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个体化抗癌疫苗的辅助抗肿瘤病毒治疗

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发表时间:2021-05-14 09:16作者:武汉新启迪Xinqidbio

摘要

通过给予系统保护和持久的益处,癌症免疫疗法正在成为癌症治疗的长期解决方案.目前正在进行临床试验的一种方法是一种治疗性的抗癌疫苗,该疫苗使用两种表达相同肿瘤抗原的不同病毒来增强抗肿瘤免疫。通过提供直接杀死癌细胞的额外优势,oncolytic病毒(oncolytic virus,OVS)构成了这种治疗策略的理想平台。然而,由于靶向肿瘤抗原被编码到病毒基因组中,其产生需要强有力的感染,因此疫苗接种的效率在一定程度上取决于每个肿瘤对OV感染的不可预测性和高度变化的内在敏感性。在本研究中,我们证明用OVS(腺病毒(Ad)、马拉巴病毒(MRB)、水泡性口炎病毒(VSV)和痘苗病毒(VV))与抗原肽协同接种抗癌疫苗与抗原工程OVS一样有效,不依赖病毒复制。我们的策略对于针对患者特定突变的个性化抗癌疫苗尤其有吸引力。我们建议使用OVS作为治疗性防癌疫苗的辅助平台,值得对癌症治疗进行测试。

导言

免疫系统已经进化到识别和消除病原体,如病毒。这一功能长期以来一直被用于疫苗接种的目的,使用的病毒编码的抗原,对其免疫反应是可取的。鉴于其直接的肿瘤学和免疫刺激作用,OVS对于这类应用特别有吸引力。1。目前正在进行临床测试的一种策略(nct 02285816和nct 02879760)是通过依次使用两种编码同一肿瘤抗原的不同病毒来提高抗肿瘤免疫力。2,3。应用Ad和MRB进行临床前研究4作为启动剂和助推剂,分别证明了对一小部分动物实现完全反应的可能性。3。虽然这项重要的研究证实了异源ov主要增强疫苗的潜力,但并不是所有肿瘤都表达由癌细胞特异性表达的共同抗原,而针对单个靶点的疫苗接种则施加了一种选择压力,有利于无反应的逃逸肿瘤变体的进化。5,6。此外,产生抗病毒免疫是一个重要的限制,阻止使用相同的病毒有效地接种不同的肿瘤抗原。理想情况下,一轮治疗将被实施,并针对所有肿瘤细胞,尽管肿瘤异质性。

T细胞识别肿瘤特异性突变(即所谓的突变体表位(MutS))可在患者肿瘤标本中发现。7针对这些癌症新抗原的疫苗正在进行临床试验(nct 02316457,nct 02035956,nct 02149225)。8,9,10,11。一种以肿瘤突变体为靶点的ov主要促进疫苗将允许以病毒为媒介直接杀死癌细胞并产生抗肿瘤免疫;然而,为每个患者量身定做的独特病毒的产生将耗费时间,因此对这一方法有相当大的限制。

在本研究中,我们发现OVS(Ad,MRB,VSV和VV)可以作为抗肿瘤疫苗的佐剂,用于首选的增强方案。通过将病毒与与MutS相对应的多肽联合使用,我们能够有效地免疫动物,并通过小鼠癌症模型来提高治疗效果。我们的策略绕过了为每个病人生成独特病毒的需要,并赋予了易于适应于对给定的指示最理想的病毒平台的优势。

