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人效应细胞Treg细胞转录和表观遗传特征在关节炎中的应用

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发表时间:2021-05-12 10:07作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

Treg细胞是免疫稳态的关键调节因子,环境驱动的Treg细胞分化为效应细胞(E)Treg细胞是优化功能的关键。然而,人类Treg细胞在炎症过程中的编程尚不清楚。在这里,我们结合转录和表观遗传图谱来识别人类eTreg细胞的特征。炎症衍生的功能性Treg细胞有一个转录谱,其特征是核心Treg细胞(FOXP 3,CTLA 4,TIGIT)和效应程序(GITR,blimp-1,batf)都被上调。我们鉴定了一个特定的人eTreg细胞信号,其中包括维生素D受体(VDR)作为eTreg细胞分化的预测调节因子。H3K27ac/H3K4me1的入住率表明,VDR和BATF结合基序的富集是一种改变的(超级)增强因子。Treg细胞的形态与肿瘤浸润的Treg细胞有明显的重叠.我们的数据表明,人类炎症衍生的Treg细胞在表观遗传变化的指导下获得了保守和特异的eTreg细胞轮廓,并通过特定环境的适应性进行了微调。

导言

叉头盒P3-表达(FOXP 3)+Treg细胞是控制异常免疫反应的关键细胞。突变Foxp 3基因导致小鼠和人类的严重自身免疫和炎症1,2。由于其潜在的临床应用,Treg细胞在过去几十年中得到了广泛的研究。

从小鼠模型中积累的证据表明,炎症或非淋巴组织等特定环境可诱导进一步分化/适应为特异性活化Treg细胞亚群,也称为效应细胞(E)Treg细胞。3,4(参考文献)5)。ETreg细胞的特点似乎是维持FOXP 3的表达,增加与其功能相关的几个分子的表达,如ICOS、CTLA 4和TIGIT,以及适应当地环境。例如,最近在小鼠体内的研究表明,在内脏脂肪组织中,Treg细胞在代谢平衡中起主导作用。6,而皮肤和肠道中的Treg细胞可以促进伤口修复,并参与局部干细胞的维持。7,8.

在小鼠身上,eTreg细胞已经被证明在特定的炎症环境中起着至关重要的作用。有趣的是,炎症信号可以诱导典型的th细胞转录因子(如T-bet)的稳定上调,从而使Treg细胞迁移到炎症部位。9。此外,T-bet和Foxp 3的共同表达对于防止Th1自身免疫是必不可少的。10。利用转基因小鼠进行的研究为这一领域的知识做出了贡献,但如何将其转化为人类仍有待阐明。由于人们对使用Treg细胞治疗多种人类疾病感兴趣,因此了解人eTreg细胞在炎症环境下的编程是相关的。

在人类身上,也有证据表明环境对人(E)Treg细胞的适应作用。4,7,11(参考文献)12)包括肿瘤浸润的Treg细胞信号13,14,15。有待解决的相关问题是,人类eTreg细胞编程在炎症环境中的多样性和稳定性,以及这是否在表观遗传学水平上受到调控。

在本研究中,我们研究了人Treg细胞在自身免疫相关炎症环境中的基因表达谱和活性增强子景观。我们表明,在炎症环境下,Treg细胞分化为eTreg,并在转录和表观遗传学水平上适应环境。此外,我们还发现滑膜液(SF)Treg细胞信号与最近发表的肿瘤浸润Treg细胞标记之间存在大量重叠。这些发现表明,人类eTreg细胞规划是表观遗传印记,可能是常见的炎症诱导条件下,从自身免疫到肿瘤环境。

结果

炎症关节增强的核心Treg细胞信号

探讨人Treg细胞在炎症环境中的基因表达谱是否与循环中的人Treg细胞CD3不同。+CD4+CD 25+CD 127低层Treg细胞和CD3+CD4+CD 25CD 127+非Treg细胞分离自:幼年特发性关节炎(JIA)患者关节炎患者滑膜渗出液,JIA活动期和非活动性疾病患者外周血(PB),健康儿童和健康成人PB(补充图)。1A选通策略)。90%以上的分类Treg细胞群体为FOXP 3阳性(补充图)。1B)。RNA测序法测定转录水平。采用非监督主成分分析法(PCA)研究了不同环境下Treg细胞间的差异。SF来源的Treg细胞明显地与PB来源的Treg细胞聚集在一起(如图所示)。1A),表明与PB衍生Treg细胞相比,SF衍生Treg细胞具有特定的表达模式.

