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Th17细胞参与MEK抑制剂的联合作用及抗PD-L1的耐药KRAS/p53突变型肺癌

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发表时间:2021-05-11 09:35作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

了解突变型KRAS肺癌的靶向治疗和免疫检查点阻断的耐药机制对于开发新的联合治疗方法和提高患者生存率至关重要。在突变型KRAS肺癌中,MEK抑制增强了PD-L1的表达,而PD-L1阻断了MAPK信号的上调。MEK抑制与抗Pd-L1协同作用可降低肺癌的生长和转移,但肿瘤最终对持续的联合治疗产生耐药性。多平台分析显示,耐药肺肿瘤增加了Th17细胞的浸润,Th17细胞分泌IL-17和IL-22细胞因子,促进肺癌细胞侵袭性和MEK抑制剂抵抗。IL-17A抗体耗竭联合MEK抑制和PD-L1阻断可明显降低体内治疗耐药性。临床上,Pd-1阻断治疗的患者Th17相关基因的表达增加,预示着非小细胞肺癌患者整体生存和反应较差,而抗-PD1反应较弱。在这里,我们展示了三重组合治疗策略,以克服抵抗联合MEK抑制剂和PD-L1阻滞。

导言

非小细胞肺癌(NSCLC)是由于晚期疾病的出现、转移和对常规治疗的抵抗而导致的癌症相关死亡的主要原因。约有30%的肺腺癌患者拥有激活的kras突变,目前缺乏有效针对所有致癌蛋白变体的批准的药理学药物。1,2。虽然MEK是MAPK信号通路中活化突变体KRAS的典型下游效应,但MEK抑制剂对KRAS突变型癌症的临床疗效不佳。3,4。先前的研究表明,获得常见的次级突变,如p5 3,会促进对mek抑制剂的抗药性。5。我们小组利用KRAS;p53(KP)突变型小鼠肺肿瘤模型6证明肺癌细胞的上皮亚群体对MEK抑制剂有反应,而耐药肺癌细胞则经历zeb 1依赖的上皮间充质转换(Est)。7,8。相反,我们先前的研究还表明,与上皮性kp肿瘤相比,间充质kp肺癌对pd-l1/pd-1轴免疫检查点阻滞的反应更强,这是由于zeb 1介导的间充质细胞pd-l1和其他检查点蛋白的上调。9,10,11.

虽然pd-1或pd-l1免疫检查点阻断的实施大大提高了肺癌患者的生存率,但只有少数患者对治疗表现出持久的反应,表明他们对免疫治疗有先天或后天的抵抗力。12。我们的研究结果表明,肺癌细胞的两个不同的亚群对个别治疗有互补的反应,为将MEK抑制与免疫检查点阻断相结合以克服对个体治疗的抵抗力提供了潜在的理论依据,补充了MD Anderson(ClinicalTrials.gov标识符:NCT 03225664)正在进行的临床试验。以往的临床试验结合MEK抑制剂和抗pd-l1治疗实体瘤(黑色素瘤、非小细胞肺癌和结直肠癌)显示出可管理的安全性,但只有中度的肿瘤反应。13,14,15。综上所述,这些试验已经证明了令人失望的结果,即使在KRAS和BRAF突变亚组中,尽管表明CD8+T细胞浸润到肿瘤中,但随着治疗的进行,表明其他次要因素可能限制了双重治疗的疗效。因此,用MEK抑制剂和PD-L1阻断剂进行小鼠临床前试验将阐明潜在的耐药机制,并确定更多的治疗靶点。

在此,我们首次发现,与单药治疗相比,MEK抑制与Pd-L1阻断明显降低了KP肺癌的生长和转移。我们观察到,随着长期治疗,最初对药物组合的反应是不可持续的,因为原发性肺肿瘤最终会产生耐药性。细胞因子阵列分析显示耐药肿瘤增加了Th17CD4的浸润。+T细胞分泌促肿瘤细胞因子IL-17和IL-22。16。IL-17A抗体耗竭联合MEK抑制和Pd-L1阻断,可持久地减少肺癌的生长、转移,防止肿瘤耐药性的发展。黑色素瘤患者和非小细胞肺癌患者Pd-1阻断后的基因表达分析显示,Th17相关基因信号水平的增加预示着患者整体存活率和免疫检查点阻断反应较差。我们的发现揭示了MEK抑制剂与PD-L1阻断结合的分子基础,鉴定了联合耐药的机制,确定了潜在的免疫治疗反应的预测指标,并验证了KRAS突变型肺癌患者的三重组合治疗策略。

