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工程红细胞作为一种现成的异基因抗肿瘤药物

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发表时间:2021-05-14 09:28作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

检查点抑制剂和T细胞治疗强调了T细胞在抗癌免疫中的关键作用.然而,与这些治疗相关的限制促使人们需要其他方法。在这里,我们将红细胞工程成人工抗原提呈细胞(AAPC),它呈现一种与主要组织相容性复合物I(共刺激配体4-1BBL)和白细胞介素(IL)-12结合的肽。这导致强健,抗原特异性T细胞扩张,记忆形成,额外的免疫激活,肿瘤控制和抗原扩散在体内肿瘤模型。4-1BBL和IL-12的存在由于对血管和脾脏的限制而导致毒性最小。异基因AAPC,RTX-321,由人类白细胞抗原-A*02:01组成,表达人乳头瘤病毒(HPV)肽HPV16E7。11-19在体外,4-1BBL和IL-12激活HPV特异性T细胞,促进效应细胞功能。因此,RTX-321是一种潜在的‘现成’细胞免疫疗法治疗HPV+癌,包括宫颈癌和头颈部癌症。

导言

T细胞通过T细胞受体(Tcrs)对肿瘤抗原的特异性识别,在抗癌免疫中发挥重要作用。1。旨在操纵或模拟T细胞反应的方法(如检查点抑制剂和嵌合抗原受体T[car-T]细胞)是近年来抗癌治疗的一个重要研究热点。然而,这些治疗的局限性(包括致命的副作用)2,3,4以及在某些情况下抵抗的发展5,6),以及自体CAR-T细胞所需的复杂而昂贵的个性化生产工艺。7,8,9,促使人们继续研究刺激T细胞介导的抗肿瘤反应的其他途径。

有效的T细胞活化需要三种不同的信号:与主要组织相容性复合物(Mhc)分子结合的肽(信号1)与tcr的结合;促进T细胞活化、功能和存活的共刺激信号(信号2);促进T细胞进一步扩张和分化的细胞因子信号(信号3);增强效应功能和形成免疫记忆的细胞因子信号(信号3)。10,11。信号1和2通常由抗原提呈细胞传递。12。树突状细胞或人工APC(AAPC)平台利用成纤维细胞、微珠子、生物降解聚合物和K 562细胞作为抗肿瘤药物,在体内或体内均能刺激T细胞。13,14,15,16.

红细胞(Rbc)具有独特的特性,使其对异基因细胞治疗具有吸引力,包括使用O阴性供体血液时固有的生物相容性。17。这导致了他们的长期使用和熟悉的历史,在输血医学,很少有副作用。18。此外,rbc还与多种免疫特权机制相关,这些机制可以保护它们免受宿主的抑制或不良反应。18。从制造角度来看,造血祖细胞的细胞培养和分化可以使红细胞多倍膨胀。此外,通过基因改造19,可以生成表达生物治疗蛋白的工程人类rbc,这里称为红细胞治疗学。或RCTs。由于红系前体细胞去核,表达的蛋白质得以维持,但对祖细胞进行的基因修饰并没有被携带到最终产品中供病人使用。19。最后,由于rbc仅限于大部分实质器官和脾脏的血管,它们有可能避免循环免疫调节蛋白所见的某些靶点毒性。20,21.

在这里,我们描述了我们的异基因,红细胞治疗学AAPC平台(RCT-AAPC)的发展,特征和临床前测试(RCT-AAPC)包括一个与MHCⅠ类结合的肿瘤特异性肽,一个共刺激配体(4-1BBL)和一个细胞因子信号白细胞介素12(IL-12)。我们证明了这种rct-AAPC在体外和体内都能驱动抗原特异性T细胞的扩增和获得效应功能,并能在临床前小鼠模型中控制肿瘤。重要的是,肿瘤控制与长期记忆的发展和表位的扩展有关,导致对不表达原靶抗原但在其他方面相同的肿瘤的疗效。这些功能导致了临床候选产品rtx的诞生。-321,用人乳头瘤病毒(HPV)16 E7肽表达人白细胞抗原(HLA)-A*02:0111–19(Hla-A2-HPV),4-1BBL和IL-12。我们发现RTX-321能诱导人乳头瘤病毒抗原特异性原代T细胞的激活,这三种信号对有效效应功能和效应记忆细胞的分化都是足够的。考虑到与某些复发的HPV相关的低生存率+22我们的研究表明,RTX-321是一种在多种肿瘤类型的临床研究中很有前途的策略。

