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STAT 1结合增强子促进肿瘤相关巨噬细胞NAMPT的表达和功能

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发表时间:2021-05-12 11:24作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

肿瘤相关巨噬细胞反应受影响其功能的不同代谢状态的调节。然而,局部肿瘤微环境中的特异性信号对巨噬细胞代谢的影响仍在研究中。在此,我们发现NAMPT是NAD挽救合成中的限速酶,是干扰素γ激活STAT 1的靶点,γ干扰素是巨噬细胞极化和抗肿瘤反应的重要驱动因子。我们证明了STAT 1在第一个内含子中占据了一个保守的元素。NAMPT,称为NAMPT-调节元件-1(NRE1)。通过破坏NRE 1或药物抑制作用,M1基因的一部分通过其对糖酵解过程的影响而对NAMPT活性敏感。ScRNAseq通过建立一种独特的小鼠品系来分析黑色素瘤肿瘤中NRE1缺乏、与肿瘤相关的白细胞在体内的反应。减少NAMPT在特定的髓系和APC群体中存在炎症基因的表达,而且在巨噬细胞系中靶向消融NRE 1会导致更大的肿瘤负担。最后,高架NAMPT表达与干扰素γ反应及黑色素瘤患者生存相关。本研究鉴定了IFN和STAT 1的诱导性。NAMPT肿瘤相关巨噬细胞是影响肿瘤相关巨噬细胞代谢过程和功能的重要因素。

导言

肿瘤微环境(TME)极其复杂,甚至在肿瘤相关巨噬细胞(TAM)行为的狭窄范围内也是如此。除了典型的免疫激活途径外,其他免疫细胞或肿瘤也会对巨噬细胞代谢网络进行操作和重新编程,这些多方面的变化会影响TAMS显示的抗肿瘤和亲肿瘤表型。最近,控制巨噬细胞代谢状态的关键因素已经被发现,并开始揭示这些联系。1,2,3,4。重要的是,越来越清楚的是,巨噬细胞代谢和炎症信号通路之间的这种动态相互作用是我们理解有效癌症治疗的核心。

γ干扰素(IFNγ)是肿瘤浸润淋巴细胞(如NK和T细胞)产生的一种标志性细胞因子,其活化可通过多种机制抑制肿瘤。5。增强的细胞毒性、抑制血管生成和逆转免疫抑制性髓系细胞功能都被归类为干扰素γ依赖的抗肿瘤活性。6,7,8。尽管如此,tme通常能够将髓系细胞的功能塑造成成瘤前的程序,这通常涉及到对干扰素γ介导的功能的调节。5。因此,TME内的髓样细胞可以存在于从杀瘤到促肿瘤的光谱中。最近的数据也开始将干扰素γ与巨噬细胞代谢的变化联系起来。一项研究表明,干扰素γ通过eIF4E调节mTOR和mNK激酶对翻译起始的调节作用。1。此外,有证据表明,IFNs也能促进有氧糖酵解,尽管它是通过一种不完全被理解的机制来实现的。3,9。干扰素γ和其他促炎信号使巨噬细胞重新编程以促进糖酵解,这似乎对炎症表型的许多方面都是至关重要的。10,11,12。尽管取得了这一重要进展,但关于干扰素如何通过转录依赖机制调节巨噬细胞代谢的研究还不多见。

烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)是启动哺乳动物NAD挽救合成途径的重要限速酶。它在许多人类疾病中表达异常,包括急性肺损伤、糖尿病和类风湿关节炎。13。原被发现为前B细胞集落增强因子14,NAMPT后来被证明能促进免疫细胞的发育、存活和功能。15,16,17。NAMPT挽救途径可以通过药物调控来降低NAD,从而限制肿瘤细胞的代谢。18,19,或提高NAD水平以保护神经。20. NAMPT是普遍表达的,但也被证明在对炎症刺激的反应中增加到更高的水平。21,22。然而,围绕这种上调的机制,以及这种诱导在TME中的生物学后果,仍在研究之中。

尽管对细胞活力至关重要,但组织特异性基因敲除和抑制策略已被应用于NAMPT功能的表征。例如,最近使用驱动程序删除NAMPT在髓系细胞中特异性编码序列,虽然改变了某些细胞的免疫功能,但只导致NAMPT蛋白水平略有下降。23。这可能反映了完全缺失与细胞存活之间的冲突导致的不完全消融。到目前为止,还没有研究诱导性相关性的现有模型。NAMPT基因表达而不改变基线和基本功能。这样的模型将揭示出对…的作用的更深入的了解。NAMPT抗肿瘤免疫过程中巨噬细胞和其他免疫细胞的表达。

在这里,我们寻找以前未知的机制,通过干扰素γ信号调节TAM代谢。通过对WT和IFNγ受体(IFNγR)缺乏的小鼠的肿瘤细胞进行rna-seq,并与rps/IFNγ刺激的骨髓巨噬细胞(Bmms)进行比较,我们确定了一部分代谢基因,包括NAMPT,是通过干扰素依赖的过程被强上调的。我们描述了一种机制NAMPT在小鼠和人髓系细胞中,通过直接在体内占有我们在第一个内含子中发现的未被识别的保守元件而在小鼠和人髓系细胞中诱导。NAMPT,称为NAMPT调节元件-1(Nre 1),与NAMPT启动子。通过NRE 1的缺失和NAMPT的药理抑制作用,我们证明了IFNs诱导NAMPT通过NRE 1,一个关键的过程,有氧糖酵解和表达的炎症基因子集。应用单细胞RNA-Seq技术,分析造血细胞中缺乏NRE 1区的小鼠肿瘤浸润免疫细胞,发现单核细胞和APC细胞存在炎症和代谢缺陷,肿瘤生长控制不良。在有针对性地删除此调控区域时NAMPT在包括TAMS在内的特定髓系细胞中,我们观察到控制黑色素瘤肿瘤的能力明显丧失。最后,来自癌症基因组图谱(TCGA)数据库的人类临床数据揭示了NAMPT黑色素瘤和其他肿瘤的表达、免疫特征、炎症状态和患者生存。总之,我们的研究确认了依赖于统计的NAMPT诱导是一种调节巨噬细胞代谢变化及其功能的机制,并扩展了我们对干扰素γ如何促进TMS在TME中的作用的理解。

