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机械生物膜破坏导致牙周炎患者微生物和免疫功能的改变

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发表时间:2021-05-08 14:44作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

牙周炎的特点是牙龈下生物膜失调、炎症和组织破坏。目前的治疗方法包括机械生物膜破坏,称为非手术性牙周治疗。本研究试图描述治疗对微生物多样性和整体群落的影响,以及对口腔宿主炎症的平行影响。本研究收集了42例牙周炎患者的牙周临床参数、牙龈下菌斑和治疗后90天的唾液样本。唾液细胞因子定量,牙龈下菌斑16S rRNA测序分析。经处理后,与健康有关的微生物组成和多样性发生了明显的变化,包括42属61种的不同丰度。这些改变伴随着大量的临床改善(口袋≥5毫米,27.50%至9.00%,p < 0.001) and a decrease in salivary IL-1β (p < 0.001)—a putative marker of periodontal inflammation. Despite significant reductions in disease associated anaerobes, several genera (镰刀菌,Prevotella,Tanenerella,Treponema)仍然存在,并形成一个与残留疾病相关的明显亚网络。综上所述,这项研究表明,目前的牙周治疗可以部分恢复健康的微生物生态系统,但有些患者的生物膜功能失调和宿主炎症的特征仍然存在,这与临床反应有着惊人的独立性。

导言

牙周炎(Pd)是一种高度流行的生物膜介导的慢性口腔炎症状态,影响到50%的人群,其中10%患有严重疾病。1,2。PD是通过牙龈下菌斑生物膜的形成而产生的,这种生物膜会使牙龈组织内的免疫反应加重。3。反过来,这又导致了宿主-细菌相互作用的持续循环,炎症促进了微生物群的更大的失调,反之亦然。4。如果不加以治疗,这种免疫反应将导致牙周膜和牙槽骨的不可逆损伤,最终导致易感个体的牙齿丢失。新的证据表明,pd的后果可能超出口腔,先前的研究表明牙周炎与糖尿病风险之间存在关联。5,6,类风湿关节炎7,8,9,动脉粥样硬化10,11、高血压12,13阿尔茨海默病14。考虑到牙齿脱落的营养和心理社会后果以及PD与全身疾病之间的联系,恢复牙周健康(PH)对口腔和一般健康都是必不可少的。目前的治疗是资源密集型的,耗时的,而且往往只是部分成功。因此,有必要了解微生物和宿主的免疫反应,以进一步优化治疗结果。

有几项研究一致地记录了pd牙龈下菌斑的独特细菌特征,苏格拉斯基对不同复合体的开创性发现--每一种都指定了一种颜色--根据它们与健康和疾病的关系(红色、橙色、绿色、紫色、蓝色、黄色),将相关的细菌群分解。15。值得注意的是,“红色复合体”由牙龈卟啉单胞菌[医]齿密螺旋体与PD严重程度密切相关。最近,分子研究的进展表明牙龈下菌斑的多样性比先前所设想的要高。16,17,18,19,20。而“红色情结”与疾病的关系依然存在21,大规模的分析显示,整个菌斑群落的失调,与微生物多样性和厌氧菌增加有关。16,17。根据这些发现,最近的一项系统审查记录了几个与PD有关的新物种,例如[医]菲氏因子(Philifactor Alocis)蛇床子22.

慢性炎症反应牙龈下菌斑生物膜是pd的一贯特征,局部产生的炎症介质逃逸到循环中被认为是口腔和全身健康之间的一种联系。23。唾液中的促炎细胞因子被认为是潜在的pd生物标志物,独立的横断面研究显示pd中几种细胞因子的水平高于健康。24,25。然而,这似乎并不是一致的独立研究和病人队列。例如,Ebersole等人.,结果发现,10 1例PD患者唾液中白细胞介素-1β和白细胞介素-6水平高于65例健康对照者。24。相比之下,Teles等人.,74例PD患者和44例健康对照者唾液中两种细胞因子的测定结果无显着性差异。26。因此,描述细胞因子如何对临床状态的改善作出反应,可能为了解细胞因子在PD中的作用提供了一个重要的见解。

