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从创业到侵袭性肺腺癌的免疫进化及相关分子特征

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发表时间:2021-05-14 09:07作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

抗肿瘤免疫形成肺癌早期癌变的机制尚不清楚.本研究采用转录免疫分析、T细胞受体(TCR)测序和多重免疫荧光(MIF)等方法对侵袭性肺ADC及其前驱物的免疫背景进行了研究。我们的结果表明,抗肿瘤免疫进化为一个连续的过程,从肺创伤性ADC到侵袭前ADC、微创ADC和坦率侵袭性肺ADC,其免疫应答逐渐变得不那么有效和调控更强,包括免疫激活途径的下调、免疫抑制途径的上调、细胞毒性T细胞(CTL)和抗肿瘤辅助T细胞(Th)的低浸润、调节性T细胞(Tregs)的高浸润、T细胞克隆的减少以及晚期T细胞克隆频率的降低。驱动突变、染色体拷贝数畸变(CNAS)和DNA异常甲基化可能共同影响宿主的免疫应答,促进免疫逃避,促进侵袭性ADC中发育为优势克隆的适配亚克隆的生长。

导言

尽管在临床治疗方面取得了有希望的进展,但肺癌仍然是全世界癌症死亡的主要原因,这主要是由于在晚期诊断,而这些晚期的治疗通常是无法实现的。CT引导下肺癌筛查显示肺癌死亡率降低了26-61%。1强调需要早期发现和干预,以此作为降低肺癌发病率和死亡率的关键战略。然而,许多关于原发性肺癌预防的随机临床试验的结果令人失望。1,主要是因为我们对肺癌早期发展的基本认识。深入了解肺癌早期发生的分子机制,可促进肺癌的精确诊断及有效的预防和治疗策略的制定。

肺腺癌是肺癌最常见的组织学亚型。早期肺adc及其前体的分类已由多个专业学会修订,包括不典型腺瘤性增生(AAH)、唯一公认的肺ADC、侵袭前原位腺癌(AIS)、被称为微创腺癌(Mia)的微小浸润性病变(Mia),以及最终坦然浸润的adc。2,3,4,5。早期肺ADC及其前体常表现为肺结节,具有明显的X线特征,称为磨玻璃混浊(GGO)。这些肺结节通常被称为无组织学诊断的不确定肺结节(IPNs),因为GGO为主结节的活检诊断率低,手术切除不是治疗标准。这导致缺乏足够的材料来研究肺ADC前驱物的分子景观。

癌症的发生源于分子异常的累加(分子进化)和逃避宿主免疫监视(免疫编辑)。我们对肺adc前驱物基因表达和基因组图谱的初步研究显示了明显的转录特征。6以及沿着AAH谱向AIS、MIA和ADC的渐进基因组进化7。然而,免疫编辑造影剂早期肺癌发生的程度以及与这些免疫特征相关的潜在的基因组和表观遗传学改变仍未确定。本研究采用免疫基因表达谱、T细胞受体(TCR)测序和多重免疫荧光(MIF)染色等方法,对切除的AAH、AIS、MIA、侵袭性ADC病变和成对的正常肺组织(NL)进行免疫基因表达谱、T细胞受体(TCR)测序和多重免疫荧光(MIF)染色,以勾勒早期肺ADC发病不同阶段的免疫背景,特别是T细胞景观。我们进一步利用整个外显子序列(WES)。7甲基化数据8从同一组IPN中解开可能影响免疫背景的基因组和甲基化改变(补充数据)1还有无花果。1).

图1:不同阶段的免疫景观IPN及相关的基因组和表观基因组特征。
figure1

免疫基因定时器法检测CD4+T细胞、CD8+T细胞浸润,用多重免疫荧光法(MIF)检测调节性T细胞(Tregs,CD3+CD8-FOXP 3+)和CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL,CD3+CD8+颗粒酶B+);全外显子测序(WES)的基因组改变包括EGFR/克拉斯下面面板显示了突变、HLA LOH、拷贝数变异(CNV)负担、等位基因失衡(AI)负担、与预测的新抗原相关的总突变数以及与预测的新抗原相关的未启动子甲基化的突变总数;在底部面板显示了以长间隔转座元件-1(第-1行)作为替代标记的全局甲基化状态。53例患者,包括典型腺瘤样增生(AAH)、原位腺癌(AIS)、微创腺癌(MIA)和侵袭性腺癌(ADC)。(源数据作为源数据文件提供)。