图1:人发炎细胞和外周Treg细胞的明显特征。
figure1

a。无监督主成分分析(PCA)的所有Treg细胞组,滑液(SF)和外周血(PB),从儿童。bCD4抑制(百分比)的定量研究+T细胞来自健康供者或幼年特发性关节炎(JIA)患者PB和JIA患者SF的Treg细胞。用50,000 ctViet标记的同种异体健康供体PBMC,用不同比例的Treg细胞在抗CD3包被板中培养4天。n=4,平均±SEM)。c人核心Treg细胞标志基因的基因集富集分析(由Ferraro等人鉴定)。31)对SF Treg细胞与非Treg细胞、SF Treg细胞和健康儿童PB Treg细胞进行配对比较,以归一化富集评分(NES)和FDR统计值(FDRq)为代表。dRPKM的mRNA表达(Log2RPKM)Foxp 3, CTLA 4TIGIT健康成人(成人)从PB衍生出来的Treg细胞中,n=4),健康儿童(儿童,n3),JIA患者活动期(Ajia,n=3)或不活动(iajia,n=4)JIA患者的疾病,SF(JIA SF,n=4)和非Treg细胞(n健康成人的PB和JIA患者的SF(显示中位数+IQR,de=按log 2倍变化差异表达,≥0.6,经调整(Adj))p-数值≤0.05,所有归一化计数的平均值>10;p-价值观Foxp 3=1.1E−95,CTLA 4=2.3E−05,TIGIT=1.9E−17)eCD3中FOXP 3、CTLA 4和TIGIT的中位荧光强度(MFI)+CD4+CD 25+CD 127低层Treg细胞和CD3+CD4+CD 25CD 127+-5例JIA患者成对SFMC和PBMC的Treg细胞。采用双向方差分析和SIDAK校正进行统计学比较.b, e数据是两个独立实验的代表。源数据作为源数据文件提供,并保存在GSE 161426下。

根据以前的文献,我们通过体外抑制实验证实了SF衍生的Treg细胞具有功能(如图所示)。1B和补充图。2A)16,17。正如所料,与sfd4相比,sftreg细胞中Treg细胞标志基因显著富集。+非Treg细胞(图.1C,左面板)。与来自健康儿童和JIA患者的PBTreg细胞相比,Treg细胞标志基因在SF中也得到了丰富。1C、右面板和附图。2B)。这些基因包括对Treg细胞稳定性和功能非常重要的Treg细胞标记基因,例如Foxp 3, CTLA 4,TIGIT,无论是转录水平还是蛋白质水平。1D,e和附图。1A2C)18,19。在人类中,CD3+CD4+非Treg细胞可上调FOXP 3及相关标记物,这些标记可作为T细胞活化的标记物。3。我们确实观察到SF非Treg细胞FOXP 3、CTLA 4和TIGIT在mRNA和蛋白水平上略有上调,但未接近SF Treg细胞的水平(见图)。1D,e和附图。1B2C),进一步证实SF Treg细胞和非Treg细胞是不同的细胞群.这些数据表明炎症环境强化了Treg细胞相关程序.

发炎诱导的Treg细胞有一个特定的效应物轮廓。

对健康儿童的sf细胞和pb来源的Treg细胞进行配对比较,发现了许多差异表达的基因,包括核心Treg细胞标记,包括Foxp 3CTLA 4,同时也能反映出分化程度更高的Treg细胞,如PRDM 1(编码Blimp-1),ICOS、BATF,和巴奇2(无花果)2A,补充数据1)。摘要根据最近的文献,我们分析了与eTreg细胞分化相关的标记在小鼠体内的表达。3,13,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34。分层聚类分析证实Treg细胞与非Treg细胞是分开聚类的,并揭示了核心Treg细胞基因在所有Treg细胞组中的表达增加,包括CTLA 4, Foxp 3, IL2RA(编码CD 25),TIGIT,和IKZF 2(编码Helios)(如图所示。2B,方框1)。此外,聚类还揭示了Treg细胞群中存在分子异质性的基因。一些标记几乎完全由SF Treg细胞表达(包括GMZB, ICOS,和IL 10而另一些细胞则由sf Treg细胞高表达,而sf非Treg细胞(包括PRDM 1, BATF, TNFRSF 18编码GITR,TNFRSF1BHAVCR 2编码Tim-3)(如图所示。2B,方框2)。第三个簇涉及在非Treg细胞中高表达的基因(如图所示)。2B,方框3)。该簇中的一些基因与SF Treg细胞共享表达,如LAG 3, CXCR 3,PDCD 1(编码pd-1)CD40LG, 巴奇2, SATB 1, CCR 7,和Tcf7在SF Treg细胞中明显降低(图1)。2B,方框2和3)。有趣的是,方框2和3中列出的更多异质表达的基因以前与eTreg细胞图谱相关,包括ICOS, IL 10, PRDM 1, TNRFSF 18,和PDCD 13,27,30,31,33。ICOS、GITR和Pd-1在蛋白水平的表达增强(图一)。2C和补充图。3A)。除了这些标记的差异表达外,我们还发现最近在小鼠中描述的SF Treg细胞内基因的显著富集在eTreg细胞中被上调或下调。35(无花果)二维空间和补充图。3B),确认eTreg细胞配置文件。这些数据表明,自身免疫炎症衍生的人Treg细胞具有eTreg细胞的特征.

