您好,请问有什么可以帮到您的。 点击这里给我发消息
武汉新启迪生物科技有限公司
新启迪-您的生物科研好伙伴!2008-2021
Wuhan Xinqidi Biotech Co.Ltd
本企业通过iso9001质量体系认证

PPARɣ驱动IL-33依赖的ILC 2促肿瘤功能

 二维码
发表时间:2021-05-06 10:57作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

第2组固有淋巴样细胞(ILC2s)在抗蠕虫和多种炎症疾病的保护中发挥着关键作用,其机制是通过对肿瘤组织中高表达的可溶性因子如Alarmin IL-33作出反应。尽管如此,支配ILC 2功能的调控因素仍未得到充分的研究。在此,我们发现过氧化物酶体增殖物激活受体γ(pPARγ)在人和小鼠的ILC2s中被选择性表达,作为中枢功能调节因子。ILC2s中PPARγ的药物抑制或基因缺失对IL-33诱导的细胞因子产生和线粒体适配有显著影响。此外,ILC2s中PPARγ的阻断破坏了分泌IL-33的癌细胞的促肿瘤作用。最后,PPARγ在ILC2s中的基因消融对体内肿瘤的生长有明显的抑制作用。我们的发现强调了pPARγ在支持IL-33促肿瘤作用中的关键作用,并提示PPARγ可被认为是抑制其效应功能的一种可药物途径。因此,pPARγ靶向可能被用于癌症免疫治疗和其他ILC 2介导的疾病,如哮喘和过敏。

导言

先天淋巴样细胞(ILCs)是最新发现的先天淋巴细胞亚群。ILCs根据转录因子的表达和细胞因子的分泌可分为三大类,在一定程度上反映了CD4 T辅助亚群。1。第1组ILCs(ILC1s)表达T-bet,分泌IFN-γ.第2组ILCS(ILC2s)表达GATA 3,分泌IL-13和IL-5。组织居群3 ILCs(ILC 3)表达rorγT并分泌IL-22和IL-17,而在人外周循环中,ILC 3也由一群能够分化为所有ILC亚群和自然杀伤细胞(NK)的祖细胞(ILCP)组成。2。在过去的几年里,不同的报道强调了ILCs在不同的生理和病理生理过程中的重要贡献。3。特别是,据报道ILC2s在哮喘、慢性鼻窦炎和变应性鼻炎等炎症性疾病中起着至关重要的作用。4,5,6。此外,我们和其他人已经证明ILC2s可以介导肿瘤的免疫反应,其效果取决于肿瘤类型,可能是亲肿瘤的,也可能是抗肿瘤的。7,8,9,10,11。尽管如此,决定ILC 2活化和功能的外部和细胞内的调节因子仍然缺乏研究,特别是在人类。更好的了解ILC 2-驱动程序是必要的,以使药物干扰ILC 2功能在疾病设置。在这方面,alarmins(例如,IL-33)被证明直接激活了ST2表达的ILC2s,并诱导了它们的2型细胞因子的分泌。12。此外,据报道,某些类型的脂类或脂类衍生物是参与ILC 2活化的关键介质。特别是在蠕虫感染的情况下,ILC 2的功能依赖于脂肪酸的合成和氧化,而脂肪酸的合成和氧化是由过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome增殖物激活受体)调节的。13,14。PPAR是一类作为转录因子调节基因表达的核激素受体。15。它们分为三种主要的异构体:α,β/δ和γ,它们的组织表达和功能不同。15。PPARγ调节脂质代谢相关基因的转录,在不同的免疫细胞中表达,包括淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和血小板,主要发挥抗炎作用。16。虽然临床上使用了不同的合成pPARγ配体,但15-脱氧-Δ12-14-pgj 2(15d-pgj 2)是少数常被称为内源性pPARγ配体的中介分子之一。17。15D-pgj 2是一种前列腺素D2(Pgd 2)衍生的产物,已被报道为激活白细胞介素2(Ilc 2)所必需的产物。18,19,20。特别是最近的研究表明,pgd 2及其代谢物(包括15d-pgj 2)是在IL-33、IL-25和tslp刺激后内源性合成的。19。此外,最近在从人扁桃体组织中分离的ILC2s的单细胞mrna序列分析中,报道了pPARγ和其他与前列腺素(Pg)合成和反应有关的基因水平的升高。21。在本工作中,我们描述了pPARγ在人和小鼠ILCs中的表达和功能作用,以评估pPARγ是否可以在ILC导向的免疫治疗中被靶向。