结果

侵袭性肺腺癌与其前驱物相比全身免疫功能下降

为了评估早期肺癌发生过程中免疫背景的动态变化,我们使用n计数器泛癌免疫分析面板(NanoString Technologies,Inc.)进行了免疫分析。由770个基因组成,包括~700个免疫相关基因,涵盖先天免疫和适应性免疫应答。9切除的肺ADC及其前驱物(n=9对AAH,n=11对AIS,n=21对MIA,和n=6(用于侵入式ADC)(补充数据)2)。年龄没有差别。p=0.55,Kruskal-Wallis检验),性别(p=0.31,Fisher‘s确切测试)或吸烟状况(p不同组织学分期肺结节间的Fisher‘s精确检验(=0.35,Fisher’s确切检验)。共鉴定出291个差异表达基因(DEGS;FDR<0.1%)。有趣的是,大多数DEG的变化,无论其方向如何,都呈现出从NL到AAH、AIS、MIA和ADC(辅助数据)的逐步变化模式。3)。递增基因的例子包括免疫抑制基因。CD 47(保护癌细胞免受免疫细胞的杀伤)10, CD 276(抑制免疫反应)11CTLA 4(检查点分子)12,而逐渐减少的基因包括ENTPD 1(表达于肿瘤特异性T细胞)13、颗粒酶B(GZMB),以及穿孔素1(PRF 1(T淋巴细胞和自然杀伤细胞产生的细胞毒性分子)14,15(补充图。1)。这291个DEG的功能通路分析揭示了26条明显的去调控通路(-log(-log))。p)>10和绝对值z->0.5)与肿瘤从NL到侵袭性ADC的演变相关,其中23例下调(图1)。2A)后期IPN。另一方面,晚期IPN中所有三种上调的途径(B细胞信号中的系统性红斑狼疮(SLE)、T细胞衰竭信号和PARP信号通路)都可能损害免疫应答。16,17,18。这些结果表明,在晚期疾病中,免疫进化是一个连续的过程,从创业到侵袭性肺ADC,免疫功能全面下降。

图2:从创业到侵袭性肺腺癌的免疫景观。
figure2

a利用独创性路径分析软件(IPA;In脑力系统)显着地丰富了基于291个差异表达基因的功能通路。带-log的路径(p-价值)>10(p-数值是从Fisher‘s右尾精确检验得到的)和一个绝对值z-得分>0.5。被预测会被抑制的通路(阴性)Z在后期阶段是蓝色的,被预测为激活的通路(阳性)。Z在后期阶段是橙色的。杆的高度表明了富集的意义(−log(p)和橙色或蓝色的尺度代表预测的方向性。部分免疫细胞,包括CD4+T细胞(b),CD8+T细胞(c),CD4/CD8比值(d)用定时器根据基因的表达情况,用n计数器泛癌免疫谱板进行检测。误差条表示95%的置信区间,实心点表示每个阶段的平均值。用双面Kruskal-Wallis H检验评价不同时期细胞比例的差异。38例患者,包括正常肺组织(NL)、不典型腺瘤性增生(AAH)、原位腺癌(AIS)、微创腺癌(MIA)和侵袭性腺癌(ADC)。(源数据作为源数据文件提供)。

侵袭性肺腺癌与其前驱物的抗肿瘤免疫反应

接下来,我们使用计时器进行免疫基因表达谱分析。19评价免疫细胞组成的变化。如图所示。2BCD4+T淋巴细胞浸润从NL逐渐增加到侵袭性ADC。相反,随着肿瘤的发展,CD8+T淋巴细胞的浸润逐渐减少。2C)导致晚期病变CD4/CD8比值明显升高(图一)。二维空间)。为了验证这些发现,我们将计时器应用于rna测序(rna-seq)数据,这些数据来自先前发表的一组独立的肺adc前体。6并观察到类似的结果(附图)。2).