图2:炎症衍生的Treg细胞有一个特定的效应物。
figure2

a滑液(SF)差异表达基因的Ma图n=4)和外周血(PB),n=3)健康儿童的Treg细胞,黑点反映无变化,红色点转录本经调整p-数值<0.05(用Benjamin amini和Hochberg方法校正多次检验),所有标准化计数的最小平均值>10,对数2倍变化>0.6。b热图的层次聚类分析,包括所有组测量的RNA测序选择的基因根据最近的文献(相对表达的log2RPKM)。c门控CD3中ICOS、GITR和PD-1的中位荧光强度(MFI)+CD4+CD 25+CD 127低层Treg细胞和CD3+CD4+CD 25CD 127+5例JIA患者成对SFMC和PBMC的非Treg细胞。采用双向方差分析和SIDAK校正进行统计学比较.数据代表两个或两个以上的独立实验。d小鼠效应细胞基因集富集分析(Dias等人鉴定)53)在涉及SF Treg细胞的配对比较中(n=4)和PBTreg细胞(n=3)健康儿童,以标准化富集评分(NES)和FDR统计值(FDRq,样本置换多假设检验)为代表。源数据作为源数据文件提供,并保存在GSE 161426下。

SFTreg细胞适应干扰素介导的炎症环境

为探讨炎症环境源性细胞与PB源性细胞之间的关系,我们对健康儿童的SF、非Treg细胞和PB Treg细胞进行了非监督PCA分析。PBTreg细胞与SF衍生细胞明显分离,证实环境在决定转录景观中起主导作用(图1)。3A)。K均值聚类分析表明,SF Treg细胞和非Treg细胞与炎症相关通路相关基因的表达增加,包括与细胞因子反应相关的途径,如Interferon和IL-12(补充图1)。4A)。从儿童中提取的SF Treg细胞和所有PB Treg细胞的K-均值和随后的基因本体论分析表明,与Th1-倾斜相关的通路在SF Treg细胞中被特异性地上调(图1)。3B和补充图。4B,c)。事实上,Th1关键转录因子的表达Tbx 21(t-bet),Th1相关的趋化因子受体CXCR 3,以及IL-12受体β2(IL12RB2在SF中,Treg细胞在mRNA和蛋白水平上均有增加(如图所示)。3C,d和补充图。4D)。表达Tbx 21CXCR 3SF Treg细胞和非Treg细胞同样高,而IL12RB2在SF Treg细胞中有明显的高表达(经调整)p-价值=6.8E−10)。因此,与非Treg细胞相比,SF Treg细胞显示了T-bet和FOXP 3蛋白的共同表达,排除了对非Treg细胞的显著污染,这可能是SF Treg细胞中观察到的高T-bet水平的原因(见图)。3E)。这些结果表明,SF Treg细胞表现出功能特异性,可以在特定的组织部位调节特定的Th细胞反应,就像以前在小鼠身上所建立的那样。36,37,38。在此,我们发现了TIGIT转录信号在SF Treg细胞中的富集。+已鉴定为活化的Treg细胞选择性抑制小鼠Th1和Th17细胞19(补充图。4E)。SF中存在的记忆Treg细胞的频率高于PB,这并不能解释观察到的差异(补充图)。二维空间以及e、3c和4f)。

图3:SFTreg细胞适应干扰素偏斜的炎症环境.
figure3

a滑膜液(SF)衍生Treg细胞和非Treg细胞(配对)的无监督主成分分析(PCA)n=4)和外周血(PB)来源的Treg细胞(n(3)健康儿童。b与SF中特异上调的1791个基因相关的基因本体论术语(n=4)与来自儿童的PBTreg细胞(活动性青少年特发性关节炎(JIA),(n),不活动的JIA(n=4),以及健康的儿童(n),按富集分数排列。基因本体术语中标注的基因数目与基因本体术语中注释的基因总数相比,被描述在术语之前。cRPKM的mRNA表达(Log2RPKM)Tbx 21, CXCR 3,IL12RB2健康成人(成人)从PB衍生出来的Treg细胞中,n=4),健康儿童(儿童,n3),JIA患者活动期(Ajia,n=3)或不活动(iajia,n=4)JIA患者的疾病,SF(JIA SF,n健康成人PB中的非Treg细胞(4)和非Treg细胞(n=4)和JIA患者的SF(n=4)(所示为中位数+IQR,de=根据图中的描述差分表示。1D)。[医]p-价值Tbx 21=0.91,CXCR 3=0.44,IL12RB2=6.83E−10。dCD3中T-bet、CXCR 3和IL12Rβ2的中位荧光强度+CD4+CD 25+CD 127低层Treg细胞和CD3+CD4+CD 25CD 127+5例JIA患者成对SFMC和PBMC的非Treg细胞。e两个独立实验的代表等值线图,T-bet和FOXP 3在CD3中+CD4+CD 25+Foxp 3+Treg细胞和CD3+CD4+CD 25INT/−Foxp 3来自SFMC的非Treg细胞。fCD3中干扰素γ和IL-2阳性细胞百分比的测定+CD4+CD 25+Foxp 3+Treg细胞和CD3+CD4+CD 25INT/−Foxp 3来自sfmc和pbc的非Treg细胞(IFNγ:n=11 PB,n=12 SF;IL-2:n=6 PB,n=7 SF,平均±SEM,p-价值:IFN-γPBp>0.9999,干扰素γSFp < 0.0001, IL-2 PB p=0.0051,IL-2 SFp < 0.0001). d, f数据是两个独立实验的代表。采用双向方差分析和SIDAK校正进行统计学比较.源数据作为源数据文件提供,并保存在GSE 161426下。