结果

NAMPTTAMS中IFN通过Jak/STAT 1信号转导上调

为了鉴定巨噬细胞在对干扰素γ的反应过程中的代谢调节因子,我们从WT和IFNγR中分离了tams。−/−同基因B16f10黑色素瘤小鼠(附图)1A)进行RNA测序,并将KEGG途径数据集中的代谢基因与体外刺激的原鼠BMMS数据进行比较。12个代谢基因,包括NAMPT,无论是在WT TME的TAMS内,还是在体外受到LPS/IFNγ的刺激,其表达均明显上调(图1)。1A). NAMPTTams需要完整的IFN-γR信号通路,只有在LPS/IFN-γ(“M1”条件下)刺激,而不是IL-4(“M2”条件)刺激下才能产生。NAMPTBMMS中的上调(图1.1B)。如所料,用lps/IFNγ或IL-4刺激bmms可导致m1的表达。NOS 2(一氧化氮合酶2),或抗炎M2标记物。Arg 1(精氨酸酶1),由这些群体分别(图1)。1C). NAMPT在原代BMMS中,mRNA是通过多种炎症刺激而诱导的,尤其是那些已知能诱导IFN自分泌/旁分泌信号的(图1)。1D)。我们注意到NAMPT在mRNA和蛋白质水平上,用BmMS中的Northern和westernblots单独刺激干扰素γ(图1)。1E,f).

图1:NAMPT在M1巨噬细胞和TAMS中被IFN和TLR配体上调。
figure1

a表显示来自bmmLPS/IFNγ与培养基处理细胞和WT与IFNγR的前12位基因。−/−这种M1刺激显着地提高了TAMs,或在WT TAMS中显著升高。原木2Fc日志(基2)的表达式折叠变化,FDR错误发现率。bFPKMNAMPT中描述的测序实验a。补充图中提供的流式细胞术分类净化门控策略。1A. cFPKMNOS 2Arg 1M1刺激(LPS/IFNγ)与M2刺激(IL-4)BMMS。错误条表示扫描电镜N=3,或范围N=2个独立的RNA-seq样品。dQPCRNAMPT在BMMS中,用所指示的PAMPs刺激6h。eNorthernblot分析NAMPT干扰素γ刺激B6WT小鼠BMMS。尺寸标记在kB中。f用干扰素γ处理BMMS 24 h后,NAMPT的westernblot检测,大小标记均为kDAL。g表达NAMPT在BMMS中,以一定浓度的鲁克索利替尼治疗,无论是否有干扰素γ刺激。h NAMPT在264.7细胞中表达,其中STAT 1的表达通过CRISPR/Cas9靶向STAT 1(STAT 1 CR)或非靶向对照(WT EV)被删除。i264.7细胞株NAMPT、STAT 1和肌动蛋白的Westernblot分析c. j NAMPT, k IL6,和l CXCL 10中描述的细胞mRNA表达h用所指示的PAMP刺激6h WT EV。STAT 1+非目标控制或STAT 1通过CRISPR/Cas9目标定位的−CR缺失被指定在x-STAT 1+轴或−轴。数据代表至少三个独立的实验,但rna-seq的结果除外。ad, j(两个独立的实验)。错误条表示扫描电镜N=3个生物独立样本。p数值是由两尾未配对确定的。t-测试:*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0005, ****p < 0.00005. EV non-targeting CRISPR gRNA control. Uncropped images provided in Source Data file in Supplementary information.

接下来,我们要确定诱导性调控所需的上游信号通路。NAMPT对干扰素γ的反应。升华NAMPT作为对干扰素γ的反应,原发性BMMS在刺激后1小时内发生,并持续了至少48小时(补充图)。1B),暗示转录因子的参与能够迅速提高NAMPT。Jak/Stat信号通路是干扰素γ下游已知的一条信号通路,我们推测它将参与调控。NAMPT表情。为了验证这一点,我们首先使用jak 1/jak 2抑制剂ruxolitinib,观察了该药物对NAMPT在干扰素γ刺激的BMMS中的表达(图)。1g)。然后,我们用crispr/ca 9技术从小鼠巨噬细胞原始的264.7细胞中删除了STAT 1蛋白,发现这种转录因子是干扰素诱导的γ在小鼠巨噬细胞中增加所必需的。NAMPTMRNA和蛋白的表达,但不作为基线表达NAMPT(无花果。1h,i)。这些STAT 1相关效应NAMPT与标准STAT 1靶标CXCL 10平行。1C,D)。此外,增加了NAMPT作为对脂多糖的反应,干扰素γ、脂多糖/干扰素γ组合和干扰素β也需要完整的STAT 1信号(如图所示)。1J)。作为对照,归纳为IL6未受到STAT 1丢失的显著影响(图1)。1K)。促炎细胞因子基因IL6以依赖TLR 4-NF-κB通路的方式被LPS强烈诱导。24,但在高脂多糖剂量下,这种诱导确实显示出一定程度的STAT 1依赖性(如图所示)。1K)。此外,CXCL 10激活,直接需要STAT 1,是强烈减少(图一)。1L)。这些数据表明Jak/Stat通路在调控NAMPT表达中起着重要作用,同时也表明了STAT 1在NAMPT表达中的作用。NAMPT对一系列炎症刺激的反应。

