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用微晶电子衍射和连续飞秒晶体学研究Myd 88的tir结构域高阶组装相互作用

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发表时间:2021-05-11 09:37作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

MyD 88和MAL是Toll样受体(Toll样受体,TLR)适配器,它们能诱导促炎细胞因子的产生。我们以前观察到“仲裁示范法”(“仲裁示范法”)的tir域TIR)在体外形成丝,诱导形成myd 88 tir结构域(Myd 88)的晶体高阶组装体(Myd 88)。TIR)。这些晶体对于传统的X射线晶体学来说太小,但非常适合于用微晶电子衍射(MicroED)和连续飞秒晶体学(SFX)来确定晶体的结构。在这里,我们介绍了MyD 88的MicroED和SFX结构。TIR组装,它揭示了类似于之前对“仲裁示范法”所见的tir域的双链高阶组装排列。TIR。我们通过诱变证明MyD 88TIR组装接口是TLR 4在体内信号传递的关键,我们发现MAL促进了myd 88的单向组装。TIR。总的来说,我们的研究为TLR信号转导提供了结构和机制上的洞察力,并允许直接比较MicroED和SFX技术。

导言

Toll样受体(TLRs)检测病原体和内源性危险相关分子,启动天然免疫反应,导致促炎细胞因子的产生。TLR的信号传导是由其胞质TIR(Toll/白细胞介素-1受体[IL-1R]结构域)二聚而起的,随后包括髓系分化初级应答基因MyD 88和MAL(MyD 88适配器样/TIRAP)。1)1。这些适配器的组合招募通过TIR:TIR相互作用协调下游信号,导致促炎基因的诱导。在以前的工作中,我们证明了Mal tir域(“仲裁示范法”)。TIR)体外自发和可逆地形成花丝。它们还与tLR 4、tir结构域(TLR 4)形成了共丝。TIR)并使MyD 88的组装成核。TIR变成晶体阵列2。这些结果提示协同组装形成(Scaf)是天然免疫和细胞死亡途径中普遍存在的一种信号传导机制。3,4提出了一种信号放大模型,TLR 4、MAL和MyD 88 TIR结构域依次协同组装成一个高阶TIR结构域。然后这个组装诱导了Myddosome的形成,它涉及MyD 88的死亡结构域和蛋白激酶IRAK 2和IRAK 4,从而导致这些激酶的近距离激活(如图所示)。1)5,6。MAL的7-低温电子显微镜(cryo-EM)结构TIR长丝显示由12个双链的tir结构域的双链原丝组成的空心管,突变分析显示,在体内信号传递过程中,这些原丝内的蛋白质相互作用很可能代表更高阶的tir-结构域相互作用界面,尽管在细胞内形成的结构在大小上可能比较有限。7。但是,MyD 88的结构基础TIR和TLR 4TIR域自组装与MAL交互TIR仍未发现。

图1:用于TLR信令的SCAF模型的示意图。
figure1

病原体相关的分子模式(如LPS)与TLR的胞外LRR结构域(如TLR 4)结合,导致其TIR结构域的二聚,从而导致一个适配体TIR结构域(例如,MAL)的出现。TIR)到TLR 4创建的扩展曲面TIR二聚体。通过增加适配器的TIR域(例如“仲裁示范法”)来延长这种三聚体的长度TIR或MyD 88TIR)进入一个更高层次的复杂系统,导致MyD 88 DDs的聚类,并随后通过DD交互来招募IRAK。初始的TIR二聚和三聚步骤可能是不利的和限速的,而随后的单体加入则更有利、快速和协同。LRR,富含亮氨酸的重复区;LPS,脂多糖;TLR,Toll样受体;TIR,Toll/白介素-1受体结构域;DD,死亡域。

在这里,我们开始从结构上描述MyD 88。TIR在我们以前的工作中观察到的晶体组装2。由于晶体尺寸太小,无法进行常规X射线衍射,我们采用了微晶电子衍射(MicroED)和连续飞秒晶体学(SFX)的互补技术。微ED8,9能够确定亚微米大小的晶体的结构。在MicroED数据采集中,晶体在透射电子显微镜(TEM)中连续旋转。10,11,12,类似于x射线晶体学中的旋转方法。13,并对透射电镜中相关的三维电子衍射方法进行了分析。14。Microed可以补充现有的结构生物学方法,例如常规的x射线晶体学,在这种方法中,生长足够大小和结晶度的晶体往往是结构确定的主要障碍。15,16,17,18。事实上,许多失败的结晶试验已经证明含有微晶。19,20,21。此外,小的大分子晶体有可能减少缺陷。22,23,24,对样品的控制扰动,如浸泡、玻璃化等,可以快速、均匀地应用。24,25,26。MicroED已经使从微晶中确定蛋白质结构成为可能。9,10,23,27,28,29,30,一种以前未表征的金属酶的结构解31嵌锂立方相微晶膜蛋白的结构测定32,33,34,35配体结合作用的可视化25,36。此外,MicroED还可以研究天然聚集或组装成微晶的生物分子,从而有助于确定来自细朊原纤维的几个短肽片段的结构。23,37,38,39。这些自然发生的晶体组件具有特殊的意义,因为它们可以揭示细胞内组装中发生的相互作用,说明指导组装形成的潜在机制,并提供相关的结构洞察。

