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粘膜干扰素γ的产生及其保护作用大肠杆菌O 157:H7牛接种疫苗并受到攻击

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发表时间:2021-05-08 14:38作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

产志贺毒素大肠杆菌O 157:H7(O 157)疫苗可以为限制O 157的食源性人畜共患病提供一种潜在的干预策略。虽然对O 157疫苗免疫的外周抗体反应已有特征,但O 157特异性细胞免疫(RAJ)是O 157定植的首选位点,其描述仍不清楚。疫苗诱导的黏膜O 157特异性抗体可能提供一定的保护作用,细胞免疫应答在RAJ中也可能起到一定的保护作用。免疫/挑战动物的Raj区有明显的淋巴滤泡增多。此外,免疫/挑战动物的RAJ滤泡区检测到更多的干扰素γ产生细胞和γδ+T细胞。同样,佐剂疫苗配方对O 157肠外疫苗的免疫原性至关重要.局部T细胞产生的干扰素γ可能会影响上皮细胞,进而限制O 157粘附,这在牛上皮细胞体外粘附实验中得到证实。因此,免疫接种动物和受到攻击的动物在粘膜上引起的不同的免疫变化提供了与限制O 157粪便脱落有关的机制。加强黏膜免疫可能是进一步开发有效疫苗控制反刍动物O 157,从而限制O 157向人类传播的关键。

导言

志贺毒素大肠杆菌O 157:H7(O 157)是一种引起出血性腹泻或出血性结肠炎的病原体,在非常年轻的老年人和有潜在免疫紊乱的人群中,由于出血性尿毒症(HUS)的发展,可能导致肾功能衰竭。1。HUS的发展是一种潜在的危及生命的疾病,需要住院治疗。2。在O 157介导的疾病中,非动态护理通常是支持性的(静脉内液体,溶血性尿毒症患者的透析),因为抗生素是禁忌的。3。特别是,人类疾病是通过食用受污染的肉类、蔬菜或水从牛身上传染的。4,5,6,7,8,9,10。虽然安全的食品处理方法可以帮助尽量减少O 157的疾病传播,但针对宿主动物(牛)可能是减少O 157人类疾病发病率的一个重要方面。通过接种疫苗可以预防或减少O 157暴露后的定殖和粪便脱落,是一种经济的宿主动物靶向性方法。

在先前的一项研究中,我们证明,如果实验动物接种含有灭活疫苗的疫苗,O 157的粪便脱落量减少50%。HHA高表达3型分泌系统蛋白(T3SP)的O 157缺失突变株11。在随后的一项研究中,我们证明在疫苗配方中加入佐剂是很重要的,因为接种佐剂疫苗的动物粪便脱落的时间(平均14天)和粪便中O 157的排出量(10天)都有所减少。5与粪便脱落时间(平均30天)和O 157大棚量(10次)相比,CFU/克粪(Cfu/g粪)的排泄量更长(平均30天)。7假疫苗牛的CFU/克粪12。虽然我们的小组和其他人已经确定了与减少脱落有关的免疫学指标,例如O 157特异性的IgG和IgA。12,13,14,15,16,17或外周O 157特异性T细胞反应18对O 157免疫方案的组织特异性免疫应答未作明确界定。

O 157能在新生牛和断奶禁食牛的直肠肛门接头(Raj)上定植和诱导微小附着和脱落(A/E)病变。19,20,21,22,23。然而,在传统的牛身上发现了微小的病理。组织匀浆中的O 157特异性IgA和粒细胞的增加表明免疫系统可能对O 157定植有积极的反应,但对脱落的影响可能很小。24。另一些人则认为O 157在殖民点起共同作用。25,26通过表达致病特性来破坏免疫反应来抑制免疫27。一项研究表明,接种疫苗支持组织特异性炎症(局限于直肠淋巴结)以及CD4。+可能有助于减少粪便脱落的T细胞反应28。直肠末端组织的转录分析也支持疫苗引起炎症的结果,这可能有助于限制O 157定植或粪便脱落的适应性免疫反应。29.