虽然CD8+T细胞被广泛接受为抗肿瘤细胞。20CD4+T细胞的功能更为复杂。CD4+T细胞表型高度异质,可分为T助手1(Th1,抗病毒/抗肿瘤),T助手2(Th2,变态反应),T助手17(Th17,自身免疫和病原体反应)和Tregs(免疫抑制)。21,22,23,24。最近的工作还描述了具有细胞毒性潜能的CD4+T细胞的数量,这可能有利于抗肿瘤反应。25。为了表征这些IPN中浸润T细胞的表型,我们用MIF(补充表)评估了T细胞标记物。1和补充图。3)在一个有可用材料的IPN子集上。众所周知,抗CD4抗体对MIF是有问题的。26用CD3+/CD8-T细胞代表MIF的CD4+T细胞。如附图所示。4免疫基因表达谱显示CD4+T细胞比例与总T细胞(CD3+)、Tregs(CD3+CD8-FoxP3+)呈正相关,与MIF中ThCTL(CD3+CD8-GZMB+)无相关性。免疫基因表达谱显示CD8+T细胞与CD8+CTL(CD3+CD8+GZMB+)呈正相关,MIF与Tregs(CD3+CD8-FoxP 3+)呈负相关。由基因表达数据推断的CD4/CD8比值也与Treg/CD8+CTL(CD3+CD8−FoxP 3+/CD3+CD8+GZMB+)比值呈正相关。尽管ThCTL(CD3+CD8-GZMB+)和Tregs(CD3+CD8-FoxP 3+)仅代表这些IPN中CD4+T细胞的少数(补充图)。5正常肺组织中ThCTLs所占比例最高。5A)和最低比例的Tregs(补充图)。5B)表明免疫逃避可能早在前发育阶段就开始了。值得注意的是,尽管以低丰度存在,但Tregs在后期IPN中增加,表明随着肿瘤的进化,进一步的免疫负调节(附图)。5B).

此外,我们试图评估T辅助极化在不同阶段的IPN。由于目前MIF面板测试的细胞表面标记有限,我们利用基因表达数据获得了T辅助标记。这些分析表明,后期IPN中Th2/Th1和Th17/Th1的比值显著高于后期IPN(补充图)。6a,b)提示T细胞向较小的抗肿瘤表型倾斜,尽管需要进行功能研究来证实这些观察。此外,从AAH和ADC独立队列的rna-seq数据中提取的Th2/Th1和Th17/Th1比值(GSE 102511)6显示了同样的趋势(附图)。6C,d)。这些结果表明,免疫进化从创业发展到侵袭性肺ADC,可能失去抗肿瘤反应,获得抑制性或无效的免疫细胞亚群。

随着肿瘤进展而逐渐发散的TCR储备

鉴于T细胞在抗肿瘤免疫监测中的核心作用,我们接下来将研究T细胞的功能。27通过T细胞受体(TCR)测序,比较不同阶段IPN的互补TCR指标,包括最高频率T细胞克隆、T细胞克隆性、T细胞密度和T细胞多样性。如图所示。3A和补充图。7,T细胞克隆在NLS中所占比例最高,而AAH、AIS、MIA和侵袭性ADC则逐渐下降(P<0.05)。p < 0.0001) implying reduced T cell expansion during early carcinogenesis of lung ADC. Moreover, NL showed the highest T cell clonality, while later-stage IPNs appeared to have higher T cell density and diversity, but lower T cell clonality (Fig. 3B-d)。值得注意的是,T细胞密度和T细胞多样性与免疫基因表达谱推断的CD4+T细胞呈正相关,而与CD3+CD8-T细胞和Tregs(CD3+CD8-FOXP 3+)呈正相关。8)。T细胞克隆性与免疫基因表达推测的CD8+T细胞、MIF推测的CD8+CTL(CD3+CD8+GZMB+)和ThCTL(CD3+CD8-GZMB+)呈正相关,与免疫基因表达推测的CD4+T细胞、CD3+CD8−T细胞及Tregs(CD3+CD8-FoxP 3+)呈负相关。4).