结果

MEK抑制增加pd-L1的表达,pd-l1阻断则上调MAPK信号。

我们实验室先前的工作表明,突变型KRAS肺癌的上皮亚群对MEK抑制剂有反应,而肿瘤内的间充质细胞则是耐药的。7,8。因此,我们寻求寻找潜在的分子靶点是特定于间充质亚群体协同MEK抑制剂治疗。我们采用了反相蛋白阵列(RPPA)分析方法。17,18曾用MEK抑制剂Selumetinib(AZD 6244)治疗异质性同基因344平方千米的肺肿瘤7鉴定MEK抑制后差异调节的信号蛋白。RPPA谱显示在荷瘤小鼠经AZD 6244治疗后,CD 274(PD-L1)表达明显上调(假发现率(FDR)<0.0 5)(P<0.0 5)。1A)。通过Westernblotting验证RPPA数据证实了PD-L1的上调(图1)。1B)。为了进一步验证我们的观察,我们分析了mek抑制剂敏感的393 pkp肿瘤,这些肿瘤以前用AZD 6244治疗,然后在药物敏感点(393 p AZD-S)或在产生耐药性(393 p AZD-R)后收获。7。与我们之前的发现一致7,19对MEK抑制剂耐药的393 p肿瘤显示EMT相关转录因子ZEB 1的表达上调,Pd-L1表达增加(如图所示)。1C)。有趣的是,393 p肿瘤显示PD-L1的表达增加,即使在对MEK抑制的敏感点(如图所示)。1C)。为了确定pd-L1表达的增加是否是肿瘤细胞内固有的信号,而不是肿瘤组织中其他细胞类型的次级信号,我们用MEK抑制后的人肺癌细胞株(H 2122,H 1299,H 358,H 157,A 549)和人肺癌细胞系(H 2122,H 1299,H 358,H 157,A 549),分别与AZD 6244进行体外共突变处理,观察到MEK抑制后肺癌细胞Pd-L1 mRNA和蛋白表达的增加。1D,e;补充图。1A, b)。有趣的是,携带LKB 1突变(KL)的细胞株(H 157和A 549)与携带Kras/p53突变的细胞株(H 2122、H 1299和H 358)相比,PD-L1的总表达水平要低得多(补充图)。1A).

图1:MEK抑制增加PD-L1的表达,而PD-L1阻断则上调MAPK信号.
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A反向相蛋白阵列(RPPA)热图显示,用硒美替尼(AZD 624)、MEK抑制剂(黑色)或载体(灰色)治疗4周的344平方鼠KP同基因肿瘤中差异调节蛋白(FDR<0.05)有统计学意义(P<0.05)。B用Vehicle或AZD 6244对344 SQ肿瘤中PD-L1和β-actin的Westernblot检测4周。数量表示肿瘤复制。C用AZD 6244处理393 P肿瘤,当肿瘤对MEK抑制敏感(AZD-S)或耐药(AZD-R)时,ZEB 1、PD-L1和β-actin的Westernblot分别作用4周或8周。数量表示肿瘤复制。D顶部:定量PCR分析DMSO或10 M AZD 6244作用48h后393 p(蓝色)和344 SQ(红色)细胞系CD 274(PD-L1)的表达情况,并以流式细胞仪分析PD-L1+393 p(蓝色)和344 SQ细胞(RID)的百分比,并以指示浓度的AZD 6244处理48h,数据为平均值±SD。n=3.使用未配对学生对数据进行分析t测试一下。**P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001. EAZD 6244标记蛋白在393 p和344 SQ细胞中的Westernblotting作用48h。FPd-L1阻断抗体(黑)或IgG同型对照(灰色)治疗7周后,RPPA的热图显示差异调节蛋白(FDR<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)。G用IgG亚型对照或PD-L1阻断抗体治疗344平方公里肿瘤所指示蛋白的Westernblotting观察7周。数量表示肿瘤复制。

本小组先前的研究表明,间充质kp肿瘤在肿瘤生长的早期阶段表达较高水平的pd-l1,并对pd-l1阻断剂有反应。19,20。同样,为了确定pd-l1阻断后的蛋白靶点,我们分析了在治疗7周后对抗pd-l1阻断抗体产生耐药性的344平方公里肿瘤的rppa数据。20。我们观察到包括活化磷酸化MAPK信号蛋白在内的多种途径的信号转导增加。1F),通过Westernblotting验证。1g)。为了确定pd-L1阻断后MAPK信号的增加是否是由于免疫介导的反应,我们与脾细胞进行了共培养实验,并观察到只有在344 SQ细胞与脾细胞共培养并用抗PD-L1(补充图1)处理后,肿瘤细胞MAPK信号才会增加。1C)。我们的发现表明,当肿瘤分别用单剂MEK抑制剂或PD-L1阻断治疗时,PD-L1和MAPK信号的相互激活。

MEK抑制和pd-ll阻断联合应用可降低肺癌的生长和转移,但最终产生治疗耐药性。

由于MEK抑制增加了Pd-L1的表达,而PD-L1的阻断增强了肺肿瘤的MAPK信号,我们下一步寻求将这两种治疗结合起来,以防止个体治疗产生耐药亚群体的生长。AZD 6244与PD-L1阻断联合应用于同种肿瘤植入后3周,与单药或载体/同型对照相比,344平方千米的肺肿瘤生长和转移明显减少,持续8~9周(如图所示)。2A)。然而,344平方公里的肿瘤最终对联合治疗产生了耐药性,到了11~12周,就产生了原发肿瘤大小和转移性疾病(图一)。2A)与未治疗的对照组在9周时相当。肿瘤组织的流式细胞术免疫分析(免疫人群的门控策略,见附图。2)无论是在实验终点还是在治疗2周后,CD8的总量都有明显的增加。+当抗Pd-L1作为单一剂或与AZD 6244联合使用时,T细胞(图1)。2B,补充图。3A)。此外,记忆/效应因子CD8+T细胞亚群显著增加,而幼稚和精疲力竭的CD8则显著增加。+联合治疗组在疗效点T细胞明显减少(图1)。2C,补充图。3A)。然而,尽管肿瘤内T细胞群有短暂的益处,但CD8却耗尽了。+T细胞(pd-1)+提姆-3+当肿瘤最终发展为对联合治疗的抗药性时,则明显增加(如图所示)。2C).