结果

体外及体外扩增的人白细胞介素2特异性表达pPARγ

为了从功能和激活的角度对ILC2s进行表征,我们从健康供者(HD)PBMC中提取了ILC1s、ILC2s和ILCP的RNA-seq分析,并比较了它们的转录标志(ArrayExpress E-MTAB-8494)。我们特别关注脂肪酸代谢相关基因,这些基因与蠕虫感染期间的ILC 2反应相关,我们发现pPARγ(PPARG)在ILC2s中表达较多,与其它ILC子集相比(图1)。1A,左面板),而pPARα(PPARA)和pPARβ(PPARD)在各亚组中均有表达(如图所示)。1A,右面板),也得到了qPCR的证实(如图所示)。1B)。从mRNA和蛋白水平分析PPAR在体外扩增的ILC亚型中的表达情况,并进行了类似的观察(见图)。1C,d)。鉴于ILCs被认为是CD4 T辅助亚群的固有镜像,我们分析了PPAR在ILC1s、ILC2s和ILCP中的表达,即Th1、Th2和Th17细胞。PPARγ在人Th2和Th17细胞中有较好的表达,而对Th1细胞则无明显影响(补充图)。1A,d),与小鼠相反,pPARγ蛋白主要在Th2细胞中表达。22。综上所述,这些发现表明PPARγ在人白细胞介素2,这也是在体外培养期间保持。

图1:人体外和体外扩增的ILC2s特异性表达pPARγ。
figure1

a与脂肪酸代谢相关的蛋白质(斜体)或与pPARγ的蛋白-蛋白质相互作用(黑体字突出显示)的z行热图。脂肪酸代谢基因摘自“脂肪酸代谢过程”基因本体基因集(GO:0006631,Http://geneontology.org/)。将RNA测序计数转化为对数2/百万计数,用R的VOM函数拟合每个基因的线性模型进行差异基因表达分析(v.3.38.3),然后用在LIMMA软件包中实现的经验Bayes统计模型进行适度的t统计计算(见Ercolano等人)。1关于详细方法)。与ILC1s和/或ILCP相比,ILC2s中显著上调的基因使用*(n=3;*P < 0.05). Proteins putatively involved in protein–protein interactions were taken from the STRING database (Https://string-db.org/). b表达PPAR人新排序ILC子集(开方ILC1s、开圆ILC2s、开三角形ILCP)的qPCR评估(ILC1s)n=6;ILC2s和ILCPsn=7;ILC1s诉ILC2s**P=0.0032,ILC2s对ILCP**P=0.0021)。c表达PPAR体外扩增人ILC亚群(开放方ILC1s、开圆型ILC2s、开三角形ILCP)(ILC1s和ILCPs)的qPCR评价n=3;国际法委员会第2sn=5;ILC1s诉ILC2s*P < 0.0001, ILC2s vs ILCPs *P=0.0020)。d与ILC1s和ILCP比较,蛋白水平上PPARγ在ILC2s表达的Westernblot分析(一个个体实验)。每个符号代表一个单独的捐献者。数据显示为平均值±扫描电镜,并进行了单次分析。b)或双向(c)方差分析。源数据作为源数据文件提供。

PPARγ抑制人白细胞介素2s分泌2型细胞因子

为了更好地阐明pPARγ在ILC2s中的作用,我们分析了pPARγ拮抗剂T 0070907与非毒性浓度的T 0070907预孵育后,IL-33/IL-25(又称IL-25)刺激的细胞因子的产生情况。23。如图所示。2A,bT 0070907处理的ILC2s产生的IL-13明显低于对照ILC2s。此外,其他ILC 2特异性细胞因子也有降低趋势,包括IL-4和两两调节素(AREG)(如图所示)。2B)24。T 0070907处理前后细胞培养上清液中细胞因子的定量结果证实了上述结果。2C)。这个额外的读数使我们能够观察到T 0070907不仅以浓度依赖性的方式减少了IL-13的分泌(补充图)。2A),而且在预处理后的ILC2s中也含有IL-5(如图所示)。2C)。为了验证T 0070907对PPARγ的选择性抑制作用,我们用靶向γ的小干扰RNA(SiRNA)转染人体外扩增的ILC2s。QPCR分析证实了PPARγ的基因敲除(附图)。2B)。与药物抑制作用一致,PPARγ沉默导致细胞因子的产生和分泌显著减少(附图)。2C-e)。这种对2型细胞因子分泌的影响可能至少部分是PPARγ与过氧化物酶体增殖物反应元件结合的直接结果,因为我们在IL-5和IL-13基因启动子区域发现了部分与人PPARγ-维甲酸X受体α(RXRα)异源二聚体结合的动机。二维空间,补充数据1)。为了证实这一发现,我们在细胞因子鸡尾酒刺激和T 0070907处理的人膨胀的ILC2s上进行了染色质免疫共沉淀(芯片)。结果表明,PPARγ与细胞因子激活的ILC2s中IL-13启动子直接结合。2F)。越来越多的报道显示PG合成与pPARγ激活直接相关。25,26,27。特别是最近有报道说,环氧化酶(Cox)是PG产生的关键限速酶,抑制细胞因子刺激的ILC2s分泌IL-5和IL-13。19。基于这些数据,我们推测COX和PPARγ可能对IL 2细胞因子的分泌产生协同作用。因此,我们用T 0070907和celecoxib(Cxb)联合治疗ILC2s。19。虽然没有统计学意义,但我们观察到这种治疗会导致IL-13和IL-5分泌的部分减少(补充图)。2G).