考虑到先前发现的与PD相关的宿主和微生物标志物,我们试图评估这些标志物如何反映疾病的严重程度和治疗后的变化以及临床状况的改善。非手术性牙周治疗(Npc)是大多数pd患者的第一道治疗方案,包括用手或超声波刮除牙龈线下面的生物膜,导致广泛的(虽然不是完全的)临床改善。27, 28。为了防止疾病复发和潜在的系统并发症,了解物理生物膜破坏是否足以减少局部炎症和微生物失调是至关重要的。唾液细胞因子和微生物群在健康和疾病的横断面研究中有很好的特点。16,17,24,26然而,对治疗的变化了解有限。在本研究中,我们旨在研究牙龈下菌斑微生物群和唾液炎性细胞因子-与基线疾病严重程度的关系,并纵向跟踪国家防止酷刑小组委员会。

方法论

研究人群、治疗和临床检查

这一纵向研究是根据“赫尔辛基宣言”(2013年)进行的,并得到伦理批准(伦敦-斯坦莫尔研究道德委员会,参考:14/LO/2064)。符合条件的病人从格拉斯哥牙科医院转诊而来。牙周炎的定义是指在不包括第三磨牙的两个或更多牙齿上探测口袋深度≥5mm。29。其他纳入标准包括书面知情同意,以及18岁的男性或女性≥。排除标准包括糖尿病、类风湿关节炎、已知或怀疑有肺结核、乙型肝炎或艾滋病毒感染的风险,或有出血史。共招募了45名患者,并提供了书面同意参加这项研究。在试验期间,三名病人因新诊断为全身疾病而被排除在外。因此,对42例患者进行了分析。

国家预防小组委员会由一名经验丰富的牙科卫生医生提供,他与经验丰富的牙周病医生进行了校准。患者返回不同数量的治疗访问(在1-6之间)取决于疾病的严重程度和首选的治疗时间。牙周参数评估前任何治疗访问(基线)和90天后,最后一次治疗访问(第90天)(图)。1a)。牙周参数按每颗牙6个部位进行评估,包括全口菌斑评分。30满口出血分数31(无花果)1b)。记录牙周袋深度(PPD)、牙龈边缘位置(LGM)和临床附着水平(CAL),并将其除以位点总数,得出平均满口腔评分。牙周炎症表面积(PISA)的计算如前所述。32.

图1
figure1

概述学习协议(A)和牙周临床测量的收集(B)。测量每颗牙周围6个部位的斑块指数、BOP、PPD和CAL。CEJ;水泥釉质结;探诊出血,PPD;探诊袋深度,CAL;临床附着丧失。使用BioRender创建的图像。

样品采集与处理

在基线和第90天采集牙龈下菌斑和唾液。在基线,牙龈下菌斑是从每个象限最深的口袋用刮子收集,然后放置在含有500 uL无菌磷酸盐缓冲液的Eppendorf管中(Sigma Aldrich,Gillingham,英国)。通过离心(13,500 rpm,10 min)分离细菌细胞,丢弃上清液.从每个病人中挑选一个位点进行测序,并在治疗前后对同一部位的样本进行测序,以确保准确的纵向分析。从右上象限采集的样本优先选择(n=35),除非无法在第90天对同一部位进行取样。在这种情况下,选择来自不同象限的治疗前后样本:左上(n=1),右下角(n=3),左下(n=3)。唾液采用被动流口水法收集,离心(13,000 rpm,5分钟),如前文所述。33。所有样本都被转移到附近的实验室并立即处理。样品保存在-80°C,待分析。

唾液细胞因子分析

用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒测定唾液肿瘤坏死因子α(α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)的浓度。唾液白细胞介素-8(IL-8)用双抗体夹心ELISA试剂盒(生物技术研究与开发系统,英国阿宾登)进行定量。唾液白细胞介素-17A(IL-17A)用高灵敏度的ProQuantity免疫分析法进行定量,用StepOne+实时PCR分析仪(英国拉夫堡温菲赫)进行。样品按厂家说明书稀释1:2用于IL-1β、TNF-α和IL-6,1:3为IL-8,1:5为IL-17 A。1例标本量有限,不包括在任何唾液分析(41例唾液细胞因子)。细胞因子检测限为:IL-6:0.0 4 pg/mL,IL-1β:1.35 pg/mL,IL-8:6.78 pg/mL,TNF-α:0.14 pg/mL,IL-17A:2.75 pg/mL。所有标本均检测IL-6、IL-1β和IL-8.3例肿瘤坏死因子α<LOD(基线1例,90天2例),12例IL-17A<LOD(基线10例,90天2例)。在统计分析方面,样本<LOD被指定为LOD/2。