NRE 1是一个调控干扰素γ介导的内含子STAT 1位点。NAMPT感应

虽然我们和其他人已经注意到在整个启动子区域有许多潜在的STAT 1 dna结合位点,这可能是干扰素γ诱导表达的原因之一。NAMPT25在没有任何功能相关性的情况下,这种短序列模式也渗透到基因组中。然而,善意STAT 1-调控的基因也具有类似的同源基序,不能立即与非功能序列区分开来。因此,我们对编程中的STAT 1活动进行了更深入的分析。NAMPT干扰素γ依赖性诱导。使用Jaspar26扫描所有潜在的调控区域。NAMPT,我们在它的第一个内含子中鉴定了几个STAT 1基序。我们进一步观察到基于rna-seq读图到第一个内含子的转录水平升高。NAMPT在原代BMMS中,用LPS/IFN刺激,γ(补充图)。2A),与增强子的活性一致。来确定这个内含子区域是否在调节NAMPT通过作为一个真正的转录增强子,我们利用携带sgRNAs的crispr/ca 9结构来表达。NAMPT在原始的264.7细胞中,我们称之为NRE1(图1)。2A)。该方法建立了具有NRE 1缺失和突变的克隆群体,并通过对基因组PCR产物的Sanger测序进行了验证(附图)。2B)。NRE1缺失克隆表达正常基线水平NAMPT但却削弱了提升的能力NAMPT干扰素γ/LPS刺激后的mRNA和蛋白水平(如图所示)。2B、c)。这也是在干扰素γ的条件下看到的(补充图)。2C),删除CRISPR/Cas9STAT 1作为可诱导性的控制NAMPT。重要的是,Northernblot分析没有发现NAMPTNRE1CRISPR/Cas9克隆的mRNA亚型与对照克隆比较,表明突变位点正常剪接(附图)。二维空间)。与干扰素γ诱导能力丧失的关系NAMPT在不存在NRE 1的情况下,用液相色谱-质谱法(LC-MS)测定这些细胞中NAD+的丰度也显著降低(附图)。2E).

图2:干扰素γ诱导表达NAMPT通过NRE 1进入巨噬细胞。
figure2

a的第一个内含子的原理图NAMPT,它包含我们所说的STAT 1结合位点,我们称之为NRE 1。CRISPR/Cas9-介导的该位点的缺失由所指示的结构(CR1,CR2)完成。bQPCRNAMPTEV-WT克隆和NRE1CR克隆在LPS/IFNγ刺激下表达6h。cLPS/IFNγ作用24h后,标记细胞的Westernblot检测,大小标记均在kB中。d第一内含子内STAT 1结合位点的保守性NAMPT. e用qPCR方法对264.7株STAT1EV细胞和264.7株STAT 1细胞进行染色质免疫沉淀分析。fCRISPR介导的STAT 1结合位点(BS)缺失的原理图NAMPT. gRt-qPCR检测NAMPTRAW 264.7 STAT1BS CR细胞和对照组NRE 1的STAT1BS区,用干扰素γ刺激或不刺激6h。h 黄花将(NanoLuc)荧光素酶报告载体(EV)、含有STAT 1结合位点(SBS)的WT NRE片段或置乱的STAT 1结合位点(SBS-m)导入264.7细胞,经干扰素γ处理或单独培养。由此产生的发光被测量和归一化相对于共换能器。菲蒂纳斯荧光素酶阳性对照。为b, e, g, h,所提供的结果是N=3次生物复制,代表至少三个独立实验。p数值是由两尾未配对确定的。t-测试:*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0005, ****p < 0.00005. Error bars represent SEM. EV non-targeting CRISPR gRNA control. Uncropped images and raw scans provided in Source Data file in Supplementary information.

接下来,我们假设nre 1包含STAT 1所需的一个结合位点,用于编程诱导上调NAMPT在IFN-γ刺激过程中。这一区域的保守性分析揭示了包括人类在内的多种哺乳动物物种之间的双重相邻STAT 1结合位点(SBS)。二维空间)。虽然在整个6kBNRE1与基因组中的任何其他区域没有广泛的同源性,但与NRE1中类似的保守的最小STAT 1结合基序很容易在其他IFN协调调控基因的调控区域中被识别出来。RAW 264.7巨噬细胞中STAT 1相关dna的染色质免疫共沉淀(芯片)显示了该区域,位于第1外显子下游的~800个碱基对。NAMPT,在干扰素γ刺激的细胞中,STAT 1的占用率增加,而这依赖于STAT 1的表达(如图所示)。2E)。我们只看到STAT 1的基础水平在其他推测的SBS在NRE 1或启动子区域。因此,我们设计了一个双重的sgRNA CRISPR/Cas9靶向结构(STAT 1 BS CR),删除含有双STAT 1基序(SBS)的NRE 1的小(78 Bp)区域,芯片观察到STAT 1结合量增加幅度最大(图1)。2F)。该区域经证实缺失和/或突变的细胞克隆在诱导能力上存在缺陷。NAMPT对干扰素γ的反应(图1)。2G)。将该区域克隆到异位荧光素酶报告质粒中,在原264.7巨噬细胞中表达干扰素γ应答荧光素酶,然后用一个置乱序列取代该片段中的。2H)。这些结果表明,nre 1含有一个SBS,它有助于诱导上调NAMPT用干扰素γ。

NAMPT酶抑制抑制干扰素γ介导的炎症反应

我们探讨了巨噬细胞经IFN诱导后NAMPT的作用。用rna-seq对经干扰素γ处理的bmms和研究药物fk 866进行了研究。fk 866是一种nmpt抑制剂,已被证明能阻断nmn的产生,而nmn是NAD的直接前驱物。18,19。结果表明,这种抑制NAMPT可导致炎症反应、肿瘤坏死因子α信号的表达减少,也可引起正常情况下因干扰素γ而引起的糖酵解途径(如图所示)。3A)。这些通路的缺陷诱导通过将NAMPT的直接产物NMN进一步纳入到其他相同的实验环境中而获救(见图)。3B)。在FK 866抑制的NAMPT存在下,干扰素γ反应基因本身也有明显的改变。3A和V.B)。NMN的加入部分恢复了对干扰素γ反应基因的诱导,该基因集于干扰素γ单独治疗中所见(补充图)。3C),提示干扰素γ程序的许多方面受到NAMPT产生的NAD的影响,包括糖酵解的上调。

图3:在干扰素γ反应过程中,炎症表达程序需要NAMPT。
figure3

a在γ和(或)FK 866和NMN存在下,对原代BMMS进行RNA-seq检测。炎症和糖酵解通路的GSEA信号,显示在FK 866 NAMPT抑制剂的存在下,其干扰素依赖的诱导作用降低的基因的富集。b相同的谷胱甘肽能抑制NMN对FK 866的抑制作用。为a, b,NES归一化富集评分,p[医]调整后p数值:双尾,校正为多次比较使用本雅明-霍奇伯格方法。cLPS/IFNγ刺激下FK 866存在时所指示的炎症基因的RT-qPCR表达。d流式细胞仪测定细胞表面CCR 1的平均荧光强度。eIL-6细胞因子经酶联免疫吸附试验(ELISA)测定24h后,用纯化标准稀释法测定。f用Griess法测定培养液中NO的分泌e。为cf,所提供的结果是N=3次生物复制,代表至少三个独立实验。p数值是由两尾未配对确定的。t-测试:*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0005, ****p < 0.00005. Error bars represent SEM.