图2:pPARγ维持人白细胞介素2型细胞因子分泌。
figure2

a以T 0070907为代表的流式细胞术分析白细胞介素-13(IL-13)治疗前后(蓝点图)及未处理(红点图)。bT 0070907治疗前后白细胞介素2型细胞因子阳性细胞的频率(开蓝圈)n=6;*P=0.0002)。cT 0070907治疗前后ILC2s细胞培养上清液中2型细胞因子的测定n=6;IL-13*P=0.048,IL-5*P=0.040)。dPPARγ-RXRα结合基序(TOP)在IL-5和IL-13(人类基因组)启动子区的定位。生得最低的图案p-FIMO工具的值(蓝色)或荷马软件的最高得分(橙色)显示。整合基因组观察器(IGV,v2.8.0)用来表示这些基序在IL-5和IL-13启动子中的位置。84。在……里面bc每个符号代表一个单独的捐献者。数据以均值±扫描电镜显示,并进行双向方差分析.源数据作为源数据文件提供。

PPARγ抑制导致人ILC2s线粒体功能障碍

作为一种脂类传感器,pPARγ通过影响线粒体生物发生、葡萄糖摄取和脂质摄入等,在代谢调控中发挥着关键作用。28。为了进一步分析PPARγ介导的抑制ILC2s的机制,我们用MitoTrackGreen摄取法和MitoTracker深红色荧光法测定了这些细胞的线粒体质量。如图所示。3A-d经PPARγ抑制剂处理后ILC2s线粒体线粒体质量下降。我们还使用了四甲基罗丹明甲酯(TMRM),通过在完整和活跃的线粒体中积累,可以评估其膜电位的变化。与MitoTracker结果一致的是,TMRM检测显示ILC2s与T 0070907孵育后线粒体电位显著降低。3E,f)。为了证实我们的数据,我们进行了电子显微镜(EM)分析,显示T 0070907处理的ILC2s细胞线粒体体积百分比低于对照组(图1)。3G,h)。这些发现表明T 0070907的抑制作用与线粒体功能的下降有关,而线粒体功能的下降又可能损害ILC 2细胞的适应能力。

图3:ILC2s中PPARγ的抑制导致线粒体功能障碍。
figure3

a, c, eMitoTracker Green流式细胞术分析的典型实例(a)MitoTracker深红(c)和TMRM(e)在未处理的ILC2s(灰度直方图)和T 0070907处理后(蓝色直方图)处理48h后,分别以平均荧光强度(MFI)进行量化。b, d, fILC2s未处理(开环)和T 0070907处理后(开放水圈),(n=8;Mitotracker Green*P=0.0282,米托跟踪器深红色**P=0.0019,TMRM**P=0.0036)。具有代表性的电子显微镜图像(×4800放大率;刻度条:1μm)(g)和定量地块(h)未处理(开放环)和T 0070907处理(开放水环)48h(n=在一个独立实验中为每个实验条件检查40个细胞;*P=0.0307)。每个符号代表一个单独的捐献者或一个细胞。数据以平均±扫描电镜显示,用双尾Wilcoxon检验进行分析.源数据作为源数据文件提供。