图3:T细胞从创伤性肺腺癌到侵袭性肺腺癌。
figure3

aT细胞克隆在正常肺、AAH、AIS、MIA和侵袭性ADC病变中的分布频率分别为前1(棕)、前2~10(黑)、前11~100(橙)、顶101~200(紫)、顶201~500(绿)、顶501~1000(红)和大于1000(蓝)。bT细胞密度cT细胞多样性d正常肺T细胞克隆性、AAH、AIS、MIA和侵袭性ADC。误差条表示95%的置信区间,实心点表示每个阶段的平均值。用双面Kruskal-Wallis H检验评价T细胞基质在不同阶段的差异。51例患者,包括正常肺组织(NL)、不典型腺瘤性增生(AAH)、原位腺癌(AIS)、微创腺癌(MIA)和侵袭性腺癌(ADC)。(源数据作为源数据文件提供)。

图4:T细胞克隆性与T细胞亚群的相关性。
figure4

a用n计数器泛癌免疫谱板的基因表达测定标记基因Th1(IFNG、IL12A、IL12B)的平均值。CD8+T细胞(b)和CD4+T细胞(e)用计时器从基因表达谱中推断。cCD8+CTL(CD3+CD8+颗粒酶B+)dThCTL(CD3+CD8-颗粒酶B+)fCD3+CD8-T细胞gMIF测定Tregs(CD3+、CD8-FoxP 3+)。相关系数(Rho)采用双尾Spearman秩相关检验.采用正常肺组织(NL)、不典型腺瘤样增生(AAH)、原位腺癌(AIS)、微创腺癌(MIA)和侵袭性腺癌(ADC)35例。(源数据作为源数据文件提供)。

与T细胞克隆性低相一致,一般表明T细胞缺乏扩张,T细胞储备受到抑制28T细胞克隆性与这些IPN中最显性T细胞克隆的频率呈显著正相关(附图)。9A-d),提示T细胞克隆性增高与克隆扩增增加有关。相反,T细胞克隆性与T细胞密度无关(附图)。9E)提示晚期IPN T细胞克隆性降低可能反映T细胞增殖减少,而不是T细胞排斥。综上所述,这些结果表明,后期IPN具有更高、更多样的T细胞浸润,并伴有较少的克隆扩张。在后期IPN中观察到了较高的Tregs、较低的CTL和Th1;一个合理的解释是,虽然宿主免疫系统可能已经吸收了更多的T细胞,但由于免疫抑制的增加(如Tregs的增加),这些T细胞无法有效地应答和扩展。

染色体不稳定和HLA缺失导致T细胞反应受损

接下来,我们试图探索与在这些病变中观察到的免疫背景相关的分子特征。据报道,染色体拷贝数的变化影响了各种癌症的免疫微环境。29,30我们观察到后期ipn ADC的拷贝数变化(Cnv)负担和等位基因不平衡(AI)负担较高。7。因此,我们试图探索拷贝数的变化是否与这些肺ADC前驱物的免疫景观有关。如附图所示。10A-cAI负荷与CD8+T细胞浸润呈负相关,与CD4+T细胞浸润和CD4/CD8 T细胞比率呈正相关。CNV负担也有类似的趋势,尽管这些差异没有达到统计学意义(补充图)。10d-f)。根据最近的研究表明,由于HLA的缺失,无效的新抗原的出现可能会促进免疫逃避。31,我们将LOHHLA(杂合性损失)算法应用到HLA中。31这些病变的WES数据7并观察到晚期IPN HLA位点的LOH发生率在AIS、MIA和ADC分别为7%、15%和33%,而在AAH中为0%。5A, p=0.005,χ2测试)。有趣的是,与无HLA LOH的IPN相比,有HLA LOH的IPN表现出更高的AI负荷和CNV负荷。5B,c)。一个合理的解释是,由染色体不稳定(CIN)和CIN水平较高的细胞引起的AI、CNV或HLA LOH的发展可能导致CNV/AI负担增加,HLA LOH的可能性增加,从而使这些细胞逃避抗肿瘤免疫监视,在晚期肿瘤病变中发展为优势克隆。