图2:MEK抑制与PD-L1阻断联合应用,最初降低了肺癌的生长和转移,但最终形成了对治疗的抗药性。
figure2

A左图:用溶剂(黑色)、25 mg/kg AZD 6244(蓝色)或200 mg/kg pd-L1阻断抗体(绿色)作为单剂或联合治疗后,在指定时间点对同基因野生型小鼠344平方公里皮下肿瘤进行体内肿瘤体积测量。治疗开始时间以黑箭头表示,联合敏感组以(S)(红色)表示,联合抗性组以(R)(紫色)表示。右图:在治疗终点对所示实验组肺转移表面结节进行定量。数据以平均值±SD表示。N=10(溶剂+IgG),n=10(溶剂+抗Pd-L1),n=6(AZD 6244+IgG),n=4(AZD 6244+抗PD-L1 S)n=5只(AZD 6244+抗PD-L1 R)小鼠。使用未配对学生的数据进行分析。t测试一下。**P < 0.01. BCD4~+肿瘤CD 45~+CD3~+总CD8~+T细胞百分比的研究A。数据以平均值±SD表示。N=每组3~5只小鼠。使用未配对的学生对数据进行分析。t测试一下。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001. C左:PD1+TIM3+耗竭CD8+T细胞百分比。中:CD 44+CD62L−记忆/效应细胞CD8+T细胞百分比。右:CD 44+CD 62+幼稚CD8+T细胞百分比。所有来自CD8+T细胞的人群B。数据以平均值±SD表示。N=每组3~5只小鼠。使用未配对的学生对数据进行分析。t测试一下。注:不显著;*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001. D左:用溶剂(黑色)、25 mg/kg AZD 6244(蓝色)或200 g PD-L1阻断抗体(绿色)作为单剂或联合治疗后,在指定时间点测定同种野生型小鼠393 p皮下肿瘤体积。治疗开始时间用黑色箭头表示。治疗开始时间以黑箭头表示,联合敏感组以(S)(红色)表示,联合抗性组以(R)(紫色)表示。右图:在治疗终点对所示实验组肺转移表面结节进行定量。数据以平均值±SD表示。n=5只小鼠/组。使用未配对学生的数据进行分析。t测试一下。**P < 0.01. E393 P肿瘤CD 45+CD3+总CD8+T细胞百分比D。数据以平均值±SD表示。N=5只小鼠/组。使用未配对的学生对数据进行分析。t测试一下。**P < 0.01; ***P < 0.001. F左:PD1+TIM3+耗竭CD8+T细胞百分比。中:CD 44+CD62L−记忆/效应细胞CD8+T细胞百分比。右:CD 44+CD 62+幼稚CD8+T细胞百分比。所有来自CD8+T细胞的人群E。数据以平均值±SD表示。N=5只小鼠/组。使用未配对的学生对数据进行分析。t测试一下。*P < 0.05. G左:年龄匹配的肺癌整体面积变化百分比克拉斯G12DP53−/−(Kp)每周用200克Pd-L1阻断抗体单药(蓝色)或与25 mg/kg AZD 6244联合治疗(红色)后的指定时间点,用小鼠肺的微CT成像评价。右图:指治前(第0周)和治疗终点(第17周)的KP小鼠肺横断面微CT图像。黄色圆轮廓有代表性的靶病灶。每一行代表一个单独的鼠标。

同样,我们联合治疗MEK抑制剂敏感的上皮-393 pKP肿瘤,并观察到单药AZD 6244与联合治疗组的原发性肿瘤生长速度无显着性差异(图1)。二维空间)。与我们之前的报道一致,393 p上皮性肿瘤也对单药或联合治疗产生了耐药性,但有趣的是,与AZD 6244单药耐药组相比,联合治疗组转移率有所下降,即使在原发肿瘤表现出耐药性的10周时也是如此(如图所示)。二维空间)。393 p肿瘤组织在实验终点或治疗2周后的免疫图谱显示,只有用AZD 6244单药或联合抗PD-L1治疗肿瘤时,CD8+T细胞总数才会增加(见图)。2E和补充图。3B)。同样,我们只观察到记忆/效应因子CD8显著增加。+T细胞亚群在对AZD 6244或联合治疗的应答期内(见图)。2F和补充图。3B)。不同治疗组344和393 p肿瘤免疫标记物的NanoString分析证实了我们的流式细胞术数据,表明肿瘤的治疗导致T细胞基因信号的增加。值得注意的是,耐联合治疗的肿瘤T细胞基因信号减少(补充图)。3C,d)。对包括CD4在内的其他免疫细胞群体的分析+T细胞亚群和抗原提呈细胞,在344和393 p肿瘤治疗2周后,治疗组间无统计学意义或一致的变化(附图)。3e-h).

