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Ambra1的缺失促进黑色素瘤的生长和侵袭

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发表时间:2021-05-06 10:40作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

黑色素瘤是最致命的皮肤癌。尽管在了解黑色素瘤生物学的分子机制和确定新的治疗策略方面有了改进,但这种疾病的治疗需求尚未得到满足。在此,我们提供证据,在贝林-1调节自噬(Ambra1)激活分子参与黑色素瘤的发展。事实上,我们证明安布拉1缺乏症会加速肿瘤的生长,降低肿瘤的整体存活率。BRAF/PTEN-小鼠黑色素瘤突变模型。同时,我们也证明了安布拉1缺失通过增加细胞的运动/侵袭和激活EMT样过程来促进黑色素瘤的侵袭和转移。此外,我们还表明安布拉1黑色素瘤的缺乏症可影响细胞外基质的重塑,并引起斑粘附激酶1(FAK 1)信号的过度激活,而FAK 1信号转导通路的抑制可减少细胞侵袭和黑色素瘤生长。总之,我们的发现发现AMBRA 1在黑色素瘤中具有抑制肿瘤的作用,建议FAK 1抑制作为治疗AMBRA 1低表达黑色素瘤的一种策略。

导言

黑色素瘤是最具侵略性和致命的皮肤癌。如果不及早诊断,黑色素瘤就会变得高度转移。尽管它的异质性很大程度上是由于它的高突变负担,但丝裂原活化的蛋白Pinase(MAPK)和磷脂酰肌醇-3-激酶/AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1(PI3K/AKT)关键基因的改变已被确认为黑色素瘤的标志,有助于改善患者的分层。1,2。在这些基因中,v-raf小鼠肉瘤病毒癌基因同源性。BRAF)突变(例如,V600E替换)是最常见的,在黑色素瘤患者中报告的比例超过50%。3。此外,进一步的基因修饰还可能交替或同时影响MAPK和PI3K/AKT通路的其他成员,如神经母细胞瘤RAS病毒癌基因同源性。NRAS),神经纤维素酶1(NF1)磷酸酶和张力素同源物(PTEN)3.

近年来,人们加紧研究黑色素瘤个体发生和发展的分子机制,以及开发新的治疗方法。4,5,6。针对晚期黑色素瘤的治疗方法有:(I)靶向治疗,目的是针对最常见的致癌突变(如brf/mek抑制剂);(Ii)免疫治疗,主要通过T细胞再活化(如免疫检查点抑制剂)刺激抗肿瘤免疫反应。4,5...尽管做出了这些努力,黑色素瘤的治疗仍然具有挑战性,因为它具有很强的转移倾向和对治疗的抵抗力,这是黑色素瘤的独特特征。

Ambra1是一种多功能支架蛋白,其功能缺陷可引起小鼠胚胎自噬损伤相关的神经上皮增生。7,8...事实上,ambra 1被认为是一种支持自噬的蛋白质,因为它通过调节Beclin 1和unc-51类自噬激活激酶(ULK 1)的活性来促进自噬的起始。7,8,9。此外,由于它的结构非常灵活,这也解释了它与许多分子伙伴相互作用的能力,因此AMBRA 1可以调节从凋亡到细胞增殖的大量生物过程。10。重要的是,自那以后,Ambra1就被提议作为肿瘤抑制剂。安布拉1在动物模型中,缺乏症和单倍体功能不全分别导致细胞增生和自发肿瘤的发生。11。特别是,我们发现AMBRA 1通过与蛋白磷酸酶2A(PP2A)的相互作用来调节c-myc的稳定性,从而控制细胞的增殖和细胞周期的进展。11最近,Cyclin D1的稳定性也是通过与E3连接酶DDB 1/Cullin 4相互作用来实现的。12.

近年来,据报道,伴随着ambra 1和Loricrin(角化细胞的主要成分)在瘤周表皮中的表达缺失,是早期黑色素瘤和高风险肿瘤亚群独立于肿瘤浸润深度的预后的生物标志物。13,14。虽然这可以证明AMBRA 1是黑色素瘤结局的预后,但AMBRA 1在该疾病中的直接作用尚未被研究。事实上,AMBRA 1在肿瘤组织中的表达水平尚未与黑色素瘤的任何阶段/特征相关。

在这里,通过应用临床前BRAFV600E/PTEN-小鼠黑色素瘤模型15结合有条件的淘汰安布拉116,我们提供证据安布拉1对黑色素瘤发展的影响。特别是,我们表明安布拉1促进黑色素细胞痣的形成,加速黑色素瘤的生长,最终增强转移潜能。