结果

Rct-aAPCs生成功能CD8+T细胞体外培养

人CD 34+扩增造血祖细胞,用慢病毒转导,然后扩增分化为去核工程RBCs,产生RCT-aAPCs(补充图)。1A)。我们用编码小鼠mhcⅠ类分子H-2K单链三聚体的慢病毒载体制备rct-aAPCs。b,β-2微球蛋白(β2m)与卵清蛋白特异性肽SIINFEKL(信号1)、4-1bbl(信号2)和细胞因子IL-7(rct-ova-4-1 bl-IL-7)、IL-12(rct-ova-4-1 bl-12)或IL-15(rct-oVA-4-1bl-IL-15)融合为信号3。b。表达上述三种信号的OT-1细胞对OVA表达的EG7细胞的杀伤作用比RCT-OVA-4-1 BBL处理的OVA肿瘤细胞明显增强,IL-12是最有效的细胞因子。1A)。以亲代OVA阴性的EL4细胞为靶点,与gp 100特异性PMEL-1T细胞的不相关TCR相互作用,表现出信号1(OVA)的特异性(补充图)。2).

图1:rct-aAPCs和mRBC-aAPCs在体外和体内促进抗原特异性T细胞的扩增、记忆形成和对肿瘤细胞的细胞毒性。
figure1

aEG7.RCT激活的OT-1细胞对OVA的杀伤率n=3)。bCD45.1小鼠随机(~180 mm)3; n(5),用天真的OT-1细胞处理,剂量为1×10。9MRBC-CTRL或mRBC-AAPC。c与mRBC-ctrl相比单程方差分析第3天:mRBC-OVA-4-1 bbl-IL-15P < 0.0001; Day 6: mRBC-OVA-4-1BBL-IL-15 P < 0.0001, mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12 P=0.0001。d在第6天的血中记忆OT-1号。单因素方差分析比较mRBC-CTRL;T供应链管理(干细胞记忆T细胞):mRBC-OVA-4-1 BBLP=0.038;T厘米:mRBC-OVA-4-1 BBLP=0.0016,mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-15P=0.025;T埃姆:mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-15P=0.0001,mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-15P < 0.0001. eCD45.1小鼠随机(~150 mm)3; n(8),用天真的OT-1细胞处理,剂量为2.5×108MRBC-CTRL或mRBC-AAPC。f肿瘤生长和g生存。生存曲线的对数秩(mantel-cox,单边)检验;mRBC-ova-4-1 bbl与mRBC-ova-4-1 bbl-12和pbs对mRBC-ova-4-1 bbl-12P < 0.0001. hCD45.1小鼠随机(~230 mm)3; n(8),用天真的OT-1细胞处理,并加入OVA。241-270IFA或1×10肽9MRBC-CTRL,mRBC-4-1 BBL-IL-12,或mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12。i肿瘤生长。j第6天血中OT-1数。单向变异数与mRBC-ctrl;mRBC-OVA-4-1 bbl-IL-12比较。P < 0.0001. kCD45.1小鼠随机(~175 mm)3; n(5),用天真的OT-1细胞处理,剂量为1×10。9MRBC-CTRL或mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12的剂量滴定(1×10)9,2.5×108). l第7天,50μL血和每克肿瘤中的OT-1数。单因素方差分析与mRBC-ctrl比较:1×10。9P < 0.0001; tumor: 1 × 109 P=0.0046。m血中OT-1 tcr频率在第0天(血前)、第7天(血后)和肿瘤组织中的β序列分析。单因素方差分析与mRBC-ctrl比较;血后:1×10。9 P < 0.0001; tumor: 3 × 108 P=0.02,1×109 P < 0.0001. n多功能(颗粒酶B)+干扰素γ+第7天肿瘤浸润的OT-1细胞的百分比。单程方差分析与mRBC-CTRL比较;1×109 P=0.0021。数据表示为平均±S.D。代表四个(l血),二(a, c, d, f, g, l肿瘤,n),或一(i, j, m)独立实验。源数据作为源数据文件提供。

Rct-aAPC对T细胞表型、效应功能及体内抗肿瘤反应的影响

由于使用体内临床前模型评估rct-aAPCs的局限性,包括快速清除非人类物种中的人rbc。23,利用点击化学技术,将重组蛋白与小鼠rbcs(Mrbc)结合,制备了小鼠替代物。24(mRBC-AAPC,附图。1B)。我们发现mRBC-aAPCs是基因改造的RBCs的合适替代品,类似的OT-1细胞增殖和干扰素(IFN)γ在体外的产生证明了这一点(补充图)。1C,d)。MRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12和mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-15分别与未修饰的小鼠RBCs、mRBC-OVA-4-1 BBL、mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-7、mRBC-1B,c)。重要的是,mRBC-OVA-4-1 bbl-12和mRBC-ova-4-1bl-IL-15扩增的OT-1群体具有显著的效应记忆(T)。埃姆)表型,同时仍保持大量的中央记忆(T)厘米)细胞种群(图1.1D).