随着MicroED的发展,SFX已经成为一种强有力的测定结构和研究微晶样品蛋白质动力学的技术。24,40,41,42,43。SFX利用极其亮的x射线自由电子激光(Xfel)脉冲的飞秒级持续时间,在室温下收集高质量的衍射数据,这些数据发生在结构改变的辐射损伤发生之前。44,45,46,47。在sfx中,衍射数据是以随机取向微晶的单个快照形式收集的。45,47。在室温和最少的样品处理下,晶体被传送到光束中,避免了与冷冷和潜在的蛋白质构象限制相关的挑战。48。Sfx促进了辐射敏感蛋白亚微米晶体结构的确定。49,50,51膜蛋白,如G蛋白偶联受体52,53,54,55。Sfx还以前所未有的时间分辨率对光敏蛋白进行了时间分辨研究。55,56,57,研究配体结合引发的反应,并利用亚微米晶体尺寸快速引发反应。49,50,51,54,56,57,58。特别是,sfx有先进的纤维研究,例如淀粉样或微管,其中纤维生物分子组装可能有部分或无结晶度,接近单分子成像的状态。59,60.

在这里,我们介绍了MAL诱导的MyD 88的微区ED和SFX结构。TIR微晶的分辨率分别为3.0和2.3。重要的是,这两种结构都显示出几个不同的重构环区,它们采用不同于先前确定的单体X射线和核磁共振结构的构象。61,62。晶体堆积分析表明Mal诱导的MyD 88TIR晶体具有双链高阶组装排列,与先前在自发形成的MAL中观察到的完全相同。TIR长丝2,以及诱变研究表明,这些高阶myd 88内的界面。TIR程序集对于信令非常重要。这个相同的体系结构为高阶myd 88的成核和组装提供了一种单向模板机制。TIR我们用晶体生长分析证实了这一点。此外,MyD 88的结构比较TIR高阶组装和单分子MyD 88TIR使我们能够理解MyD 88的构象变化TIR单体在加入高阶组装后就会发生。综上所述,我们的研究揭示了SCAF机制在TLR和IL-1R通路中的分级性质。

结果

数据采集

“仲裁示范法”诱导的MyD 88TIR微晶体的直径一般在100~200 nm之间,这使得它们非常适合这两种材料(图1)。2)和SFX。

图2:从MyD 88收集的微型化数据TIR微晶。
figure2

a, b聚集微晶的电子显微图,仅显示质量较差的衍射数据.标尺,1米。c, d多个微晶重叠,显示多个晶格在其相应的衍射模式,复杂的数据索引。标尺,1米。e, f单个水合微晶,显示高质量的衍射数据,分辨率可达3.0.显微照片上的青色环表示直径为1.5μm的平行光束,由选定的区域孔径定义,用于微电子数据采集。在0.12e剂量率下,每帧角增量为0.68°,采集了电子衍射图。/2每帧。数据af是否代表使用1:50“仲裁示范法”中的3分之1编制的三个电磁网格?TIR*MyD 88TIR晶体溶液

微晶被沉积在数量箔EM网格和玻璃化的筛选和微ED数据采集(补充图图)。1)。微晶有聚集的倾向,形成很大的束,衍射很差(如图所示)。2A,b)。此外,弯曲和重叠晶体复杂的数据解释(图)。2C,d)。用直径为1.5μm的小型平行电子束,由所选择的面积孔径定义,只选择单个薄水合微晶进行微电子发射数据采集(图1)。2E,f)。MyD 88TIR微晶衍射到3.0的分辨率,并提供了高质量的电子衍射数据(图)。2F)。18颗晶体的数据进行了集成、缩放和合并(表)1)。由于MyD 88的首选方向,总体完整性有限TIR由于测角仪的倾斜范围有限,所以在栅格上有微晶体。