结果

OVS可作为肽类疫苗的佐剂。

为了确定ov是否可以用作疫苗佐剂,我们首先要确定异源ov主要助推疫苗(Ad)中所用的引发剂是否可以与抗原协同使用,以及它的佐剂活性如何与常用的佐剂8。遵循图中所示的治疗计划。1A我们观察到Ad-DCT(编码完整的DOPAchrom互擦除(DCT)蛋白的病毒)、Ad+DCT(病毒与DCT肽共给药)和PolyI:C+DCT(PolyI:C-与DCT肽共给药)均能诱导出类似的免疫应答(图1)。1B),从而证明Ad可以作为抗癌疫苗的佐剂。接下来,我们试图确定在异源OV主要助推疫苗(MRB)中使用的增强病毒是否也具有佐剂活性。为此,我们用MRB抗原(全蛋白)和MRB+抗原(肽),以DCT或OVA为模型抗原,对荷瘤动物进行了免疫接种。有趣的是,我们的结果表明,尽管mrb-dct和mrb-ova都未能诱导抗原特异性免疫,这与之前的报道是一致的。3作为疫苗佐剂时,MRB能有效地触发抗DCT和-OVA免疫应答。1C,分别为左面板和右面板)。值得注意的是,我们得到了类似的结果使用VSV和VV(图)。1D)。为了确定病毒与肽的预混合是否影响其注射时的位置,我们对MRB-OVA与OVA肽共施与否进行了生物分布分析(图一)。1E)。我们的结果表明,注射后24小时,两组动物的肺部、脾脏、肝脏和大脑中都发现了类似数量的病毒。为了确定多肽是否与MRB结合,我们进行了MRB+肽混合物经50 kDa滤池离心分离实验。为了便于检测,我们使用了与myc标记序列相对应的肽。由于myc肽长10个氨基酸,其大小小于50 kDa,MRB病毒子大于50 kDa。结果表明,在MRB被滤液保留的同时,我们没有检测到MRB与保留液中的任何肽,而且该肽仅存在于滤液中,这表明MRB与病毒没有结合(附图)。1).

图1:OVS作为免疫佐剂有效。
figure1

a治疗时间表(bd)。所有小鼠均携带SC B16F10-OVA肿瘤。b用Ad-DCT或Ad或PolyI免疫小鼠脾细胞的IFNγELISPOT分析:C+全IM(从左至右);n=4、5、5和3);cMRB-DCT,MRB与DCT肽(左面板)或MRB-OVA或MRB与OVA肽(右面板)共给药(均Ⅳ)(从左至右);n=4、5、3、3、3、5及4)或;dMRB、VSV或VV联合DCT肽(所有IV)(从左至右);n=2、5、5和5)。为bd统计分析指的是相应的体内外“无再添”和“再添”条件的比较。NS:p>0.05,*:p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 (unpaired two-tailed t-测试)。eC57BL/6小鼠静脉注射MRB-OVA与不联合注射OVA肽24h的生物分布分析n=3)。fGFP的流式细胞分析+注射MRB-GFP和OVA肽的小鼠脾细胞。取脾脏注射后1.5h,离体培养4.5h,染色分析。图表显示活的B细胞百分比(CD 19)+,B 220+)是绿色荧光蛋白+ (n=3)。gGFP的流式细胞分析+,B 220+、CD 19+细胞来自(f) (n=3)。等高线图显示了区分B细胞不同子集的门控策略,右边的图形显示边缘区(MZ)、卵泡(FO)和其他B细胞群的量化。NS:p>0.05(未配对双尾)t-测试)。源数据作为源数据文件。精确性p值可以在源数据中找到。

Bridle等人先前的一项研究。用Ad-抗原和vsv-抗原联合应用异源抗宿主病毒原生质体疫苗的作用机理,并采用相同的治疗方案。12。研究表明,增强载体(VSV)对脾B细胞的感染对免疫效果有重要影响。因此,我们测试MRB与肽混合是否也能感染脾脏B细胞。为了便于检测感染的细胞,我们使用gfp编码的mrb变异体或预混合OVA肽。小鼠腹腔注射,1.5h后取脾。为了给gfp的表达留出足够的时间,在染色和分析之前,将这些细胞体外培养4.5小时。我们发现一小部分脾B细胞(CD 19)+,B 220+)成为全球伙伴关系司+在两个治疗组(图1)。1F和补充图。2A),说明MRB也能感染脾B细胞,且多肽的存在并不影响这种能力。根据CD 21/35和CD 23标记的表达对病毒感染的B细胞进行进一步的鉴定,结果表明,边缘区(MZ)、滤泡以及其他(非MZ和非滤泡)B细胞都被感染(如图所示)。1g和补充图。2B),与大多数绿色荧光蛋白一起使用。+B细胞为卵泡型,两组间差异无显着性(P>0.05)。这个结果与先前的研究中使用vsv抗原作为助推剂的结果是一致的。12。综上所述,我们的数据表明,几种OVS是有效的疫苗佐剂,在MRB混合物中加入游离肽并不能改变病毒的生物分布或其到达和感染脾B细胞离散亚群的能力。