结果

安布拉1缺乏症促进黑色素瘤的发展BRAF V600E/+ ;Pten −/−小鼠

评估.的作用安布拉1在……里面BRAF/PTEN-驱动性黑色素瘤,安布拉1浮标/浮标小鼠16与携带BRAFV600E突变和PTEN删除(BRAFV600E/+;Pten浮标/浮标)15,一种诱导小鼠100%外显黑色素瘤的遗传组合17,18。在这种基因工程小鼠模型(GEMM)中,黑素细胞特异性cre重组由酪氨酸酶启动子(Tyr::CreerT2/+),仅在4-羟基他莫昔芬(4-OHT)给药时发生.三周大Tyr::CreerT2/+BRAFV600E/+;Pten−/−安布拉1+/+ (双酚A+/+), Tyr::CreerT2/+BRAFV600E/+;Pten−/−安布拉1+/− (双酚A+/−)和Tyr::CreerT2/+BRAFV600E/+;Pten−/−安布拉1−/− (双酚A−/−用4-OHT局部治疗小鼠下背部皮肤,以诱发黑色素瘤(补充图)。1A2A)。值得注意的是,双酚A−/−小鼠出现更大的肿瘤(见图)。1A,b)具有较高的增长率(如图所示)。1C)超过双酚A+/+老鼠。中位生存期双酚A−/−小鼠也从56天显著减少到42天(见图)。1D)。然而,这些肿瘤的形态与粘液样,S 100没有差别。+和色素细胞(附图)。2B,c)。值得注意的是,我们观察到安布拉1剂量依赖性影响黑色素瘤的发展,如肿瘤生长和中位生存期安布拉1杂合子(双酚A+/−)小鼠(图1.1A、c、d)。尽管如此,安布拉1结果产生了更大的影响,双酚A+/−肿瘤被排除在进一步的分析之外。

图1:安布拉1缺失促进黑色素瘤的发展BRAFV600E/+;Pten−/−老鼠。
figure1

a肿瘤的代表性图片双酚A+/+, 双酚A+/−双酚A−/−小鼠治疗后32d。b重量双酚A+/+ (n=12)和双酚A−/−(n=10)终点肿瘤(42天)(**)p=0.0053,双尾未配对t-测试,双酚A−/−诉BPA+/+). c肿瘤生长动力学双酚A+/+ (n=12),双酚A+/− (n=10)和双酚A−/− (n=10)老鼠。每个数据点对应于每个实验组的平均肿瘤体积±扫描电镜。*p=0.0128;*p=0.001,单因素方差分析)。d卡普兰-梅耶整体生存曲线双酚A+/+ (n=11),双酚A+/− (n=8)和双酚A−/− (n=8)小鼠(p < 0.0001双面对数等级测试,双酚A−/−V.V.双酚A+/+)和e小鼠皮下注射2×106 双酚A+/+- (SbpA+/+; n=16)或双酚A−/−- (SbpA−/−; n16)肿瘤源性细胞。对肿瘤的出现进行了60天的监测(p < 0.0001双面对数等级测试,SbpA−/−V.V.SbpA+/+). f皮肤增生症(黑色箭头)和色素沉着区+/+ (n=9)和−/− (n=7)老鼠g量化。每个数据点代表一只鼠标,对应于色素区的平均百分比±扫描电镜(每个鼠标至少分析了四个区域):**p=0.0033,双尾未配对t-测试,−/−VS。巴+/+). h年皮肤切片中Ki 67免疫染色(红色)的代表图像+/+ (n=7)和−/− (n=7)小鼠。原子核以蓝色(Hoechst)表示。白色箭头表示发球。i中所示信号的量化h。每个数据点代表一个鼠标,对应于Ki 67的平均比±SEM。+细胞核上的细胞计数(每只老鼠至少分析三个字段)(**p=0.006,双尾未配对t-测试,−/−V.V.+/+)。图中显示的盒子和胡须情节b, g, i)表示从最小到最大的值。顶部和底部晶须表示上部(Q)3)和更低(Q)1)四分位数。方框指四分位数范围。中间线表示为框中的水平线。

此外,在同基因小鼠模型中证实了更快的生长动力学,在该模型中,小鼠皮下注射两种不同数量的细胞。双酚A+/+ (SbpA+/+)和双酚A−/− (SbpA−/−)肿瘤,随访60天。1E)和120天(补充图。二维空间)。在这个时间框架内,87.5%和80%SbpA−/−小鼠分别发生肿瘤,而未见肿瘤。SbpA+/+老鼠。