Th1相关蛋白的高表达引发了SF Treg细胞是否已获得Th1表型的问题。然而,SF Treg细胞不能同时产生IL-2和IFNγ(如图所示)。3F和补充图。4G)并随pSTAT 5水平的升高而剂量依赖于IL-2(补充图)。4H),一种对Treg细胞存活和功能起关键作用的信号通路39。事实上,与PBTreg细胞相比,SFTreg细胞对IL-2的反应更强。总之,我们的发现显示SF Treg细胞适应其炎症环境,同时保持Treg细胞的关键特征。

超增强剂对效应细胞的调节作用

为了探讨炎症适应的eTreg细胞的机制,我们分析了SFTreg细胞的增强子景观。增强子是DNA中允许转录因子结合并协调基因表达的远端调控元件。摘要增强子的表观遗传调控对特定环境下的基因调控至关重要。40。增强子可以定义为组蛋白H3上赖氨酸4单甲基化(H3K4me1富集)和组蛋白H3上赖氨酸27乙酰化(H3K27ac富集)区域,其中H3K27ac识别活性增强子。41。用SF Treg细胞和健康成人PB Treg细胞分别对H3K27ac和H3K4me1细胞进行芯片-seq检测,结果表明,SF和PBTreg细胞分别对H3K27ac和H3K4me1的增强子谱和活性存在差异,分别为37307和970个不同峰(见图1)。4A,补充图。5B、上面板和补充数据2)。接下来,我们评估SFTreg细胞的转录组是否反映在表观遗传学水平上。H3K27ac和/或H3K4me1基因在mRNA水平上增加,反之亦然。4A,补充图。5B、中、最低面板和补充数据2),证实在这些细胞中基因表达与染色质乙酰化和单甲基化是相互关联的。

图4:环境特异性效应因子Treg细胞轮廓由(超级)增强剂景观调节.
figure4

aH3K27ac芯片-seq滑膜液(SF)与外周血(PB)Treg细胞差异表达增强子(fdr<0.0001)的Ma图显示SF和PB特异性增强子的数量(顶)。以标准化富集评分(NES)和FDR统计值(FDRq)为代表的SF Treg细胞和健康成人PB Treg细胞转录组数据的配对比较中,前250位上调(中间)和下调(底部)增强子的基因集富集分析(GSEA)。b同.a超增强剂(FDR<0.05)。cH3k27ac和h3k4me1芯片seq在sf Treg细胞和健康成人pb Treg细胞中选择上调和下调的超促进剂(fdr<0.0 5;两者的BOLD=上下和转录水平上的差异表达(DE),另见补充数据2). d利用荷马预测的转录因子结合位点的基序,在SF Treg细胞中的上调(超)增强子中富集。n=3)与健康成人PBTreg细胞(n=3)用于H3K27ac和H3K4me1芯片-seq。p-数值:累积二项分布,以计算目标序列与背景序列的富集;BATFH3K27ac已知p=1e−15,de novop=1e−22,VDRH3K4me1p=1e−19。e基因轨迹VDRBATF(H3K27ac)显示芯片-seq信号,在健康成人PB Treg细胞、SF Treg细胞、VDR特异性(GSE 89431)和BATF特异性(GSE 32465)芯片-seq中,超增强子区域突出显示。Rna-seq信号VDRBATF在儿童PBTreg细胞和SFTreg细胞也显示。成人铅的有代表性样本(n=3),儿童PB(n=3)和SF(n=3表示芯片-seq和n4为RNA-seq)Treg细胞。对于所有面板,除另有说明外,FDR值均采用Benjamin amini Hochberg方法计算。源数据保存在GSE 161426和GSE 156426下。

超级促进剂是一大群增强子,专门调节在健康和疾病中决定细胞身份的基因。42,43。用ROSE算法确定超增强子相关基因是离增强子和超增强子位点中心最近的TSS。此外,在超增强子水平上,我们发现转录的基因明显富集,再次表明SFTreg细胞图谱是由表观遗传改变介导的。4B和补充图。5C,中间面板和最低面板)。对H3K27ac和H3K4me1差异超增强子相关基因的分析显示,在791和317个不同的基因位点中,分别有337个和317个(图1)。4B和补充图。5C、上面板)。具体来说,我们发现超增强子与与典型的Th1分化相关的基因相关,例如Tbx 21IL12RB2,在SF Treg细胞中增加。4C)环境相关轮廓的表观遗传调控。核心Treg细胞基因编码效应分子ICOS, IL 10,CTLA 4, TNFRSF 18,和PDCD 1与超增强剂以及呋喃ID2这些都是功能较强的Treg细胞标记物。ETreg细胞的分化也反映在sftreg细胞的增强子结构中,超增强子相关转录调节因子的差异表达包括BATF, 巴奇2, SATB 1,TRAF 3,和SOCS 1。此外,我们还发现了与先前与(E)Treg细胞分化无关的标记物相关的超级增强子,这些标记物大多对人Treg细胞具有特异性,包括VDR(编码维生素D受体),RXRA(编码维甲酸受体RXR-α),KAT2B(编码p 300/cbp相关因子(PCAF)),TOX 2(编码TOX高迁移组盒家族成员2)和IL12RB23,4,6,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53。炎症相关归巢标记(CCR 2, CCR 5, CCR 7)与SF Treg细胞中H3K27ac的差异水平有关。最后,与pb Treg细胞相比,sf的超增强因子也反映了细胞周期和凋亡的调节。DPH 5, MICAL 2,PHLDA 1,和CCND 2。总之,这些超增强子相关基因反映了Treg细胞在炎症环境中的适应和专业化.