接下来,我们评估了mRBC-aAPC在体内通过OT-1转移来控制肿瘤生长的能力。1E)。2.5×10剂量8细胞,mRBC-OVA-4-1BBL-介导的暂时性肿瘤生长抑制。1F)而不延长生存时间(如图所示。1g)与磷酸盐缓冲液生理盐水(PBS)处理的小鼠进行比较。在细胞中加入IL-12,而不是IL-7或IL-15,可增强肿瘤生长抑制作用(图1)。1F)和延长存活时间(图1.1g)与mRBC-OVA-4-1 BBL及PBS对照比较,可获得4/8的治疗效果。此外,mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12治疗2.5×10。8细胞促进肿瘤消退(6/8小鼠,附图)。3A)与mRBC-OVA-4-1 bbl治疗1×10相比,剂量低4倍。9细胞(1/8小鼠,附图)3B,c)。由于mRBC-4-1BBL-IL-12缺乏信号1,与单独治疗所有小鼠的mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12相比,只有1/8的治疗效果(补充图),因此对肿瘤抗原的靶向治疗是非常重要的。3D,e)。根据其优于其他细胞因子的疗效和其在低剂量控制肿瘤中的作用,选择IL-12作为后续研究的最佳信号3。

我们发现在EG7中用mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12治疗效果优于长OVA肽加不完全弗氏佐剂(IFA;图1)。1I)。长OVA肽加IFA免疫后的中位总生存期(OS)为17.5天,与用mRBC-CTRL观察到的中位数OS(20d)相当。相比之下,mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12治疗后的OS中位数为49天(P=0.0002 vsOVA疫苗;P=0.0226 vsmRBC-CTRL)。最佳疗效需要信号1,因为mRBC-4-1BBL-IL-12的治疗中位OS为28.5天,与mRBC-CTRL无统计学差异。只有mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12治疗可导致OT-1细胞在血液中的增殖(图1).1J),与疗效相关。

为了了解mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12疗效的细胞机制,我们对小鼠的OT-1细胞和内源性免疫群体进行了评估。1K)。我们发现在mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12治疗后,肿瘤组织中的OT-1细胞在循环中积累,并以剂量依赖性的方式增加(如图1所示)。1L)。与此相一致的是,TCRβ测序显示OT-1是血液和肿瘤中最丰富的T细胞克隆。1M,用mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12处理可提高多功能(颗粒酶B)的百分率。+干扰素γ+)肿瘤浸润的OT-1细胞(如图所示)。1N)。Mrbc-ova-4-1bbl-IL-12也能促进肿瘤细胞的抗肿瘤免疫作用,如Ki 67增加,肿瘤坏死因子(Tf)α增加,内源性CD8表达IL-2。+T细胞(附图)4A肿瘤自然杀伤(NK)细胞中Ki 67和颗粒酶B增加(附图)。4B),CD4细胞Treg%降低,Th1%增殖增加(IFNγ+Ki 67+%)。+T细胞(附图)4C),肿瘤中M_1巨噬细胞百分比增加(补充图1)。4D).

MRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12的生物分布及耐受性

以前曾观察到4-1bb激动剂的毒性。20,25以及重组IL-12在临床上的应用21,26,我们进行了安全性测量后,重复剂量的mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12在小鼠体内是否有OT-1转移(图一)。2A),表明与对照组相比体重没有明显变化(图1)。2B)。血浆干扰素γ水平2C)和血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平。二维空间)在给药期增加,最高剂量为1×10。9细胞,但在2周的恢复期后恢复到基线.低剂量(3×10)时观察到的毒性最小。8细胞,尽管如此,这是足够的抗肿瘤效果(图)。1F,g)。额外的安全性测量,包括脾脏和肝脏重量、肝脏酶水平、肝脏炎症和巨噬细胞浸润、血液学变化和血浆细胞因子水平,表明OT--1转移或不转移具有相似的轻微和可逆毒性(补充图1)。5)。我们推测mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12缺乏明显的毒性可能是由于RBCs与抗体和细胞因子相比生物分布受限所致。MRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12在所有检查组织中均有发现,但脾脏除外(图1)。2E).