测试是否损失了.安布拉1足以导致黑色素瘤的形成BRAFV600E-突变的黑素细胞18, Tyr::CreerT2/+BRAFV600E/+安布拉1+/+ (+/+)和Tyr::CreerT2/+BRAFV600E/+安布拉1−/− (−/−)小鼠出生后第1、3、5天在背侧皮肤上注射4-OHT(补充图)。1B)。4-OHT诱导后13周,皮肤切片−/−在高放大率下,小鼠的色素沉着(黑素细胞痣)和增生性区域明显增加(如图所示)。1F,g)。这些表型与Ki 67免疫染色显著增加有关,表明−/−黑素细胞增殖+/+对应方(图1.1H,I)。基67+细胞主要位于−/−皮肤切片,而Ki 67阳性率主要见于+/+小鼠(附图)2E)。通过与PP2A的相互作用考虑Ambra1在c-Myc降解中的作用11及其新发现的调节Cyclin D1稳定性的调控细胞周期进展的功能12,我们试图调查是否观察到BRAF-突变的黑色素细胞安布拉1可能与c-Myc和Cyclin D1的调控有关。有趣的是,安布拉1-缺乏症痣中Cyclin D1水平显著升高,磷酸化c-Myc(p-c-Myc-S62)略有上调(附图)。2F-h). +/+−/−观察小鼠长时间(高达350天)监测黑色素瘤的发病情况。肿瘤外显率低−/−小鼠(12.5%)(附图)。2K,补充表1),没有发现肿瘤。+/+小鼠(补充表)1).

这些结果表明安布拉1缺乏症促进黑色素瘤生长BRAFV600E/+;PTEN−/−遗传背景。同时,它还会影响色素沉着,引起皮肤增生。BRAFV600E单独突变。

安布拉1缺乏症影响细胞增殖BRAF V600E/+ ;Pten −/−小鼠

尽管有更快的生长动力学安布拉1-缺乏肿瘤,增殖率双酚A−/−在最终终点(即42天后,达到最大耐受性肿瘤大小)分析的小鼠略有下降,但明显减少(图一)。2A,b)。Ki 67的相对数量+细胞安布拉1-与其相比,缺陷性肿瘤确实减少了野生型在同一时间点(42天)的对应方(如图所示)。2A,b)。为了评估这种表面上减少的细胞增殖是否是由于细胞死亡增加所致,我们对凋亡标记物casp3进行了TUNEL和WB分析。双酚A+/+双酚A−/−肿瘤切片和提取物。两种基因型间无显着性差异(附图)。2L,m),但总核数目较少的情况除外。双酚A−/−肿瘤(附图)2N),这与细胞增殖率的降低是一致的。然而,当Ki 67分析是在双酚A+/+双酚A−/−在肿瘤出现后(≤2mm)或肿瘤达到最大允许大小(≥4mm)时,相同大小的肿瘤(如Breslow厚度),两组之间无明显差异(图2)。2C,d),建议双酚A+/+双酚A−/−肿瘤实际上有相似的增殖率。然而,值得注意的是,在基因型上,大肿瘤(即≥4mm)的总体增殖率低于小肿瘤(≤2mm)(图2)。2C,d)。这些结果清楚地表明,增殖的黑色素瘤细胞的数量并没有改变,如果按肿瘤的大小。因此,更大的体积双酚A−/−肿瘤(如图所示)。1C)只能归因于损失的损失所赋予的增殖优势。安布拉1,这使它们能够在较短的时间内达到最大尺寸。为了支持这一假设,我们观察到双酚A−/−肿瘤显示c-Myc磷酸化和Cyclin D1水平增加(如图所示)。2e-g)。这一补充证据与其他地方提供的结果一致。11,12,并表明.的损失安布拉1可能通过促进细胞增殖来促进黑色素瘤的生长。