细菌16S rRNA序列分析

用Magna纯LC DNA分离试剂盒(德国曼海姆罗氏诊断学)从牙龈下样品(基线和第90天)中提取DNA,并在Rosier等人之后加入含有溶菌酶、mutanolysin和溶菌素的酶促混合物的化学裂解步骤。. 202034。用QubitTM 3荧光计(美国马萨诸塞州沃尔塔姆温菲希尔)和16S rRNA基因亚基因组测序库制备Illumina程序(第15,044,223 Rev.A部分)制备了Illumina扩增文库。本协议中使用的引物序列为;Illumina_16S_341 F(TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG)和Illumina_16S_805R(GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC)主要针对16S V3和V4区域。扩增后,根据制造商的指示,使用2×300碱基配对协议对DNA进行了测序。在分类学分类方面,使用R中的DADA 2流水线获得了一个放大器序列变异表(ASV)。35。分类法是通过与Silva数据库的比较来分配的。36,其中朴素贝叶斯分类器用于在属和物种级别上分配序列。

数据分析

数据最初被收集到SPSS(v26,IBM)中。收集后,用Wilcoxon符号秩检验用GraphPad PRISM(V8)对临床特征和唾液细胞因子进行纵向分析。根据数据分布采用Spearman-Rho(非参数)或Pearson(参数)进行相关分析。

为分析牙龈下菌斑微生物群,采用R编程语言(v3.4+)进行统计计算。37。α-多样性指数(Shannon,ACE,Chao 1)是在物种水平上计算出来的,利用R中的Vegan库重新填充到9000条数据。38,在GraphPad PRISM(v.8)中用配对t检验评估纵向差异。

用总和标度法(TSS)计算相对丰度。微生物群统计分析中只包括了检出信号最小的属和种。具体而言,如果50%的样本中至少有一组(与Wilcoxon检验相关)或来自被研究的特定组(与关联网络和Spearman相关)中的一种或一属存在,则该物种或属被包括在内,其丰度高于最小百分比在零以上的5倍以上。在单因素分析中,用Wilcoxon符号秩检验(即R的统计库的检验函数)检验基线与90天的种属差异,并用5%的本雅明-霍奇贝格错误发现率(FDR)进行多次比较。39。因此,只有调整后的p值用于分类比较.为了比较已知的健康和疾病相关生物的丰富程度,根据苏格拉斯基等人所勾画的颜色复合体对物种进行了分类。15。分组表示相关物种的总和,详见补充表2。

对于关联网络,基于González等人描述的多元方法计算了属与种之间的成对关联。40,它是在“MixOmics”R包中实现的。41。简单地说,属与种之间的关联是根据它们在主成分分析得出的相关圆图上的投影得到的。在关联网络中,只有在-0.4以下的负关联和在0.4以上的正关联。网络图是用R‘g图’包得到的。42。为了补充关联网络,利用Spearman的Rho和相关p值,用cor.test函数确定了属和种之间的相关性。

对于多变量分析,R的Vegan库提供了Adonis检验(利用距离矩阵进行变异的多元方差分析)。38,用于比较各组间的总体组成。为了在二维映射中可视化群及其差异,我们通过约束对应分析(CCA)计算约束主成分,这也是Vegan库的一部分。38。利用微生物分析仪进行主坐标分析43,使用过去的软件计算Bray-Curtis相似(v4.01)44。所有图都是用GraphPad PRISM(V8)或R组合而成的。37.

结果

研究人群和临床参数

牙周炎患者谁需要专家牙周治疗被招募(图)。1a)。分析中患者的平均年龄为50岁,男12人,女30人(补充表1)。治疗后,所有牙周临床参数均有明显改善(p < 0.001 for all, Table 1)。与全口参数(所有牙齿的平均水平)相比,在牙龈下菌斑采集部位治疗后,基线疾病的严重程度更高,临床改善也更大(ppd和cal,均为ppd和cal)。p < 0.001, Table 1).