表1.数据收集统计。

MyD 88TIR用SFX对微晶体进行了平行研究。最初,在PETRAIII PII光束线处的固定靶上进行了系列结晶学的实验,光束尺寸为2×2m,但在此装置中,由于微晶体频繁地被捆绑成更大的聚集体,数据收集和分析变得复杂(附图)。2)。为了达到更高的分辨率和克服微晶聚集,样品以气体动态虚拟喷嘴(Gdvn)喷油器作为溶剂化的微晶体流传送。63,64SLAC国家加速器实验室LCLS脉冲XFEL光束65。利用微聚焦光束(名义上为1×1m半峰全宽),优化晶体浓度(7.5×10)。8收集了单个晶体的高质量衍射图.总体而言,SFX数据集包括1,029,868个检测器帧中的13,528次点击(35%索引率)中的4725个索引模式(平均命中率为1.3%)。由SFX数据导出的晶格参数比在低温条件下收集的MicroED数据略大(见表)。1).

结构解、建模与精化

MyD 88的结构TIR最初是用分子置换的微电子衍射数据来解决的,在空间群中找到了一个对比良好的独特的解决方案。C2.利用一个远近相关的Toll相关受体2(Trr 2)tir结构域的搜索模型找到了该问题的解决方案,与myd 88的序列同源性仅为30%。TIR(无花果)3)。MyD 88的结构TIR使用MicroED数据进行迭代构建和改进(表)2)尽管具有一定的完整性和分辨率,但静电势图显示出清晰的特征,并能够重新构造不同于先前确定的单体晶体和溶液结构的环区。61,62(无花果。34A)。较高分辨率的sfx结构(2.3aa)首先使用microedmyd 88来解决。TIR模型作为分子替换模板,然后使用与MicroED结构不同的协议进行迭代重建和精化(表)2、SFXa)。为了能够直接比较microed和sfx的模型,我们还解决、重建和改进了sfx myd 88。TIR结构,使用与微ED数据相同的协议(表)。2、SFXb)。SFXa地图(图)4B)显示出良好的分辨率特征,包括水分子没有在微观ED结构中建模.为了验证搜索模型是否偏置了MicroED和SFX地图,计算了模拟退火(SA)复合遗漏图,证实了我们的结构模型的解释(附图)。3)。因为微晶中含有少量的MALTIR分子,可能有这种异质性对衍射的贡献,但这可能有一个微不足道的影响。因此,没有证据表明“仲裁示范法”的存在。TIRMal诱导MyD 88电子密度和静电势图中的分子TIR水晶。

图3:MyD 88TIR结构比较
figure3

aMyD 88单体的带状图(蓝色)TIR高阶装配结构。结构元素在tir结构域被顺序标记,bb环连接链βb和螺旋αb,根据既定的命名。129. bfMyD 88的叠加TIRSFX结构(蓝色)bMyD 88TIR微结构(橙色);cMyD 88单体TIRX射线晶体结构(PDB ID 4EO7;洋红);dMyD 88单体TIR核磁共振溶液结构(PDB ID 2Z5V;绿色);e下后生动物Toll相关受体TRR 2 TIR区的晶体结构[医]低俗九头蛇(PDB ID 4W8G;黄色);及f“仲裁示范法”TIR高阶装配冷EM结构(PDB ID 5 UZB;红色)。

表2.完善统计数据。
图4:MyD 88的结构确定和建模TIR由MicroED和SFX组成的高阶装配。
figure4

模型和地图给出了改造后的BB环(残馀186-204,顶部)和cd循环(残馀242-251;底部)的模型和地图。aMicroED和bSFXa结构。MicroED和SFX中的碳原子a结构分别以灰色和绿色表示。氮、氧和硫原子分别以蓝色、红色和黄色表示。静电散射势(MicroED)和电子密度(Sfx)2 mFo−dfc图(蓝等深线)在1.2处等高线。σ,mfo−dfc图(正密度和负密度分别为绿色和红色等时)等值线为2.8。σ。使用加权FC值进行地图计算,没有恢复丢失的反射。

MyD 88的结构比较TIR结构

MicroED和SFXbMyD 88TIR用相同的协议构造和改进的结构几乎是相同的,对于138个Cα原子,均方根偏差(Rmsd)为0.4个。在某些侧链构象中可以观察到微小的差异,这很可能是由于某些区域的灵活性导致电子密度定义很差,或者是由于数据收集温度的差异(附图)。4)。MyD 88TIRSFXa利用结构与其它TIR结构进行了比较,并对晶体内部的相互作用界面进行了分析。MyD 88的结构TIR在MAL诱导的高阶组装中,与已知的NMR(107个Cα原子的rmsd 2.4of)存在构象上的差异。61和X射线(对118个Cα原子的RMSD=2.0)62单分子MyD 88的结构TIR。这一点在包括BB环和αB螺旋的区域和CD环中尤为明显(如图所示)。3)。构象差异很可能是由于这些区域参与了MAL诱导的高阶程序集内的TIR:TIR相互作用。在已知的tir域结构中,“仲裁示范法”TIR纤维结构(图1.3),TLR 1、TLR 2、TLR 6和IL-RACP晶体结构与bb-环和αB-螺旋结构相似。2.