这项研究的目的是部分确定T细胞细胞因子的偏差,包括这些细胞因子如何影响O 157组织在Raj上的粘附,以响应一种疫苗接种方案,使口服给接种牛的O 157粪便脱落减少50%。12。用佐剂疫苗接种O 157的动物数据表明,外周循环CD8+γδT细胞和细胞介导的反应减少。18建议进一步调查细胞种群,特别是在Raj地区。我们假设在RAJ内淋巴细胞数量,特别是γδT细胞数量会发生变化,这些细胞群体会倾向于干扰素-γ偏倚反应,以响应O 157疫苗接种方案的成功。

结果

O 157免疫和攻击动物Raj淋巴细胞增多

为了确定直肠肛管连接(Raj)细胞的变化,在研究结束时(72天)收集了Raj切片进行组织学分析。对Raj的滤泡区和鳞状区进行切片,H&E染色,用数字分析系统检测GALT增生。淋巴滤泡形成与GALT增生相关在粘膜下层观察,有时浅表延伸到从佐剂免疫攻击(Adj-Vac)动物分离的滤泡Raj的粘膜表面(见图)。1A,右面板)。从非佐剂疫苗接种动物(NoAdj-Vac)采集的Raj组织中,淋巴滤泡略有增加(见图)。1中面板),而挑战动物(诺阿杰-诺瓦茨)表现出的卵泡数量最少(图一)。1A,左面板)。与NoAdj-Novac和Adj-Vac动物的RAJ切片相比,Raj-组织滤泡明显增大(p<0.01)。1b)。

图1
figure1

免疫和受挑战牛直肠肛门结淋巴结构增加。直肠-肛门连接(Raj)切片的组织学检查显示肠相关淋巴组织(GALT)增加。从未接种疫苗(noadj-novac;左面板)收集的具有代表性的raj幻灯片,非佐剂-ΔHHA大肠杆菌-接种(noadj-vac)(中间板)和油-水佐剂-ΔHHA大肠杆菌-接种(Adj-Vac)(右板)A)。从顶部(2×)、中间(8×)和底部(20×)的面板放大。散列框表示在底部面板中显示的放大部分。底部一行中的虚线表示卵泡边界。(B)粘膜长度为每微米的谷丙转氨酶细胞的定量。开圆圈代表NoAdj-Novac,灰色圆代表NoAdj-Vac,黑圈代表Adj-Vac.对每只动物的三个复制组织切片进行分析,并对每只动物的单个数据点进行平均分析。*单因素方差分析与TUKEY后测P<0.05。

RAJ滤泡区IFNγ阳性和γδT细胞丰度增加(P<0.01)

随着Raj中淋巴细胞数量增加的证据(见图)。1),以及以前研究的数据。18提示循环淋巴细胞,特别是γδ的重要作用+T细胞、不同试验组Raj淋巴细胞的特征,可使我们了解接种疫苗对减少O 157排泄量的影响。因此,我们检测了干扰素γ。+和γδ+T细胞位于Raj的滤泡和鳞状区。RNA原位杂交分析显示Adj-Vac组的IFNG(IFN-γ基因)和TRDC(T细胞受体,δ链)mRNA表达增加。2虽然NoAdj-Novac组中也检测到大量IFNG和TRDC阳性细胞(如图所示)。2A、左面板、箭头)。另一方面,与模拟疫苗组相比,NoAdj-Vac组没有增加IFNG的表达(图1)。2B,左面板)。TRDC的表达细胞,其中一些是阳性的IFNG基因表达(数据未显示),有可能促成了一个炎症环境内的毛囊区域的Raj的接种动物(图一)。2(d-F)