为了更定量地分析NAMPT和NAD依赖的过程对m1巨噬细胞活化的依赖性,我们评估了m1巨噬细胞的活化过程。IL6, IL12b(IL-12p40)和几个编码其他炎症因子的基因在他们对脂多糖/干扰素γ的反应中。我们观察到FK 866处理后其诱导率降低,与经典激活的M1巨噬细胞反应过程中NAMPT产生NAD的作用一致(图1)。3C)。在可诱导表达受FK 866影响的基因中,CCR 1,编码一种对免疫细胞向炎症部位募集的重要细胞表面受体。27,28.

应用流式细胞术,我们发现FK 866也以剂量依赖性的方式降低CCR 1细胞表面丰度水平。三维空间)。然而,外源性NMN能使CCR 1水平恢复正常,即使在抑制剂增加的情况下也是如此。这种作用是特殊的,因为相关受体CCR 2的细胞表面表达在同一样本中不受这些处理的影响(补充图)。三维空间)。ELISA法检测BMMS分泌的促炎细胞因子IL-6在抑制NAMPT的情况下,也显示了LPS/IFNγ的弱诱导作用。3E),而作为巨噬细胞炎症反应标志之一的一氧化氮的诱导分泌也明显减少(如图所示)。3F)。为了验证FK 866的剂量是否能有效地降低干扰素γ刺激的高水平NAD,但也没有引起毒性效应,在FK 866剂量增加时,基于LC-MS的NAD+测定表明,FK 866的无毒浓度能够抑制IFNγ诱导的NAMPT活性水平(补充图)。3e,F).

BMMS中NRE1缺失降低干扰素γ诱导NAMPT依赖程序

为了进一步研究干扰素γ作用下巨噬细胞对STAT 1的激活作用,我们建立了NRE 1序列的小鼠模型。该等位基因允许在体内解耦IFN依赖性的调节。NAMPT任何细胞类型的全球统计驱动的炎症程序。然后将这条线划到Vav-CRE小鼠身上,删除造血细胞中的NRE 1(如图所示)。4A)。PCR和RT-qPCR证实了LoxP位点的适当插入和NRE 1的组织特异性缺失(图1)。4A,b)。取骨髓和对照组小鼠,体外产生BMMS。当我们用干扰素γ刺激这些细胞时,我们发现NAMPT在mRNA和蛋白水平降低(图1)。4C,d),和能力提高NAD+产生的反应干扰素γ同样是有缺陷的(补充图。4A)。在M1激活条件下,用脂多糖和干扰素γ也观察到了对NRE 1的这一要求(如图所示)。4E)。此外,我们还发现,用干扰素γ或lps/γ治疗nre 1缺陷型bmms,可显著降低bmms的表达。CCR 1,IL6,IL12b,随着趋势的减少MiR 155以及其他促炎症因子基因。4F,g),表示NAMPT活动可能影响M1程序的亚群,但不是所有方面的炎症在巨噬细胞。可能还有其他尚未特征化的依赖于STAT 1的激活元件NAMPT,此外,这些重要的炎症反应基因除了可诱导外,还受多种信号通路的控制。NAMPT/NAD依赖性激活。然而,总的来说,这些实验揭示了nre 1在调控中的作用。NAMPT原代巨噬细胞IFN反应过程中炎症基因的表达和表达。

图4:NRE1缺失降低了NAMPT的诱导和脂多糖/干扰素γ的炎症反应。
figure4

aNRE1 CRE-lox基因敲除方案:在浮动等位基因和缺失等位基因中显示与STAT 1一致位点相结合的插入的氧氟沙星位点,CRISPR缺失等位基因,以及LoxP检测引物。具有代表性的琼脂糖凝胶显示了巨噬细胞的PCR产物,用所指示的引物显示了与WT(非氟化)NRE 1相关的每个LoxP位点,并从Vav-CRE NRE1 fl/fl(NRE1-KO)原代骨髓巨噬细胞中产生了缺失连接产物。尺寸标记在BP上。b从所指示的巨噬细胞RNA中提取的RT-qPCR显示缺失中缺乏NRE 1信号。c成熟NAMPT用RT-qPCR方法检测干扰素γ处理的WT和NRE1-KO巨噬细胞RNA的mRNA表达。d对不同基因型小鼠多重干扰素、γ或未处理巨噬细胞培养物的Western分析显示,与肌动蛋白对照相比,NAMPT蛋白具有较低的诱导率。e成熟NAMPT在Vav-CREnRE1fl/fl(NRE1-KO)巨噬细胞中,在无NRE1的情况下,γ的表达减弱。f用RT-qPCR方法检测干扰素γ作用于WT和NRE1-KO巨噬细胞RNA中CCR1mRNA的表达.g用RT-qPCR方法检测IFN、γ和LPS处理的WT和NRE1-KO巨噬细胞RNA的炎症和糖酵解途径基因的mRNA表达。为b, c, eg,所提供的结果是N=3次生物复制,代表至少三个独立实验。p数值是由两尾未配对确定的。t-测试:*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0005, ****p < 0.00005. Error bars represent SEM. Uncropped images and raw scans provided in Source Data file in Supplementary information.

诱导的NAMPT/NAD驱动脂多糖/干扰素γ依赖的糖酵解和tca循环

归纳之间的相互作用NAMPT,通过进一步表征糖酵解对糖酵解的特殊要求,研究了糖酵解的经典m1模式激活。NAMPT脂多糖/干扰素γ诱导过程中的活性。用胞外酸化率(ECAR)测定乳酸产量来评价糖酵解活性,发现在FK 866存在下,脂多糖/干扰素γ激活的BMMS的糖酵解能力明显降低,糖酵解率和糖酵解能力几乎不存在(图1)。5A).