MyD 88TIR微晶中的相互作用界面

晶体堆积分析显示MyD 88TIR高阶组件,每个组件由两个偏移的TIR域平行链组成,每个链由头到尾排列的子单元构成(图)。5A-C和补充表13)。MyD 88的形成TIR组装是由两种主要类型的不对称TIR结构域相互作用介导的:一种是在两股(链内接口)中的每一条内,另一种是在这两条链(链间接口)之间。

图5:MyD 88的结构TIR高阶组装微晶。
figure5

aMyD 88的表面表示TIR微晶,由双链高阶组件(黑点线)组成.这两条线分别用蓝色和洋红色表示。bMyD 88丝带图TIR高阶装配。黄色球体表示每个TIR单体的N端,红色球体表示每个TIR单体的C端。这两条鱼分别是蓝色和绿色,洋红色和暗鲑鱼。cMyD 88的示意图TIR微晶和两种不同类型的不对称相互作用在高阶组装中。BB表面由BB环中的残基组成;EE表面由βD和βE链中的残基组成,αE螺旋中的残基组成;BC表面由αB和αC螺旋中的残基组成;CD表面由CD环中的残基和αD螺旋区组成。d, e高阶程序集中的详细交互。d链内界面e链间界面f双链高阶组件之间的详细相互作用,形成了片状结构.

基于sfx结构,链内界面涉及myd 88的反面。TIR共埋~18.0-18.6%(1500奥瓦)2)结构中每个亚基的总表面积。它由位于一个亚基(BB面)的BB环中的残基与下一个亚基(EE面)上的βD和βE链以及αE螺旋之间的相互作用组成。5B-d和补充表1)。BB环高度保守的脯氨酸残基(MyD 88中的P 200)被埋在βE链和αE螺旋之间的一个浅口袋中,该螺旋由I 253、C 274、L 290和A 292残基组成。氢键(补充表)1W 284和R 196侧链间的疏水堆积相互作用稳定了界面。BB环的构象也是通过E 183和R 196之间的内盐桥来稳定的(如图所示)。5D).

链间界面掩埋占每个亚基总表面积的12.0-12.2%(991个亚基)2它是由位于一个分子(BC表面)的αB和αC螺旋上的残基之间的相互作用和CD环与伙伴分子的αD螺旋区(CD表面)的相互作用组成的。5B、c、e和补充表2)。几个残基(W 205、F 235、K 238、F 239、L 241、P 245、I 267和F 270)对此界面起疏水作用(图1)。5E).

MyD 88之间的相互作用TIR在微晶中形成连续薄片的双链组件,涉及主要位于αA螺旋以及cd和EE环中的残基(补充表)。3)。界面掩埋~7-8%(570个)2)每个亚基的总表面积,比链内和链间相互作用的范围要小(如图所示)。5F和补充表3)。这些组装间的相互作用很可能类似于大分子晶体中的非生物晶体接触。2,66.

MyD 88突变TIR链内和链间残基干扰组装和信号传递

我们以前曾发现,链内界面的r 196,d 197,p 200,W 284和R 288的丙氨酸突变,以及在链间界面上的K 238,L 241,S 266和R 269的突变破坏了Mal-诱导的myd 88。TIR溶液中微晶形成2。为了证明相互作用界面在生物学上的重要性,我们用核因子-κB(NF-κB)驱动的m血红-Ⅰ报告子和内源性的m血红-Ⅰ报告子,检测了HEK 293 TLR 4报告细胞中界面残基突变的影响。MyD 88被击倒(无花果)6a,b和补充图。5)。链内突变R196A、W284A、I253D和R288A可阻断TLR 4配体脂多糖(LPS)对NF-κB的激活,而BB环中的P200A则显著降低活化(图1)。6A和补充图。5D)。在链间界面上,突变体K238A、L241A、F270A和F270E对LPS的应答较小或不明显。F 239的丙氨酸突变主要与αB螺旋残基在同一亚基内的疏水相互作用有关,仅导致20%的失活。位于链间界面边缘的突变体具有完整的信号传递(P245H和R269A)或~20%的活性丧失(D234A)。突变体K282A,位于形成被认为在生物学上不重要的片状结构的界面上(如图所示)。5F也有完整的信号,这些信号的结果与对LPS诱导的细胞内表达的MyD 88聚类的分析非常一致(见图)。6B和补充图。5E,f)。这一结果与我们先前关于自发聚类和MAL诱导的myd 88聚类的研究结果也是一致的。2,除了这里,利用缺乏内源性MyD 88的细胞系,可以清楚地看到链间突变的影响。