图2
figure2

IFNG和TRDC转录本的RNA原位杂交。滤泡直肠-肛门连接(Raj),从未接种佐剂或疫苗株的典型动物(noadj-novac)中分离而来。A)描述粘膜上皮(左侧)和粘膜下层-滤泡(右侧)。从一种具有代表性的接受非辅助性Δ的动物中分离出滤泡Raj。HHA-大肠杆菌疫苗(NoAdj-Vac)(B)描述粘膜上皮(左侧)和粘膜下层-滤泡(右侧)。从一种具有代表性的接受佐剂-Δ的动物中分离出滤泡RajHHA-大肠杆菌疫苗(Adj-Vac)(C)描述粘膜上皮(左侧)和粘膜下层-滤泡(右侧)。γδTCR的图形表示+(右)和干扰素γ+(左)来自粘膜上皮(D),粘膜下腔(E)和粘膜下层-滤泡(F)。内嵌板上所示(AC),一个大约5×放大截面,而较大的面板大约20×放大的嵌入。黑色箭头表示γδT细胞染色(特别是T细胞受体,δ链RNA),蓝色箭头表示干扰素γ(IFNγ)染色。开圆圈表示NoAdj-Novac,灰色圆表示NoAdj-Vac,黑圈表示Adj-Vac群.每个符号代表一个单独的动物。N=每组4例。棒状物=±SD。BAR数据表示RNA染色测量的细胞百分比。采用单因素方差分析和Tukey后测进行统计分析。****p < 0.001, *p < 0.05.

Raj的鳞状区确实有一些IFNG或TRDC表达(RNA染色阳性)细胞(补充图)。1(A)IFNG和TRDC阳性细胞的丰度在各组间无显着性差异(附图)。1B、BAR代表RNA染色测定的细胞百分比(±SD),与卵泡区相比明显减少。因此,对卵泡Raj切片进行了IFNγ(红色)和γδTCR(绿色)蛋白的染色。3a)。在淋巴滤泡内,与NoAdj-Vac和NoAdj-Novac动物相比,Adj-Vac组的γ和γδTCR染色区域都更大。3b)。如图所示。3组织切片检测到的IFNֱγ(红色)和γδTCR(绿色)信号的相对含量显著高于非Adj-非Vac组(p<0.0001)和非Adj-Vac组(P<0.05)。p < 0.0001 for IFNγ and p < 0.001 for γδTCR). (Fig. 3c)。此外,在检测肠系膜淋巴结和脾脏时,Adj-Vac动物体内检测到更多产生IFN-γ的淋巴细胞(补充图)。2).

图3
figure3

牛接受佐剂疫苗后,RAJ中IFNγ阳性细胞的丰度增加。γδ、TCR和IFNγ免疫荧光染色对直肠肛门结缔组织滤泡内细胞的鉴定(英文)A, B)。用荧光抗体标记RAJ滤泡区,荧光抗体针对IFNγ(红色)或γδTCR(绿色),核染色DAPI(蓝色)。虚线表示毛囊边界,散列框表示放大部分(B)具有代表性的部分,如非佐剂-未接种疫苗(NoAdj-Novac;NA-NV)、非佐剂疫苗(NoAdj-Vac;NA-V)或佐剂疫苗(Adj-Vac;A-V)。(C)指示组的荧光数据的图形表示。条为±SD。****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05 one-way ANOVA with Tukey’s post-test.

O 157免疫动物卵泡Raj免疫基因表达的变化

为进一步了解滤泡Raj区的免疫反应,采用逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测炎症介质的相对表达,包括与干扰素γ偏向反应相关的免疫反应。从NoAdj-Vac动物的滤泡Raj中分离出的RNA与对照组相比,许多基因的表达(分别为蓝色或绿色)下降或不变(NoAdj-Novac;图1)。4A,左栏,补充表沙一)。相反,被分析的大多数基因在Adj-Vac动物的卵泡Raj中增加(红色)。4(A,右列)与NoAdj-Novac组相比。例如,如图所示。4与对照动物相比,Adj-Vac动物IFNγ基因表达增加,NoAdj-Vac动物表达下降。IL-10受体是α受体(IL-10 RA)和β受体(IL-10 Rb)的复合物,NoAdj-Vac组与NOAdj-Novac组相比,IL-10 R基因表达无统计学差异(P>0.0 5);4(a、c)。