图5:脂多糖/干扰素γ诱导的糖酵解所需的NAMPT酶功能。
figure5

a糖酵解应激试验显示,用细胞外酸化率(ECAR)测定了脂多糖/干扰素、γ和FK 866联合治疗BMMS的分泌乳酸。错误条表示扫描电镜N=10个生物复制体。b脂多糖/干扰素、γ和FK 866联合治疗BMMS的糖酵解和TCA周期中间代谢产物。上值Y-轴为原木2脂多糖/干扰素γ的比值可使代谢产物的代谢水平与单纯的非诱导培养基(黑色)或仅含FK 866的培养基(红色)的代谢水平趋于一致。蓝色背景表示需要GAPDH步骤的第一个NAD之前的步骤,红色背景表示GAPDH之后的步骤。X轴类是代谢物,按通路顺序排列,如附图所示。5A86。FK 866对诱导的影响的统计学意义见附图。5B. c用RT-qPCR方法检测LPS/IFNγ和FK 866联合作用后,小鼠单个糖酵解基因的表达水平,显示FK 866抑制NAMPT诱导表达的减少。d相同的糖酵解基因组成员的表达c仅从VaV-CRE或VaV-CRENRE1fl/fl(NRE1-KO)巨噬细胞RNA经脂多糖/干扰素γ处理后,在无NRE 1的情况下失去诱导作用。e诱导性糖酵解f在糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖的存在下,炎症基因的表达消失.所提供的结果是N=3个生物复制体。除了a, b, e, f,数据代表至少三个独立的实验。为bf,所提供的结果是N=3个生物复制体。p数值是由两尾未配对确定的。t-测试:*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0005, ****p < 0.00005. Error bars represent SEM.

为了更准确地描述由诱导NAMPT活性丧失所影响的葡萄糖利用和随后能量代谢的酶促步骤,我们采用气相色谱-质谱(GC-MS)方法对脂多糖/干扰素γ和FK 866联合处理的BMMS代谢组学进行了分析,分析了糖酵解和TCA循环中间体(图1)。5B和补充图。5一个,B)。单用脂多糖/干扰素γ或脂多糖/干扰素γ和FK 866同时测定代谢物的水平,分别与单纯培养基或FK 866单用组比较(见图)。5B)。检测到葡萄糖分解中间体产生于GAPDH酶催化的糖酵解步骤上游,包括G-6-P和Dhap(见附图)。5A),FK 866处理的M1激活BMMS相对于正常培养基积累到较高水平。我们认为这是由于GAPDH是这一途径中最早的酶,需要NAD,并且FK 866依赖于NAD的减少抑制在激活的对照细胞中观察到的正常有效的底物转换。然而,GAPDH下游的中间产物,包括丙酮酸和细胞内乳酸,在NAMPT的抑制作用下未能积累到正常水平。在缺乏正常NAMPT活性的TCA周期中间体和产品中,M1激活的BMMS中的代谢物水平减弱的模式也是如此,在另外需要NAD的步骤中也是如此。这些代谢物包括柠檬酸盐,琥珀酸酯,一种用于天然免疫信号传递的分子。29,以及衣康酸,IRG 1催化转化tca中间体的产物。顺式-乌头,通过抑制TCA循环的后续步骤,参与调节巨噬细胞炎症ROS的产生。30(见附图。5A)。这些结果表明干扰素γ激活的巨噬细胞在糖酵解过程中NAMPT的产生具有重要作用。

我们接下来需要验证的是,这些代谢组学结果显示了整个呼吸和糖酵解过程中的缺陷,同时也证明了整个代谢表型的结果。此外,我们还试图测试单用干扰素γ诱导的代谢重编程是否同样依赖于同样的NAMPT依赖的NAD产生,就像用LPS和IFNγ发现的那样。因此,我们对干扰素γ处理的细胞进行氧消耗率分析,利用线粒体应力测试。我们的数据表明,在线粒体γ产生过程中,BMMS的IFN-γ激活会引起OCR的增加,这也依赖于完全的NAMPT活性(补充图)。5D),这种增加是对FK 866抑制的剂量反应。FK 866存在时,LPS/IFNγ对WT BMMS的激活也显示RT-qPCR检测到糖酵解通路基因的诱导功能受损。5C)。LPS/IFNγ处理含nre 1的bmms(对照组)或vv-cre缺失的纯合nre 1基因敲除等位基因,证明有诱导作用。NAMPT增加糖酵解基因的表达。5D)。为了比较FK 866与直接抑制糖酵解过程中的基因表达差异,我们还在己糖激酶抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-dg)存在下测定了wtbms激活后的基因表达。31,32。我们观察到糖酵解通路基因激活的减少。5E)除脂多糖/干扰素γ诱导的炎症因子外(图1)。5F)。这些结果模拟了FK 866的作用,证实了NAMPT支持的糖酵解促进巨噬细胞炎症基因表达的作用。