然后,我们想确定OVS是否可以作为免疫佐剂,在异源病毒的主要促进条件下进行免疫增强。为此,我们用Ad-DCT启动了荷瘤动物,并在7天后使用VV、VSV或MRB和DCT肽增强了免疫反应(见治疗时间表,图1)。2A)。结果表明,VV、VSV和MRB均能有效地增强抗原特异性免疫。2B)。有趣的是,进一步的实验表明,MRB(使病毒灭活)的辐射并不影响产生的免疫反应的大小,因此证明病毒复制不是佐剂性所必需的(补充图1)。3)。在对不同给药途径进行测试时,我们发现MRB+DCT在静脉(IV)、瘤内(IT)和肌注(IM)(补充图)的作用下,能有效地增强免疫应答。4)。重要的是,MRB不能同时用作启动和增强佐剂平台,因为在这些条件下的免疫反应可以与MRB+DCT启动后获得的免疫反应相媲美(补充图)。5)。其次,我们比较了MRB和疫苗佐剂在病人中的佐剂作用。我们比较了铝水凝胶(氢氧化铝(明矾)基)和Addavax(类似于MF 59的水中油乳剂)。13以MRB作为我们异源免疫方案中的佐剂。我们发现MRB是增强CD8 T细胞免疫功能的最佳佐剂。6)。阿达瓦克斯的促进作用很小,但并不明显,而阿利福尔促进的动物与只接受黄金的动物相比没有任何改善。综上所述,我们的数据表明,MRB是一种有效的佐剂,在异源肿瘤学病毒的主要促进条件下增强免疫。

图2:OVS是免疫增强的有效佐剂。
figure2

a本研究使用的治疗方案。bIFNγELISPOT分析Ad-DCT刺激小鼠脾细胞,用VV、VSV或MRB联合DCT肽刺激小鼠脾细胞(从左向右);n=2、3、5、5和5);c以Ad-DCT为基础,MRB-DCT或MRB与DCT肽(MRB+DCT)联合应用(从左至右)促进;n=4、4、5和5);d以Ad-Ova为基础,MRB-OVA促进,MRB与OVA肽(MRB+OVA)或OVA肽(从左至右)共给药;n=2、3、4、5和5)。e同一实验的脾细胞流式细胞仪分析。d)(从左到右;n=2、3、4、5和5)或(f小鼠经Ad-E6/E7刺激,MRB-E6/E7或MRB与E6/E7肽联合应用(从左至右);n=5、5、14和5)。除非另有说明,统计分析指的是相应的活体外“无再添”和“restim”条件之间的比较。NS:p>0.05,*:p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 (unpaired two-tailed t-测试)。源数据作为源数据文件。精确性p值可以在源数据中找到。

然后,我们比较了MRB-抗原和MRB+抗原疫苗在Ad-抗原启动时的免疫反应,发现在这两种增强策略下,都有相同的抗原特异性免疫应答(如图1所示)。2C和d)。流式细胞仪分析显示,15%-20%的脾CD8 T细胞是抗原特异性的,采用两种主要的促进方法(图1)。2E),进一步证实MRB与抗原肽共给药与编码相同抗原的MRB同样有效地增强抗肿瘤免疫。重要的是,我们利用临床试验候选病毒Ad-E6/E7和MRB-E6/E7获得了类似的结果。2F),从而证实了MRB作为免疫增强佐剂的有效性。