肿瘤源性IL-33使ILC2s对产生IL-13敏感

在过去的十年中,alarmins被确认为参与癌症发展和进展的信号介质。29,30。特别是,不同的研究报道,IL-33及其受体st2在乳腺癌、肝细胞癌和结直肠癌(Crc)等不同类型癌症的发病中起着关键作用。31,32,33,34。我们以CRC为模型,探讨肿瘤源性IL-33在肿瘤免疫背景下对ILC 2功能的作用。首先,我们用组织微阵列技术证实了IL-33在人大肠癌组织中的表达。4A)。GATA 3+CD3细胞在IL-33附近被识别。+CRC上皮细胞,提示从这些恶性细胞释放的IL-33可能刺激人CRC病变中的ILC2s(如图所示)。4B)。根据这些发现,我们观察到CRC患者血清中IL-33水平高于HDs(图1)。4C)。其次,我们从细胞因子产生的角度,评估了大肠癌患者外周血单个核细胞(PBMC)和肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)中ILC 2的频率和功能。正如先前报道的那样,循环ILC 2的频率在HDs和CRC患者中是相当的(见图)。4D)35。重要的是,从分离的CRC组织的流式细胞仪分析来看,TIL中存在ILC2s(如图所示)。4D)。在功能方面,CRC患者PBMCs产生的ILC2s比HDs PBMCs产生的ILC2s多(图1)。4E,f)。为了进一步了解pPARγ在crc设置中ILC2s中的作用,我们评估了PPARγ,以及CPT1A,它是pPARγ的直接目标基因之一。36,分别从大肠癌患者的PBMC和TIL中分离得到新分类的ILC2s。如附图所示。3A,b,高表达的趋势PPARγCPT1A在CRC患者PBMC中观察到与HDs相比,PPARγ不仅增加,而且在CRC环境下也更活跃。此外,T 0070907暴露于CRC患者的扩张ILC2s后,IL-13和IL-5分泌减少,线粒体功能受损,从而使HD ILC2s所观察到的效应再次出现。3C-E)。这些结果表明,肿瘤患者的ILC2s更容易分泌细胞因子,这可能与他们在系统和肿瘤微环境中暴露于IL-33有关。

图4:来源于肿瘤的IL-33使ILC2s敏感,产生IL-13。
figure4

aIL-33的典型例子+人CRC组织中的肿瘤上皮(CRC组织芯片中88个染色核心中的一个),标尺:600 m。b典型的CRC核心染色的IL 33和CD3(大插入),放大的地区标志为黑方后,两种染色都进行了颜色反褶积和共配准(右插入)。标尺:大插入:100米小瓷砖:50米合并(大瓷砖):25米。cELISA法检测大肠癌患者(开放紫罗兰环)和健康献血者(开放红环)血浆IL-33水平(HD)n=21,CRC患者n=15;*P=0.0001)。d在HDPBMCs(开放红圈)、CRC患者PBMCs(开放紫罗兰环)和TILs(闭合紫罗兰环)中ILC2s的频率和绝对值方面的代表性例子和量化(n=10)。e流式细胞术分析HDPBMCs、CRC患者PBMCs或TIL中IL-13的典型例子。fIL-13和IL-5在体外HD PBMCs(开放红环)、CRC患者PBMCs(开紫环)或TILs(闭合紫环)(HDs和CRC PBMC)中的表达频率n=15,“儿童权利公约”n=12;IL-13 HD PBMCs与CRC PBMC*P=0.0144,IL-13 HD PBMCs与CRC TIL**P=0.0094,IL-5 HD PBMCs与CRC TIL**P=0.0044)。每个符号代表一个单独的捐献者。数据显示为平均值±扫描电镜(*)P < 0.05; **P < 0.01, ***P < 0.001) and were analyzed by Wilcoxon (c),1(d)-或双向(f)方差分析。源数据作为源数据文件提供。