我们先前的工作证明,基因工程小鼠模型(GEMM)中的基因突变型kp肺癌对AZD 6244单药具有抗药性。7,但对抗pd-l1阻断剂有部分反应,但在出现抗药性前约12周。20。为了验证GEMMS中同基因肿瘤模型的结果,我们单独或与AZD 6244联合治疗抗PD-L1的KP小鼠,以确定联合治疗是否能阻止耐药肿瘤的生长。与未治疗的对照组相比,接受联合治疗或抗PD-L1单药治疗的小鼠肺组织微CT显像显示肺肿瘤生长初步减轻(图1)。2G)。然而,在17周的治疗后,肺部肿瘤对单一药物和联合治疗产生了耐药性,这与我们先前的报道是一致的(见图)。2G)20.

联合治疗耐药的同基因和本地肿瘤增加了Th17CD4的水平。+T细胞

虽然344和393 p肿瘤的联合治疗表现出不同的肿瘤生长和转移表型,但两种肿瘤类型的CD8变化相似。+T细胞在对相关药物治疗的敏感性和抗药性点上的模式,这意味着一种相互的次级免疫细胞浸润,促进了CD8之后的抗药性。+T细胞浸润。为了鉴定耐药393 p和344平方英尺肿瘤中的特异性免疫细胞群和上调的细胞因子,我们用qPCR芯片分析了多种细胞因子、免疫相关受体和转录因子。数据来自免疫qPCR阵列344平方千米和393 p肿瘤治疗的个人或组合疗法描述在图中。2A,d显示与Th17CD4相关基因的持续上调+T细胞(IL 23,IL 17,IL 22,和RORγt)在耐药的393 p和344平方公里的肿瘤中(如图所示)。3A,b;补充图。4A,b)。Th17细胞是促炎CD4的一个子集。+表达rorγt并分泌促肿瘤细胞因子IL-17和IL-22的T细胞。16,21,22,23,24,25,26,27,28,29。NanoString分析比较了对联合治疗有反应和耐药的344平方公里肿瘤,证实了我们的qPCR阵列,显示了显著的上调。伊尔-17F在耐药344平方公里的肿瘤(补充图。4C)。流式细胞术分析344 SQ和393 p肿瘤组织中CCR 5含量增加。+、CCR 6+,以及IL-17+RORγt+CD4+肿瘤中出现对治疗产生抗药性的T细胞(如图所示)。3C,d;补充图。4D)。免疫组织化学染色在抗Pd-L1或联合治疗原发性KP肺肿瘤中的RORγt染色。2GRORγt升高+肿瘤浸润细胞在KP肿瘤中的抵抗治疗(图)。3E).

图3:联合治疗耐药肿瘤增加了Th17 CD4的水平。+T细胞
figure3

A细胞因子qPCR阵列热图对344平方公里肿瘤的实验结果如图所示。2A。溶剂+IgG(黑色),25 mg/kg AZD 6244(蓝色)或每周用200 g Pd-L1封闭抗体(绿色)作为单剂或以(S)(红色)表示的联合敏感组,联合耐药组以(R)(紫色)表示。B图中393 P肿瘤细胞因子qPCR阵列热图。二维空间. C图1:图5+RORγt+和CCR 6+RORγt+Th17CD4+T细胞百分比。2A。补充图中从CD4+T细胞总数中选择的所有人群。S3D。底部:CCR 5+RORγt+和CCR 6+RORγt+Th17 CD4+T细胞的代表点图。数据以平均值±SD表示。N=每组3~5只小鼠。使用未配对学生的数据进行分析。t测试一下。*P < 0.05; **P < 0.01. D图中393 P肿瘤CCR 5+RORγt+和CCR 6+RORγt+Th17 CD4+T细胞百分比。二维空间。数据以平均值±SD表示。N=每组3~5只小鼠。使用未配对学生的数据进行分析。t测试一下。*P < 0.05; **P < 0.01. E每周用200 g PD-L1封闭抗体单独或联合AZD 6244 25 mg/kg治疗Kp小鼠肺肿瘤的RORγt IHC染色,为期17周。2G。标尺=50m。