图2:mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12耐受性好,可优先向脾脏分布,促进T细胞相互作用.
figure2

aCD45.1 Pep Boy小鼠(n=10)用1×10处理6单纯的OT-1细胞或未处理的细胞,且剂量为1×10。9MRBC-CTRL或mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12的剂量滴定(1×10)9,3×108)在第0、4、7和11天。n=5人在第12天被杀n=5所有群体在第12天后的时间点中,除第12天外nMRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12+OT-1=4。b与第0天相比体重发生了变化。与mRBC-CTRL比较第3天:1×109 P=0.019;第12天:1×109+OT-1P=0.048。c血浆干扰素γ水平随时间的推移。n=10(第3和第7天);n=5后第10天,但第10天除外n在第17和25天,mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12+OT-1=4。与mRBC-CTRL比较第3天:3×108和1×109 P < 0.0001, 3 × 108+OT-1P=0.0002,1×109+OT-1P < 0.0001; day 7: 3 × 108+OT-1P=0.018;第12天:3×108+OT-1P=0.025,1×109 P < 0.0001. d第12天和第25天血清ALT水平。单因素方差分析比较mRBC-CTRL;第12天:1×109+OT-1P=0.023。eCD45.1 Pep Boy小鼠(n=5)用2×10转移61×10剂量前细胞微量黄标记的OT-1细胞9细胞追踪远红色染料标记mRBC-CTRL或mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12。免疫荧光分析表明,注射mRBC后1h或17h,每个组织区均有荧光标记的mRBCs。单因素方差分析与mRBC-CTRL比较脾脏:1hP < 0.0001, 17 h P=0.022;肝脏:1小时P=0.0006。f将活化的OT-1细胞(Green)固定在固定化细胞-远红色标记的mRBC-CTRL细胞或mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12细胞上,并与DL 650标记的4-1BBL蛋白(红色)结合,作为共聚焦活细胞成像分析的典型框架。用Mander的共定位系数量化每帧中与mRBC信号重叠的OT-1信号的百分比(mRBC-CTRL:n=54帧;mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12:n=58帧的活细胞成像视频。未配对双面学生t-测试;P < 0.0001. Data are depicted as mean ± s.d. and are representative of two independent experiments. Source data are provided as a Source Data file.

脾血管的解剖使红细胞与红髓实质内的淋巴细胞直接相互作用。27因此,我们推测mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12可能参与了与T细胞的同源相互作用。事实上,1天内对脾脏的分析表明,与mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12相比较,Ot-1抗原特异性T细胞接触mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12的频率高于mRBC-CTRL(补充图1)。6A, b)和流式细胞术对双链细胞的定量(附图)。6C)。这也与CD 44的表达有关,证实了OT-1细胞的激活(补充图).6d)。在体外活细胞显像中,我们还证实了OT-1细胞与mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12之间的直接相互作用。2F,补充电影1,和补充电影2)。这些结果表明,mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12具有与抗原特异性T细胞进行同源相互作用的能力,提示脾脏可能是该基因在体内的主要位置之一。

长期记忆的形成及其对肿瘤再挑战的保护作用

为探讨mRBC-aAPCs对小鼠免疫记忆的影响,首次注射肿瘤后第66天再用EG7.OVA治疗后治愈的小鼠,用EG7.OVA-4-1BBL-IL-12对小鼠进行免疫再攻击,观察mRBC-aAPC对小鼠免疫记忆的影响。在EG7.OVA挑战前1天,将年龄匹配的纯种小鼠移植OT-1细胞,以表示OT-1细胞的残留背景水平(图一)。3A)。五分之四天真的老鼠屈服于EG7.OVA挑战(图一)。3B),而OT-1细胞在这些小鼠中并没有扩张(如图所示)。三维空间)。与此形成对照的是,所有7只小鼠均用mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12治疗后治愈了EG7.OVA肿瘤。3B)。这与OT-1和内源性OVA特异性T细胞在肿瘤复发10天后的增殖有关。3C-E用mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12进行初步治疗,显示OVA特异性免疫记忆形成。

图3:mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12促进免疫记忆和表位扩展,并利用内源性T细胞。
figure3

aCD45.1当EG7.OVA肿瘤达到~230 mm时,将Pep雄性小鼠随机化。3 (n(8),用天真的OT-1细胞处理,剂量为2.5×108MRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12。8只小鼠中有7只治愈了原来的EG7.OVA肿瘤,第66天又用EG7.OVA再次攻击。年龄匹配的天真CD 45.1 Pep Boy小鼠(n=5)在第65天用5×10进行治疗。5以EG7.OVA细胞为对照,在攻击前1天检测OVA细胞。b所有先前治愈的小鼠均拒绝EG7。c具有代表性的流式细胞仪图显示EG7.OVA再刺激后10天,外周血50μL中Ot-1和内源性OVA特异性T细胞。dOT-1和e50μL外周血中内源性OVA特异性T细胞数分别在再挑战前2天(第64天)、第4天(第70天)和第10天(第76天)。单因素方差分析与第64天比较OT-1:第75天P=0.0009;内源性OVA-特异性:第75天P=0.0079。未配对双向学生t测试比较天真;OT-1天75P=0.018;内源性OVA-特异性:第75天P=0.018。f在第127天EG7.OVA挑战后61天,小鼠治愈(n=7)与年龄匹配的天真对照小鼠(n=5)受到EL4的质疑。7只治愈的小鼠中有3只推迟了EL4的生长,7只小鼠中有3只拒绝EL4。g第65、73、126和136天血中OT-1频率的TCRβ测序分析.hEL4刺激后显著扩增的TCR克隆在整个肿瘤挑战过程中被追踪。显示了单个小鼠的总和克隆频率的对数。数据表示为平均±S.D。代表两个(bf)或一(g, h)独立实验。源数据作为源数据文件提供。