图6:界面,疾病相关和磷样突变调节MyD 88信号和组装.
figure6

a, b在表达TLR 4、MD2和CD 14的HEK 293细胞上检测MyD 88突变对LPS诱导的信号转导和MyD 88聚集的影响。MyD 88敲除并稳定转染NF-κB驱动的m血红-I荧光报告。转染表达野生型或突变型V5标记MyD 88或空载体的质粒,隔夜用黑条(100 ng/mL)或不加脂多糖(100 ng/mL)处理,免疫染色检测MyD 88-V5,流式细胞仪分析。用极低表达MyD 88的细胞进行分析,以避免自发信号(附图)。5B,c)。平均±范围n=2独立实验。死亡域突变g80k,这已经被证明可以阻止myd 88聚类。130,而TIR域本身的构造提供了负控制。a用m血红阳性群体相对于表达野生型MyD 88细胞的几何平均荧光强度测定NF-κB活性。虚线表示空载体细胞的激活程度。b根据myd 88信号高度与面积的升高率来确定成簇md88的细胞百分比,当myd 88团簇出现时,可观察到这一现象。2(补充图。5E). c用N端gfp标记的无细胞系统表达了野生型MyD 88和突变体,并在国产共聚焦显微镜上对荧光样品进行了单分子光谱分析。为了表征野生型myd 88和突变体形成高阶组装的倾向,我们计算了蛋白质的平均亮度值(方程式(1))。72。结果表明,S209R、S244D、P245H和T281P突变体比野生型MyD 88具有更高的齐聚倾向。平均±扫描电镜n=3或n=2(F270E和T281P)实验采用不同的溶出物批次,每个实验重复两次。以G80K突变体和TIR结构域为阴性对照。

疾病相关突变和翻译后修饰位点调控组装形成

几个MyD88tir结构域错义突变(V204F、S206C、I207T、S209R、S230N、M219T、L252P和T281P)由于NF-κB信号转导机制而维持淋巴瘤细胞的存活。67,68,69。将这些残基映射到MyD 88上TIRS209R突变可能直接影响链间相互作用,而T281P突变可能影响链内相互作用(附图)。6)。L 252被掩埋,不直接参与高阶组装相互作用,但分子动力学模拟表明,这种突变很可能调节cd环的构象。70,这对于MyD 88高阶组装中的链间相互作用至关重要。为了直接检验这些疾病相关的突变增加MyD 88高阶组装的假设,我们分析了它们对基于细胞和无细胞系统聚类的影响(图一)。6A-c)。与以往报道一致,S209R、L252P和T281P突变体在本报告细胞系中的表达增强了NF-κB的基础活性。6A)。L252P对LPS无进一步诱导作用,而S209R和T281P对LPS有反应。与野生型(WT)MyD 88相比,3个突变体的基础聚类均增加,而LPS对S209R和T281P的影响更大。6B)。用单分子光谱法测定无细胞表达绿色荧光蛋白(Gfp)标记蛋白荧光时间轨迹的亮度,评价这些突变体的聚集倾向。71(无花果)6C)。S209R和T281P突变体具有较强的聚集倾向,形成比WT MyD 88更大的粒子。7)。相反,L252P突变体形成的粒子比WT MyD 88(补充图)要小。7),但正如以前报道的那样,这些复合物的数量较多,形成于较低的蛋白质浓度。72.

据报道,myd 88 tir结构域被磷酸化在S 242(αC螺旋)和S 244(cd环)上,这些残基的模拟突变对NF-κB的激活产生相反的影响:S244D突变变得过度活跃,而S242D突变具有抑制作用。70,73。S 242在MyD 88高阶组装中与W 205形成氢键,该残基突变到天冬氨酸,因此很可能会破坏链间界面的稳定(附图)。6)。S 244不直接参与高阶组装相互作用,但与l252p类似,分子动力学模拟表明s244d突变会引起cd环构象的改变。70。当检测MyD 88在HEK 293细胞中聚集的能力时(见图)。6B),S244D类磷突变增加了MyD 88。FlS242D抑制聚类,这与这些突变体激活NF-κB完全一致。6A)。在单分子分析中也观察到了类似的数据,使用的是无细胞的表达蛋白(如图所示)。6C)。总之,我们的新数据强烈地表明,MAL诱导的MyD 88 TIR结构域聚类与NF-κB激活水平直接相关,因此支持了我们的结构作为MyD 88 TIR结构域关联模型的相关性。