图4
figure4

直肠-肛门交界滤泡区细胞的转录分析。采用单步逆转录定量PCR(RT-qPCR)方法对靶区进行转录分析.(A)热图显示非佐剂疫苗(noadj-vac;na-v)和佐剂免疫(adj-vac;A-V)动物相对于未接种-非佐剂(noadj-noac;na-nv)动物的目标基因的变化。−ΔΔCT方法。值为log2转化为反映负褶皱变化。红色值表示转录水平增加,绿色表示没有变化,蓝色表示与NoAdj-Novac组相比水平下降。每一列都代表了所列治疗组中的一种动物。将值归一化为3个看家基因,以解释RNA载量的变化。干扰素γ的变化B)和IL10RA和IL10RB(C)被证明突出了几个特定的基因。N=每组4例。棒状物=±SD。采用单因素方差分析和Tukey后测进行统计分析。*p < 0.05.

干扰素γ治疗可降低O 157对Hep-2细胞和牛肠上皮细胞的粘附作用

在Raj淋巴滤泡内检测到产生干扰素γ的细胞,其在O 157免疫动物中的潜在限制脱落作用尚不清楚。为了探讨干扰素γ在限制O 157粘附上皮细胞中的作用,我们观察了重组干扰素γ处理两种不同细胞株对O 157粘附上皮细胞的影响。在Hep-2细胞中加入重组牛干扰素γ,然后接种O 157.计数O 157。干扰素γ刺激的Hep-2细胞(p < 0.05) reduced O157 adherence (Fig. 5(一条黑色的线条,黑色填充的圆圈)。虽然hep-2细胞常被用作上皮细胞O 157附着的代用品,但与牛细胞相比,与hep-2粘附的o 157蛋白可能有所不同。30。为了研究干扰素γ对牛肠上皮细胞O 157粘附的能力,牛肠上皮细胞株(bec-c4)31用于附件分析。在BIEC-c4细胞上加入重组牛干扰素γ后,O 157对BIEC细胞的附着率约为40%。5b)。因此,局部产生的干扰素γ可能会影响Raj上皮细胞来限制附着,这可能有助于减少接种动物的粪便脱落O 157。

图5
figure5

干扰素γ对上皮细胞的作用限制了O 157的附着。Hep-2细胞(A)和牛肠上皮细胞(BIEC)(B)或用重组牛干扰素γ(干扰素γ,黑圈)和随后的O 157附件(材料和方法所描述的)进行预处理。(A)结果为两种独立检测的平均结果,每种检测包括四口井。条为±SD。**P<0.01采用单因素方差分析和Dunnet后测,(B)数据相对于媒体井O 157的平均值表示。数据代表两个生物实验(n=2)和三个技术复制。

讨论

牛对产生志贺毒素疫苗的反应大肠杆菌O 157:H7(O 157)以前通过血清学被描述11,12免疫动物粪便中存在抗O 157抗体18,以及外周T细胞反应的诱导。18。一些研究已经研究了O 157挑战对直肠肛门连接(Raj)内转录变化的影响。27,29,32,外围细胞数量的变化32,Peyer‘s贴片27或直肠淋巴结28。在这里,一个密切检查的组织变化发生在毛囊区域发生的拉吉疫苗接种和O 157挑战牛。由于抗体或外周反应只能作为疫苗效果的部分预测指标,因此位点特异性反应可能有助于减少接种反刍动物O 157的定植和脱落。