Il-12在促进表位扩散方面发挥了一定的作用。28。为确定mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12治疗对OVA以外的其他肿瘤抗原是否具有保护作用,在第二次EG7.OVA攻击后61天,用OVA阴性的肿瘤细胞株EL 4、61天对治愈小鼠和年龄相匹配的正常对照进行攻击。引人注目的是,与对照组相比,先前治愈的小鼠要么对肿瘤生长表现出抵抗力(3/7),要么表现出延迟性肿瘤生长(3/7)。3F)。这说明在诱导对EG7.OVA的免疫应答过程中,mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12可诱导抗原表位向其他肿瘤抗原扩散。

外周血T细胞TCRβ测序结果显示EG7.OVA刺激小鼠后OT-1克隆频率增加(见图)。第三代)。Ot-1频率在肿瘤攻击后未增加,说明肿瘤本身不足以刺激OT--1细胞的增殖。我们还评估了T细胞克隆中独特的tcRβ序列的频率,这些克隆显著扩展了EL4挑战后(EL4应答TCR)。在每一次肿瘤攻击(EG7.OVA和EL4)时,EL4应答TCRs的频率增加与完全应答者(拒绝EL4挑战的小鼠)有关,表明T细胞介导的对肿瘤抗原的保护作用是在EL4攻击之前产生的(如图1所示)。3H)。部分应答者(肿瘤生长延迟与单纯小鼠相比)EL4刺激后TCR频率增加,而EG7.OVA再刺激时无反应者(肿瘤生长类似于天真小鼠)在EL4刺激时TCR频率增加极小。总之,控制EL4肿瘤的能力与EL4反应的TCR克隆的扩大有关.

EG7.OVA在不转移OT-1细胞的情况下,由4-1 BBL和IL-12驱动

为评价mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12介导OVA特异性T细胞介导肿瘤控制的能力,于EG7后第二天给小鼠注射mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12、mRBC-4-1 BBL-IL-12、mRBC-4-1 BBL-IL-12或不转移OT-1的mRBC-CTRL。4A)。我们观察到与mRBC-CTRL相比,mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12治疗能显著延缓EG7肿瘤的生长,增加中位OS。4B, P < 0.0001 and P=1×10=0.00039和3×108剂量)。缺乏信号1,即mRBC-4-1 bbl-IL-12的mrbc也能延缓肿瘤的生长,增加1×10的中位OS。9和3×108与mRBC-CTRL比较P < 0.0001 and P分别为0.013),与mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12比较,差异无统计学意义.MRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12和mRBC-4-1 BBL-IL-12均能在血液中扩增内源性OVA特异性T细胞,但当信号1存在时,这种扩张的动力学明显加快,即mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12。4C)。这些数据表明,在AAPC上存在的抗原导致抗原特异性T细胞的快速积累,然而信号2和3(4-1BBL和IL-12)是观察到的抗肿瘤效应的主要驱动因素。

图4:mRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12和mRBC-4-1 BBL-IL-12延缓EG7的生长。
figure4

aC57BL/6小鼠皮下接种2×106EG7.OVA细胞。之后,1×109MRBC-CTRL或mRBC-4-1 bbl-IL-12或mRBC-OVA-4-1 bl-IL-12的剂量滴定法(1×10)9,3×108)管理(n=8)在第1、4、8、11、15及18天。b治疗后肿瘤生长曲线。c卵四聚体+CD8+T细胞在50μL血中。与mRBC-CTRL比较:1×109MRBC-4-1 bbl-IL-12:第18天P=0.0057,第21天P=0.014;3×108MRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12:第11天P=0.0087,第14天P=0.023;1×109MRBC-OVA-4-1 BBL-IL-12:第7和第11天P < 0.0001, day 14 P=0.006,第18天P=0.017。数据表示为平均±S.D。是两个独立实验的代表。源数据作为源数据文件提供。