IL-13驱动ILC2s与癌细胞之间的串扰。

近年来,IL-13及其受体被认为是肿瘤治疗的新靶点,抑制IL-13产生细胞是实现这一目标的一种策略。37。为了更好地理解pPARγ、ILC2s和CRC细胞之间的串扰,我们用T 0070907或溶剂对照对ILC2s进行预处理,并与SW 1116细胞共培养。如图所示。5A,b,ILC2-SW 1116共培养可提高ILC2s的IL-13产量,而T 0070907预处理ILC2s可使IL-13的产量降低。ILC2s中IL-13的产生可能是由于IL-33在共培养的CRC细胞中的表达增加而引起的(如图所示)。5C)。为了解决这一假设,我们使用已知通过干扰IL-33途径抑制2型免疫反应的寄生虫分泌蛋白(Hpari)进行了共培养实验。38。如附图所示。4A加入HpARI后,与SW 1116大肠癌细胞共培养后,ILC2s产生IL-13的量明显减少。由于IL-13通过影响上皮向间充质转化(EMT)参与大肠癌的进展和转移。39我们推测IL-2衍生的IL-13可能影响CRC细胞的EMT。为了解决这一问题,我们用活化的ILC2s的条件培养基(CM)进行了伤口愈合和克隆形成试验,无论是否与T 0070907预处理(分别为ILC 2和ILC 2+T 0070907)。未观察到对CRC细胞增殖的影响(附图)。4B)。然而,我们发现IL C2 CM的存在促进了SW 1116细胞的迁移,而IL 2+T 0070907 CM的加入则产生了相反的作用(图1)。5D,e)。同样,集落形成实验证实,与对照组相比,ILC2CM增加了SW 1116集落的数量,并与ILC 2+T 0070907CM相比,增加了SW 1116的数量。5F)。此外,加入一种抗IL-13的阻断抗体可阻止SW 1116集落的形成,证实IL-13参与了IL 2-PPARγ对大肠癌细胞的依赖性作用(图1)。5F)。为了证实ILC2CM对大肠癌转移和侵袭的促肿瘤作用,我们在SW 116细胞株中检测了细胞因子的表达。MMP 9N-钙粘素,两个与肿瘤细胞的进展和侵袭有关的分子。40,41,42。我们发现,加入ILC2CM显著增加了这两个EMT标记在CRC细胞上的表达,而加入ILC 2+T 0070907CM或抗IL-13阻断抗体则使其表达降低到基础水平(如图所示)。5G)。综上所述,我们的数据表明癌细胞和ILC2s之间存在串扰,其中癌细胞触发ILC2s产生IL-13,进而维持其迁移和侵袭能力,但不影响其增殖速度。PPARγ在此回路中的抑制阻碍了ILC2s的促肿瘤作用。

图5:IL-13驱动ILC2s与癌细胞之间的串扰。
figure5

a白细胞介素2衍生白细胞介素-13流式细胞术与SW 1116细胞共培养的典型例子。bT 0070907与SW 1116 CRC细胞共培养时IL-13和IL-5阳性表达频率(中(开圆)+SW 1116(开放红圈)培养基+T 0070907+SW 1116(开蓝圆))(培养基)n=6,中等+SW 1116n=8,中等+T 0070907+SW 1116n=8;中等对中等+SW 1116*P=0.0313,中等+SW 1116 vs中型+T 0070907+SW 1116*P=0.0103)。c用qPCR方法检测IL-33在SW 1116 CRC细胞中的表达(SW 1116 CTR(开放圈)SW 1116+ILC 2(开放红圈)SW 1116+ILC 2+T 0070907(开放蓝圆))(n=3;*P=0.0419)。d创伤愈合实验的典型例子(×20放大;标尺:50m),用SW 1116 CRC细胞(开圈)与ILC 2(开放红圈)或ILC 2+T 0070907条件培养液(CM)(开蓝圆)孵育。e24、48和72h愈合伤口面积的量化(n=5;**P=0.0078,*P=0.0493)。fSW 1116 CRC细胞(开放红圈)、ILC 2+T 0070907 CM(开蓝环)或ILC 2 CM+抗IL-13阻断抗体(开放绿环)孵育14天后克隆形成的典型例子及定量分析(SW 1116 Ctrr)n=6,ILC2 CM和ILC 2+T 0070907 CMn=8,ILC2 CM+抗IL13n=3;*P=0.0002,**P=0.0085,*P=0.0497)。g表达MMP 9(左)及N-钙粘素(右)用qPCR方法对SW 1116个CRC细胞(开放红圈)、ILC 2+T 0070907 CM(开放蓝圈)或ILC 2 CM+抗IL-13封闭抗体(开放绿环)(SW 1116 CTR、ILC2 CM、ILC 2+T 0070907 CM)进行鉴定。n=6,ILC2 CM+抗IL13n=5;MMP 9SW 1116 CTR诉ILC2 CM**P=0.0035,ILC2 CM对ILC 2+T 0070907 CM*P=0.0425,ILC2CM对ILC2CM+抗IL13*P=0.0152;NCADSW 1116 CTR诉ILC2 CM*P < 0.0001, ILC2 CM vs ILC2 + T0070907 CM **P=0.0041,ILC2CM对ILC2CM+抗IL13*P=0.0002)。每个符号代表一个单独的捐献者或样本。数据显示为平均值±扫描电镜,并进行了单次分析。c, f, g)或双向(b, e)方差分析。源数据作为源数据文件提供。