表1基线和第90天牙周参数的比较(n=42)。

牙周治疗后的微生物群

对牙龈下菌斑样本进行测序,在84个样本中产生4745个ASV,平均每个样本读取90,830条(从35,372条到343,259条不等)。去除单个个体后,这些ASV被分类为206属379种。稀疏曲线表明,对分类多样性进行可靠的估计是可行的,每个样本的阅读量为9,000次(图1)。2a)。治疗后,牙龈下菌斑分类多样性明显减少,与评估方法无关(p < 0.001 for all, Fig. 2b)。

图2
figure2

牙龈下菌斑样本的α多样性。观察到的物种在基线(红线)和第90天(蓝线)的稀疏曲线(A)。比较物种级治疗前后Shannon、ACE和Chao 1指数的差异(B)。统计数据为配对t检验,*p < 0.001. n = 42. Bars represent mean with individual values shown.

随着微生物多样性的变化,处理导致了微生物组成的明显变化,这是通过CCA分析在属-(图)。3(A)和物种水平(图1.3b)。对不同属和种的评价结果显示,在基线和90天样本中,有42属和61种的物种发生了显著变化(附图)。1)。在42属中,34属减少,8属增加;在物种水平上,处理后46种减少,15种增加(补充数据集)1)。为了找出对组分变化贡献最大的属和种,采用进一步的丰度筛选(平均丰度均大于0.15%),并对31属44种进行了差异多度分析。在31属中,25属减少,6属增加(图1)。3c)。在物种水平上也有类似的趋势,处理后32种减少,12种增加(图1)。3d)。

图3
figure3

评估治疗后牙龈下菌斑组成的纵向变化。典型对应分析(CCA)比较基线(红色)和第90天(蓝色)样本在属和物种水平(AB分别)。原木2所有重要属的褶皱变化(C)和物种(D)两者的平均丰度均大于0.15%。阳性值(蓝条)表示治疗后显著增加的生物,负值(红条)表示治疗后显著下降的生物。Wilcoxon符号秩检验,用Benjamin amini-Hochberg错误发现率(5%)进行校正.所有绘制的有机体p(经调整)<0.05。N=42。NA表明没有在属或种级别上进行分类。

总体上有明显的趋势,即严格的厌氧物种的丰度随着国家防止酷刑小组委员会的出现而减少,兼性厌氧或好氧细菌数量增加。有趣的是,在物种层面,增长幅度最大的是[医]意大利卟啉单胞菌(P[调整]=0.02)属于传统疾病相关属,尽管其丰度相对较低(占补充图总数的0.6%)。1).

健康和疾病相关生物的变化

历史上,苏格拉斯基等人.15识别出不同的复合物,并根据它们与疾病关联的强度,给每一种颜色(红色、橙色、绿色、紫色、蓝色和黄色)指定颜色。红色和橙色复合物含有与疾病相关的生物群,而绿色、紫色、蓝色和黄色复合物则含有更多与PH相关的物种(补充表)。2)。经处理后,红色和橙色复合体的丰度显著减少(p < 0.001 for both). No difference was observed in green and purple complexes, whilst significant increases were found in the blue (p < 0.01) and yellow (p < 0.001) complexes at day 90 (Fig. 4a)。Perez-Chaparro等人最近的评论.,发现了一个更复杂的疾病相关细菌群落22,经过处理后,这些物种的丰度也有了类似的下降,当它们聚在一起时(p < 0.001, Fig. 4b)。在这一组中,大多数个体物种的数量显著减少(p < 0.05, Wilcoxon signed rank tests), with the exception of 密螺旋体培养基[医]假单胞菌它们的丰度很低。

图4
figure4

比较牙龈下菌斑中健康和疾病相关物种的丰富程度。16 SrRNA测序检测到的物种分为苏格拉斯基(1998)红、橙、绿、紫、蓝、黄三种(A)。Perez-Chaparro(2014)确定的与疾病相关的“新”物种之和的比较(B)。图B所列物种如下;梅毒螺旋体培养基、胃肠球菌、齿状假丝酵母菌、假丝酵母菌、菲氏因子alocis、sputigena Selenomonomonassputigena、革兰氏变态反应菌、geminatus Anaeroglobus geminatus、嗜筋膜杆菌、齿内卟啉单胞菌、文茨密螺旋藻、卵卵石霉和肺炎双歧杆菌。给出了所有个体的图克盒图(N=42)。Wilcoxon签名秩检验*p < 0.001, *p < 0.05, ns means no significant difference. P-数值用FDR调整(5%)。

属丰度与关联网络

以及组分变化(附图)。2),对细菌关联网络的分析显示,整个群落结构发生了变化。网络分析采用相关圆图(附图)。3),并强调了在每个时间点的个别属和物种的不同聚类。大多数属间的关联(基线为93.2%,90天为90.0%)和物种(基线为88.3%,90天为90.3%)得到了显著的Spearman-Rho相关性的支持(p(调整后)<0.05,补充数据集1).