针对肿瘤相关抗原(Gp 100)的mrbc促进抗原特异性pmel-1 T细胞的增殖,并显著减少b16-f10肿瘤转移。

为了证实我们的方法可以扩展到肿瘤相关抗原,mrbc与不同的mhc i肽复合物-H-2D结合。b携带gp 100肽(一种在B16-F10黑色素瘤细胞上表达的肿瘤抗原),加上4-1BBL和IL-12产生mRBC-gp100-4-1BBL-IL-12。在B16-F10肺转移模型中,PMEL-1(gp 100-特异性)T细胞转移(图1)。5A我们观察到mRBC-gp 100-4-1BBL-IL-12治疗肺转移瘤的剂量依赖性,其剂量最高,几乎消除了它们。5B,c)。相比之下,与mRBC-CTRL相比,抗程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)抗体对肺转移没有影响.1×10后,血液、脾脏和肺中的pmel-1细胞增加。9剂量(图1.5D-f)。此外,mRBC-gp 100-4-1BBL-IL-12可使肺浸润抗原特异性PMEL-1细胞总数增加,显示效应功能标记物(IFNγ和颗粒酶B)。5G)。内源性T细胞也浸润肺部,伴随着干扰素γ和颗粒酶B的增加(如图所示)。5G).

图5:针对肿瘤相关抗原(Gp 100)的mRBC-aAPC促进抗原特异性的PMEL-1 T细胞增殖和效应功能,显著减少B16-F10肿瘤的肺转移。
figure5

aC57BL/6小鼠静脉注射1×105B16-F10肿瘤细胞0天后转移2×106天真的PMEL-1T细胞在第1天。小鼠(n=8)剂量为1×109MRBC-CTRL,1×109具有抗PD-1(αPD-1)或1×10的mRBC-CTRL9,2.5×108,或6×107MRBC-gp100-4-1BBL-IL-12在第1、4和8天进行分析,除非另有说明。1×109MRBC-gp 100-4-1 BBL-IL-12,n=第14天分析5次。b1×10典型肺照片9MRBC-CTRL,1×109MRBC-CTRL+αPD-1或1×109MRBC-gp 100-4-1 BBL-IL-12小鼠。c第14天肺转移计数。单向变异数P < 0.0001 compared to mRBC-CTRL at all dose levels. dg50μL血中PMEL-1细胞数d),脾脏(e),灌流肺的左叶(f),肺浸润PMEL-1和内源性CD8的效应功能。+T细胞(g)。单因素方差分析与mRBC-CTRL比较;血(d):1×109第4天和第7天P < 0.0001, day 11 P=0.002;脾脏(e)和肺(f):1×109 P < 0.0001; functionality (g):PMEL-1和内源性CD8(1×10)9剂量P < 0.0001 for IFNγ+%,颗粒酶B+%和干扰素γ+颗粒酶B+%。数据表示为平均±S.D。是两个独立实验的代表。源数据作为源数据文件提供。

Rtx-321处理激活hpv特异性tcr转导的人T细胞

为了治疗HPV 16+我们研制了rtx-321,由异基因、培养的人去核红细胞组成,构建成单链三聚体HLA-A*02:01和β2m与hpv 16 e7融合。11–19肽(HLA-A2-HPV;信号1),4-1BBL(信号2)和IL-12(信号3)在细胞表面(图3)。6A)。确认rtx-321能与hpv 16 e7结合并激活。11–19-特异性T细胞,CD8+HLA-A*02:01供者T细胞经慢病毒转导表达hPVE7特异性TCR29(E7-TCR细胞)6B)与rtx-321或表达rtx-321不同成分的工程RBCs共培养。此外,我们还通过检测rct-aacpc,而不是hpv 16 e7,检测出一种巨细胞病毒(Cmv)肽,以此来评估抗原特异性。11–19肽(RCT-CMV-4-1BBL-IL-12)。

图6:rtx-321促进了原代抗原特异性T细胞的体外扩增、激活、记忆分化和效应功能.
figure6

aRtx-321通过抗IL-12、抗4-1BBL和抗β2m染色表达。b有代表性的流式细胞图显示E7-TCR细胞在共培养前与未转导的T细胞相比有TCR的表达。chE7-TCR细胞(3个供体重复)与RCT-CTRL、RCT-HPV、RCT-4-1BBL、RCT-IL-12、RCT-HPV-4-1BBL、RCT-4-1 BBL-IL-12、RTX-321或RCT-CMV-4-1BBL-IL-12共同孵育。NURR 77+2小时百分比(c),CD 69+24小时百分比(d),以及4-1BB+第5天的百分比(e)E7-TCR细胞。f显示E7-TCR的有代表性的流程图+RCT-CTRL-和RTX-321处理的E7-TCR细胞在第5天的表达。E7-TCR细胞的增殖和未转导的CD8+在第5天,T细胞在媒体处理的对照上。g颗粒酶B+第1天E7-TCR细胞百分比,第5天上清液中IFNγ浓度。h T厘米和T埃姆第5天的E7-TCR细胞数。单向方差分析与rct-ctrl;nr 77的比较+% (c),CD 69+% (d),以及4-1BB+% (e):RCT-HPV,RCT-HPV-4-1 BBL或RTX-321P < 0.0001; CD8 T-cell expansion (f):RTX-321 E7-TCRP < 0.0001, untransduced P=0.0062;颗粒酶B+% (g):RTX-321P=0.0021;干扰素γ分泌(g):RTX-321P < 0.0001; T厘米编号(h):RCT-HPV-4-1BBLP=0.011,rtx-321P < 0.0001; T埃姆编号(h):RTX-321P < 0.0001. Data are depicted as mean ± s.d and are representative of two independent experiments. Source data are provided as a Source Data file.