接下来,我们要对佐剂性MRB疫苗增强诱导的CD8 T细胞进行研究。在这些实验中,我们使用无肿瘤动物进行样本采集,在以后的时间点,来自对照组的荷瘤动物将死亡。所有小鼠在第0天注射Ad-OVA,第7天用MRB与OVA联合使用(见图中的治疗时间表)。3A)。令人印象深刻的是,超过60%的血液CD8 T细胞是Ova-四聚体。+7天后,与之相比,只有20%的动物获得了最佳状态(如图所示)。3B,顶图)。鉴于增强后检测到更多的CD8 T细胞,两组之间的差异在观察Ova特异性CD8 T细胞的活血细胞百分比时进一步放大:两组之间的差异接近20倍(MRB增强法从2%到38%)(图1)。3B、底部面板)。类似的分析显示,在第3周和第4周(分别为第28天和第35天),具有Ova特异性的CD8 T细胞的百分比随着时间的推移保持在类似的水平(图1)。3B虽然随着时间的推移,具有OVA特异性的CD8 T细胞的总血细胞百分比有所下降,但与对照组相比仍保持着明显的高水平(图1)。3B、底部面板)。第35天,对脾细胞进行体外肽再刺激后产生细胞因子的分析。正如我们所预期的那样,我们发现MRB促进动物在OVA肽刺激下产生干扰素γ和肿瘤坏死因子α的能力都有了提高(如图所示)。3C和D)。为了进一步研究疫苗诱导的抗原特异性CD8 T细胞,我们首先评估了CD 127和klrg 1的表达,这是一种表面标记物,可以区分记忆前体效应细胞(mpecs:klrg 1)。罗氏、CD 127),双阳性效应细胞(dpecs:klrg1)、CD 127),短期效应细胞(SLEC:KLRG 1)、CD 127罗氏)和早期效应细胞(EECS:KLRG 1)罗氏、CD 127罗氏)。我们发现不同类型的Ova特异性CD8 T细胞在MRB增强前后的比例是相似的,其中最大的一部分属于SLECs亚群体,并且随着时间的推移保持稳定(图1)。3E和F)。虽然MRB促进小鼠的DPECs稍多,SLEC较少,但治疗组间观察到的差异无统计学意义。当我们观察脾脏中细胞的绝对数量时,我们发现了更多的mrb+抗原免疫增强的亚群体(图1)。第三代),这一发现与为增强小鼠检测到的Ova特异性T细胞数量的增加相一致。我们通过评估CD62L和CD 44的表达来进一步鉴定这些细胞,从而可以识别出天真的CD 44。、CD62L+,中央存储器(CM:CD 44)+、CD62L+),效应器存储器(EM:CD 44)+、CD62L)和双阴性(DN:CD 44)、CD62L-)细胞(图1.3H,左面板)。我们发现两组患者的Ova特异性CD8 T细胞大多为EM细胞(图1)。3H(右面板),I(顶部面板)和补充图。7)。此外,随着时间的推移,这些细胞的表型保持稳定,而绝对值(除了幼稚细胞外)都较高,但仅随着辅助性MRB对EM亚型的增强而显著增加(如图所示)。3I、底部面板)。综上所述,我们的结果表明,MRB与抗原联合使用能有效地增强Ad-抗原免疫启动时的抗原特异性免疫,并产生重要的记忆细胞池,主要是EMs和CMS。

图3:佐剂OV增强免疫产生记忆性CD8 T细胞。
figure3

a本研究使用的治疗方案。b流式细胞术分析荷瘤小鼠脾细胞和血细胞的变化,并于7d后与MRB联合注射OVA肽,观察其对小鼠脾细胞和血细胞的影响。第14、28、35天采血,第35天检测脾细胞。条形图显示了Ova-四聚体的百分比。+细胞(CD8内)+活细胞群)(顶板)或活细胞数为CD8+,Ova-四聚体+(底部面板)(n=2(无质数,无助推)和3(Ad-Ova,no Boost和Ad-Ova,MRB+OVA)。cCD 44表达及CD8产生干扰素γ或α的等高线图+脾细胞(第35天)用OVA肽进行体外再刺激。dCD8细胞百分比的定量研究+CD 44细胞+、干扰素γ+或CD 44+、肿瘤坏死因子α+有无体内外刺激n=2(无质数,无助推)和3(Ad-Ova,no Boost和Ad-Ova,MRB+OVA)。eOva-四聚体表达KLRG 1和CD 127的等高线图+CD8 T细胞图中还描绘了不同的T细胞亚群:记忆前效应细胞(Mpecs)、双阳性效应细胞(Dpecs)、短命效应细胞(Slecs)和早期效应细胞(Eecs)(n=2(无质数,无助推)和3(Ad-Ova,no Boost和Ad-Ova,MRB+OVA)。f确定的人口数量(e)所有老鼠(n=3)。数据以平均值±扫描电镜表示。g第35天小鼠脾脏MPECs、DPECs、SLECs和EECs的绝对数(n=3)。数据以平均值±扫描电镜表示。h根据未经治疗的动物脾细胞CD 44和CD62L的表达(左面板)或CD8表达显示不同T细胞群的典型轮廓图+,Ova-四聚体+第35天(右侧),两组患者血液和脾脏中的细胞。图中还显示了用于区分天真、中央记忆(CM)、效应记忆(EM)和双阴性(DN)CD8的门控策略。+T细胞(n=2(无质数,无助推)和3(Ad-Ova,no Boost和Ad-Ova,MRB+OVA)。i确定的人口数量(g)所有小鼠在不同时间点(顶板)和绝对值的朴素,CM,EM和DN CD8。+,Ova-四聚体+第35天小鼠脾脏细胞(下板)(n=3)。数据以平均值±扫描电镜表示。除非另有说明,统计分析指的是相应的活体外“无再添”和“restim”条件之间的比较。NS:p>0.05,*:p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 (unpaired two-tailed t-测试)。源数据作为源数据文件。精确性p值可以在源数据中找到。