在基线,有两个疾病相关的集群组成厌氧属(图一)。5a)。第一个预处理网络由Prevotella, 硒单胞菌, 迪亚里斯特, 茄杆菌, 奥尔森拉阿托邦,同时艾克涅拉集杆菌与其中一些属呈负相关(图一)。5A,红线)。在第二组中,菲利普因素假单胞菌都与所有三个红色复杂属(即,卟啉单胞菌, 密螺旋体, (坦纳雷拉)。治疗后(如图所示)。5),一个新的疾病相关网络被观察到。密螺旋体, Prevotella,Parvimonas,Fusobacterium, [医]阿氏菌, 硒单胞菌, 迪亚里斯特,和卡托内拉。重要的是,罗西娅与.硒单胞菌, 梭杆菌,和Prevotella在这个集群中,同时也发现了以下两种类型之间的正相关关系罗西娅放线菌.

图5
figure5

细菌关联网络利用主成分分析得出的相关圈图,在各时点建立了丰富属种间的关联网络。(A)GENUS级基线网络,(B)第90天的属级网络,(C)基线上的物种级网络,(D)90天的物种级网络。只显示关联<−0.4(负关联)和>0.4(正关联)。

在物种水平上也观察到了类似的结果菲氏因子猫黄杆菌是一个密切相关的厌氧菌网络的中心,在基线时与各种PD相关的生物形成了强有力的联系(图一)。5c)。后续治疗(图1.5d),齿状Rothia docariosa与未分类硒单胞菌SP.和厌氧带Sp.,同时马氏棒状杆菌与.[医]无齿梭杆菌帕维莫纳斯·米克拉两个橙色的复杂物种。

微生物群、疾病严重程度及对治疗的反应

为探讨微生物区系与临床疾病严重程度的关系,采用Spearman-Rho相关分析方法,对采样牙袋深、个体属/种丰度与α-多样性指数进行了相关分析。没有观察到站点口袋深度与任何属或种的丰富程度之间的联系。然而,当考虑到整个牙齿的疾病严重程度(平均6个位点)时,注意到了一些积极和消极的关联。在基线时,牙袋深度与α-多样性指数,特别是Shannon指数呈弱的正相关(r=0.403,p(=0.008),但没有发现与任何个别属或物种的丰富程度有关联。在第90天,与Shannon指数(补充表)没有关联。3)。相反,牙齿PPD与严格的厌氧菌属之间存在微弱的正相关关系。密螺旋体, Prevotella, 帕维莫纳斯, [医]阿氏菌, 迪亚里斯特和非机密Clostridiales第十三家庭),而兼性厌氧菌则呈负相关(棒状杆菌, 肉芽肿金黛拉)。有趣的是,所有与牙袋深度正相关的属都是90天发现的其余疾病相关网络的关键成员(图1)。5c)。相反,棒状杆菌与袋深呈负相关,与其中两个属呈负相关。迪亚里斯特帕维莫纳斯).

为了确定微生物剖面是否影响治疗反应,进行了探索性分析,并根据取样地点是否实现了“口袋闭合”(定义为将测量≥5毫米的站点转换为测量≤4毫米的站点)将患者分组。27,45。在基线时对两名患者进行了<5mm的取样,并将这些患者排除在此分析之外(补充数据集)1)。评估其余地点的口袋闭合率(n=40),21个地点在第90天实现口袋关闭,而19个地点没有。当比较两组在基线处的口袋深度时,没有观察到明显的差异,表明开始疾病的严重程度相似(图1)。6a)。两组患者的口袋深度在统计学上均有显著下降,但在未完成口袋闭合的地点(p < 0.001). To investigate the difference in the baseline microbiota of each group, a Bray–Curtis based principal coordinate analysis was performed (Fig. 6b)。尽管临床结果不同,但每组患者的基线微生物谱无显着性差异。同样,在Bray-Curtis相似曲线(BL与D90)中也没有发现差异,表明微生物对NST的反应相似(图1)。6c)。通过比较物种的相对丰度,发现各组间在任何时间点上都没有显着性差异(图1)。6D),这是一致的α-多样性指数(数据未显示)。另外的探索性分析显示,在当前队列中,不同人群(性别、年龄)和行为亚组(吸烟状况)之间的基线微生物剖面或反应没有差异(补充图)。4).