STAT 1诱导NAMPT支持小鼠黑色素瘤模型的髓鞘功能

为了探讨NAMPT在体内肿瘤环境中诱导表达的作用,将携带具有广泛造血系特异性缺失驱动子Vav-cre的纯合子nre 1浮动等位基因的小鼠,或其不含cre基因的nre 1杂合突变体小鼠皮下接种b16f10-卵形黑色素瘤细胞。33形成侧部肿瘤。造血细胞钝诱导小鼠NAMPT由于组织特异性缺失,NRE1有较大的肿瘤(如图所示)。6A)。为评价肿瘤浸润免疫细胞的nre 1依赖性功能,并确定哪些特异性免疫亚群与nre 1依赖的肿瘤控制有关,采用流式细胞术(FACS)从wt和nre 1-ko小鼠中分离出CD 45阳性细胞,进行单细胞RNA测序(ScRNAseq),然后用Seurat和自行开发的方法进行分析。34,35计算平台。图形6B用均匀流形近似和投影比较图说明多维基因表达谱从每种基因型中识别出的细胞类型。35,36。“补充数据”中完整描述了标记基因作为分类标准来划分聚类,包括表达水平、频率和意义1。在免疫基因组计划(ImmGen)数据库中,利用转录组范围的相似性和已知的小鼠免疫细胞亚群,共鉴定和注释了18个单细胞簇。37。通过差异表达分析来区分密切相关的细胞群,包括Nr4a1中不同的单核细胞群和类似的功能相关基因(与经典和非经典单核细胞表型一致)、S100A9状态分类的粒细胞簇、按CXCL 4水平分类的巨噬细胞,以及根据细胞因子和趋化因子及其受体等多个标记基因的表达而指定的树突状细胞类型。两种基因型的肿瘤在免疫细胞类型上分布相似,特别是单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞的丰度没有显著差异,某些其他细胞类型的相对细胞数量变化不大(附图)。6一个,B)。对于大多数髓系细胞和APC细胞群体来说,NRE 1的缺失导致细胞数量减少。NAMPT表达式(图1.6C),与使用这些小鼠系BMMS的体外结果一致。进一步分析其中两种细胞类型Nr4a1阳性单核细胞(与非经典单核细胞谱一致)和成熟树突状细胞的基因表达谱在WT和NRE1-KO之间有显着性差异。与NRE1-KO相比,WT样品有几条促炎和促糖酵解途径(图1)。6d)。其他细胞NAMPT改变也显示部分富集在某些途径,包括亲糖酵解的mTORC 1信号基因集(补充图)。6E)。测量NAMPT其他所有细胞簇中的表达水平在以下情况下没有显着性差异NAMPT可在大量细胞中检测到(补充图)。六小时)。此外,还利用基因本体(GO)对WT和NRE1-KO样本中所有识别的聚类进行了综合表达分析,并在补充数据中显示了所有结果。2和补充数据3。总体而言,上述数据表明了一种方案,在该方案中,干扰素γ/STAT诱导水平为NAMPT支持需要骨髓和APC细胞类型的代谢和炎症反应来抑制恶性肿瘤。这些差异在造血细胞存在广泛缺失的NRE1小鼠身上,包括肿瘤免疫功能阳性和阴性的多种细胞类型,以及免疫发育的不同阶段。例如,具有亲和抗炎特征的巨噬细胞。38,39在TME中共存。与我们关于NRE1在骨髓巨噬细胞中的重要性的其他发现一致。NAMPT对干扰素γ的反应,scRNAseq的结果指导我们假设在TAM中NRE1调节抗肿瘤功能。

图6:STAT 1-诱导型NAMPT在B16F10黑色素瘤的造血谱系中。
figure6

aB16F10-卵黑色素瘤细胞株(见“方法”)在WT或VaV-CRE NRE1fl/fl(NRE1-KO)小鼠中的生长速度和终点质量。b用UMAP图分析Wt或NRE1KO小鼠B16F10-卵细胞中CD 45+细胞的scRNAseq细胞聚类分析。补充图中提供的流式细胞术分类净化门控策略。6,以及补充信息中的源数据文件。c NAMPT在WT或NRE1KO小鼠scRNAseq细胞中的表达。盒晶须图显示了基因在单个细胞中的分布,红点表示样本内细胞的平均表达量。横梁、盒子和胡须分别代表NAMPT表达的中位数、四分位数范围和总范围。dSscRNAseq所指示的细胞类型中的促炎症和代谢的GSEA信号,相对于右侧的NRE1KO,每个区域左侧的基因集在野生型中正富集。归一化浓缩分数,p[医]调整后p数值:双尾,校正为多次比较使用本雅明-霍奇伯格方法。eB16F10-卵在WT或LysM-CRE NRE1fl/fl(NRE1-KO)小鼠的肿瘤大小、生长速率和终点质量。除了bd,数据是三个独立实验的代表。结果显示至少有四个生物复制的平均值。为a,所提供的结果是N=9或15次生物复制e, N=10或15次复制,至少代表两个独立实验。p数值是由两尾未配对确定的。t-测试:*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0005, ****p < 0.00005. Error bars represent SEM.

为了更直接地验证这一点,我们构建了带有巨噬细胞选择性缺失驱动子LysM-CRE的纯合子NRE 1的小鼠品系。这些或其NRE1不含CRE的小白蚁再次接种上述B16F10-卵细胞。图形6E结果表明,干扰素对小鼠巨噬细胞的γ依赖性诱导作用减弱。NAMPT其控制黑色素瘤生长的能力明显不足,无论是生长速度还是最终肿瘤肿块。流式细胞术分析这些肿瘤中的巨噬细胞,无论基因型如何,也显示出相似的比例(补充图)。6f),表明TAM功能而不是丰度是重要的。巨噬细胞NRE1在肿瘤控制中的要求也可能适用于其他恶性肿瘤,因为在LysM-CRE NRE1 FLOX缺失背景下,MC-38-卵子结肠腺癌衍生的皮下侧翼肿瘤的肿瘤负担也有类似的增加(补充图1)。6g)。这些观察结果与NAMPTNRE1作为TAMS在干扰素γ/STAT驱动的抗肿瘤计划中的关键控制点。

NAMPT干扰素γ表达与人黑色素瘤预后的关系

由于恶性肿瘤常被来源于髓系的天然免疫细胞浸润,其极化特征和功能状态影响疾病的进展,因此,我们对免疫细胞的作用进行了研究。NAMPTIFN/STAT在人黑色素瘤TME中的诱导作用。我们首先评估了几个人巨噬细胞株,它们对干扰素γ的反应都是通过上调而产生的。NAMPT表达式(图1.7A),与阳性对照干扰素γ靶平行。CXCL 10引导我们研究这种代谢酶在调节人类肿瘤相关免疫反应中的作用。

图7:人体免疫之间的相关性NAMPT、恶性肿瘤、炎症和预后。
figure7

aQPCRNAMPT用干扰素γ和hs刺激6 h的人髓系细胞。CXCL 10感应作为感应的对照。数据是N=3次生物复制,代表至少三个独立实验。p数值是由两尾未配对确定的。t-测试:*p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0005, ****p < 0.00005. Error bars represent SEM. bTcga 30年(左)或头10年(右)黑色素瘤患者生存数据的Kaplan-Meier图显示中位分割曲线。NAMPT表达率,也就是肿瘤组织中表达率最高的和最低的50%。NAMPT表情。正确的地块来自进一步分层的数据,无论是最高的还是最低的10%。NAMPT表达水平和细胞学分类为高免疫浸润和低免疫浸润。p值在图形面板中报告,以了解高和低之间的差异。NAMPT表达图的角蛋白签名或免疫签名丰富的样本,并来自对数等级(曼特尔-考克斯)检验。c年TCGA黑色素瘤基因表达数据指示通路的GSEA分析b。基因等级顺序是通过比较每个基因在高与低样本之间的表达来确定的。NAMPT水平。归一化浓缩分数,p[医]调整后p数值:双尾,校正为多次比较使用本雅明-霍奇伯格方法。b, c基于463名患者的数据。dTCGA、SKCM黑色素瘤组NAMPT表达水平及巨噬细胞亚型的中间特征分析表明,免疫丰富肿瘤中NAMPT丰度与炎性巨噬细胞基因表达谱(M1、中间)呈显著正相关。e二甲苯特征分析NAMPT与干扰素γ诱导的多个肿瘤类型的反应相关的表达水平。y轴显示Pearson相关值。为d, e, p从两个变量之间的正斜率的检验来看,数值是双尾的.