OVS可作为异源病毒主要增强疫苗的佐剂。

考虑到与单一免疫相比,主要的疫苗接种方案会产生更大的免疫反应,接下来我们将测试Ad和MRB是否可以与多肽协同使用,以及与使用编码相同抗原的病毒相比,这种疫苗的接种效率如何(如图所示的治疗时间表)。4A)。利用DCT或卵清蛋白(OVA)作为抗原,我们的结果清楚地表明,在这种情况下,OVS+肽与编码抗原的OVS一样有效地诱导抗原特异性免疫(图1)。4B,分别为左图和右图)。然后,我们测试了我们的策略是否能将治疗效果赋予已建立的B16F10肺肿瘤动物,有趣的是,我们发现来自OVS+抗原主要助推组的30%的动物被治疗治愈(图1)。4C这两种病毒在这种侵袭性肿瘤模型中无法提供治疗效果。当将佐剂OV的主要促进作用与使用抗原编码病毒的疫苗进行比较时,两种疫苗都提供了同等的治疗效果(图1)。4D),这一发现与两种疫苗诱导的等效抗肿瘤免疫应答相一致(图1)。4B)。考虑到我们发现了抗原特异性的CD8+T细胞在接种疫苗后将被诱导。2E,f3),我们下一步试图确定耗尽CD8 T细胞是否会取消佐剂OV疫苗的治疗效果。正如预期的那样,Ad+OVA和MRB+OVA疫苗所提供的保护由于CD8的耗尽而完全丧失。4E)。综上所述,这些结果表明OVS可以作为抗癌疫苗的佐剂,以CD8依赖的方式提高荷瘤动物的存活率。

图4:OVS在异种疫苗接种方案中具有启动和促进佐剂的作用。
figure4

a本研究使用的治疗方案。b第7天用Ad-DCT刺激小鼠脾细胞,第14天用MRB-DCT刺激小鼠脾细胞,第14天用Ad和MRB刺激小鼠脾细胞(左图),第7天用Ad-OVA刺激小鼠脾细胞,第14天用MRB-OVA刺激小鼠脾细胞,第14天用Ad和MRB刺激小鼠脾细胞(从左到右);n=2、5和5)。统计分析指的是相应的体内外“无再添”和“restim”条件的比较。NS:p>0.05,*:p < 0.001 (unpaired two-tailed t-测试)。B16F10荷瘤小鼠的Kaplan-Meier生存分析;cAD(第7天)和MRB(第14天)或Ad和MRB与DCT肽联合用药(n=10(Ad,MRB和Ad+DCT,MRB+DCT)和11(NT);d第7天加入ad-dct,第14天与dct肽联合使用mrb-dct或mrb,或(n=7(Ad-DCT,MRB-DCT和Ad+DCT,MRB+DCT)和9(NT);e第7天注射阿托瓦,第14天MRB与Ova肽联合应用,并伴有或不伴有CD8耗竭(n=20(NT和Ad+Ova,MRB+OVA)和19(Ad+Ova,MRB+Ova-CD8),2组实验合并。p>0.05,*:p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 (Mantel–Cox test, two-sided). Source data are provided as a 源数据文件。精确性p值可以在源数据中找到。

Ovs可以作为个性化的癌症疫苗平台使用。

为了确定ov是否适合作为针对肿瘤新表位(Mus)的疫苗佐剂,我们首先测量了针对前面描述的mus疫苗所产生的免疫应答。8,14从B16F10细胞株中使用多聚I:C作为佐剂(治疗时间表如图所示)。5A)。正如以前的一项研究所做的那样8我们使用了位于第14位的不同突变的合成的27-聚肽,以便处理和呈现所有可能的突变表位变异。正如预期的那样,不同的MutS诱导的抗原特异性免疫反应比野生型的相同肽的突变要优越(如图所示)。5B)。接下来,我们试图确定MRB和PolyI:C是否都能诱导类似的抗Mut免疫反应.首先,我们确定了多效I:C的给药途径,从而获得了最佳的免疫效果。结果表明,多肽的最佳注射路线为IM和皮下注射(SC)(附图)。8A)。鉴于MRB在我们的疫苗模型中通常使用IV,我们比较了多肽SC或IV与多I:C和MRB的佐剂活性。当我们比较这些疫苗时,我们观察到两种佐剂在抗DCT(补充图)时的抗原特异性免疫反应是相当的。8B因此,再一次证明MRB的佐剂活性与PolyI:C的佐剂活性相比较,而且,我们在免疫两种不同的MutS时也得到了相似的结果(见图)。5C)。鉴于我们的最终目标是对抗原的混合物进行免疫,接下来我们将测试针对1、2或4种不同的突变体的疫苗是否会损害针对单个肽的免疫效果。重要的是,我们的结果表明抗原特异性免疫反应不受不同肽的数量的影响(图1)。5D).