O 157菌可以通过附着在瘤胃、网状和螺旋结肠内的部位,暂时将牛的肠道定植几天。33然而,O 157优先殖民在拉杰可能会导致较长的持续时间一至两个月。30,34,35,36。O 157定植通常与牛体内的亚临床反应有关,如Raj的微小病变发展。37,38。然而,其他的影响,如大约20%的站点特异性CD4增加。+T细胞32直肠固有层轻度粒细胞浸润24可能与O 157定植有关。由于在我们的研究中,每个实验组的Raj中都发现了淋巴细胞聚集体,所以O 157本身可能有助于RAJ细胞形态的增加或改变。此外,疫苗接种可能通过增加白细胞总数来推动Raj细胞构成中的额外变化(图1)。1)或组织中存在的淋巴细胞类型(如图所示)。2)。进一步研究疫苗接种后细胞浸润或扩张的时间过程,O 157攻击,或免疫和挑战,对于识别导致粪便脱落减少的重要淋巴细胞群体具有重要的价值。我们在先前的一项研究中证明,只注射佐剂制剂的动物对大肠杆菌O 157:H7脱落并未能诱导循环IgG应答12。然而,在未来的研究中,可以对佐剂治疗进行额外的免疫学评估,以帮助在佐剂导向的、细胞特异性宿主反应的背景下描述疫苗制剂的有用性。

干扰素γ可作为巨噬细胞活化或粘膜上皮改变的重要介质,以防止细菌浸润。39。在此,粘膜内滤泡形成增加,同时产生γ的细胞增多,这与以前的研究结果相关联,表明用佐剂疫苗疫苗接种动物对减少O 157粪便脱落的数量和持续时间是很重要的。12。类似于目前的研究结果,其他人已经证明了低排放的粪便脱落动力学。大肠杆菌与高脱落株相比,O 157:H7株确实与低脱落组中IFN、γ和其他Th1斜交转录本的增加有关。32。这里主要关注的是干扰素γ和IL-10受体基因的表达,因为这些基因与我们组先前记录的蛋白质和细胞表达有关。18然而,许多其他的炎症基因被分析并发现在实验组之间有显着的差异(如图所示)。4,补充表沙一)。有必要进行进一步的研究,以确定这些发现的生物学意义。

在干扰素γ的肠道外,奶牛经重组干扰素γ预处理后,经乳腺内注射。大肠杆菌动物感染时间缩短,乳腺炎临床评分低于未治疗动物。40。干扰素γ对大肠杆菌反刍动物宿主以外的菌株也已被发现。重组干扰素γ在禽类致病性中的应用大肠杆菌-受攻击的鸡增强了巨噬细胞的吞噬能力,同时外周血白细胞mhcⅡ的表达也全面增加,提示在某些情况下可能使用干扰素γ治疗。41。同样,干扰素γ受体的表达也可能在发展有利的环境中发挥作用。大肠杆菌殖民统治。例如,肠出血性大肠杆菌在小鼠模型中感染导致干扰素γ受体表达改变,并抑制干扰素γ偏向信号,提示干扰素γ的作用减弱可能是其重要的作用之一。大肠杆菌病理学42。总的来说,干扰素γ可能在改善疾病中起一定作用。大肠杆菌定植、感染或恢复;今后有必要对干扰素γ的位点特异性反应进行研究。

O 157攻击后,免疫细胞特异性亚群在反刍动物宿主肠道内的定位对减少O 157粪便脱落可能具有重要意义。在此之前,我们在这项研究中从动物身上发现了抗原特异性γδ。+T细胞对O 157的反应比自身CD4更能产生干扰素γ。+免疫后T细胞18。在目前的研究中,在滤泡Raj中发现了γδT细胞,尽管抗原特异性γδT细胞的O 157疫苗驱动反应与反刍动物宿主之间的联系尚未被发现。由于牛有广泛的胃肠道,γδT细胞被认为是调节肠道和呼吸粘膜免疫反应的关键。43。根据细胞表面表型,γδT细胞有两种不同的亚群,即CD8。γδTCR+和CD8+γδTCR+牛体内已鉴定出细胞。虽然这两个子集都有重叠的功能,但已经证明了γδtcr+CD8+细胞对干扰素γ敏感,与IL-2R信号一起促进细胞增殖。44。有可能γδ的tcr+CD8+与γδtcr相比,细胞亚群在干扰素γδ偏向性炎症反应中可能起着更大的作用。+CD8对口。由于γδT细胞是能够产生干扰素γ的重要粘膜相关细胞,其在针对O 157的干扰素γ偏倚免疫应答中的作用可能对减少O 157的粪便脱落至关重要。然而,还需要更多的研究来确定γδT细胞及其细胞亚群对O 157的反应,包括研究佐剂在O 157疫苗中的广泛作用。同样的,更多的研究来描述CD4+、CD8+而其他产生干扰素γ的细胞(即NK细胞)是必要的,以收集一个完整的观点,干扰素γ偏倚的反应,在接种的挑战宿主。