图6
figure6

研究牙龈下菌斑微生物群与治疗反应的关系。(A比较基线(BL)和90天(D90)取样点的口袋深度取决于治疗后是否达到封口(n=21)(n=19)。虚线黑线表示5毫米。组间比较指未配对的t检验(ns:非显着性,*)。p < 0.001), within-group comparisons refer to paired t-tests (†p < 0.001), graphs display mean ± 95% confidence interval. (B)物种级的基于Bray-Curtis的PCoA分析每组在基线,统计是PERMANOVA显示的原始p-值。(C)将Bray-Curtis相似性与组间基线进行比较,统计数据参照Mann-Whitney检验,ns:无显着性.(D)在BL和D90组间绘制前30种最丰富的物种,没有;口袋闭合没有实现,是的;口袋关闭实现了。

炎症反应、疾病严重程度和治疗反应

鉴于炎症在牙周发病机制中的关键作用,我们接下来试图研究临床和微生物的改善是否伴随着局部炎症反应的改变。基线时,唾液IL-1β与所有临床参数,包括PISA呈正相关(r=0.534,p < 0.001), which reflects the inflammatory burden of PD (Fig. 7a)。唾液IL-8与全口袋深度、牙周袋深度、牙周袋深度与PISA呈弱正相关(r=0.423、0.424、0.372),而IL-17A与菌斑指数呈弱负相关(r=−0.375,P<0.05)。p=0.049)。唾液TNF、α和IL-6与牙周临床参数无明显相关性.此外,在调整多个比较后的任何时间点,均未观察到属或种丰度与唾液细胞因子之间存在显著的正或负关联(补充表)。4).

图7
figure7

唾液局部炎症标志物的水平。(A)唾液炎症标志物水平与临床牙周参数相关,其值与Spearman-Rho相关。使用FDR(5%)校正P值*p(经调整)<0.05和**p(经调整)<0.01。置信度区间在补充数据集中提供。1 (B比较基础(BL)和90天(D90)时肿瘤坏死因子(α)、IL-6、IL-8、IL-17A和IL-1β水平的变化。图是图箱图,其中水平线表示中间值,个别点表示潜在的异常值。统计数据是Wilcoxon签名的秩检验,其中*p < 0.001. n = 41. (CPISA的变化与唾液细胞因子的变化之间存在相关性,说明PISA的变化与唾液细胞因子的变化有关.

后续治疗(图1.7(B)唾液IL-1β显著减少(p < 0.001), and, somewhat surprisingly, an increase in the level of salivary IL-17A, albeit a quantitatively small change (p < 0.001). No significant longitudinal changes were observed for TNFα, IL-6 or IL-8. To further evaluate the relationship between clinical disease and local inflammation, we assessed correlations in the change in each cytokine against the change in PISA (Fig. 7c)。唾液IL-1β的变化与PISA的变化呈正相关,与基线时的病情严重程度和治疗后的减少相匹配。尽管在第90天没有变化,但唾液中的IL-8也表现出类似的关系(r=0.45,pPISA下降幅度最大的患者在治疗后唾液中IL-8水平下降,而变化不明显的患者似乎与基线相似或升高。

讨论

尽管之前的研究已经评估了NSPT之后的微生物群46,47,48据我们所知,这是第一项同时研究牙龈下菌斑微生物群、局部炎症标志物和牙周临床参数在同一患者队列中的纵向变化的研究。此外,本研究是研究牙龈下菌斑微生物群变化的最大队列之一。在我们的研究中,我们显示,疾病相关的生物明显减少,在牙龈下微生物区系后,伴随着唾液细胞因子的改变。尽管所有患者临床变化均为阳性,但只有47%的患者获得了与牙周健康相称的PISA(130.33mm)。2)49-这与大量已发表的研究相当。因此,确定患者对非手术性牙周治疗的反应--包括临床、微生物和炎症标志物--对于合理测试和实施迫切需要的非手术牙周治疗药物和新疗法至关重要。