图5:OVS可作为肿瘤新表位疫苗接种的佐剂.
figure5

a本研究使用的治疗方案。免疫小鼠脾细胞的IFNγELISPOT分析;b聚酰亚胺:C与不同的b16f10muts(IM)共给药,并与相同或相应的非突变肽进行体外再刺激。n=2(WT Restim)和6(Mut Restim);c多I:C或MRB与不同的B16F10Muts联合给药,并以相同的肽或(从左至右)再刺激体外;n=4、4、3和3);d多聚I:C与1,2或4种不同的突变体(各100μg)联合给药,再用Mut30进行体内外刺激。n=5)。除非另有说明,统计分析是指相应的“无再提”和“再添”条件之间的比较。NS:p>0.05,*:p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 (unpaired two-tailed t-测试)。B16F10 SC荷瘤小鼠肿瘤生长(左板)和Kaplan-Meier生存分析(右板);e第7天和第14天:C±Mut30,或(n(5)数据为平均值±SEM;f第7天:C或MRB+Mut30(n=10)。数据以平均值±扫描电镜表示。肿瘤生长分析:NS:p>0.05,*:p < 0.05, ***: p < 0.001 (unpaired multiple two-tailed t-试验)和生存分析:NS:p>0.05,*:p < 0.05, **: p < 0.01, ***: p < 0.001 (Mantel–Cox test, two-sided). Source data are provided as a 源数据文件。精确性p值可以在源数据中找到。

然后,我们要测量辅助MRB与多聚I:C疫苗在B16F10 SC荷瘤小鼠中对Mut30的治疗效果。首先,我们确认了,正如以前由另一组发布的那样8抗突变体30治疗性疫苗能控制肿瘤生长,并能稍微延长生存期(图1)。5E,分别为左面板和右面板)。接下来,我们比较了多效疫苗:C疫苗和MRB佐剂疫苗的治疗效果,发现单剂量的MRB疫苗足以控制肿瘤生长,使动物的中位生存期延长10天。5F,分别为左面板和右面板)。综上所述,我们的数据表明,MRB和PolyI:C对肿瘤新表位具有同等的疫苗佐剂活性,但当使用OV进行抗癌疫苗接种时,其治疗效果更好。

鉴于我们的目标是通过对多种抗原的免疫来防止疫苗诱导的癌症免疫编辑,我们首先要识别多个可靶向的癌症新抗原。为了选择在b16f10量身定做疫苗中加入哪一个mus,我们测试了先前描述的新表位的治疗潜力。14使用多聚I:C作为主要的佐剂,增强抗肿瘤免疫(如图所示的治疗时间表)。6A)。我们发现4个新表位(B16Mut20、B16Mut30、B16Mut44和B16Mut48)在这种治疗环境下可以成功地延缓肿瘤的生长。6B)。然后,我们测试了由OVS+MutS组成的疫苗是否能给已建立肿瘤的动物带来治疗效果。为此,我们预先混合Ad或MRB与4个保护性新表位,并接种小鼠接种B16F10肺癌。ELISPOT分析显示,接种疫苗的动物对所有4种突变都有免疫反应(图1)。6C)。此外,如图所示。4C单用Ad和MRB治疗的小鼠对B16F10肺癌没有明显的保护作用。6d)。另一方面,异源OV+MutS主要促进疫苗可以治愈20%的动物,延长其余队列的存活时间。为了将我们的发现扩展到另一种肿瘤模型,我们还测试了先前描述的ct 26结肠癌新表位的保护潜力。15正如我们对B16F10Muts所做的那样,我们发现在治疗环境中,所检测的3种抗原(CT26Mut20、CT26Mut27和CT26Mut37)都能减缓肿瘤的生长。6E)。用Ad和MRB作为佐剂,结合这3种突变体治疗CT26SC荷瘤动物时,我们观察到动物对这3个突变体具有抗原特异性免疫(图1)。6f),他们的肿瘤生长缓慢(补充图。9超过20%的接种过疫苗的小鼠都被治愈了(如图所示)。6g)。综上所述,我们的数据表明,OVS与定制的辣椒癌新抗原鸡尾酒协同使用,构成了高效的个性化抗癌疫苗。