RTX-321与RTX-321共培养2 h和24h后,分别显著增加了NURE 77和CD 69在E7-TCR细胞上的表达,表明TCR已成功结扎。6C,d)。TCR信号不依赖于4-1BBL和IL-12的表达,因为仅表达HLA-A2-HPV的工程RBCs能够诱导这些激活标记物(如图所示)。6C,d),以及4-1BB(图1所示)。6E)。HLA-A2-HPV单独(信号1)足以激活T细胞,而三种信号均为T细胞扩增所需(图1)。6f),伴随着颗粒酶B和干扰素γ的分泌(如图所示)。6g)。RTX-321与RCT-CMV-4-1BBL-IL-12共培养可诱导E7-TCR细胞的增殖,说明其增殖受抗原特异性的驱动.CD8+T细胞对rtx-321的反应而扩展,由两种T细胞组成。厘米和T埃姆细胞(图1.六小时)。T的增加厘米细胞主要依赖于信号1和2,而这三种信号都促成了T的增加。埃姆细胞。这些数据表明rtx-321促进了原始CD8的扩展。+抗原特异性T细胞,诱导效应分子的产生,增加T细胞的活化和T细胞的生成。埃姆和T厘米抗原特异性的表型。

讨论

在这里,我们证明RBCs可以通过在体内扩展针对目标抗原的T细胞而被工程成诱导肿瘤特异性免疫反应的aAPC。值得注意的是,RTX-321使人乳头瘤病毒特异性原代T细胞体外扩增,突出了该平台的潜在治疗应用。这种方法是通过在人去核红细胞的细胞表面展示数以千计的生物治疗蛋白来模拟人类的免疫生物学,从而有别于其他利用合成受体(如car-T细胞)、非异基因细胞系进行体外T细胞扩增或合成平台(例如脂质体或可生物降解的聚合物颗粒)的方法。30,31,32.

除了肿瘤抗原负载的MHC I(信号1)外,我们还使用4-1BBL作为T细胞共刺激配体(信号2)。4-1bbl与T细胞的结合促进了T细胞的存活和增殖,增强了效应功能,对免疫记忆的形成起着至关重要的作用。33。在car-T细胞的临床试验中,与使用CD 28结构域相比,4-1bb共刺激结构域的加入有利于中央记忆T细胞的发育和T细胞的持续时间的延长。33.

我们确定将IL-12作为细胞因子(信号3),通过促进抗原特异性T细胞的扩增、记忆和效应功能以及肿瘤的控制而达到最佳效果。这与已知的IL-12的功能是一致的,它是一种强大的促炎细胞因子,可诱导NK细胞及CD4释放干扰素γ。+和CD8+T细胞此外,通过STAT 4的IL-12信号通路对Th1的分化和CD8的细胞毒活性是必不可少的。+T细胞34.

在两种小鼠肿瘤模型中,我们证实了与肿瘤消退和治疗相关的T细胞增殖和活化。我们的数据表明,mRBC-aAPCs不仅能对外来抗原OVA,而且对一种天然表达的肿瘤抗原gp 100产生抗肿瘤反应。MRBC-AAPC治疗比长肽加IFA疫苗(相当于临床试验中的Montanide™ISA 51)提供了更好的生存效益;如图所示。1I)。长肽+IFA是HPV 16+癌临床发展中最重要的免疫平台35,36,37用于单个T细胞表位,因此与其他平台(如dna疫苗、蛋白质疫苗和病毒/细菌载体疫苗)相比,被用作比较器。我们的结果表明mRBC-AAPC格式提供了疫苗和佐剂可能无法提供的额外治疗效果。此外,与抗pd-1治疗相比,mrbc-aapc的治疗促进了肿瘤控制的改善,而在b16-f10肿瘤模型中,这一治疗已经被证明只有极小的效果。38,39,40。有趣的是,静脉注射mRBC-aAPCs似乎仅限于脾的循环和开放血管,在那里发生了与抗原特异性T细胞的相互作用(补充图)。6),在诱导抗肿瘤反应方面被证明是有效的。事实上,最近的数据表明脾脏是对免疫治疗有反应的细胞的重要来源。41.