PPARγ在小鼠ILC2s中的表达和功能

为了将我们的发现转化为体内环境,我们评估了PPARGC57BL/6小鼠肺组织中的ILC亚群。与我们的人类数据一致,PPARG在ILC2s中特异表达,而在ILC1s和ILC3s中不能检测到(图1)。6A)。因此,我们在体外将小鼠ILC2s暴露于T 0070907中,从而可以重复利用人ILC2s所获得的结果,同时降低IL-13和IL-5的产生(图1)。6B,c)。接下来,为了确定pPARγ在ILC2s中的作用,我们使用了一种具有icc特异性pPARγ诱导基因敲除(Ko)的转基因小鼠模型。PPARGfl/fl小鼠在Id2启动子下表达CRE酶的动物,已知可控制ILC的发育43。该模型允许他莫昔芬以ILC特有的方式及时诱导cre活性。44(无花果)6d)。我们下一次敏化PPARGfl/flID2克里尔T2阳性或阴性小鼠PPARGfl/fl ID2CRE+PPARGfl/fl ID2分别用IL-33和IL-25I.P。连续3d,注射他莫昔芬5天后。如图所示。6E,ILC2s从PPARGfl/fl ID2CRE+与对照组相比,小鼠分泌的白细胞介素13和白细胞介素5显著减少。PPARGfl/fl ID2CRE老鼠。此外,与在人类中观察到的结果相似,我们发现动机部分匹配小鼠pPARγ-rxrα异二聚体结合基序在两者的启动子区域。伊-5伊-13基因(图1.6f,补充数据2)。综上所述,这些结果证实了PPARγ在体内作为ILC 2功能的关键调节因子的作用。

图6:pPARγ在小鼠ILC2s中表达和功能。
figure6

a表达PPARG应用qPCR技术对C57BL6小鼠肺组织中新分类的ILC亚群进行分析(n=3)。bT 0070907处理小鼠白细胞介素-13的流式细胞分析代表例。cIL-13及IL-5阳性ILC2s未治疗的频率(开放红圈)及T 0070907治疗后的频率(开放蓝圈)(n=4;*P=0.0101,**P=0.0015)。d表达PPARG白细胞介素33/白细胞介素25治疗后新鲜肺组织白细胞介素2的qPCR分析PPARGfl/flID2克里尔T2正(开蓝色圆)或CreerT2阴性小鼠(开放红圈)(n=10,**P=0.0098)。eIL-33和IL-25刺激小鼠ILC2s细胞培养上清液中IL-13和IL-5的检测PPARGfl/flID2克里尔T2正(开蓝色圆)或CreerT2负老鼠(开红圈)(PPARGfl/flID2克里尔T2n=11,PPARGfl/flID2克里尔T2阳性n=14;IL-13**P=0.0086,IL-5**P=0.0035)。fPPARγ-RXRα结合基序(TOP)在IL-5和IL-13(小鼠基因组)启动子区的动机定位。动机与最低的原始p值发现FIMO工具(蓝色)或最高的得分发现荷马软件(橙色)。整合基因组观察器(IGV,v2.8.0)用来表示这些基序在IL-5和IL-13启动子中的位置。84。见补充数据2完整的主题搜索结果。每个符号代表一个单独的鼠标。数据显示为平均值±扫描电镜,并进行了Wilcoxon分析。d)或双向(c, e)方差分析。源数据作为源数据文件提供。