MEK抑制促进Th17细胞的分化,分泌IL-17和IL-22,促进肿瘤细胞的耐药和侵袭性。

因为Th17细胞通常需要TGF-β、IL-6和IL-23刺激才能分化。30下一步,我们要确定MEK抑制肺癌细胞是否参与Th17细胞的分化。首先,我们用AZD 6244处理小鼠KP肺癌细胞,并观察到转化生长因子-β,IL-6,和伊-23MEK抑制后的表达4A)。人非小细胞肺癌细胞株H 358和H 1299经AZD 6244体外处理后有类似的趋势(附图)。5A)。此外,AZD 6244处理人肺癌细胞后,Th17相关基因(转化生长因子-β,IL6,IL23,IL17,IL22,IL1b,和RORγt)(附图。5A)。然后,用抗CD3/CD 28激活的脾细胞共培养393 p和344 SqKP细胞,与AZD 6244共培养,并分析Th17细胞的增殖情况。体外共培养试验显示CCR 5含量增加。+RORγt+CD4+T细胞总CD4无明显变化+用AZD 6244处理393 P或344 SQ细胞时,T细胞。4B)。为了确定共培养的Th17细胞是否分泌IL-17,我们用抗CD3/CD 28激活的脾细胞共培养344 SQ细胞,用AZD 6244、抗PD-L1或两者联合处理细胞,用ELISA法分析条件培养液中分泌的IL-17水平。单独处理344平方千米的细胞,无论治疗与否,分泌的IL-17并没有显着变化(图1)。4C)。然而,脾细胞与344平方细胞共培养时,条件培养液中可检测到IL-17水平,联合治疗后,IL-17水平进一步升高(约为两倍)(如图1所示)。4C)。接下来,我们检测了Th17细胞分泌的IL-17和IL-22细胞因子是否促进了肺癌细胞的耐药和侵袭。重组IL-17和IL-22处理的393 p和344 SQ细胞通过基质包被的Transwell插入物具有更强的侵袭性(图1)。4D),对体外AZD 6244 MEK抑制反应减弱。4E).

图4:MEK抑制促进Th17细胞的分化,而Th17细胞分泌IL-17和IL-22,促进肺癌细胞的耐药和侵袭性。
figure4

A用10μm AZD 6244处理48h后,对344 SQ(左)和393 p(右)小鼠KP细胞系转化生长因子-β(黑色)、IL-6(绿色)和IL-23(紫色)基因表达进行了qPCR分析,数据为平均值±SD。n=3.使用未配对学生的数据进行分析t测试一下。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001. B左:CD4%+CD 45门控T细胞+CD3+抗CD3/CD 28激活的脾细胞(Sp)与393 p(蓝色)或344 SQ细胞(红色)共培养,用10 mAZD 6244处理96h。+RORγt+来自CD4的Th17细胞+T细胞群(左)后,共培养和治疗条件,前面描述。数据以平均值±SD表示。n=3-4.使用未配对学生的数据进行分析t测试一下。*P < 0.05. CELISA法测定单独培养或与脾细胞共培养(Sp)、10 mAZD 6244和/或20μg/ml Pd-L1阻断抗体作用96h的IL-17浓度,数据为平均值±SD。n=3-4.使用未配对学生的数据进行分析t测试一下。**P < 0.01. D393 p和344平方细胞通过基质包被的Transwell插入剂±IL-17和IL-22细胞因子刺激的定量和代表性图像。数据以平均值±SD表示。n=3.使用未配对学生的数据进行分析t测试一下。*P < 0.05; **P < 0.01. Scale bar = 200 µm. E细胞在393 p和344 SQ细胞±IL-17和IL-22细胞因子刺激下72h的细胞存活反应(AZD 6244)。数据以平均值±SD表示。N=每浓度6-8次。FIL-17和/或IL-22单独或联合作用于393 p和344 Sq细胞中指示蛋白的Westernblot分析。G白细胞介素22RA1在小鼠上皮细胞(灰色)和间充质细胞(黑色)中表达的qPCR分析。数据以平均值±SD表示。n=3项技术性三倍。使用未配对的学生对数据进行分析。t测试一下。****P < 0.0001. H拟议工作模式。联合治疗的初始反应促进耐药肿瘤细胞释放IL-6、TGF-β和IL-23细胞因子.释放的细胞因子促进CD4+T细胞分化为Th17细胞,分泌IL-17和IL-22,增强对MEK抑制和PD-L1阻断的抗性。

虽然Th17相关细胞因子促进了393 p和344 Sq细胞对MEK抑制剂的耐药性和癌细胞的侵袭,但与393 P肿瘤相比,344 Sq肿瘤在联合治疗后的转移率高于393 p肿瘤,提示抗PD-L1对肿瘤有不同的反应。免疫抑制分子的westernblot分析表明,在IL-17或IL-22作用下,393 p细胞可上调PD-L1蛋白水平。相反,尽管344平方细胞有较高的pd-l1的基础水平,如前所述。9用IL-17刺激344 SQ细胞可降低pd-L1的表达,但显著增加CD 38的表达,从而促进免疫抑制性肿瘤的微环境和对pd-(L)1免疫检查点的阻断。20。此外,Westernblots还显示,当393 p细胞单独或联合作用于IL-17或IL-22时,p-STAT 3的表达也增加,而344 SQ细胞的p-STAT 3基础水平较高,而p-STAT 3信号仅在IL-22刺激下才能增强(如图所示)。4F).