总之,我们的数据表明,接种了佐剂的、灭活的突变株的动物大肠杆菌O 157:H7显示卵泡Raj处γδT细胞增多。在免疫动物的组织中,淋巴细胞表达干扰素γ的程度高于未接种或未接种的动物。此外,在滤泡Raj的转录谱显示了不同实验组之间的特征差异,表明佐剂疫苗将促进炎症扭曲的细胞轮廓。虽然干扰素γ对RAJ的特异性作用尚不清楚,但干扰素γ体外处理上皮细胞可降低O 157粘附性,提示接种IFNγ可能在减少O 157粪便脱落中起一定作用。在组织部位考虑疫苗驱动的细胞介导的干扰素γ可能对O 157定向疫苗的未来发展产生重大影响。

材料和方法

动物

临床健康的泽西岛雄性牛(12头),大约6个月大,用于疫苗接种和大肠杆菌O 157:H7(O 157)在先前发表的一项研究中的挑战18作为血液、粪便和组织样本的来源。所有的动物都在挑战大肠杆菌O 157:H7,NoAdj-Novac组为未接种对照组,NoAdj-Vac(不含疫苗佐剂)组和Adj-Vac(佐剂疫苗)组在接种疫苗之前分别接受了各自的治疗(详见下节)。动物被安置在BSL-2的条件下,喂食维持饮食的谷物.实验开始前,将动物随机分为4组,并允许其适应环境2周。在这些研究中采用的动物程序由国家动物疾病中心机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准,并按照相关的IACUC和机构准则和条例执行。

O 157疫苗株的产生、疫苗接种和挑战程序

O 157疫苗株(大肠杆菌O 157:H7ΔHHA,菌株NADC 6597)如前面所述。11,45,46。对疫苗株的甲醛灭活和灭活菌株在疫苗制剂制备中的应用也作了介绍。12。简单地说,疫苗制剂中含有1.2mL含10的磷酸盐缓冲溶液(PBS)。9灭活菌种与0.8mL PBS(非佐剂疫苗,简称NoAdj-Vac)或0/8 mL SEPPIC Montanide ISA 61 VG佐剂(Adjuvanted-疫苗,简称Adj-Vac)混合。对照组仅注射PBS(NoAdj-Novac)。动物在增强疫苗之前接种了三周的疫苗。疫苗接种后三周,所有动物口服接种大肠杆菌O 157:H7株NADC 656412。接种疫苗后对动物进行监测,并增加不良反应。12只动物中有3只表现出对刺激的小部位反应。挑战后,动物被监测4周,并对其进行人道安乐死以收集组织。

显微分析用组织

安乐死后,收集直肠肛管连接(Raj)切片,并将组织收集到Raj的滤泡和鳞状区。肉眼可见毛囊和鳞状邻近的Raj区,因为组织形态显示这些直肠切片。组织经10%中性福尔马林浸泡24h后,转移到70%乙醇中。切片采用标准石蜡包埋技术,切取5μm切片,用苏木精和伊红(HE)染色或切成20μm切片进行RNA提取。将毛囊或鳞状组织的重复切片植入最佳切割温度(OCT)复合物中,在干冰/乙醇浴中冷冻闪光。两微米切片安装在带正电的滑片上,风干10分钟,去除多余的OCT。然后,用丙酮/乙醇(50:50)溶液固定和渗透,用StartingBlock试剂(热科学)阻断,4℃保存。福尔马林固定切片用于淋巴组织显微分析和原位杂交或RNA分离,冰冻OCT切片用于免疫荧光标记。