ILC2s中PPARγ的表达对CRC小鼠肿瘤进展的影响

接下来,为了研究白细胞介素2(ILC2s)在大肠癌发生、发展中的作用,我们采用了小鼠异位性CRC模型。罗尔aFl/sgIl7rCRE小鼠(称为ILC2KO小鼠)45。我们皮下注射(S.C.)MC-38小鼠基因修饰的CRC细胞构成性产生IL-33(报告为MC-38-IL33)。将肿瘤细胞注射到ILC2KO的右侧,观察其存活情况。如图所示。7A与对照组相比,ILC2KO小鼠的肿瘤进展较慢,在KO株中具有较好的生存优势,提示ILC2s在该模型中具有促肿瘤作用。这种效应在从C57BL6小鼠肺中分离的扩张的ILC2s过继转移后恢复(见图)。7b)。接下来,为了进一步评估pPARγ在肿瘤发生过程中对白细胞介素2的贡献,我们将mc-38-IL 33细胞注射到PPARGfl/flID2CRE+老鼠和PPARGfl/fl ID2CRE老鼠(图1.7C)。引人注目的是,18天后,肿瘤体积减少。PPARGfl/fl ID2CRE+小鼠与对照组比较(图1)。7D)。根据这些数据,PPARGfl/flID2CRE+与对照组相比,小鼠的存活时间更长(如图所示)。7E)。为了证实ILC2s参与EMT现象的体外实验结果,我们采用qPCR方法检测了小鼠MMP-9和N-cadherin在游离肿瘤组织中的表达。如图所示。7F,两者的高表达MMP 9Ncad在……里面PPARGfl/flID2CRE相比较PPARGfl/flID2CRE+观察肿瘤。此外,为了评价PPARγ抑制在大肠癌发生和进展中的治疗作用,我们用T 0070907对荷瘤小鼠进行了治疗。如附图所示。6AT 0070907可显著降低肿瘤体积和重量,提示在CRC患者中应用PPARγ抑制剂是一种可能的治疗方法。此外,我们还通过抗IL-13中和抗体治疗荷瘤小鼠,评价了IL-13在体内的促肿瘤作用。治疗18天后,与对照组相比,治疗后小鼠的肿瘤体积和重量均显著减少(补充图)。6B)。综上所述,这些结果强调了ILC2s和PPARγ在促进癌细胞进展和随后转移潜能方面的相关性。

图7:pPARγ在大肠癌小鼠模型中的表达影响肿瘤的进展。
figure7

a肿瘤存活罗尔aFl/sgIl7rMc-38-IL 33鼠CRC细胞移植后CRE阳性(蓝巴)或阴性(红巴)小鼠n=6,ILC2 KOn=7;*P=0.0227)。b以肿瘤体积表示的肿瘤大小(左)和肿瘤发育(右)在ILC2WT(开放红圈)、ILC2KO(开放蓝圈)和ILC2KO小鼠ILC2-转移(开放绿色圆圈)中表现为肿瘤体积。n=6;*P=0.0473,**P=0.0023)。cCRC小鼠模型的图式表示PPARGfl/flID2克里尔T2老鼠。d肿瘤发育表现为肿瘤体积PPARGfl/flID2克里尔T2阳性(开蓝圈)或负鼠(开红圈)(n=15;*P=0.0451)。e生存PPARGfl/flID2克里尔T2阳性(蓝棒)或阴性(红棒)荷瘤小鼠(n=5;*P=0.0338)。f表达MMP 9(左)及Ncad(右)PPARGfl/flID2克里尔T2阳性(开放蓝色圆)或阴性(开放红色圆)分离的肿瘤组织(n=8;MMP 9 *P=0.0379,Ncad*P=0.0104)。每个符号代表一个单独的鼠标或示例。数据以平均±扫描电镜显示,用对数秩(Mantel&Cox)进行分析。a, e)Wilcoxon(f)或双向(b, d)方差分析。源数据作为源数据文件提供。

讨论

ILC2s通过在稳态和疾病中影响下游适应性免疫,成为2型免疫应答的关键调节因子。然而,决定ILC 2功能的外部和细胞内的调节途径仍然很难理解。在这里,我们证明PPARγ在人和小鼠的ILC2s中都有选择性的表达。其药理抑制作用可降低ILC2s在IL-33刺激下的线粒体适配度,减少ILC2s中2型细胞因子的分泌。此外,在人类白细胞介素33富集型癌(如大肠癌)的环境中,白细胞介素2(ILC2s)显示了pPARγ依赖的促肿瘤功能。最后,通过在ILCS中诱导和有条件地删除pPARγPPARGfl/flID2克里尔T2小鼠和一个异型肿瘤模型,我们显示出明显减少肿瘤的发展和发展在体内。总之,我们的研究结果指出ILC2s在IL-33依赖性肿瘤中的促肿瘤作用,提示pPARγγ靶向治疗ILC 2引起的疾病,包括癌症,可能成为一种有吸引力的辅助治疗方法。