尽管有初步的疗效迹象,但在临床试验中,IL-12和抗4-1bb的激动剂抗体已被证明会引起肝脏和其他毒性反应。20,21,25,26。这在一定程度上是由于多向效应导致免疫激活,而牺牲了严重的靶外毒性。31,这促使人们试图将治疗性免疫调节蛋白限制在肿瘤微环境中,并尽量减少全身暴露。20。我们的mRBC-aAPCs由膜结合的4-1BBL和IL-12组成,保持了良好的安全性,表明小鼠体重没有明显变化,脾肿大、肝脏炎症、ALT升高和干扰素γ水平的变化极小,可逆性很小(如图所示)。2B-d和补充图。5)。这可能是由于mRBC-aAPC在血管和脾脏中的生物分布,以及4-1BBL和IL-12的膜结合性质,这限制了其在靶外和组织外毒性的可能性。

重要的是,EG7.OVA模型中治愈的小鼠不仅对EG7.OVA肿瘤细胞耐药,而且对缺乏OVA的亲代EL4细胞也具有抗药性,提示了记忆形成和表位扩展。42,43这已被证明可以改善接受癌症免疫治疗的患者的预后。42。而抗原表位的扩展已经被证明是通过预激活的过继转移来实现的。44,45或转基因T细胞28,46在此,我们发现一种人工APC修饰的红细胞可以通过单纯的T细胞转移促进抗原表位在体内的扩散。在我们的研究中,这是一个特别有希望的发现,因为使用单一的肿瘤抗原可以被认为是我们研究方法的一个潜在的限制。例如,来自CD 19导向免疫治疗研究的最新数据表明,疾病复发的患者中有一部分可以以从肿瘤细胞表面丢失CD 19为特征。47。然而,我们的数据表明,替代的mRBC-aAPCs不仅推动抗原特异性T细胞的激活和扩展,而且促进肿瘤微环境的改变,包括内源性T细胞的增加、Treg数目的减少、增殖的Th1细胞的增加和M1巨噬细胞的增加(补充图1)。4)。这些变化可能有助于抗原扩散和相关保护观察到的动物与缺乏目标抗原的肿瘤细胞(图一)。3F)。此外,广泛的免疫激活(补充图。4)可能有助于提高长肽疫苗的免疫效果。

Hpv+癌患者循环中存在不同频率的hpv抗原特异性T细胞。48,49,50。通过OT-1过继转移的存在与否,我们模拟了患者抗原特异性T细胞频率的范围。在抗原特异性T细胞频率高的情况下(即OT-1过继转移),提供这三种信号的mRBC-AAPC比缺乏信号的mRBC-AAPC更有效(图1)。1I和补充图。3D,e)。然而,在抗原特异性T细胞频率较低的情况下(即不进行OT-1转移),我们观察到mRBC-OVA-4-1BBL-IL-12和mRBC-4-1BBL-IL-12具有相似的疗效。4B)。这表明,在无OT-1转移的模型中,抗肿瘤作用的主要驱动因素是mRBC-AAPC的4-1BBL和IL-12组分。虽然信号1的提供导致了靶抗原特异性T细胞的早期扩张,但这并没有转化为对肿瘤生长的额外影响。因此,我们的数据表明,这些信号在临床中的相对重要性可能取决于患者中预先存在的靶抗原特异性T细胞的数量。

尽管有现有的治疗方案,在治疗HPV方面仍有很高的未得到满足的需求。+癌症和复发性疾病患者的生存状况仍然很差。22。这促使我们开发了一种RCT-AAPC,将一种HPV特异性抗原用于潜在的治疗应用(RTX-321)。众所周知,HPV的病毒癌蛋白E7通过破坏pRb抑癌活性来推动许多癌症的发展。51。E711-19来自hpv 16的肽被选择用于rtx-321,因为它来自癌蛋白的一个不变区域。52在美国人群中,HLA-A*02:01是最常见的HLA等位基因。53,54。我们发现rtx-321诱导tcr信号转导,导致hpv抗原特异性T细胞的扩增,促进效应细胞功能,诱导效应记忆细胞群的扩大,并建立了一套T细胞库。厘米细胞,提示rtx-321治疗可能导致持续的抗肿瘤反应。55.

我们的研究提出了一个基于基因工程红细胞的AAPC治疗癌症的平台,并展示了该方法在原代人类细胞中的活性。红细胞已被用于输血医学数十年,O-阴性献血者的血液可以可靠地输往大多数人口。异基因工程rbc可以应用于多个患者,并使用可伸缩的制造过程,而不需要复杂的、个性化的tcr-T细胞和car-T治疗所使用的生产流程。7,8,9。Rct-aapc平台展示了广泛的抗原适用性,旨在模拟T-细胞-apc相互作用的生物学,潜在地应用于多种癌症的免疫治疗。19,56,57.


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