“仲裁示范法”的比较TIR和MyD 88TIR总成

为了更深入地了解tir域组装的形成,我们对myd 88进行了比较。TIR微晶结构(图1.5)我们之前发表的“仲裁示范法”的cryo-EM结构TIR长丝2。两个组件共享一个共同的总体架构,由BB和EE表面介导的头对尾链内相互作用,以及BC和CD表面介导的链间相互作用(补充图)。8A)。与MAL相比,MyD 88的αE螺旋、EE和CD环的构象不同。3和补充图。8A),导致链内和链间MyD 88的埋地表面增加。TIR交互作用(补充表)4).

αE螺旋和EE环中的构象差异也导致了双链高阶组件之间界面的差异(补充图)。8B)。在MyD 88中TIR微晶,这些相互作用涉及αA螺旋以及CD和EE环,而在MAL中TIR冷电镜结构-αA、αC和αD螺旋以及AA和EE环参与了这些相互作用.这些相互作用的差异导致双链高阶组件“仲裁示范法”的不同包装。TIR形成由12个原丝组成的管状,而MyD 88TIR形成连续表(附图)。8C).

“仲裁示范法”TIR核化MyD 88TIR单向装配形成

“仲裁示范法”TIR核化MyD 88的组装TIR微晶2。“仲裁示范法”中所观察到的类似结构TIR和MyD 88TIR高阶组装提出了一种成核和组装的分子模板机制,其中MAL。TIR作为推动MyD 88单向组装的平台TIR通过链内和链间的相互作用。为了验证这个假设,我们捕获了MyD 88TIR用差示干涉对比度(DIC)和荧光显微镜生长微晶。“仲裁示范法”TIR或GFP-“仲裁示范法”TIR融合蛋白是组装形成和gfp-MAL的成核因子。TIR核化相同类型的MyD 88TIR微晶作为MALTIR(补充图。9)。短仲裁示范法TIR-MyD 88TIR将结晶种子洗净除去MAL,然后与MyD 88混合。TIR。结果显示MyD 88TIR组装形成是单向的,有大量的种子只从一端生长(见图)。7A和补充电影1)。然而,MyD 88微晶聚集的趋势在这里也出现了一个问题,因为从种子聚集体中也可以看到组装向多个方向生长(附图)。10)。在gfp-mal的整个过程中都观察到gfp荧光。TIR*MyD 88TIR水晶种子,暗示MalTIR也可以在MyD 88中合并。TIR高阶装配,这与我们先前的报告一致,表明“仲裁示范法”TIR和MyD 88TIR当混合比例为1:1时,可以形成较小的非均匀复杂结构。2。作为gfp-mal的浓度TIR用于制备种子的(0.25~2M)明显低于MAL的临界浓度。TIR长丝形成(30微米)2,以及MyD 88的初始浓度TIR比GFP-Mal高出50-400×TIR或“仲裁示范法”TIR,种子必须主要由myd 88组成。TIR分子,一小部分MALTIR分子定位在一端,也分散在种子中。此外,MyD 88TIR在gfp-“仲裁示范法”被移除后,组装继续增长。TIR,证明“仲裁示范法”TIR仅适用于MyD 88TIR组装成核而不是伸长。

图7:“仲裁示范法”TIR核化MyD 88TIR单向装配形成。
figure7

aMyD 88的延时成像TIR微晶形成单个GFP-MAL晶体生长的典型图像TIR-MyD 88TIR和马尔TIR-MyD 88TIR种子被展示出来。种子被洗去除去马尔,然后与MyD 88混合。TIR。数据是五个独立实验的代表。星号表示具有单向生长的种子。标尺条:左面板5米;中面板和右面板10公分。bMyD 88的带状图TIR单分子MyD 88的NMR溶液结构TIR(PDB ID 2Z5V)和高阶组装结构)和“仲裁示范法”TIR单体MAL的(NMR)溶液结构TIR(Db Id 2 Ndh)和高阶组装cryo-EM结构(Pdb 5 Uzb),突出bb环和αB螺旋的重排(myd 88中的洋红色)。TIR绿色的马累TIR)在单体向低聚物转变的过程中。c两个链间相互作用的模型,MyD 88之间的过渡TIR单体(黄色)和MyD 88TIR高阶装配(蓝色):(I)MyD 88的EE曲面TIR单体停靠在MyD 88 BB表面TIR高阶装配。这种相互作用不需要在绑定之前在BB循环和αB螺旋中发生任何构象变化。(二)MyD 88的BB面TIR单体对接到MyD 88的EE表面TIR高阶装配。这种相互作用需要bb循环和αB螺旋在绑定之前发生显着的构象变化,因此不那么受欢迎。dMyD 88模型TIR单向装配编队新的TIR结构域亚基的合成所需的BB环和αB螺旋的构象变化是由链间相互作用引起的。MAL的高阶装配构象TIR和MyD 88TIR,以及MyD 88的单体构象TIR分别以橙色、蓝色和黄色显示。