图5:不同组织学分期的IPN中HLA杂合性缺失(HLA LOH)及其与染色体改变的关系。
figure5

aAAH、AIS、MIA和ADC病变在HLA-LOH中所占比例。双面χ2试验采用不同组织学分期间的差异。人工智能负担的比较(人工智能事件的数量)(b)和CNV负担(归一化为CNV基因的百分比)c)病变中有(紫色)和无(绿色)HLA-LOH。采用双侧Wilcoxon秩和检验来评估差异。误差条表示95%的置信区间,实心点表示每个阶段的平均值。35例患者,包括正常肺组织(NL)、不典型腺瘤性增生(AAH)、原位腺癌(AIS)、微创腺癌(MIA)、侵袭性腺癌(ADC)。(源数据作为源数据文件提供)。

DNA甲基化异常可能影响肺癌早期的基因组改变和抗肿瘤反应。

体细胞突变通过产生T细胞识别的新抗原,在激活抗肿瘤免疫反应中起核心作用。32,33。如附图所示。11从AAH到AIS、MIA和ADC,总突变负担逐渐增加。然而,从同一组IPN的减少表示亚硫酸氢钠序列(RRBS)中甲基化数据的分析8提示晚期病变中有更大比例的基因表现为启动子甲基化(>30%CpG甲基化),从而潜在地抑制了晚期病变中新抗原的表达。这些数据表明,启动子高度甲基化可能导致新抗原的缺失和免疫逃逸。此外,我们还评估了全局甲基化状态的影响,使用长间隔转移元素-1(第-1行)作为替代标记。34,35,36这些病变的免疫微环境。组织学后期IPN的整体低甲基化明显增加(附图)。12A)与AI负荷呈负相关(附图)。12b),CNV负担(补充图。12C)和TMB(附图)。12D表明整体低甲基化与CIN水平升高有关。有趣的是,全甲基化水平与CD4+T细胞浸润和CD4/CD8比值呈负相关,Tregs浸润和Treg(CD3+CD8-FOXP 3+)/CD8(CD3+CD8+)比值与MIF呈负相关。6),表明全球甲基化降低与抑制性免疫相关。

图6:全球甲基化和免疫浸润的潜在影响。
figure6

CD4+T细胞与全球甲基化水平(以第1行作为代谢性标记)的相关性a),CD4/CD8比值(b)通过Timer和Treg(CD3+,CD8-FOXP 3+)推测免疫基因的表达。c)和Treg(CD3+CD8−FOXP 3+)/CD8(CD3+CD8+)比值(d)由MIF测量。相关系数(Rho)采用双尾Spearman秩相关检验.24例患者,包括正常肺组织(NL)、不典型腺瘤性增生(AAH)、原位腺癌(AIS)、微创腺癌(MIA)和侵袭性腺癌(ADC)。(源数据作为源数据文件提供)。

驱动程序突变可能影响前/早期ADC的宿主免疫应答。

在肺癌中,肿瘤基因突变与独特的分子环境和肿瘤免疫微环境有关。我们接下来要探讨的是EGFR克拉斯,这组ipn中两个最频繁的突变驱动基因。7,与观察到的免疫特征有关。相比较EGFR-突变型或双野生型病变,克拉斯突变型IPNs以免疫基因表达的CD8+T细胞浸润率最高,CD4/CD8 T细胞比例最低,MIF法检测的Treg/CD8+T细胞比率最低,TCR序列分析获得的T细胞克隆性最高(附图)。13A-d),暗示癌基因突变与免疫监视在肺腺癌早期发病中的相互作用。值得注意的是,在这些分子亚型中,TMB和全局甲基化状态是相似的(补充图)。13E,f),与我们以前在侵袭性肺癌方面的研究相一致。37提示这些驱动突变对免疫微环境的潜在影响与全球基因组和甲基化状态无关。