以往比较PH和PD的研究表明PD患者牙龈下菌斑的微生物多样性较高,表明口袋深度的增加、营养物质的可利用性和/或免疫功能的损害使更多样化的生物膜群落得以生长。16,50。根据这一理论,我们观察到治疗后多样性持续下降,与口袋深度减少和临床炎症相匹配。随着分类学多样性的变化,我们观察到了国家防止酷刑小组委员会之后的42属61种物种的差异丰度,这代表了微生物组成的大规模变化。治疗后减少的大多数生物是严格的厌氧菌。梭杆菌、Prevotella、卟啉单胞菌),通常出现在兼性厌氧菌或有氧运动中。金丝拉,罗希亚,放线菌)。这一趋势表明,除了物理生物膜破坏外,临床上的改善可能会推动环境的改变,从而导致生物膜的组成,例如增加氧气(从口袋深度减少)和减少与炎症有关的营养物质供应。51,52.

有趣的是,我们观察到,尽管基线疾病严重程度相似,但没有实现口袋闭合的站点之间没有明显的微生物区系差异。这项研究独特地调查了整个牙龈下菌斑微生物因子在口袋闭合,作为临床相关的治疗结果的病人接受国家预防小组委员会。我们选择这个结果作为临床上最有意义的阈值来决定是否需要进一步的积极治疗。27。当使用ppd、cal和bop作为治疗成功的指标时,以前也有类似的数据在一个较小的队列中报告过。47。在解释当前研究的分析时要考虑的一个重要观察是,即使是没有达到口袋闭合的部位,在治疗后也会显示出显着的、尽管不那么明显的临床改善。未来的研究,包括真正的“无反应者”的国家防范小组委员会,将有助于建立任何原因之间的基线牙龈下菌斑微生物群和治疗的反应。

评估整个队列中的纵向变化,我们观察到治疗后疾病相关物种的水平显著下降,包括[医]筋膜梭菌, 猫黄杆菌[医]菲氏因子. [医]菲氏因子已被认为是牙周炎的一种生物标志物,并被认为是一种诊断标志物。53,54。此外,假单胞菌,包括F.筋膜藻,在不同的独立研究中与PD有关。有趣的是,红色复合属(卟啉单胞菌, 密螺旋体, 坦纳雷拉)与菲利普因素假单胞菌在我们的研究的基线,这导致了一个明确的疾病相关的集群的形成。经过治疗,这些联系消失了,并形成了一个新的疾病相关网络,包括健康丰富但PD增加的属(例如,梭杆菌Prevotella)16,连同密螺旋体, 硒单胞菌, 帕维莫纳斯, 迪亚里斯特卡托内拉。疾病相关生物群是否会持续下去导致未来的疾病复发尚不清楚,需要更长的研究时间和微生物监测。

正关联提供了牙龈下菌斑内主要相互作用的有用指标,而牙龈下菌斑是导致生物失调的主要因素;尽管研究生物体之间的负面联系是PD中一个经常被忽视的概念。这些关联可以阐明有助于维持生物膜处于共生状态的相互作用,并可能成为鉴定潜在益生菌的一个有用的起点。在我们第90天的研究中,我们观察到罗西娅与pd有关的几个属(硒单胞菌, 梭杆菌Prevotella)之间的正相关关系。罗西娅放线菌。双管齐下罗西娅放线菌确认硝酸盐减少属55,56,一些严格的厌氧pd相关物种已被证明对氧化应激和一氧化氮敏感。57。因此,这些属产生的一氧化氮和其他抗菌成分在抑制PD相关生物和维持生物膜共生中的可能作用值得进一步研究。