序列分析表明,与PBTreg细胞相比,在SF中特异性上调的(超级)促进剂转录因子结合位点的预测,揭示了Treg细胞特异性转录因子的基序。其中包括STAT 5和Myb;后者最近被描述为eTreg细胞分化中的核心转录因子。53。最近的文章进一步证明batf和rela是小鼠eTreg细胞的关键调节因子。47,49。在此支持下,我们发现BATF,TF 65(编码rela)和VDR基序在SF Treg细胞(如图所示)增强子区域中明显富集。4D和补充图。5D),从而进一步加强SFTreg细胞的eTreg细胞轮廓。最常见的基序属于激活蛋白1(AP-1)转录因子亚家族,是碱性亮氨酸拉链(BZIP)家族的一部分(补充图)。5D)如DiSpirito等人所提出的,表明这个亚家族在驱动eTreg细胞签名方面至关重要。54全组织Treg细胞。此外,在转录调节剂vdr和batf的超级增强子中,发现了它们各自的结合位点,表明batf(与其他蛋白质复杂)和vdr调节着自己的基因表达,也控制了其他eTreg细胞基因(图1)。4E)。这些观察表明,在转录水平上观察到的SF Treg细胞的炎症适应效应表型反映在表观遗传学水平上,具有超增强子特征和eTreg细胞基因结合位点的富集,在慢性炎症组织中显示出与其他Treg细胞共同的特征。

维生素D 3受体对eTreg细胞分化的调节作用

为了提取基于人类转录因子和辅助因子的关键基因调控因子,从健康的PB细胞分化为SFTreg细胞,采用数据驱动的网络和富集方法(RegEnrich)。建立了一个由调控者及其目标组成的网络(如图所示)。5A)在预测值最高的情况下,人们发现从PB向SFTreg细胞分化的调控因子是Tcf7, LEF 1, , 斯潘(否定)和ENO 1, THRAP 3,和VDR(正)(见图)。5A、b)。斯潘, THRAP 3,和VDR以前没有与eTreg细胞分化相关。VDR与核心Treg细胞基因相关的下游基因包括Foxp 3STAT 3,但也Tbx 21(无花果)5A,c和补充数据3)。因此,FOXP 3和FOXP 3之间存在着很强的正相关关系(r=0.772,p < 0.0001) and T-bet (r=0.937,p < 0.0001) with VDR protein expression (Fig. 5D)加强预测的调整器网络。

图5:维生素D受体是效应细胞分化的预期调节因子。
figure5

a基于非监督加权相关网络分析,在RNA水平上驱动外周血(PB)向滑膜液(SF)Treg细胞分化的关键调节因子(Pb)的网络推理,然后对转录因子和辅助因子(红色=上调,绿色=下调)进行Fisher‘s精确检验。紫色线描绘了监管机构与目标之间的联系。圆圈大小表示−log 10(p)对于每个比较,使用p(-值)来自差异表达式分析(log折叠变化>1),文本大小表示RegEnrich分数;对于这两种情况,更大的表示更高的分数(另见补充数据)3). bRNA表达谱VDR从JIA sf Treg细胞样本1-4到成人pb Treg细胞样本1-4,其相关基因以灰色表示。Z-得分c所有与VDR相关的基因都由密钥调节器网络推理定义。dPB(圆)和SF(三角形)VDR与FOXP 3(左)和T-bet(右)中位荧光强度(MFI‘s)的Pearson相关图,用线性回归法拟合。n=12 PB HC和PB JIA(PBMC),n=8 SF JIA(SFMC)。e相对e挤压褶皱变化(2)ΔΔCT)IL2RA, CTLA 4, TNFRSF 8, IL 10, Tbx 21, IRF 4,和VDR(左下角)培养50,000激活CD3的Treg细胞+CD4+CD 25+CD 127低层用10 NM维生素D从HCPB中分离Treg细胞,与不含维生素D 2天比较(n=4,平均±SEM)。f实验后CD 25(IL2RA)、CTLA 4和TNFRSF 8相对MFI的变化e用(n=7,平均数±扫描电镜(SEM)。df数据是两个独立实验的代表。源数据作为源数据文件提供。

探讨维生素D的直接作用3在推动Treg细胞向效应型方向发展的过程中,我们用维生素D孵育了CD3/CD 28刺激的PBTreg细胞。3(Calcitriol/1,25-二羟基玻璃体D3),检测(E)Treg细胞功能相关基因的表达。与维生素D孵育3(10 NM;生理维生素D)3),表达增加IL2RA, CTLA 4, TNFRSF 8(CD 30),以及IL 10,以及eTreg细胞转录因子。Tbx 21IRF 4被观察到(如图所示)。5E)。蛋白质水平上,维生素D还显著增加了CD 25、CTLA 4和TNFRSF 8。3孵化(图1.5F)。此外,与表观遗传数据一致的是维生素D3刺激诱发正反馈环VDR表达式(图1.5E)。这些发现支持了维生素D的假设3VDR信号转导促进eTreg细胞分化,同时与核心Treg细胞标记表达呈正相关。

类似的eTreg细胞在其他炎症和肿瘤环境中的分布

为了研究SFTreg细胞中所识别的程序是否对接触炎症的人Treg细胞更为普遍,我们将我们的结果与来自PB的Treg细胞和类风湿关节炎(RA)患者的炎症关节进行了比较。事实上,在RA患者炎症渗出液的Treg细胞中,类似的eTreg细胞基因也被上调(如图所示)。6A).

