,由于numbm的降解而导致numbm的丢失,但它并没有一致地或具体地导致notch 1的降解;它甚至在肺鳞状细胞癌中发挥了相反的作用。41,42。因此,NSCLC中NICD 1高水平和Notch信号过度激活的临床相关机制尚不清楚。

我们目前的研究表明,在包括LUAD和鳞癌亚型在内的近50%的非小细胞肺癌患者的基因组中扩增出的RFC 4直接结合NICD 1与竞争性废除CDK 8诱导的磷酸化和FBXW 7诱导的NICD 1泛素依赖性降解密切相关,为观察到的NICD 1在细胞核中的稳定性增加提供了一个生物学和临床上有效的解释。值得注意的是,核nicd 1在规范Notch信号中取代了唯一的转录因子rbp-jκ(最初被确定为转录抑制因子)中的copresors。43没有阐明RBP-Jκ结合位点的抑制状态是如何被破坏的,因为NICD 1不具有结合能力。在此背景下,NICD 1/RBP-Jκ复合物中的RFC 4作为一种DNA复制因子,可能有助于将靶基因的反应元件从抑制性转变为转录活性的RBP-Jκ激活。此外,我们的研究还发现RFC 4RBP-Jκ作为Notch信号转导的下游靶基因,通过RBP-J鉴定RBP-J直接转录,提示存在一个由高水平RFC 4和NICD 1组成的正反馈环。值得注意的是,虽然Notch信号在干细胞和高度恶性细胞中是活跃的,但以前发现的大部分Notch目标基因都是分化或增殖调节基因。44,45。根据我们发现rfc 4在诱导非小细胞肺癌的干细胞和转移特性方面的强大能力,以及rfc 4与促进干细胞和转移特征的正相关关系(如对tcga肺癌数据集中大量rna-seq谱的分析所显示的),很有可能RFC 4表示功能性Notch目标基因。在此背景下,我们建议由RFC 4基因扩增导致Notch信号的扩增和持续过度激活,并促进NSCLC中一组转移和肿瘤干细胞促进基因的转录激活。然而,由于RCF 4的表达与人非小细胞肺癌组织中的细胞增殖标志物密切相关,RFC 4对细胞增殖、致瘤性和肿瘤转移的影响可能共同影响NSCLC患者预后的恶化。

众所周知,非小细胞肺癌可以迅速发展远距离转移和耐药性药物治疗。这种特征至少可以部分归因于NSCLC细胞的转移和干细胞特性。与之前公认的Notch信号直接或间接激活促进干细胞和转移基因的表达相一致。46,47本研究提示,RFC 4和NICD 1高水平的NSCLC细胞可能构成一个积极的信号反馈回路,具有较强的转移和干细胞特性,可能成为治疗NSCLC转移和耐药的合理靶点。值得注意的是,nicd 1或rfc 4过表达的nSCLC细胞对γ分泌酶抑制剂的治疗不敏感,一些γ分泌酶抑制剂已经在I/II期临床试验中用于各种癌症的临床试验,包括具有难治性转移或局部晚期疾病的非小细胞肺癌患者,由于不良影响和不良效果而失败,主要是由于Notch抑制的复杂性,以及其他途径可能产生的替代致癌信号。48。有趣的是,我们目前的研究表明正反馈环是由RFC 4基因扩增产生较高的NICD 1水平,而不依赖于γ-分泌酶介导的切割。此外,研究表明Notch途径突变并不是预测非小细胞肺癌对γ-分泌酶抑制剂应答的最合适的生物标志物。48,49。因此,有必要进行进一步的研究,以阐明非小细胞肺癌细胞对γ-分泌酶抑制剂的不敏感性是否是由于这些细胞内存在一个正反馈环;因此,rfc 4水平低的非小细胞肺癌患者是否不敏感?RFC 4γ分泌酶抑制剂治疗应选择扩增。此外,这可能是值得制定RFC 4靶向治疗NSCLC的策略。

此外,在许多类型的鳞状癌中,如头颈部鳞状细胞癌、皮肤癌、口腔癌和食道癌,10-20%的肿瘤病例中都存在失活突变。NOTCH 1基因,许多研究表明Noch 1在这些鳞状细胞癌中具有抑制肿瘤的作用。50,51,52。在LUSC中,大约5%的患者样本含有灭活突变NOTCH 1基因53。然而,在LUSC中,Noch 1的抑癌和抑癌作用都有报道。54,55。有趣的是,从TCGA肺癌数据集和KM图数据库中分析,Noch 1的高mRNA水平与LUSC患者的整体生存和疾病进展密切相关(附图)。3)。本研究还利用LUSC细胞株(H 1703)证实了RFC 4和RFC 4定向稳定NICD 1蛋白的促侵袭性和促肿瘤作用,从而激活Notch信号,提示RFC 4-导致Noch 1信号的过度激活在LUSC进展过程中发挥重要的促肿瘤作用。另一方面,与3Q染色体的扩增一致RFC 4基因定位,多见于鳞状细胞癌,rfc 4 mRNA水平平均升高约9.42倍,约占40.3%。RFC 4TCGA肺癌数据集中的基因扩增;相比之下,LUAD中RFC4mRNA水平平均增加了三倍,约2.33%的LUAD样本RFC 4TCGA肺癌数据集中的基因扩增。我们的研究表明,通过活化的Noch 1信号通路,rfc 4的转录上调和RFC 4在LUAD和LUSC中,扩增可能不同程度地促进RFC 4的高水平表达,两者都可以利用RFC 4和NICD 1之间的正反馈回路在NSCLC转移和干细胞特性耦合中的关键作用。此外,我们发现高水平的RFC4,以及RFC 4基因扩增在伴有LN转移的原发性非小细胞肺癌肿瘤中更常见,且与无转移和无进展的无进展生存期相关,提示RFC 4尤其对转移性NSCLC患者具有潜在的诊断和预后价值。值得注意的是,其他癌症类型,如食管癌和卵巢癌,其异常激活的Noch 1信号也起着重要作用,也有明显的高比例。RFC 4基因扩增和高RFC4水平与非小细胞肺癌患者预后不良密切相关,说明RFC 4的致癌作用并不局限于非小细胞肺癌。


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