据报道,脂肪酸代谢相关基因(包括己糖激酶2(HK2)、丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK 1)和ftp-6)在蠕虫感染过程中发挥重要作用。13。在其他免疫细胞类型中,pPARγ被证明是肺泡巨噬细胞脂代谢的主要调节因子。46,作为促炎细胞因子分泌的抑制剂。47,并促进2型反应。48。在这方面,Nobs等人。发现IL-33通过诱导pPARγ在CD4中参与Th2反应和肺变应性炎症的发展。+T细胞和DC22。最近,有报道称pPARγ对t9功能有正调节作用,可促进急性变态反应性皮肤病患者分泌白细胞介素9(IL-9)。49。人和小鼠组织中pPARγmRNA在人和小鼠组织中表达的不同转录分析21,50。此外,最近有报道说pPARγ是白细胞介素2在过敏性气道炎症过程中的重要调节因子。51,52。此外,Batyrova等人还证明,pPARγ控制了pd1在ILC2s上的表达,影响了IL-5和IL-13在体内的产生。53。然而,这种核受体在ILC2s中的功能相关性仍然是有限的,特别是在人类中。与活化诱导的pPARγ在CD4中的表达形成对比+Th2细胞22,我们的结果认为pPARγ在ILC2s中的稳定表达,它显然是2型细胞因子分泌的稳态调节因子,可能是在内源性配体(如pgd 2衍生的15d pgj 2)存在的情况下,正如以前所报道的那样。19。研究表明,pPARγ刺激通过pgc-1α的诱导,促进不同细胞类型的线粒体生物发生。54。我们的发现与PPARγ在维持ILC2s能量平衡方面的作用是一致的,这可能是通过促进PGC-1α的表达和促进线粒体活性来实现的。此外,pPARγ-rxrα异二聚体可直接调控IL-13和IL-5在2型细胞因子表观调控的ILC2s中的表达。55在这些基因的启动子区域存在潜在的pPARγRXRα结合元件。PPARγ在不同发育阶段或/或在不同组织的ILC2s亚群体中的表达是否存在异质性,仍有待于通过高清晰度筛选方法来阐明,如单细胞mrna测序。

越来越多的证据表明,IL-33及其受体st2(又称IL1RL1)是肿瘤生物学和免疫学中的重要炎症途径。34,56。特别是,一些研究报告说,IL-33和st2被认为是tme促进不同类型癌症(包括乳腺癌、肝细胞癌、胃癌和crc)中免疫细胞吸收和肿瘤恶性化的强有力的调节因子。31,57,58。在结直肠癌中,不同的报道显示IL-33和st2在肿瘤组织中高表达,并与肿瘤的发生发展相关。31晚期肿瘤与预后不良59,60,61。ILC 2肿瘤浸润已经被我们和其他不同类型的癌症所报道,它与亲和抗肿瘤的活动都有联系,这取决于环境的不同。10。ST2信号转导可直接刺激ILC2s产生2型细胞因子62。反过来,IL-33触发的IL-13有利于诱导骨髓源性抑制细胞(MdSCs),并与膀胱癌复发有关。7,57,63。此外,有报道称IL-13可以通过IL-13R/STAT 6信号传递来促进EMT,但此前没有关于EMT与ILCS之间可能的联系的报道。39。结果表明,ILC2s通过促进大肠癌细胞的迁移和侵袭,在肿瘤驱动的IL-33/st2/IL-13轴中发挥重要作用,是促进肿瘤转移的关键因素。64。我们的结果表明,pPARγ是ILC2s与癌细胞相互作用的关键,通过支持ILC2s的癌前功能,ILC2s可能在乳腺癌和肝癌等不同的IL-33依赖肿瘤中保守。然而,在其他肿瘤类型中,ILC2s可能发挥抗肿瘤作用,因此认为靶向ILC2s的好处是肿瘤类型依赖性的。65。到目前为止,有关pPARγ在癌症发展和进展中的相互矛盾的数据已经被报道。66。一方面,pPARγ在大肠癌中的表达与预后密切相关。67应用pPARγ激动剂曲格列酮和罗格列酮通过肿瘤导向作用抑制大肠癌和膀胱癌模型的肿瘤发生。68,69。另一方面,在APC小鼠同样的治疗会增加肿瘤的数量,并使用pPARγ抑制剂(包括T 0070907)抑制乳腺癌细胞的体外增殖。70抑制CRC细胞在体内外的迁移和侵袭。71,72。在以ILC2s为靶点的pPARγ靶向性实验中,体内条件性和诱导性的γ基因缺失所获得的抗肿瘤表型提示ILC特异性和时态靶向性可能对肿瘤有一定的治疗作用。因此,我们发现PPARγ是一个可药物的靶点,可以抑制强有力的、快速的ILC 2效应功能。其药理抑制作用可作为癌症治疗和/或其他ILC 2介导的疾病的辅助治疗,最近在过敏和哮喘中得到了证明。22,48,73.


武汉新启迪生物科技有限公司联系邮箱:
service@qidibio.com  techsupport@qidibio.com  
武汉新启迪生物科技有限公司咨询客服:周一至周五8:30-17:30
联系我们
服务保障                        支付方式
武汉新启迪生物科技有限公司联系电话:
027-87610298
027-87610297