预测“仲裁示范法”中是否存在任何一种线间和链内界面TIR优先考虑与MyD 88的交互。TIR,我们计算了预测的埋地面积。TIR和MyD 88TIR互动。计算表明“仲裁示范法”TIRBB面-MyD 88TIREE表面相互作用面积最大(补充表)4)。我们还绘制了MAL表面的静电势图。TIR和MyD 88TIR,并发现“仲裁示范法”TIRBB曲面与MyD 88TIREE表面是唯一高电荷互补的相互作用界面(补充图)。11)。此外,MAL的分子动力学模拟TIR*MyD 88TIR配合物显示,Mal BB和MyD 88 EE表面的配合物比Mal EE和MyD 88 BB表面的配合物更稳定(附图)。12)。与这些分析相一致,我们之前已经证明了“仲裁示范法”中的突变TIRBb表面在体外和细胞内均能阻止mal诱导的myd 88聚集(r121A、p125A和p125h)。2.

我们还比较了“仲裁示范法”的结构。TIR和MyD 88TIR在高阶组件中具有各自结构的单体。这一比较揭示了BB和BC表面区域(BB环和αB螺旋)有很大的构象差异,而EE和CD表面区域呈现相似的构象(图1)。7b)。单分子MyD 88的招募模型TIR对于一个不断增长的链表明,通过EE表面招募新的亚基只需要在结合之前最小的构象变化,而通过它们的BB表面向组装中招募新的亚基需要在结合之前对bb环和αB螺旋进行大的重新排列,因此,它将被预测为不太有利(如图1所示)。7C)。总之,我们的结构分析表明,在Myd 88的成核和伸长步骤中TIR进料MyD 88的装配成形、EE表面TIR分子停靠在MAL的BB表面TIR或MyD 88TIR亚单位。然后,通过bc和cd表面的链间相互作用在这些新结合的tir结构域分子中触发αB螺旋和bb环的重新排列,使它们能够与新传入的myd 88的EE表面相互作用。TIR亚单位(图1.7D).

讨论

在过去的十年里,通过微电子衍射的发展,结晶学在几个不同的方向上都有了扩展,无论是电子结晶学还是电子结晶学。8,9,在x射线晶体学方面,通过sfx45,46,47。在这里,我们分别用MicroED和SFX从水合微晶阵列中确定了MyD 88的TIR结构域,其分辨率分别为3.0和2.3。这两种技术各有优缺点。SFX利用高强度X射线在室温下产生高分辨率结构,并且能够使用喷油器样品输送系统来克服晶体聚集问题,而牺牲高样品消耗(通常为0.3-12毫克蛋白质)。74,75,76。相比之下,MicroED能够最大限度地减少样品消耗(<1μg蛋白),允许使用玻璃化微晶在低温下的旋转方法,仅使用几个甚至仅仅一个单晶,对倒数空间进行几乎完全的取样。然而,这可能是以牺牲通常比X射线结晶学中通常达到的更差的结晶质量指标为代价的。该方法的进一步发展,如串联电子衍射法等。77,78改进的电子衍射探测器,以及考虑到原子的荷电状态和势分布的静电势的精确模拟,都可能改善电子衍射探测器的地图质量,并提供有关电荷相互作用的信息。30,79。对于sfx,利用纳米聚焦的x射线束在xfel上进行混合和注入实验的进展。80,81伴随着数据分析的进展82将为将来进行蛋白质组装形成的时间解析研究提供机会。Xfel结构生物学的最终目标是尝试将信号到噪声的极限推到能够在溶液中成像单个分子的程度。83.