为了探讨393 p和344 SQ细胞对IL-17和IL-22刺激的差异反应,我们分析了IL-17和IL-22受体在小鼠KP细胞中的表达情况。尽管IL17RAIL17RC所有细胞系的表达相似(附图)。5B),我们观察到IL22RA1所有转移,间充质KP细胞(图)。4G)与无转移上皮细胞比较。此外,IL22RA1ZEB 1过表达或获得对AZD 6244耐药后,393 p细胞表达升高(附图)。5C)。相反,miR-200在间充质344 SQ细胞中的过表达显著降低。IL22RA1表达,表明EMT和IL22RA1表达之间有很强的相关性(补充图)。5C). IL22RA1重组IL-17A对393 P细胞也有诱导作用。5C)。我们的发现提出了一种抑制肺癌细胞分泌Th17细胞因子IL-6、TGF-β和IL-23的工作模型。4H)。浸润的Th17细胞分泌IL-17和IL-22,促进原发性肿瘤对联合治疗的耐药性。4H).

Th17基因标记预测pd-1阻断治疗的癌症患者的应答和总生存期。

为了评估我们发现的临床相关性,我们分析了抗PD-1治疗患者的rna-seq数据集中Th17相关基因的特征,以预测免疫检查点阻断治疗的反应。首先,我们分析了非小细胞肺癌患者肿瘤治疗前可公开发表的rna-seq数据。31。Th17相关基因的表达IL17RA、IL17RC、IL22RA1、RORC、CCR 5、CCR 6、IL6、IL23、TGF-B1)在治疗前,非小细胞肺癌患者样本显示IL17RC与进展性疾病相关的mRNA与抗PD-1相关(图1)。5A(12例为进展性疾病,4例为部分缓解)。此外,较高的病人IL17RC表达显示整体和无进展生存率较差,但由于样本数量少,差异没有统计学意义(补充图)。6a,b)。虽然对其他Th17相关基因的分析没有显示出抗PD-1反应或存活的显着性差异,但我们的临床前数据表明,肿瘤中Th17细胞的上调是在治疗后才发生的。不幸的是,对于单用免疫疗法治疗或联合使用mek抑制剂的肺癌患者,治疗前后没有匹配的数据集,因此,我们分析了从抗pd-1治疗的黑色素瘤患者中公开发布的数据集。32。与非小细胞肺癌患者数据集一致,几乎一半的黑色素瘤患者拥有MAPK通路的激活突变,包括克拉斯BRAF(补充图。6C)。同样,在治疗前黑色素瘤患者标本中Th17相关基因的表达分析显示,IL17RCMRNA与进展性或稳定性疾病相关,而较低IL17RCMRNA与抗PD-1的部分或完全反应相关(如图所示)。5B)。治疗前和治疗后黑色素瘤患者样本基因表达的比较显示,IL17RA,TGF-1,和CCR 5当病人接受抗PD-1治疗时(见图)。5C)。由于患者对多种标记物的基因表达有不同的变化,对Th17相关基因表达的净变化(治疗前和治疗中活检之间的表达方向变化)的分析预测,在表达下降的患者中,总生存率将显著改善。RORγt,IL17RA,TGF-B1,和CCR 5(无花果)5D)。在与CD4亚群相关的其他基因的净变化中,患者的总体生存率没有显着性差异(补充图)。6d)。我们对临床数据的分析证实了我们的实验结果,并确定Th17相关基因是预测免疫检查点阻断后患者预后的有希望的标记。

图5:Th17基因标记与IO治疗的黑色素瘤患者生存率下降有关.
figure5

A非小细胞肺癌进展性疾病(PD)与部分抗Pd-1治疗(Nivolumab)患者IL17RC mRNA水平差异有显着性(P<0.05)。12例为进展性疾病,4例为部分缓解。具有显着性意义的双边Wilcoxon匹配对秩检验统计量P < 0.05. B治疗前IL17RC mRNA水平的黑色素瘤患者表现为进展或稳定的疾病(PD/SD)与部分或完全反应(PR/CR)抗PD-1治疗(Nivolumab)。36例为PD/SD,10例为PR/CR。具有显着性意义的双边Wilcoxon匹配对秩检验统计量P < 0.05. C左:IL17RA,中间:TGFβ1,右侧:Nivolumab治疗前后黑色素瘤患者CCR 5 mRNA表达水平。用Wilcoxon配对秩检验进行统计学分析。39份独立的病人样本,用于治疗前和治疗中。盒子图显示为中位数±1四分位数,胡须延伸到一个极端的数据点。用双侧Wilcoxon配对秩检验计算的统计量,具有显着性P < 0.05, **P < 0.01. DKaplan-Meier曲线预测黑色素瘤患者的生存,根据RORγt,IL17RA,TGF B1和CCR 5的净变化。存活率下降的百分比以蓝色表示,而以红色表示的百分比增加。采用对数-秩Cox检验进行统计学分析。

中和IL-17对MEK联合抑制和pd-L1阻断治疗的抵抗力

为探讨白细胞介素-17(IL-17)产生增加的体内效应,将IL-17的治疗性抗体中和与MEK抑制、PD-L1检查点阻断或MEK抑制剂联合抗PD-L1联合应用于小鼠移植后3周的肿瘤中。对344平方公里肿瘤的初步治疗表明,与对照组、单一治疗组或不同双联合治疗组相比,三联疗法治疗3周后最明显地降低了原发肿瘤生长和肺转移(图一)。6A-c)。为了评估另外一种kp肺癌模型的三联疗法,我们治疗了393例对硒美替尼产生耐药性的肿瘤。7(393 p-AR1)与相同的治疗组,并观察到肿瘤生长明显下降,仅治疗三联疗法(图一)。6d,e)。为了确定三联疗法是否能维持肿瘤生长的长期减少和防止耐药生长,我们治疗了344平方千米的肿瘤10周,这表明与双联合治疗相比,三联疗法可以消除耐药肿瘤的生长和转移(图一)。6f-h).