图2:细胞增殖安布拉1删除。
figure2

aKi 67在FFPE肿瘤切片上的代表性IHC染色双酚A+/+ (n=7)和双酚A−/− (n=7)小鼠。bKi 67的量化+细胞显示在a。每个数据点代表一个鼠标,对应于Ki 67的平均比±SEM。+细胞核计数上的细胞(每只老鼠至少分析三节)(*p=0.0262,双尾未配对t-测试,双酚A−/−V.V.双酚A+/+). cBreslow≤2mm组织中Ki 67的典型染色(平均=1.79±0.28mm);双酚A+/+ n=3,双酚A−/− n≥4mm(平均=4.24±0.69mm);双酚A+/+ n=7,双酚A−/− n=7)。dKi 67的量化+细胞显示在c。每个数据点代表一个鼠标,对应于Ki 67的平均比±SEM。+每只小鼠细胞核上的细胞数(**p=0.0045双酚A+/+≥4 mm V.双酚A+/+≤2 mm;**p=0.0015双酚A−/−≥4 mm V.双酚A−/−≤2毫米,双向变异)。e年Cyclin D1的代表性WB分析与定量(盒图)双酚A+/+ (n=4)和双酚A−/−(n(4)块状肿瘤裂解物。微管蛋白用作装载控制(*p < 0.0001, two-tailed unpaired t-测试,双酚A−/−V.V.双酚A+/+). fFPE肿瘤切片中Cyclin D1和p-c-Myc-S62的代表IHC染色双酚A+/+ (n=6)和双酚A−/− (n=6)小鼠。g中所示Cyclin D1和p-c-Myc-S62信号的定量f (*p=0.0117;*p=0.0002,双尾未配对t-测试,双酚A−/−VS。双酚A+/+)。图中显示的盒子和胡须情节b, e, g表示从最小到最大的值。顶部和底部晶须表示上部(Q)3)和更低(Q)1)四分位数。方框指四分位数范围。中间线表示为框中的水平线。

安布拉1缺乏症促进了一种侵袭性表型的形成。BRAF V600E/+;PTEN −/−小鼠

接下来,进一步了解受安布拉1缺乏症,我们进行了RNA测序双酚A+/+双酚A−/−肿瘤在42天的终点。基因本体论分析表明,细胞外基质组织(ECM)、整合素信号转导、神经系统发育和粘着斑基因等多种过程均显著上调。双酚A−/−肿瘤,由各种本体论库(p < 0.01) (Fig. 3A;补充图。3A-d和补充数据1)。基因集富集分析(GSEA)也显示了与侵袭性相关的基因集的丰富(Verfaillie等人的侵袭性黑色素瘤信号)。19组织(GO:0030198),上皮间充质转化(Emt)(hallmark基因集)和灶性粘连组装(go:0005925)。双酚A−/−黑色素瘤3B)。在这些发现的推动下,我们评估了双酚A+/+双酚A−/−肿瘤切片用Pmicrosirius Red(PR)染色。一般情况下,肿瘤主要表现为胶原纤维汇合较厚的区域,类似于正常的网状真皮,厚厚的胶原纤维被细纤维间质分离和分离的区域,以及仅有细纤维间质的区域。组织病理学分析显示双酚A−/−黑色素瘤有一个占主导地位的细纤维间质,而双酚A+/+肿瘤更多的表现为更长更厚的胶原纤维(如图所示)。3C,d)。Rna seq分析显示,包括ECM降解蛋白酶在内的ECM相关基因也有上调作用。双酚A−/−黑色素瘤3E),通过定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)进一步验证所选择的基因(补充图)。4A)。值得注意的是,明胶检测显示人SK-Mel-5黑色素瘤细胞对AMBRA 1(SiAMBRA 1)与对照相比,其降解明胶基质的能力更强。西斯克尔)细胞(图1.3F),从而强调AMBRA 1缺失对黑色素瘤细胞侵袭和迁移能力的可能影响。为了进一步解决这方面的问题,我们进行了伤口愈合和跨井迁移试验,这两种方法都是在体内进行的,即从体外分离出的黑色素瘤细胞。双酚A+/+双酚A−/−小鼠(Bdmc)+/+和Bdmc−/−分别)(附图。4B,c),以及体外,也就是说,在人黑色素瘤细胞株上SiAMBRA 1-介导的击倒(图1.3G,h和补充图。4D-g)。在所有不同的环境组合中,我们观察到AMBRA 1缺乏引起更快的伤口关闭动力学和增加迁移能力。侵袭能力的增加也与EMT基因的表达增加有关(例如,CdH 2, FN1, 维姆, Snai 1),如RT-qPCR和WB分析显示的体积肿瘤(图)。3i,j;补充图。4H)、Bdmc+/+和Bdmc−/−细胞(附图)4I)和SiAMBRA 1人黑色素瘤SK-MEL-5(图5)。3K,l和补充图。4J),MeWo和SK-Mel-2细胞(附图)。4K-m).