讨论

随着CT引导筛查的日益普及和高分辨率诊断性CT扫描的出现,ipn的检测量急剧增加。38,39,其中许多是肺ADC前驱物。IPN的管理现在以对恶性进展的更清晰的临床认识为指导。为了减少过度治疗,许多IPN现在在没有手术干预的情况下进行成像监视,除非表现出诸如快速生长等具有侵略性的特征。早期肺癌现在可以采用微创手术治疗,这种手术可以耐受,治愈率高,住院时间短,成本低。另一方面,20%的患者可出现多灶性疾病。40这可能代表了亚时性原发性肺癌或肺癌的前兆,使手术复杂化。对于这些患者,外科切除原发性肺癌可以辅之以辅助或化学预防方法。目前的治疗策略将大大受益于对早期肺癌发生的分子机制的更好的了解。

我们目前对早期肺腺瘤性癌变的认识尚不成熟。癌症的进化是由癌细胞和宿主免疫监视之间的相互作用形成的,这是一种称为免疫编辑的过程,包括消除阶段、平衡阶段和逃逸阶段。41。有充分的文献证明,大多数人类癌症都浸润着各种免疫细胞,但通常是在免疫抑制的微环境中,作为免疫编辑的残余证据。41。T细胞免疫即使在Ⅰ期肺癌中也明显受损。37,42表明这些癌症已经开始逃避免疫监视。然而,何时以及如何在肺癌演化过程中发生消除和平衡阶段尚不清楚。研究肺癌前驱物的分子和免疫前景,以阐明早期肺癌发生过程中免疫激活/逃避的时机及其可能的分子机制。

在目前的研究中,我们利用一组相对较大的切除肺ADC前体和可用的基因组和表观遗传图谱数据,通过免疫基因表达谱、MIF和TCR测序来表征正常肺、AAH、AIS、MIA和ADC的免疫背景。总的来说,在晚期病变中有一种更抑制性和更强调控的免疫反应,尤其是T细胞反应,这表明癌症细胞与宿主免疫监视之间的动态相互作用在肺ADC的发病过程中已经演变为免疫逃逸。值得注意的是,免疫背景作为一个连续的过程,从创业AAH到侵袭前AIS,到微创MIA,最后坦率地说是侵袭性ADC。这与从AAH到AIS、MIA和ADC的总体渐进基因组进化是一致的。7提示肺ADC的早期癌变是宿主免疫监测形成的一个渐进过程。这与Mascox和他的同事对肺鳞状细胞癌(Scc)前驱物的类似研究相一致,该研究揭示了随着浸润前scc病变的演变,免疫逃避的证据。43。综上所述,这些数据提倡针对肺癌患者的免疫微环境进行治疗,以防止侵袭性肺癌的发展。根据这些发现,在侵袭性肺癌患者进行强免疫抑制之前,重新规划肺癌患者的肿瘤免疫/炎症微环境可能是有益的。改善肺免疫/炎症微环境的干预措施一直被提出用于肺癌的预防。44在两种临床前模型中都显示出了希望45和病人队列46。前瞻性肺癌免疫预防临床试验,如随机阶段的免疫治疗第二阶段为预防肺癌(印记-肺;NCT 03634241)检测免疫检查点抑制剂(ICIS)的高风险IPN患者目前正在验证这一假设。

识别与免疫激活和免疫逃避相关的分子特征可能有助于为选择可能受益于免疫预防的患者建立生物标志物。例如,克拉斯突变与更活跃的免疫反应相关,而EGFR突变与这组IPN中的冷免疫微环境有关。众所周知,EGFR进展期NSCLCs患者免疫治疗不良反应与突变相关47。然而,目前尚不清楚致癌突变对免疫微环境的影响以及对免疫治疗的反应在完全癌症与肺癌前体中是否不同。来自印染-肺试验的数据,其中ICI被测试在高风险的IPN患者,无论致癌的驱动状态,可能会揭示这个关键的问题,并提供新的洞察力,以指导未来的免疫预防试验。