免疫荧光标记(IFA)与玻片成像

OCT切片和块片用磷酸盐缓冲液冲洗3×3(PBS,Thermo Science-Gibco)。组织切片用疏水屏障(PAP Pen,载体实验室,加拿大伯灵顿)和干扰素γ[1:50]染色(克隆7B6,IgG 1,Bio-Rad)和γδTCR[1:100](克隆GB21A,IgG2b,华盛顿州立大学)。玻片可在加湿遮光室中孵育1h,用pbs冲洗3×,与抗鼠IgG 1-fITC[1:500]或抗鼠IgG2b-PE[1:1000](来自南方生物技术公司的所有二级细胞)孵育,并可在加湿的遮光室中孵育1小时,冲洗3×并装上含有VectorLabs的细胞核染色(DAPI)。次级只包括背景荧光切片。幻灯片被允许治愈24小时,并通过尼康相机和莱卡显微镜装置成像。次要部分仅用于调整相机设置以设置信号基线。每个组织块(动物)制作三份幻灯片,并在每张幻灯片中收集三张图像。数据表示为每只动物平均三张幻灯片。用ImageJ软件(NIH,BethesdaMD)分析图像的颜色强度。

组织中基因转录产物的检测

用原位杂交(ISH)方法观察细胞因子mRNA转录本。47,48,49. 牛金牛-针对IFNG(猫#315581)、IL 10(猫#420941)或TRDC(猫#407481)的淋巴细胞亚群γδ的特异性专有探针组合,根据制造商的说明RNASCOL2.0(先进细胞诊断,海沃德,美国)进行检测。在HybEZ™杂交炉(高级细胞诊断)中,取福尔马林固定的石蜡包埋组织,在60℃下加热60 min。组织在二甲苯中分离,再用乙醇进行复水,风干5 min。组织切片与预处理1液(内源过氧化物酶块)在室温下孵育10 min。用双蒸馏水(DdH2O)浸泡,预处理2(抗原回收柠檬酸盐缓冲液)在100~104°C(煮沸)下浸泡15 min。切片用ddH2O冲洗,预处理3(蛋白酶)30 min(40°C);切片用ddH2O冲洗,靶标或对照探针在40°C下孵育2h,RT在冲洗缓冲液(高级细胞诊断)中冲洗2 min。信号扩增试剂1~6依次应用30 min、15 min、30 min、15 min、30 min和15 min。在两种扩增试剂之间,用冲洗缓冲液冲洗2 min。放大试剂1~4在40℃孵育,RT与放大器试剂5、6孵育。用快速红显色底物和鳃苏木精染色显示阳性信号。然后将幻灯片通过乙醇系列脱水生成二甲苯。在60°C干燥15 min后,用安装介质(生态安装、生物医学、康科德、美国)对幻灯片进行覆盖。阳性对照探针由专用探针组成。牛金牛亲环素B(猫#3194510),阴性对照探针靶向DapB枯草芽孢杆菌(猫#312038)。

形态计量学

用Aperio ScanScope XT工作站(Aperio Technology,Inc.,Vista,CA,USA)和Aperio电子幻灯片管理器版本(Leica Biossystems,Inc.,Buffalo Grove,IL.)对H&E、HC和ISH检测后的组织切片进行40倍最大放大扫描和数字化扫描;Https://www.leicabiosystems.com)。利用图像分析软件Halo Version 3.1,IS-模块3.0.3对数字化图像进行分析(Indica Labs,Inc.,Corrales,NM;Https://www.indicalab.com/halo/)。对于H&E染色显微图像,勾勒出GALT的面积(2.0m),并通过对每个切片的粘膜长度除以GALT内淋巴细胞数(用软件识别)来标准化,以获得每单位粘膜长度内的淋巴细胞数。虽然测量Raj中的滤泡细胞是困难的,但作者认为使用每一个粘膜长度的GALT细胞是一个合乎逻辑和有意义的参数。使用粘膜或粘膜结构的长度,如肌层粘膜,是一种优先使用的技术。50,51。同样,对于ISH,图像分析软件确定标记为淋巴细胞亚群(TRD、CD4或CD8A)或细胞因子mRNA(IL 10或IFNγ)的细胞,并计算粘膜单位长度的细胞数。