图3:安布拉1缺失引起的侵袭性表型BRAFV600E/+;Pten−/−老鼠。
figure3

a提升过程(p < 0.01) and b谷胱甘肽其他,标准化富集评分;FDR,错误发现率)双酚A−/− (n=3);双酚A+/+ (n(3)肿瘤。c有代表性的图像和d组织病理学评价小天狼星红染色双酚A+/+ (N)=6)和双酚A−/− (n(6)肿瘤。e部分ECM相关基因在肿瘤中的差异表达(英文)n=每组3人,FC>2,帕迪 < 0.05.) fAMBRA 1-沉默SK-Mel-5细胞中明胶降解的研究。F-肌动蛋白和细胞核用Phalloidin和Hoechst染色。图像是有代表性的。每个点表示每个字段的平均计数±sd(n=3;**p=0.0022;*p < 0.0001, one-way ANOVA). gAMBRA 1的伤口闭合区-沉默的SK-Mel-5。定量显示为百分比±SD比。T0在指定的时间。白色和黄色线条轮廓伤口边缘T0在指定的时间。图片具有代表性(n=4;**p=0.0021 6 h;*p=0.026 9h;*p < 0.0001 12 h, 18 h and 24 h, SiAMBRA 1#1V.V.西斯克尔. n=3;°p=0.0234 6 h;°°p < 0.0001 9 h, 12 h, 18 h and 24 h, SiAMBRA 1#2VS。西斯克尔、双向方差分析(ANOVA)。hAMBRA 1-沉默SK-Mel-5细胞迁移计数。数据表示为平均值±SD,图像代表(n=3;*p=0.0289SiAMBRA 1#1VS。西斯克尔, *p=0.0454SiAMBRA 1#2V.V.西斯克尔、单向方差分析)。世行fh表示沉默的效率。iRt-qPCR分析Cdh 1, CdH 2, 泽布-1, Snai 1, 维姆, Fn1CTNNB 1在……里面双酚A−/− (n=48)和双酚A+/+ (n=4-8)。数据归一化为L34表示为折叠变化(*p=0.0158Chd1;*p=0.0417CHD 2;**p=0.0096Zeb-1;*p=0.0006Snai 1;*p=0.0239VIM;*p=0.0458Fn1,双尾未配对t-测试,双酚A−/−V.V.双酚A+/+). j大体积肿瘤中Cdh 1、Cdh 2、-catenin、Vimentin和Snai 1的WB分析(n=每组3人)。kRt-qPCR分析CdH 2, FN1, 维姆Snai 1 inAMBRA 1-静音SK-Mel-5。数据归一化为L34表示为折叠变化±sd(n=4;**p=0.0045CdH 2; **p=0.0022FN1; *p=0.0353维姆; *p=0.0005Snai 1,双尾未配对t-测试,SiAMBRA 1V.V.西斯克尔、虚线)。l代表(n(4)WB分析AMBRA 1-沉默的SK-Mel-5中Cdh 1、Cdh 2、-catenin、vim和SNAI 1。盒子和胡须情节f, i表示最小到最大值。顶部和底部晶须表示上部(Q)3)和更低(Q)1)四分位数。方框指四分位数范围。中间线表示为框中的水平线。

总之,这些结果表明安布拉1通过诱导ECM重构和EMT样表型,促进黑色素瘤侵袭。

安布拉1缺乏症促进小鼠黑色素瘤转移

为了探讨这些发现在体内的相关性,我们分析了安布拉1-缺乏黑色素瘤细胞,使其他器官定植。宏观观察和组织学分析显示腹股沟淋巴结双酚A−/−与老鼠相比,老鼠拥有更大的色素区域。双酚A+/+小鼠在42天的终点(图)。4A-d),并显示S 100的数量较高。+黑色素瘤细胞4C,d)。有趣的是,iLNs的组织学分析双酚A+/+小鼠最大耐受性肿瘤大小(59天和42天)双酚A−/−)色素区呈上升趋势。双酚A+/+相似,但低于观察到的双酚A−/−老鼠(图1.4A-d)。这一证据支持了这样一种假设:安布拉1缺失加速了黑色素瘤的发展,促进了黑色素瘤的侵袭状态。然而,当原发肿瘤的最大耐受性达到最大时,两组均未见肺转移。因此,评估远距离器官是否能更有效地被安布拉1-缺乏症黑色素瘤细胞,我们利用一种同基因小鼠模型,即向C57BL/6小鼠注射新鲜解离细胞。双酚A+/+双酚A−/−肿瘤通过尾静脉(SbpA+/+SbpA−/−)(图1.4E)。健康状况SbpA+/+SbpA−/−对小鼠进行3个月的监测,并对其进行安乐死和肺采集。虽然转移瘤在宏观上看不出,但组织学分析显示SbpA−/−小鼠有更多的归巢和更大的结节。SbpA+/+老鼠(图1.4F-h),建议安布拉1耗竭促进黑色素瘤转移。