在我们的研究中,微观ED和SFX结构之间只观察到细微的差异,这可以通过数据分辨率和完整性、某些区域的灵活性以及低温和室温数据采集的差异来解释。据我们所知,只有另一组人报告了这两种技术在同一蛋白质晶体系统中的比较。24。他们的工作显示,SFX案件中单位细胞略有扩大,这与数据收集温度的差异有关。我们的室温sfx数据也显示,沿a-轴,与低温微ED数据相比较(表)1),表示晶格变化与两个数据集之间的温差有关。

SCAF是信号转导中的一个新兴主题,它涉及到将受体激活信息传递给细胞反应的高阶寡聚体的组装。4并在几种天然免疫和细胞死亡途径中运作,包括炎症信号。84,类I受体85和TLR途径2,5。在本研究中,我们发现Mal诱导的myd 88TIR晶体组件包含一个双链的头对尾排列的tir结构域,就像以前观察到的适配器蛋白mal的tir结构域一样。2。分析单个氨基酸MyD 88突变对细胞信号传递的影响,支持定义界面的生物学相关性。先前的功能分析测定了MyD 88在HEK 293细胞中过度表达的自发信号。70。我们在这里的分析有几个优点。首先,我们使用内源性细胞MyD 88敲除,使突变体的功能有了更严格的确定。这一改进使我们能够证明残基在链间相互作用中的重要性,这在我们早期的研究中并不明显。2。其次,通过流式细胞术,我们可以分析单个细胞的反应,只选择MyD 88在极低水平表达的细胞,以避免自发信号。这使我们能够通过完整的信号通路观察突变体对LPS处理的反应,从而避免过度表达的产物。利用这一技术,我们证明了r196a突变体是完全不活跃的,而先前的工作表明它在内源性myd 88存在下促进了56%的wt nf-κB活性,尽管具有缺陷的tir结构域相互作用。70。因此,我们对这里报道的信号分析的生物学相关性很有信心,它证实了在myd 88的链内和链间界面中几个关键残基的重要性。TIR大会。

我们提供证据证明“仲裁示范法”TIR作为推动MyD 88单向组装的平台TIR寡头。单向延伸的一个特点是在高阶低聚物中建立层次结构,其中上游分子可以成核下游分子的组装形成,反之亦然,这似乎是许多先天免疫途径的共同特征。例如,在CARMA1-Bcl10-MALT1组件中Bcl 10适配器的伸长是单向的,只有通过共焦成像才能显示一端的生长。86,以及平台I:Mavs卡、fdd:caspase-8 ded和myd 88:irak 4:irak 2 dd组件的结构显示,该平台-1、fdd和myd 88寡头分别通过一张卡dd和dd面招募下游合作伙伴。5,85,87.

我们的数据增加了对tlr信号转导的顺序和协作机制的支持,在该机制中,受体和适配器tir结构域通过myd 88中观察到的链间和链内相互作用聚集在一起。TIR和马尔TIR高阶程序集,导致TIR域信号小体的形成.这将促进myd 88 dds的聚类形成myddosome,并通过irak的招募和激活。5。在体外定义的mddosome是一个dd的螺旋阵列,dd为myd 88-irak 4-irak 2,排列方式为6:4:4。5。与此机制形成对比的是,通过dd相互作用,一些myd 88预存在于一个自由寡聚复合体中的未受刺激的细胞中,但由于tir结构域阻断了irak 4结合表面的通路,因此无法招募irak 4。6。当受体激活时,建议将myd 88 tir结构域加入到tLR 4中。TIR-“仲裁示范法”TIR信号复合物,释放自身抑制和促进IRAK的招募到预先形成的MyD 88寡聚体。需要进一步的数据来验证这两种模型,但对于预先形成的自抑制复合物的可能性有一些警告。首先,参与IRAK 4相互作用的MyD 88 DD表面也是将MyD 88 DDs组装成hexamer的必要条件,MyD 88 tir结构域与这些表面的结合很可能完全阻止DD寡聚体的形成。第二,全长myd 88和myd 88 dd在体外均存在着高度的齐聚浓度依赖性。72而MyD 88在细胞中的聚集阈值很容易被过表达所超越。过度表达的自发信号88反对MyD 88集群在本质上被禁止招募IRAK。在正常细胞浓度下,自身抑制可能在限制myd 88的自联想中发挥作用。72。逐步的TIR结构域介导的招募到一个TLR信号小体,然后会增加DD的局部浓度,导致Myddosome组装。

总之,我们的研究为TLR通路中TIR结构域信号小体的结构和组装机制提供了新的见解,同时也允许对MicroED和SFX的互补技术进行比较。本研究中详细报道的TIR:TIR相互作用也可能为设计重要界面的小分子模拟物提供模板,以抑制MyD 88高阶组装的形成,为潜在的治疗应用提供模板。


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