图6:中和IL-17可解除对MEK抑制和Pd-L1阻断联合治疗的抵抗.
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A用25 mg/kg AZD 6244与每周200 g PD-L1和/或200μg IL-17阻断抗体联合治疗后,对同基因野生型小鼠344平方公里皮下肿瘤的体内肿瘤体积进行测量,从肿瘤生长的第3周开始。溶剂+IgG(黑色),每日25 mg/kg AZD 6244(蓝色),每周用200 g PD-L1阻断抗体(绿色),每周用200 g IL-17封闭抗体(灰色),联合阻断抗体200 g PD-L1+200 g IL 17(紫色),组合25 mg/kg AZD 6244+每周200 g阻断抗体IL 17(粉红色),组合25 mg/kg AZD 6244+每周200 g阻断抗体PD-L1(红色),复合25 mg/kg AZD 6244+每周200 g阻断抗体-L1+200 g阻断抗体IL 17(TEAL)。数据以平均值±SD表示。n=4-5.使用未配对学生的数据进行分析t测试一下。*P < 0.05. B, C肿瘤重量B肺转移结节C在实验终点344平方公里的肿瘤中A。数据以平均值±SD表示。n=4-5.使用未配对学生的数据进行分析t测试一下。*P < 0.05; **P < 0.01. D用25 mg/kg AZD 6244与200 g PD-L1和/或200μg IL-17阻断抗体联合治疗后,对同基因WT小鼠393 pAR1皮下肿瘤在指定时间点的肿瘤体积进行测量,从肿瘤生长的第12天开始。溶剂+IgG(黑色),每日25 mg/kg AZD 6244(蓝色),每周用200 g PD-L1阻断抗体(绿色),每周用200 g IL-17封闭抗体(灰色),联合阻断抗体200 g PD-L1+200 g IL 17(紫色),组合25 mg/kg AZD 6244+每周200 g阻断抗体IL 17(粉红色),组合25 mg/kg AZD 6244+每周200 g阻断抗体PD-L1(红色),复合25 mg/kg AZD 6244+每周200 g阻断抗体-L1+200 g阻断抗体IL 17(TEAL)。数据以平均值±SD表示。n=每组4~5只小鼠。使用未配对学生的数据进行分析。t测试一下。**P < 0.01. E肿瘤重量393P-AR1肿瘤在实验终点D。数据以平均值±SD表示。n=5.使用未配对学生的数据进行分析t测试一下。*P < 0.05; ***P < 0.001. F用25 mg/kg AZD 6244与200 g PD-L1阻断抗体或200μg IL-17A阻断抗体联合治疗后,对同基因野生型小鼠344平方公里皮下肿瘤在指定时间点的肿瘤体积进行测量。黑色箭头表示治疗开始时间。溶剂+IgG(黑色),25 mg/kg AZD 6244+每周200 g阻断抗体PD-L1(红色),25 mg/kg AZD 6244+每周200 g阻断抗体PD-L1+200μg阻断抗体IL 17(Teal)。数据以平均值±SD表示。n=9只小鼠/组。使用未配对学生的数据进行分析。t测试一下。*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001. G, H肿瘤重量G肺转移结节H在实验终点344平方公里的肿瘤中F。数据以平均值±SD表示。n=9只小鼠/组。使用未配对学生的数据进行分析。t测试一下。*P < 0.05; *P < 0.01; ***P < 0.001.

实验终点肿瘤的免疫分析显示CD8总数增加。+和记忆/效应因子CD8+T细胞随后减少精疲力竭和幼稚的CD8+T细胞(图1.7A)。虽然CD4总数+T细胞水平没有变化(补充图)。7A),我们观察到CCR 6持续增加+和CCR 5+RORγt+Th17细胞对双重联合治疗耐药,而用三联疗法治疗的肿瘤则阻止Th17细胞数量的增加(图1)。7b)。我们的发现提出了一种工作模式,在这种模式中,单一药物治疗选择了耐药的上皮细胞或间充质细胞,而MEK抑制剂与PD-L1阻断联合治疗可以减少上皮细胞和间充质亚细胞,从而抑制整个肺肿瘤的生长(图一)。7C)。虽然IL-17分泌的Th17细胞浸润促进了联合治疗的耐药,但中和IL-17可消除耐药性,产生持续活化的CD8。+T细胞水平和肺癌的减少,验证了一个很有前途的三重组合治疗策略,以克服单一药物或联合治疗耐药在KRAS驱动的肺癌(图一)。7C).