图4:安布拉1缺失促进黑色素瘤转移。
figure4

a收集腹股沟淋巴结的宏观评价双酚A−/−肿瘤的耐受性达到最大(42天),双酚A+/+, n=4;双酚A−/−, n=4)或最大允许体积双酚A+/+肿瘤(59天)n=4)。每组显示三幅有代表性的图像。bILNs的平均面积为42(双酚A+/+, n=4;双酚A−/−, n=4和59(双酚A+/+, n=4)天。每个点表示每个鼠标iLAN的平均面积。数据显示为平均值±扫描电镜(*p=0.0172;**p=0.0063,单因素方差分析)。cFFPE-iLNs切片用H&E(左板)和抗S 100染色(IHC,中间板;IF,最右边板)。转移区域由黑色箭头表示。IF染色用Hoechst染色。图片代表每一组(n=5)。dS 100 IHC的量化每个数据点代表S 100的平均百分比。+每只小鼠的iLN面积±SEM(n=5,**p=0.0079;*p=0.0002,单因素方差分析)。e黑色素瘤细胞肺归巢模型的示意图0.25×106细胞/小鼠静脉注射。fFFPE-肺灌流,H&E染色,黑箭头示细胞归巢区。图片代表每一组(n=4)。g总面积(**p=0.0075)和h群众人数(**p=0.0025)双酚A+/+ (n=4)和s双酚A−/− (n4)小鼠被量化(双尾未配对)。t-测试,SbpA−/−V.V.SbpA+/+)。图中显示的盒子和胡须情节b, d, g, h)表示从最小到最大的值。顶部和底部晶须表示上部(Q)3)和更低(Q)1)四分位数。方框指四分位数范围。中间线表示为框中的水平线。

安布拉1缺乏症导致黑色素瘤FAK 1信号过度激活

散在RNAseq和gsea分析表明,粘着斑基因(GO:0005925)在安布拉1-肿瘤衰竭(图1)。3A,b和补充图。三维空间)。近年来,已有研究表明,AMBRA 1通过与FAK 1和src相互作用,调控小鼠鳞状细胞癌中的粘着斑激酶1(FAK 1)介导的信号通路。20。因此,我们研究了是否观察到安布拉1-低强度肿瘤与FAK 1信号轴的磷酸激活有关,这已被证明有助于黑色素瘤的侵袭性表型。21,22,23,24。WB分析显示FAK 1(pFAK-Y 397及-Y 576)及src(psrc-y 416)的磷活性显著增加。双酚A−/−肿瘤(如图所示)。5A和补充图。5A)和人黑色素瘤细胞的AMBRA 1沉默(图一)。5B和补充图。5B-d),以及在ILN转移中双酚A−/−(补充图。5E)和黑素细胞痣−/−小鼠(附图)2F,i)。免疫荧光分析进一步证实FAK 1在SiAMBRA 1SK-Mel-5细胞(图1.5C和补充图。5F显示pFAK-Y 397信号与F-肌动蛋白纤维边缘的FA相关蛋白共同定位(图1)。5C和补充图。5F)。值得注意的是,AMBRA 1缺乏与FAs的大小和长度增加和形状因子降低有关,FAs是癌细胞的一个特征,其特征是运动速度更快(图一)。5D-g和补充图。5G-I)25,26.

图5:安布拉1-缺乏症显示FAK 1信号亢进。
figure5

a42天pFak-Y576、pFak-Y397、Fak1、PSRC-Y416和Src的WB分析双酚A+/+/双酚A−/−在59天内双酚A+/+肿瘤(n=每组3人)和b在AMBRA 1-沉默SK-Mel-5(图像代表的是n=4)。c代表(n(3)AMBRA 1-沉默的SK-Mel-5中pFAK-Y 397的IF染色。分别用Phalloidin、vinculin和Hoechst对F-actin纤维、细胞骨架和细胞核进行染色.最右边面板显示用于量化的阈值d平均尺寸(*p=0.001),e长度(渡轮)(*p=0.0003),f周长(*p=0.0005)和g形状因子(*p=0.0098(n=3,双尾未配对t-测试,SiAMBRA 1V.V.西斯克尔). h代表(n(3)断裂PARP-1(CL-PARP-1)和CASP-3(CL-CASP 3)的WB分析长曝光在AMBRA 1/FAK 1共沉默的SK-MEL-5中,红带识别信号饱和度)。i的情况下评估了伤口的愈合情况。h并显示为百分比±SD比。T0在指定的时间。白色和黄色线条轮廓伤口边缘T0在24小时内提供统计数据和有代表性的图像。n=3;*p=0.037;*p < 0.0001、双向方差分析(ANOVA)。jAMBRA 1/FAK 1共沉默SK-MEL-5细胞迁移计数。数据表示为平均值±SD,图像代表(n=3;*p=0.0246SiScr:siAMBRA 1VS。SiScr:siScr; *p=0.0116SiFAK 1:siAMBRA 1VS。SiScr:siAMBRA 1; *p=0.0304SiScr:siFAK 1V.V.SiScr:siScr、双向方差分析(ANOVA)。k示意图表示法法基治疗。l肿瘤生长动力学车辆- (n=5)或法基- (n=5)处理SbpA−/−老鼠。数据点代表平均体积比.第0天±扫描电镜(**p=0.0022;*p < 0.0001, two-way ANOVA). m重量SbpA+/+*车辆 (n=8),SbpA+/+*法基 (n=5),SbpA−/−:车辆 (n=10)和SbpA−/−*法基 (n=9)牺牲肿瘤(*p=0.0007;*p < 0.0001, two-way ANOVA). nBdmc创面闭合术+/+ (n=3)和Bdmc−/− (n=3)经1M处理的细胞法基在24小时内,行定义为i,数据显示为百分比±SEM比。T型024小时,图像代表(*p=0.0003;*p < 0.0001, two-way ANOVA). o迁移Bdmc计数+/+ (n=3)和Bdmc−/− (n=3)细胞n。数据表示为平均值±扫描电镜,图像代表**p=0.0047;*p < 0.0001, two-way ANOVA). Box-and-whisker plots in dg, m表示最小到最大值。顶部/底部晶须表示上部(Q)3)/较低(q1)四分位数。方框指四分位数范围。中间线表示为框中的水平线。