图6:抗MutS佐剂OV疫苗提高了治疗效果。
figure6

a本研究使用的治疗方案。b建立的SC B16F10肿瘤小鼠在接种肿瘤后第7天和第14天分别用多聚I:C和指示肽进行IM治疗。所有肿瘤于第21天测量。肿瘤体积表示为对照小鼠(仅用PolyI:C处理)的平均肿瘤体积(从左到右);n=5、10、10、4、10、15和10)。NS:p>0.05,*:p < 0.001 (unpaired two-tailed t-测试)。cIFNγElispot(n=5)和(d)Kaplan-Meier生存分析(nB16F10肺癌荷瘤小鼠经Ad和MRB处理或与B16Mut20、B16Mut30、B16Mut44和B16Mut48联合用药。伊丽莎白:NS:p>0.05,*:p < 0.001 (unpaired two-tailed t-试验)和生存:NS:p>0.05,*:p < 0.001 (Mantel–Cox test, two-sided). e建立的SC CT 26小鼠肿瘤的治疗和分析结果如下:b)(从左到右;n=9、5、5、10和10)。NS:p>0.05,*:p < 0.05 (unpaired two-tailed t-测试)。fIFNγElispot(n=5)和(g)Kaplan-Meier生存分析(n第7、14天接种Ad和MRB或Ad和MRB联合接种CT26Mut20、CT26Mut27和CT26Mut37的SC CT26荷瘤小鼠。伊丽莎白:NS:p>0.05,*:p < 0.001 (unpaired two-tailed t-试验)和生存:NS:p>0.05,*:p < 0.001 (Mantel–Cox test, two-sided). Source data are provided as a 源数据文件。精确性p值可以在源数据中找到。

鉴于共同的肿瘤抗原编码OVS是有效的治疗方法,并且可以作为个性化疫苗接种的辅助平台,我们测试了OV抗原与附加抗原协同使用的治疗效果(治疗时间表如图所示)。7A)。我们发现,接种Ad-Ova和MRB-Ova后Ova特异性免疫反应与Ad-Ova+DCT和MRB-OVA+DCT获得的免疫应答相似(图1)。7b)。此外,这一后来的组合还允许额外的一代DCT-特定免疫(虚线条)。接下来,我们将测试针对MutS的额外疫苗是否会带来更好的治疗效果。为此,我们植入SC B16F10-OVA肿瘤,用Ova编码Ad和MRB免疫4种保护性B16F10Muts的动物。如先前公布的那样16我们的结果表明,OV-OVA的主要助推器可以减缓肿瘤的生长和延长生存,但所有的动物仍然死于这种疾病(图一)。7C,分别为左面板和右面板)。OV-OVA+MutS治疗组肿瘤生长缓慢,存活率进一步提高,30%的小鼠治愈。这些结果支持使用编码抗原的OVS作为疫苗接种平台。

图7:编码抗原的ovs可用作个性化疫苗的平台。
figure7

a本研究使用的治疗方案。b用Ad-OVA±DCT肽和MRB-OVA±DCT肽刺激小鼠脾细胞的γELISPOT分析(从左至右);n=2、5和3)。统计分析指的是相应的体内外“无再添”和“restim”条件的比较。NS:p>0.05,*:p < 0.001 (unpaired multiple two-tailed t-测试)。cB16Mut20、B16Mut30、B16Mut44和B16Mut48联合治疗SC B16F10-Ova荷瘤小鼠的生长和存活分析n=10)。数据以平均值±扫描电镜表示。*:p < 0.05, ***: p < 0.001 (unpaired multiple two-tailed t-测试)。Kaplan-Meier生存分析:*:p < 0.001 (Mantel–Cox test, two-sided). Source data are provided as a 源数据文件。精确性p值可以在源数据中找到。