总体而言,癌基因突变、CNV负担、AI负担和甲基化状态都与IPN中的免疫背景有关,类似于晚期癌症。48,49。然而,与任何单一的基因组或表观遗传特征的相关性很弱,表明在早期肺癌发生过程中,向免疫逃逸方向的异质性但趋同性进化。我们先前的工作表明,早期肺癌的发生可能主要遵循克隆扫描模型,即早期创业中的某些亚克隆在晚期疾病中转化为优势克隆,而不适合的亚克隆被淘汰。7主要由宿主免疫系统。在癌症发生的早期阶段,随机的基因组和表观遗传改变导致具有不同分子特征组合的异质亚克隆,这些特征定义了每个亚克隆的不同生物学特性,包括在选择性免疫压力下的生存能力。值得注意的是,基因组和表观遗传改变对免疫反应的影响是交织在一起的。例如,甲基化可能通过调节免疫基因的表达直接影响免疫反应。50和潜在的新抗原51或者间接增加DNA对CNV和体细胞突变的脆弱性,进而影响免疫微环境。全球低甲基化与CIN有关。52体细胞突变率增加53事实上,在这组病变中,全球甲基化水平与tmb和cnv负担呈负相关。8。因为高的CNV负担与寒冷的免疫微环境有关。29高TMB能提高肿瘤的免疫原性,促进肿瘤细胞的免疫识别和消除。54全球低甲基化(同时伴有高CNV负荷和高TMB)对抗肿瘤免疫的影响是复杂的。最终,亚克隆的生长取决于所有分子像差的累积效应。只有这些细胞结合了分子特征,才能快速增殖和逃避免疫攻击,才能存活下来,成长为侵袭性癌症中的优势克隆。例如,虽然先进的IPN倾向于携带高TMB,从而导致积极的抗肿瘤免疫应答,但它们也表现出更高的CNV负担、更高的HLA LOH事件和降低的全局甲基化,所有这些都与冷肿瘤免疫微环境有关,从而导致晚期IPN中的整体冷免疫微环境。

据我们所知,这是第一个系统的研究免疫景观和相关的分子特征,在不同的组织学阶段,在早期肺腺瘤癌变。然而,本研究具有若干技术和科学上的局限性。从技术角度来看,我们的免疫图谱缺乏高分辨率的T细胞亚型,因为MIF和免疫基因所鉴定的标记数量有限。此外,切除IPN的匮乏和这些IPN的小尺寸阻碍了更全面的分子分析。虽然甲基化数据表明,启动子过度甲基化可能导致新抗原耗尽和免疫逃逸,但这些发现仍然是推测的,因为没有预测的新抗原的转录分析。此外,由于抗体方面的技术挑战,我们无法直接评估MIF的CD4表达。大量研究表明,双阴性(CD3+CD4−CD8−)和双阳性T细胞(CD3+CD4+CD8+)仅构成T淋巴细胞的很小一部分。55,56,57,58,59提示用CD3+CD8−推测CD3+CD4+细胞可以准确表达这些细胞,但仍不理想。随着结合大量标记物的先进技术的出现(即成像质量细胞术)的出现20在这些稀少的标本中,T细胞亚型的相互作用可以在一个更细粒度的水平上进行评估。

除了上述挑战外,由于临床过程不确定和这些病变的生物学复杂性,揭示从创业到侵袭性ADC相关的逐步分子进化在科学上是困难的。首先,在目前的研究和以往有关本课题的大多数研究中,所有的分子和免疫数据都是从切除的IPNs中提取的,这提供了肺ADC进化过程的单一分子快照。虽然从AAH到AIS的线性模型,MIA和侵袭ADC已经被提出用于肺腺瘤性癌变,但是否所有AAH/AIS/MIA最终都进展为侵袭性肺ADC,以及是否所有侵袭ADC都遵循这种线性进化轨迹尚不清楚。其次,癌前/癌细胞和免疫细胞的瘤内异质性不仅存在于完整的肺癌中。26,60,61,62,但也存在于它们的前体中7,63,进一步增加了识别推动肿瘤演化的分子事件的难度。第三,本研究中的所有患者都来自日本和中国;这些发现是否广泛适用于西方人群尚不清楚。面对如此复杂的情况,需要对具有长期随访和纵向活检的更多IPN群体进行国际合作研究,以剖析早期肺腺瘤癌变的演化轨迹及其潜在的分子机制。最后,这些有趣的发现是基于关联而不是直接的因果关系。因此,有必要利用包括人类相关动物模型在内的模型系统进行功能研究,以了解早期肺腺瘤癌变的实际分子机制。


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