图6:效应细胞与人肿瘤Treg细胞信号重叠。
figure6

a基于非监督层次聚类分析的外周血热图(PB)n=5)和(部分配对)滑液n=7)类风湿关节炎患者的Treg细胞用基因芯片进行检测,所选择的标记基因来源于幼年特发性关节炎(JIA)的SF Treg细胞和肿瘤浸润的Treg细胞。b肿瘤浸润Treg细胞标志基因的基因集富集分析(De Simone等人鉴定)。13)在涉及SF Treg细胞的配对比较中(n=4)和健康儿童PBTreg细胞(n=3),以归一化富集评分(NES)和FDR统计值(FDRq,用样本置换进行多假设检验)表示。c热图采用层次聚类分析,包括对已鉴定的肿瘤浸润Treg细胞标记基因进行RNA序列测定(参考文献)。13),具有log2RPKM的相对表达。右边的小热图显示SF Treg细胞中所选基因的log2RPKM值。dRPKM的mRNA表达(Log2RPKM)CCR 8, MAGEH 1莱恩健康成人(成人)来自PB的Treg细胞n=4),健康儿童(儿童,n3),JIA患者活动期(Ajia,n=3)或不活动(iajia,n=4)JIA患者的疾病,SF(JIA SF,n健康成人PB中的非Treg细胞(4)和非Treg细胞(n=4)和JIA患者的SF(n=4)由RNA-测序分析(显示中位数+IQR,de=差异表示,根据图中的描述)。1D调整p-数值(Benjamin amini和Hochberg方法)CCR 8=2.2E−13,MAGEH 1=1.2E−07,莱恩=1.2E−33)。e根据JIA SF Treg细胞、RA SF Treg细胞和肿瘤浸润Treg细胞中上调的重叠基因鉴定人效应Treg细胞谱(见参考文献。13,14,15,89,90),并对SFTreg细胞的(超)增强子景观进行了反思。源数据作为源数据文件提供,并保存在GSE 161426下。

然后,我们将我们的数据与最近发表的人类肿瘤浸润Treg细胞特异性信号进行了比较。13,14,15。引人注目的是,来自de Simone等人的肿瘤浸润Treg细胞信号。在SFTreg细胞中富集(标准化富集评分(NES)1.27,FDR统计值(FDRq)0.071)。6B)。反之,与正常组织Treg细胞相比,SFTreg细胞与PB Treg细胞的差异表达基因在肿瘤浸润中富集(Plitas等人,2016年:NES 1.69,FDRq 0.017,Magnuson等人,2018年:NES 1.88,FDRq 0.002;附图)。6a,b)。DeSimone等人肿瘤浸润基因信号的层次聚类分析。进一步揭示了SFTreg细胞的单独聚集现象(图1)。6C),表明标记基因的高表达是人类Treg细胞在一个以免疫细胞浸润为特征的部位所特有的。我们还观察到一小部分基因在SFTreg细胞中没有被上调。CX3CR1, IL17REL, IL1RL1,和IL1RL2,暗示环境-受限制的适应(图1.6C)。这三个基因被描述为肿瘤浸润的Treg细胞中最丰富和最独特的基因,莱恩, MAGEH 1,和CCR 8,在SF Treg细胞中有选择性和高度上调。6d)。这些数据表明,我们观察到的Treg细胞图谱并不局限于JIA和RA患者的SF渗出液。事实上,它很可能代表了人类Treg细胞在炎症环境中的一个更全面的轮廓,可能是通过特定环境的适应来微调的。

为了探讨哪些提示可能是SF的特异性,我们探讨了SF中上调基因与肿瘤浸润Treg细胞之间的差异。相对较少发现明显的SF特异性基因。在基因水平上,细胞毒性标记包括GZMM, GZMA,和GNLY,与效应细胞溶解和自身诱导的Treg细胞凋亡有关。55是SF-特异性的(补充图)。6C)。基因本体论生物学过程分析进一步揭示了SF中活性细胞周期和凋亡途径均被上调,而在肿瘤微环境中,细胞激活和效应反应显著(附图)。6d)。此外,肿瘤浸润的Treg细胞表现出明显的趋化因子和趋化因子受体的表达,如IL-8(CXCL 8)、CX3CR1、CXCR 7和CCR 10(补充图10)。6C),其中一些已被认为是癌症预后的指标和/或治疗的靶点。56.