图7:中和IL-17促进促炎性肿瘤免疫微环境。
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A占CD 45的百分比+CD3+总CD8+T细胞和精疲力竭、记忆/效应因子和幼稚CD8的百分比+T细胞亚群的门控标记,从344平方公里的肿瘤,从实验在图中。6f。数据以平均值±SD表示。n=4-5.使用未配对学生的数据进行分析t测试一下。*P < 0.05; **P < 0.01. BCCR 6的百分比+和CCR 5+RORγt+来自CD4的Th17细胞+T细胞群。数据以平均值±SD表示。n=4-5.使用未配对学生的数据进行分析t测试一下。*P < 0.05; **P < 0.01. C提出MEK抑制剂与抗PD-L1组合耐药的工作模型。联合治疗的初步反应促进CD4+T细胞分化为Th17细胞,分泌IL-17和IL-22,促进对MEK抑制和PD-L1阻断的抗性。中和IL-17,结合MEK抑制和Pd-L1阻断,可消除耐药肿瘤的生长。

讨论

MEK抑制剂对KRAS突变型肺癌的治疗失败,抗PD-1/PD-L1免疫检查点阻断治疗的持续持续应答率低,强调需要了解提高患者生存的耐药机制。在这里,我们确定了pd-l1和phk信号在肺肿瘤中的相互表达,证实了以前在多种癌症类型中报道的一种很有前途的双组合治疗方法:MEK抑制剂或抗pd-l1。13,33,34,35,36。与以前的工作一致34,37MAPK抑制与PD-L1阻断联合作用可使KP肺癌的生长明显减弱。然而,尽管在我们的KP临床前GEMMS中对双重联合治疗甚至抗Pd-L1单一疗法有初步的反应,但肺肿瘤最终对联合治疗产生了耐药性。此外,同基因KP肿瘤模型显示,对MEK抑制剂有不同基线敏感性的肺癌细胞的不同亚群也产生了对双重联合治疗的耐药性,表明一种相互作用的因素促进了耐药。在这里,我们发现Th17CD4急剧增加。+Kp同基因模型和GEM模型耐药肿瘤中的T细胞。CD4亚群的增加+在黑色素瘤1b期的研究中,部分证实了t细胞,包括MAPK抑制剂和pd-l1检查点阻断。33。此外,我们的数据表明,MEK抑制或PD-L1阻断足以显著增加Th17肿瘤的浸润。我们进一步证明,Th17细胞分泌的IL-17和IL-22细胞因子与促进耐药、侵袭和转移直接相关。不同肺癌模型的免疫抑制标记物分析显示对Th17细胞因子有不同的反应。在低基础水平的pd-L1、IL-17和IL-22刺激的393 P细胞中,Pd-L1和IL-17的表达上调,而表达高基础水平的pd-L1和IL-17的344 SQ细胞特异性地抑制了PD-L1的表达,但显著上调了CD 38的表达。我们先前已经证明,CD 38对于免疫逃避和pd-l1的阻断是至关重要的。20。在此,我们证明Th17细胞浸润和IL-17刺激癌细胞是治疗后CD 38上调免疫治疗耐药的机制之一。此外,pd-L1中Th17细胞的基础水平升高。低层393 P肿瘤提示Th17细胞可能是原发性免疫逃避和肿瘤形成的机制之一。

KL细胞株增加pd-l1水平的观察与以前的报道一样,意义重大。STK 11(LKB 1)克拉斯突变型肺肿瘤由于pd-l1的低表达而促进抗pd-(L)1治疗的耐药性38。虽然我们的临床前发现包含在kp同基因模型中,但pd-l1在突变体中的表达增加。KRAS;STK 11(KL)肺癌细胞系提示我们的治疗策略可能扩展到KL肺癌亚型。进一步研究哪些共同发生的突变导致Th17细胞在耐药肿瘤中的浸润增加,将有助于更好地理解Th17细胞如何潜在地促进基线和获得性肿瘤免疫逃避。

虽然Th17细胞通常与炎症反应有关。22对黑色素瘤患者Pd-1阻断治疗前后的rna-seq数据的分析表明,Th17相关基因信号的净增加与不良反应相关,并预测治疗后总体生存率较差。这些临床发现证实了我们的实验数据,并确定Th17基因是潜在的抗药性标志。

我们发现Th17相关的细胞因子IL-17单独或联合抑制抗pd-l1,证实了一种新的肺癌患者三重组合治疗策略,这与观察到IL-17参与肿瘤的进展是一致的。21,25。此外,联合治疗后癌细胞IL-6表达的增加以及Th17在自身免疫中的作用表明,IL-17阻断有可能改善免疫检查点阻滞引起的临床不良事件。16,39,40,41。我们提出的三重组合治疗策略的一个主要优点是,所有三个目标目前都有获得fda批准的药物,因为fda批准了IL-17药物来治疗银屑病。42。此外,我们的研究结果强调,需要可访问的肺癌患者数据集与匹配的治疗前后活检,以预测病人的反应,并确定潜在的联合治疗策略,以提高患者的生存率。


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