对人黑色素瘤肿瘤资料进行生存、免疫细胞浸润程度的分析。NAMPT皮肤黑色素瘤(SKCM)采集中肿瘤活检组织中的表达水平。使用完整数据集的长期患者生存频率与NAMPT当使用Kaplan-Meier估计值进行分析时,表达高于中位表达的患者在统计学上比肿瘤中低于中位表达的患者的生存期更长(图1)。7b)。为了评估NAMPT在肿瘤相关免疫细胞中的表达,这些数据被进一步分层。NAMPT高免疫浸润的肿瘤和表达水平(用免疫相关基因的表达特征来评估)40)与免疫低下(反之,高表达与肿瘤相关的基因,如角蛋白)。10年生存率数据显示,免疫低下的肿瘤与预期的预后不良有关,NAMPT表达水平与预后无明显差异。相反,虽然被免疫细胞浸润程度较高的肿瘤与较好的疾病预后相关,但更高。NAMPT在那些免疫功能丰富的肿瘤中,表达与预后越来越好的趋势有关。更严格的分层地块区分最高和最低的10%NAMPT患者群体中的表达水平列在补充图中。7A-C。虽然这些曲线中的数据点较少,但由于免疫浸润和高度免疫,存活的差异很大。NAMPT表达更显着。利用GSEA对这些TCGA肿瘤标本的基因表达谱进行了高与低的分析。NAMPT表达,我们观察到两种促炎症(包括干扰素γ反应基因)的增加,以及与更高水平相关的糖酵解特征。NAMPT表达式(图1.7C)。当我们检查NAMPT与以前报道的肿瘤内巨噬细胞亚群间烯特征相关的表达34,41,42,我们注意到NAMPT免疫增强黑色素瘤中的m1巨噬细胞信号,进一步支持了干扰素γ诱导的tam的功能作用。NAMPT抗肿瘤免疫(图1)。7D)。此外,TCGA黑色素瘤样本间呈显著正相关。NAMPTIFNG表达,更广泛地说,在NAMPT相对于GSEA,Hallmark,IFN,γ反应基因的水平(图)。7E)。最后,当分析tcga中的所有恶性肿瘤类型时,将其与干扰素γ诱导的偏二烯信号进行相关性分析。NAMPT表达,许多其他癌症表现出相似的,如果不是更强的正相关。综合来看,这些临床数据表明NAMPTTME的表达与免疫浸润增加、炎症状态增加相一致,可支持减少的疾病。

讨论

在小鼠中,全身缺失NAMPT对胚胎致死性的研究,同时利用组织特异性cre和FLOX进行研究。NAMPT等位基因已经证明了NAMPT各种细胞类型的生存和功能15,43,44,45。然而,迄今为止,在疾病状态下,如何在不破坏基础NAMPT功能的情况下处理上调NAMPT的相关性一直是一个挑战。在我们的研究中,我们对诱导性的调节和功能有了批判性的洞察力。NAMPT在γ激活巨噬细胞过程中,通过对NRE 1的鉴定和缺失,使我们能够从基础的NAMPT功能中启动不可诱导的偶联。我们的工作表明了增加工作的重要作用。NAMPT在促进糖酵解和随后的最佳炎症基因表达的TAM和其他APC类型。

NAMPT在多种人类炎症性疾病和癌症中被上调,因此在考虑改善治疗目标以治疗这类疾病时,它是一个令人感兴趣的基因。13,46,47。然而,转录调控NAMPT在先天免疫细胞中,大部分是未被研究过的,大部分的工作都是在NAMPT转录调节仅限于其他类型的细胞。在肺内皮细胞中,发现机械应激和LPS暴露导致启动子甲基化降低,STAT 5依赖增加。NAMPT表达48,49. NAMPT也能通过胰腺β细胞来促进胰岛素的分泌。50由NCOA 6,SREBP-1编程,并与启动子区域内的甾醇调节元件相互作用。NAMPT51. NAMPT也被证明是由sirt 1转录调控的,而nmpt依赖的nod是辅酶,它是通过与电子盒元素的相互作用而被调控的。NAMPT启动子52,53.

我们最近发现了一个位于第一个内含子内的保守SBS,并对其功能进行了表征。NAMPT。STAT 1对炎症信号的占有和激活是第一个描述转录调控元件的功能。NAMPT激活的天然免疫细胞。以前的分析表明NAMPT内含子1在其他细胞类型中受其他因素的调节作用52,53,或相关的干扰素γ/STAT 1的调节与可能存在的STAT 1结合基序在其他地点附近。NAMPT25。而这个基序分析确定了潜在的结合位点。NAMPT,在缺乏功能约束数据的情况下,这些主题的相关性是不确定的。在这项工作中,我们观察到STAT 1在包括这些潜在位点在内的近端启动子区域中很少或没有占位,但我们发现STAT 1在体内与第1内含子染色质有很强的结合。NAMPT结合以上提到的其他元素和因素,在不同的背景和不同的免疫细胞类型下。这将是很重要的,因为STAT 1不仅在对ifn的反应中起着重要作用,而且对各种其他的细胞因子和生长因子也起着重要的作用。54。因此,我们期待着对STAT 1介导的调控的进一步研究。NAMPT的潜在作用的重要洞察力NAMPT在天然免疫细胞炎症和发育,分化,和/或功能的其他免疫或基质细胞类型,居住在TME。