讨论

我们与OVS共施抗原肽的策略比使用编码抗原的OVS具有几个优点。首先,先前的一份报告已经表明,只有在第四种情况下,编码抗原的MRB才能有效地提高免疫力。3虽然我们的数据显示MRB+抗原和IV一样有效,但这是我们战略的一个重要优势,因为在肿瘤中直接注射OVS可以将整个病毒剂量传送到肿瘤部位,这可能是一些患者希望的方法。17。第二,由于抗原是作为肽给药,所以免疫系统很容易识别。此外,抗原的表达不是由病毒驱动的,因此与每一种癌症的固有病毒敏感性无关。第三,鉴于Ad、MRB、VSV和VV都可以作为疫苗佐剂,因此可以设计出包括使用不同OVS的多个疫苗助推器的疫苗接种策略。这可以最大化的抗肿瘤免疫,但也直接杀死肿瘤,因为不同的病毒都有肿瘤学活性。在考虑针对病毒载体本身产生的免疫反应时,这一点尤为重要。18,这可能限制了使用相同的病毒载体多次提升的可能性。由于目前有几个OVS正在不同的患者队列中进行测试,这些试验的结果将有助于说明在不同的适应症中使用什么是最好的病毒。因此,我们的OV疫苗不仅可以根据癌症独特的突变体定制,而且可以根据每个患者的癌症类型和位置选择最佳的OV,从而最大限度地增加阳性结果的机会,从而为每个患者量身定做佐剂平台。

进一步提高疫苗接种效果的一种方法是使用OVS基因工程来表达刺激免疫的转基因基因,以促进记忆T细胞作为佐剂的生成。我们的OV疫苗促进了EM(CD 44)的产生。、CD 62罗氏)CD8 T细胞,还有更少的CM(CD 44)、CD 62)CD8 T细胞。虽然这些记忆性T细胞亚群对观察到的抗肿瘤免疫反应的贡献仍有待确定,但设计的策略可以促进分化较低的CM T细胞的产生,这些细胞具有良好的抗肿瘤活性。19可能进一步提高OV疫苗的有效性。我们和其他人已经证明了几种转基因可以提高不同OVS在直接癌症治疗方案(干扰素-γ)中的疗效。20,白介素-1221)以及使用感染OVS(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)的受照射癌细胞的疫苗接种策略。22和白介素-1223)。这些病毒的疫苗佐剂活性仍有待测试,并可设计额外的ov来表达细胞因子,如白细胞介素2、-7和-21,这些细胞因子本身已被用作疫苗佐剂。24。评估这些细胞因子所产生的T细胞类型,选择促进肿瘤特异性CM T细胞生成的细胞因子仍然是一个很有前途的领域。

OVS作为疫苗佐剂,为利用合成肽诱导抗原特异性免疫提供了一种快速、简便、经济的方法。在这项研究中,我们发现与其他用于人类免疫的佐剂相比,OVMRB在增强抗原特异性免疫方面有更好的效果。重要的是,明矾和水中油佐剂通常用于诱导体液免疫,而不是细胞介导的免疫,在我们的研究中,我们没有评估体液免疫反应。值得注意的是,Addavax还可以触发抗原特异性T细胞。25我们确实观察到了这种佐剂的温和但微不足道的促进作用。由于抗Mut免疫必须针对突变的表位,才能防止自身免疫的发展,因此肽的使用非常适合于个性化的免疫接种。然而,使用编码肿瘤抗原的OVS同样有效,并可能更好地产生多表位免疫反应的整个蛋白质,如共同的癌症抗原。因此,我们的策略最适合于针对肿瘤突变体的抗癌疫苗。重要的是,我们的结果表明,这两种疫苗接种策略是相容的。因此,临床候选抗原Ad-MAGEA 3和MRB-MAGEA 3或Ad-E6/E7和MRB-E6/E7等已编码肿瘤抗原的OVS可作为疫苗佐剂,分别针对MAGEA 3-或E6/E7阳性肿瘤中的附加突变株。

使用编码肿瘤抗原的病毒的异源OV疫苗接种方法目前正在进行临床研究,因此,剂量和安全性数据将很快确定。在考虑将OV佐剂疫苗移植到临床之前,仍然存在一些挑战。其中,我们认为,如果在疾病早期接种抗癌疫苗,将带来最大的益处,而OV试验则会为晚期癌症患者提供服务。此外,抗Mut疫苗也正在进行临床研究,因此,我们相信,在本研究中制定的治疗策略可以迅速转化到临床,并能显著改善癌症患者的预后。因此,OV佐剂平台是一种可行的策略,可以为患者接种其独特的肿瘤突变体,在直接杀死肿瘤细胞的同时诱导出强大的肿瘤特异性免疫反应,值得临床检验。


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