两种内源性免疫沉淀分析(附图。5J)和AMBRA1-myc标记表达(补充图)。5K)SK-Mel-5细胞提取物证实了以前报道的FAK 1和AMBRA 1的相互作用。20。有趣的是,当我们表达FAK 1P876A/P882A突变体(HA-FAK1.miRes)AA)-以前曾报告要废除与AMBRA 1的相互作用20-FAK 1缺失的SK-Mel-5黑色素瘤细胞(SiFAK 1),我们观察到AMBRA 1/FAK 1相互作用的减少(补充图)。5L)。这种现象伴随着FAK 1信号的磷酸激活增加(补充图)。五米),类似于我们以前在AMBRA 1中观察到的--沉默的细胞(如图所示)。5B),提示FAK 1/AMBRA 1相互作用的消失与FAK 1的过度磷酸化有关。

以前曾报道过PP2A与AMBRA 1相互作用11调节粘着斑27,28。基于这一证据,我们试图研究PP2A活性是否能通过AMBRA 1促进FAK 1和SRC的磷酸化。为此,我们通过siRNA选择性地降低了SK-Mel-5中AMBRA 1的水平。AMBRA 1信使RNA(MRNA)(SiAMBRA 1#2),然后诱导AMBRA 1的PXP突变体的表达。AMBRA 1PXP),已被报道废除了PP2A与AMBRA 1的结合。11,16。表达AMBRA 1PXP,以及WT AMBRA 1(AMBRA 1威汤哥),不影响FAK 1或SRC的磷酸化状态。5N),从而排除AMBRA 1相关PP2A活性在AMBRA 1耗竭时对FAK 1磷酸化的调节作用。

最后,为了评估ambra 1亲自噬功能是否参与fk 1的过度激活,我们沉默了关键的自噬基因。ATG 7 (SiATG 7)在黑色素瘤细胞中。值得注意的是,FAK 1信号的激活(补充图)。6A-c)也没有观察到有侵袭性和迁移倾向的增加。SiATG 7细胞(附图)6d-i),表明这些现象与自噬无关。

总之,这些结果表明AMBRA 1对黑色素瘤细胞中FAK 1信号的调控与其PP2A和自噬相关功能无关。

安布拉1-调控FAK 1对黑色素瘤进展的影响

为了了解FAK 1是否在AMBRA 1缺乏所观察到的侵袭和迁移能力中发挥作用(图1)。3G,h),我们进行了伤口愈合和跨井迁移试验。SiAMBRA 1黑色素瘤细胞同时下调FAK 1(SiAMBRA 1:SiFAK 1双重击倒)(无花果。5H和补充图。7A)。光学显微镜分析表明,FAK 1的沉默导致了一种拯救的表型独特的.SiAMBRA 1细胞(图1.5i,j和补充图。7b,c),然而,这与任何凋亡事件无关(如图所示)。5H和补充图。7A)。另一方面,HA-FAK1.miRes的重新表达AA突变体的迁移能力高于WT FAK(HA-FAK1.miRes)(附图)。7D),支持AMBRA1-FAK1相互作用在确定黑色素瘤细胞侵袭能力方面的相关性。