巨噬细胞代谢重组被认为是有效免疫应答的重要因素,包括抑制肿瘤生长的免疫应答,我们的发现表明IFN/STAT 1诱导的NAMPT是这一反应的重要组成部分。大多数关于巨噬细胞炎症中NAMPT和NAD补救途径的研究都集中在仅受LPS信号的影响下有氧糖酵解增加的现象。55,56,57,虽然一些研究已经开始探讨干扰素γ在糖酵解前转变中的作用。9。尽管NAD生物合成的新途径最近已经被证明对炎症有反应,并且在某些情况下对NAD的产生起着重要的作用,但NAMPT介导的NAD的挽救合成是维持许多重要细胞类型NAD资源的关键途径。58,59。本研究探讨了干扰素γ驱动的经典M1巨噬细胞活化对糖酵解和炎症基因表达上调的影响。它确定了在此过程中直接诱导干扰素γ/STAT依赖的修复NAD合成途径的重要作用。最近的一项研究与我们在诱导NAMPT支持糖酵解方面的发现是一致的,即在巨噬细胞的脂多糖诱导下,在糖酵解的GAPDH步骤中需要NAD。然而,我们的研究清楚地扩展了这一概念,其独特之处在于它研究了NAMPT直接诱导由干扰素γ依赖的STAT 1招募到NRE 1和这种现象的背景下的免疫细胞在TME,包括黑色素瘤患者。然而,我们也不排除NAMPT依赖的NAD在其他与巨噬细胞生物学相关的分子机制中的可能作用,例如那些涉及sirtuins的分子机制。56,60帕普斯61,62,63,以及CD 3847,64,我们将更详细地探讨这些问题。

我们的工作还表明,几种巨噬细胞炎症因子的最佳诱导涉及NAMPT调节糖酵解过程中的IFN反应。其中之一是趋化因子受体ccr 1,它在巨噬细胞和其他天然免疫细胞内发挥作用,促进炎症部位的归巢,包括侵袭肿瘤,对免疫细胞的稳态和炎症的解决都至关重要。65。TME中的CCR 1可能同时具有抗肿瘤和促肿瘤作用,因此它在这里被定性为可诱导的-NAMPT-谭耀宗招聘中的依赖因素和参与者是很重要的。NRE 1介导的诱导NAMPT对于巨噬细胞的其他重要炎症反应也很重要,例如IL-6,IL-12p40,和MiR 155表达,除NO产生外,在调节抗肿瘤免疫中均起关键作用。4,35,66,67,68,69.

NAMPT曾被证明能介导细胞内、外效应对细胞行为的影响。我们观察到NRE 1缺乏IFN激活的巨噬细胞NAMPT酶和靶基因表达降低,表明STAT 1/NRE1依赖于诱导NAMPT支持炎症反应。这一点,以及FK 866对这些基因表达模式的影响尚未被NMN所拯救,也表明了细胞内的作用,而不是细胞外NAMPT(ENAMPT)。70,71在我们的系统里。然而,我们不能排除eNAMPT在当前研究范围内作出的任何贡献。此外,在外源添加抑制酶的下游代谢物时,可能还有许多其他因素,例如在需要的位置和亚细胞尺度上的浓度。抑制的NAMPT可能无法执行与NMN产生无关的其他未知功能,或在抑制NAMPT存在下,NMN前体如NAM的积累可能导致基因调控过程中的变构作用。这些可能性需要在今后的工作中加以评估。

NAMPT作为肿瘤化疗的靶点得到了广泛的探索。18,19,22,46,47,58,72,73,而抑制剂fk 866和其他NAMPT靶向药物已经成为临床试验的对象,其基本原理是抑制肿瘤细胞的NAD依赖的Warburg好氧糖酵解。19。然而,对正常细胞活力所必需的酶活性的严重干扰对任何药物都是一个很大的缺点。此外,我们的实验表明,NAMPT抑制剂的治疗,即使在剂量没有广泛的副作用,可能是反治疗,因为NAMPT诱导的关键作用,支持对恶性疾病的促炎症免疫反应,无论是内源性的,或特别是与癌症免疫治疗。介入治疗期间免疫人群NAMPT诱导的特异性增强可能是提高TME免疫抑制性免疫应答的途径之一。免疫丰富的TME、炎性巨噬细胞中间产物、高干扰素γ诱导免疫之间的因果关系NAMPT表达和肿瘤控制将需要进一步的研究。此外,干扰素γ诱导的信号与NAMPT在多种肿瘤中的表达表明,这种潜在的肿瘤控制途径更普遍。

目前正在进行的研究还将侧重于了解这一途径在其他免疫细胞类型中的作用,以及这些细胞促进自身免疫性疾病、病原体清除或肿瘤监测的情况。沿着这些思路,NAD代谢最近被证明在介导炎症性肠病小鼠模型中起着重要作用,同时,作者还展示了酶促NAMPT在促进炎症巨噬细胞分化和FK 866治疗小鼠炎症基因表达中的作用。74。NAMPT还参与了其他炎症疾病的调解,包括神经炎症、动脉粥样硬化和关节炎。75,76,77,今后的工作将更深入地研究STAT 1诱导的NAMPT在这些设置中的相关性。

我们观察到NAMPT在巨噬细胞中,相对于包括巨噬细胞和所有其他白细胞系在内的更广泛的造血缺失的表型,巨噬细胞在肿瘤控制方面有更强的缺陷,这表明肿瘤的作用更加复杂。NAMPT在免疫细胞中诱导。可能是因为NAMPT负性调节细胞类型的功能或其他在造血过程中的作用在肿瘤反应的演变过程中也很重要。23,38,39。TME中的髓样细胞的特征可能是混合连续的杀瘤或促肿瘤信号,导致其行为和相互作用的复杂异质性,并表明对NRE 1和类似调控物的功能进行更集中的询问将在今后的工作中提供信息。

综合起来,一个模型正在出现,其中IFN/STAT 1/NRE1-被上调。NAMPT维持最佳抗肿瘤髓系细胞反应所需NAD水平的功能。由于IFNs是各种情况下炎症反应的关键驱动因素,我们的工作表明,IFNs的一个关键功能是通过NAMPT促进NAD的产生,NAMPT是促进有氧糖酵解和释放促进抗肿瘤机制的炎症程序所必需的途径。当我们继续理解诱导者的作用时NAMPT而NAD在巨噬细胞和其他免疫细胞应答过程中,无疑会出现新的治疗方案。


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