从JIA、RA和肿瘤数据集中,我们可以推断出一组在eTreg细胞中普遍上调的基因,也可以反映在SFTreg细胞的(超级)增强因子中(如图所示)。6E). ICOS, BATF,MAF, TNFRSF 18,和SRGN也显示为与小鼠eTreg细胞相关的核心标记。此外,IL12RB2,VDR,和KAT2B,被确定为核心基因,以及PFKFB 3LDHA参与糖酵解及凋亡相关基因的研究MICAL 2TOX 2。后两者迄今尚未与人或小鼠的Treg细胞相关联,尽管两者都与人类癌症有着独立的联系。57,58。事实上,基因集富集和对活化、(共享)组织、炎症和肿瘤浸润的Treg细胞基因集的前沿分析等揭示了核心eTreg细胞基因的共享,包括BATF, CCND 2, CCR 8, TNFRSF 18,和VDR,(补充数据)4)。即使SFTreg细胞被高度激活,也不存在耗尽或exTreg细胞相关基因的富集。综上所述,我们的结果表明,人类Treg细胞在不同的炎症环境中有着共同的效应,并且强烈地表明炎症在不同的环境中以类似的方式驱动eTreg细胞的分化。

讨论

非淋巴组织和小鼠炎症部位中eTreg细胞的发现引起了人们的疑问,人类eTreg细胞是如何在不同的环境下转录和表观编程的。本研究为局部炎症环境下的人Treg细胞进一步分化为专门的eTreg细胞提供了证据。这体现在Tbx 21和CXCR 3的高表达和核心Treg细胞标记,包括FOXP 3、CTLA 4和TIGIT。基本的Treg细胞特征被保持,如抑制功能,IL-2反应和缺乏细胞因子的产生.转录变化反映在表观遗传学水平,无论是在增强子和超级增强子的景观,表明该剖面是高度调节的。此外,我们还鉴定了人eTreg细胞中以前未被发现的特异性标记物,如vdr、IL12Rβ2和batf;并将vdr作为预测的人eTreg细胞分化的关键调节因子。体外维生素D3孵育使核心(E)Treg细胞在蛋白质和mRNA水平均增强。最后,我们证明该轮廓不仅限于JIA和RA的自身免疫性炎症,而且与肿瘤浸润的Treg细胞几乎完全重叠。肿瘤与自身免疫环境的相似性似乎有违直觉,因为前者反映的是免疫抑制环境,而后者则与免疫激活有关。然而,这两种环境都具有免疫细胞浸润和炎症等特性。59。因此,这种重叠的轮廓可能代表炎症环境中人类Treg细胞的更为普遍的轮廓。由于Treg细胞具有广泛的基因组变化,因此从炎症环境中了解其功能是非常重要的。按照以前的报告16,17,我们发现sf Treg细胞确实具有抑制作用,而且通过磷酸化STAT 5而对IL-2有很高的反应,而不包括受损的IL-2信号。60,61。这主张反对Treg细胞在炎症中的固有缺陷。炎症的维持可以解释为局部效应细胞的抵抗力,这在JIA和RA中都有证明。17,62,63.

在小鼠中,Treg细胞通过上调T-bet对Th1炎症的功能特异性被描述为防止Th1自身免疫的关键。9,10。在我们的研究中,T-bet和FOXP 3在SF Treg细胞中的显著共同表达,其T-bet水平与SF非Treg细胞一样高,这意味着功能的专门化可以翻译到人类的环境中。CXCR 3和CCR 5等迁移标志在蛋白质、转录和增强因子水平上的表达增加进一步加强了这一点,因为高T-bet表达对迁移至关重要,因此Th1特异性Treg细胞和Th1效应T细胞通过上调这些趋化因子受体而共同定位。9,10.

非Treg细胞对Treg细胞的污染是体内外人类细胞分类时所关注的问题。然而,我们排除了大量的污染,因为(1)我们的数据显示sf Treg细胞和非Treg细胞之间有很强的转录差异,sftreg细胞中Treg细胞标记基因的表达增加,(2)分类Treg细胞的fxp 3>90%。+(3)FOXP 3和T-bet在单细胞水平上有明显的共表达,(4)我们发现SF Treg细胞在表达高T-bet水平的同时,缺乏细胞因子的产生,这可能是FOXP 3、SOCS 1、EGR 2和EGR 3(补充数据)高表达引起的。1)64,65。然而,正如米拉盖亚等人最近所表明的那样。4ETreg细胞群体中可能存在异质性。