在之前的较小规模的研究中,评估在npt之后的牙龈下菌斑微生物群,未分组的属,如迪亚里斯特奥尔森拉治疗后减少,同时罗西娅棒状杆菌增加47,48与我们的结果相称。然而,在目前的研究中观察到更多的微生物改变。例如,Shie等人.,有12例患者出现4属增多,8属减少,而Chen等人则有下降趋势。.,包括19例患者,观察到患者与病人之间微生物反应的巨大差异。在我们对42名病人的研究中,我们确定了42属61种的一致转移。这些发现的一个原因可能是在以前的研究中。48患者在不同的时间点(4~19周)返回,这可能影响生物膜再开发的阶段,因此构成。相反,在本研究中,所有患者在治疗后90天返回,这是一个推荐的临床随访期。58。加在一起,更大的样本大小和标准化的随访期可能有助于解释在治疗后的当前研究中发现的更多的微生物改变。

从炎症的角度来看,这项研究突出了唾液IL-1β与牙周炎症之间的明确联系,支持了以前的横断面和纵向研究。25,59,60。但其他促炎标志物(肿瘤坏死因子α、IL-6、IL-8)均未见此结果.一般而言,唾液中的肿瘤坏死因子α和白细胞介素6水平较低。61,62,类似于我们的发现,先前的研究未能证明唾液IL-8与pd之间存在一致的关系。63。唾液是一种含有粘蛋白、细菌和各种蛋白水解酶的恶劣环境。因此,肿瘤坏死因子α和IL-6的低值可能仅仅代表了他们在这种环境下生存的能力,而不是缺乏在牙龈组织中的产生。

令我们惊讶的是,我们观察到治疗后唾液IL-17A水平显著升高。白细胞介素-17A主要由Th17细胞产生,在宿主防御粘膜部位的外部病原体中起着重要的作用。64。尽管这一功能与牙周袋中生物膜挑战(PD)的病理生理学是一致的,但在现实中,IL-17A与PD之间的关系仍然是复杂和不明确的,有证据表明有保护作用和破坏性作用。65。以往评估龈沟液(Gcf)和唾液中IL-17A局部产生的横断面研究大多是不相容的,一些研究报告称pd水平较高。66,67,而其他人则发现PH值更高68,69。另一项研究报告局部局部牙周炎水平较一般pd和ph升高,提示IL-17A可能在牙龈炎症早期达到高峰,而非已建立的牙周炎。70。就我们的研究而言,第90天的样本反映了治疗后的稳定状态,而不是完全的牙周健康。鉴于Liukkonen等人的调查结果.,治疗有可能导致回到早期炎症状态,其中IL-17A是一种驱动力。为了进一步研究这一假说,将唾液IL-17A与各种临床状态进行比较,包括治疗后PD、牙龈炎和健康患者,对今后的研究将是有益的。

虽然这项研究的总体目标是确定治疗后临床、微生物和免疫学参数的纵向变化,但仍存在某些局限性,应考虑这些因素来解释结果。其中一个限制是缺乏与治疗后临床健康相比较的健康对照样本。尽管观察到已知疾病的持续变化,相关的微生物和免疫学标记15,22,61,62,71未来的研究应该调查这些手段是否回到与牙周健康受试者相当的状态。另一个限制是病人只在一个时间点被跟踪。患者在非手术治疗三个月后接受评估,并就未来的治疗方案作出决定。72。今后的研究可以考虑支持治疗、重复治疗或辅助治疗对微生物群的影响,以及是否可以利用NSPT后的微生物群来指导决策。在较早的时间点评估微生物群将提供一个迫切需要的指示,在生物膜破坏后的早期微生物再殖模式。更长的随访评估(6个月-1年)将确定是否保持移位,以及哪些(如果有的话)可以用来预测疾病复发。

总之,我们提出了第一次纵向研究的国家预防小组委员会,以评估局部炎症细胞因子和微生物群测序在同一患者队列。我们的数据突出显示了国家防止酷刑小组委员会之后大规模的龈下社区转移,这与一个更符合PH的生态系统的改革是一致的。然而,在第90天,一个紧密聚集的疾病相关属网络仍然存在,这突出了一个微生物核心的抗御能力,这可能是导致疾病慢性的部分原因。从炎症的角度来看,我们的研究证实了唾液中IL-1β与PD的关系,表明与牙周炎症密切相关,治疗后比例减少。总的来说,这项研究表明,目前的治疗可以部分恢复健康,但生物膜失调和炎症的特点仍然存在。改变这些参数以改善临床结果和减少不依赖抗生素的疾病复发是改善牙周治疗结果的非常必要的手段。


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