RNA提取与RT-qPCR

将福尔马林固定的石蜡包埋组织切成20微米切片,放入无菌、无酶管中.根据制造商的指示(RecoverAll,Thermo Science-Ambion)对切片进行处理并分离RNA。用生物分析仪和RNA 6000纳米试剂盒(Agilent)对回收的RNA进行完整性分析和定量分析。用无核酸酶水将RNA稀释成500 ng/L。基因分析采用RT2谱阵列对牛的炎症基因进行指示(炎性细胞因子和受体阵列板,前根)。每口井分别加入500 ng RNA(1 L)、1μL核酸酶无水(Thermo Science)和18 L 1步RT-qPCR反应缓冲液(One Step Kit,Chiagen)。采用BioRad CFX 96实时PCR系统热环器(Bio-Rad,Hercules,CA).扩增条件为:30 min为50°C,10 min为95°C,40次为15 s 95°C,1 min为60°C,分离步骤为15 s 95°C,1 min 60°C,15 s 95°C,15 s 60°C。−ΔΔCT方法。

ELISPOT和细胞隔离

如上文所述,分离出了信使淋巴结细胞和脾细胞。52。简单地说,组织切片均质的方法是使用带有M管的MACSOcto分离器(Miltenyi Biotec)。细胞匀浆溶解为RBCs,用PBS洗涤,用40m尼龙过滤器进行拉伸,计数活细胞,再悬浮在cRPMI中。ELISPOT是按照制造商的指示执行的(牛IFN Elispot Kit,R&D系统)。如前所述,收集了刺激细胞的溶解物。18。简短,105将淋巴结细胞或脾细胞接种到ELISpot板的每个孔中,用1μg志贺毒素刺激。大肠杆菌裂解液,1克疫苗大肠杆菌溶出物(NADC 6564),或仅限于媒体。平板在37℃下孵育48h,用抗牛干扰素γ冲洗,形成斑点。用免疫斑点分析仪(细胞技术有限公司,克利夫兰,OH)对平板进行成像和斑点计数。

O 157粘附于Hep-2和牛髂上皮细胞(BIECs)

Hep-2细胞接种量为5×10。5细胞/良好生长,如上文所述18,53融合,或未处理或用重组牛干扰素-γ(R&D系统)处理。在37℃,10℃下孵育60 min后9每井加入O 157的CFU/mL,在37°C和200 rpm的LB肉汤中过夜。平板在37℃下孵育3h,用PBS冲走未粘附的O 157,将任何强粘附的O 157留在上皮细胞层。粘附的Hep-2细胞在1%Triton-X 100中轻轻溶解,释放O 157.将含溶质的全细胞O 157样品稀释后,在LB琼脂平板上进行化学镀。37°C孵育24h后,计数在这些平板上生长的集落数。为确定O 157对BIECs的依从性(由南达科他州立大学Rindy Kaushik博士提供),融合BIEC细胞,如上文所述31,54,单用培养基或rbIFNγ在39°C处理约16h,约10℃。7将O 157细胞加入井中2h,用PBS冲走未粘附的O 157细菌。在PBS中加入0.5%Triton-X,释放O 157细胞5~10 min。细胞溶解液是连续稀释,镀和细菌计数的菌落数,生长在上述说明。数据表示相对于O 157平均附加在媒体专用井。每次检测包括3口井,每次处理,数据包括两个单独的实验。


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