我们的研究研究了人类炎症环境下eTreg细胞的转录和表观遗传调控,使我们能够识别人类特异性的eTreg细胞调控,以及小鼠和人之间的共同之处。表观遗传水平的发现仍需实验证明,因为虽然标记为H3K27ac/H3K4me1的区域与活性增强子相关,但这并不是增强子功能的初步证据。41,66。此外,我们还发现(超)增强子相关基因是离增强子和超增强子位点中心最近的TSS。因此,这些(超级)增强剂有可能调节其他基因,而不是我们的分析所预测的那样。41。这需要进一步研究Treg细胞的空间染色质组织,特别是在炎症条件下。对人Treg细胞表观遗传学的研究较少,只有两篇研究循环人Treg细胞H3K27乙酰化和H3K4单甲基化的论文。67,68。阿尔维等人结论认为,大多数Treg细胞系特异性成分在小鼠和人之间并不保守,进一步强调了对人Treg细胞表观遗传学景观的缺乏认识。高等人重点研究了1型糖尿病患者PBTreg细胞增强子内的SNPs,与我们的数据一致,细胞周期和凋亡的调控在这些患者的增强因子中得到了很好的反映。这些数据进一步强调需要进行额外的研究,特别是在非稳态状态下的非淋巴组织中。我们发现小鼠和人类在eTreg细胞分化方面有相似之处。SATB 1, Bach2,Tcf 7,和LEF 1,均与PB中的超增强子有关,而与SF Treg细胞无关。虽然这四个基因对Treg细胞的发育至关重要,但最近的研究表明,下调这些调控因子对于Treg细胞的进一步分化和防止转化为Th细胞是必要的。44,52,69,70,71,72,73。Bach 2可以转录抑制PRDM 1(编码Blimp-1)在T细胞中72,在此,我们观察到乙酰化和基因表达增加。PRDM 1在SF Treg细胞里。这进一步得到以下方面的支持:Tcf7LEF 1,均与eTreg细胞标记表达呈负相关,包括PRDM 173。此外,我们发现batf在SF Treg细胞中是一个显著的标记,在转录和表观遗传学水平上都有表达增加,并且在上调的超级增强子相关基因中有一个结合位点。此外,在RA SF Treg细胞和肿瘤浸润Treg细胞中也有BATF高表达,提示bATF是人和小鼠eTreg细胞中的关键转录调节因子。我们还发现电子Treg细胞标记与小鼠已知的标记有显着性差异。最明显的是在转录和表观遗传学水平上上调IL12RB2,以及上调超增强子相关基因的结合位点,而在小鼠eTreg细胞中,该标记被下调。相反,有报道称IL-12Rβ2表达受损是阻止Treg细胞向Th1细胞完全分化的关键检查点。38。然而,我们的数据与最近有报道显示有选择性地表达IL12RB2人PBTreg细胞30,67表明该标记在人和小鼠中具有不同的功能。

另一个意想不到的发现是在JIA和RA SF Treg细胞中,转录和表观遗传学水平以及肿瘤浸润的Treg细胞中VDR的上调。虽然没有强调,但在乳腺肿瘤浸润的Treg细胞中存在较高的vdr水平。14和子宫eTreg细胞74。此外,维生素D还有众所周知的耐受性作用。375,VDR在Treg细胞中没有得到很好的研究,特别是在人类中。最近的一项研究确实表明,记忆CCR 6+TH细胞具有抑制性表型,包括CTLA 4的表达,功能抑制能力与与维生素D孵育的Treg细胞相似。376。我们发现VDR是SF eTreg细胞中的关键调节因子,与FOXP 3和T-bet表达均呈正相关。

另一个不同之处是没有KLRG 1人eTreg细胞的上调。在小鼠中,klrg 1是识别eTreg细胞的关键标志,尽管对eTreg细胞功能不起关键作用。77。KLRG 1在SF Treg细胞上不上调,仅在PB Treg细胞中与超增强子相关。此外,在我们的数据中,KLRG 1的基因表达仅限于非Treg细胞(SF和PB)。混淆的发现是可能由组织测量或比较造成的差异。米拉盖亚等人4高调PIM 1小鼠非淋巴样Treg细胞与PB Treg细胞比较,但PIM 1在人组织Treg细胞中不表达。然而,在我们的数据中,PIM 1与健康成人和儿童的PBTreg细胞相比,SF显著增加(补充数据)1)。总之,我们发现人eTreg细胞在小鼠eTreg细胞分化标记中表现出相似之处,但也发现人特异性eTreg细胞标记物包括IL-12Rβ2和VDR,且缺乏KLRG 1。

此前的研究表明,体外人Treg细胞具有高度的糖酵解性。78,与它们的高增殖能力相一致79。在小鼠中,eTreg细胞分化和迁移到炎症部位需要增加糖酵解。80,81。在此支持下,糖酵解相关基因包括PFKFB 3,LDHA,和PKM 2SF-Treg细胞在RNA和(超)增强子水平上均有增加。最后,ENO 1编码糖酵解酶1,是预测eTreg细胞分化的关键调节因子。

最近,基于Treg细胞的治疗在自身免疫性疾病和移植环境中的应用正获得新的兴趣。从动物模型和临床试验中获得的有希望的数据,无论是涉及过继转移的细胞治疗,还是小剂量的IL-2治疗,都为Treg细胞疗法进入临床铺平了道路。82。我们的数据表明,循环中的人类Treg细胞与来自免疫激活位点的人Treg细胞有明显的不同。这反映在效应标记和转录调节因子的表达上,也反映在特定的趋化因子受体的表达上。对于基于Treg细胞的治疗,了解特定的环境可能需要适应Treg细胞的迁移和功能,是很重要的。此外,在这项研究中,我们分析了人类eTreg细胞大量存在于炎症部位。这些信息可以为后续的研究奠定基础,这些研究最终可能允许对少量循环的eTreg细胞进行定性,例如监测正在接受治疗的患者。

总之,我们的研究揭示了定义人类炎性Treg细胞的转录和表观遗传学程序。SFTreg细胞在表观遗传学水平上表现出环境适应和eTreg细胞表型。此外,我们还描述了eTreg细胞程序与RA患者肿瘤浸润Treg细胞和SF Treg细胞的显著相似之处。这揭示了JIA、RA和癌症中受影响部位的人eTreg细胞共有的一组基因,包括BATF、VDR、MICAL 2、TOX 2、KAT2B、PFKFB 3和IL12Rβ2。最后,我们证明THRAP 3、ENO 1和VDR是在转录水平上驱动人SF eTreg细胞分化的关键调控因子。


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