接下来,为了探讨这一发现的治疗意义,我们测试了FAK 1(法基)能特异性地影响小鼠皮下注射黑色素瘤细胞的肿瘤生长。双酚A−/− (SbpA−/−)肿瘤。5K)。自SbpA+/+小鼠不容易发生肿瘤(图一)。1E和补充图。二维空间),我们决定增加细胞数量(最多5×10)6)在两种基因背景下产生可检测的肿瘤。值得注意的是,肿瘤生长的动力学在法基行政管理SbpA−/−老鼠(图1.5L和补充图。7e-g),收集时肿瘤重量减少也证明了这一点(如图所示)。五米),强调FAK 1信号轴心在持续运行中的关键作用。安布拉1-缺乏肿瘤。

为了确定FAK 1的抑制是否也会影响体外侵袭/迁移能力,bdmc。+/+和Bdmc−/−细胞的最大非致命性剂量法基(1M)24小时(附图)。7H)。与我们的假设一致,伤口愈合和跨井迁移测试显示,只有在bdmc,才有统计学意义的拯救移行和侵袭性表型。−/−细胞法基(无花果)5N,o).

总之,这些发现表明AMBRA 1介导的对FAK 1信号的调控影响黑色素瘤细胞的侵袭能力,并影响肿瘤的体内生长。

AMBRA 1在人黑色素瘤中的低表达与侵袭性表型及对FAK抑制的敏感性有关

为了加强我们发现的相关性,我们对17株人黑色素瘤细胞株进行了AMBRA 1表达的检测。其中9个细胞系的特征是AMBRA 1的表达降低(图1)。6a,b)。筛选的AMBRA 1高表达和低表达细胞株的Transwell迁移和伤口愈合实验显示AMBRA 1的表达与侵袭/迁移能力之间存在明显的负相关(图一)。6C,d)。还有,AMBRA 1间充质基因的表达与表达呈负相关CdH 2, FN1维姆,而上皮标记物之间有明显的正相关关系。Cdh 1(无花果)6e-h),因此提示一个活跃的EMT样过程与人黑色素瘤细胞中AMBRA 1的低表达有关。

图6:AMBRA 1在人黑色素瘤中的低表达与侵袭性基因信号和对Faki的敏感性有关。
figure6

a17株黑色素瘤细胞裂解物AMBRA 1的WB分析肌动蛋白作为负荷对照。形象代表n=3凝胶。b以AMBRA 1/actin比值±SD表示AMBRA 1的密度分析,确定AMBRA 1的高低基团。n=3;*p < 0.0001,双尾未配对t-测试)。c迁移AMBRA 1高(n=3)和低(n(3)细胞。数据表示为平均值±SD,图像代表**p=0.0026,双尾未配对t-测试,AMBRA 1低对AMBRA 1高)。dAMBRA 1高的创面愈合n=3)和低(n3)细胞的百分比为±SD比。T012小时。白线和黄线轮廓伤口边缘T0而在24小时内,则会在12小时内提供统计数字及有代表性的图片(*p=0.0387,双尾未配对t-测试,AMBRA 1低比.AMBRA 1高)eh相关RT-qPCR分析AMBRA 1eCdh 1 (n=17;r=0.5188;p=0.0329,双尾皮尔逊相关),f CdH 2 (n=17;r=−0.5129;p=0.0353,双尾皮尔逊相关),g FN1 (n=17;r=−0.5045;p=0.0389,双尾皮尔逊相关)和h 维姆 (n=17;r = 0.6812; p=0.0026,双尾皮尔逊相关)。数据归一化为L34. i来自肿瘤基因组图谱(TCGA-SKCM)黑色素瘤样本、癌细胞株百科全书(CCLE)数据集和利兹黑色素瘤组(LMC)黑色素瘤样本的GSEA。ECM组织(GO:0030198),侵入性签名19、EMT(Hallmark基因集)和焦点粘附组装(GO:0005925)基因集在AMBRA 1_Low和AMBRA 1_High在TCGA-SKCM(n每个分组=70),CCLE(n=7(每个分组)和LMC(n=每个分组105)。其他,标准化富集评分;FDR,错误发现率。jAMBRA 1表达与药物敏感性的相关剂量反应分析法基(IC)50、M)在n=15株黑色素瘤细胞系(r=0.7752;p=0.0007,双尾皮尔逊相关)。k两个选定的AMBRA 1高、低细胞的创面闭合面积法基的百分比±SD。T024小时(n=3;*p=0.0003;*p=0.0001对于ed 129,双尾未配对t-测试,法基VS。车辆).

来自肿瘤基因组图谱(TCGA-SKCM)数据集黑色素瘤样本的转录数据n肿瘤细胞株百科全书(CCLE)数据集的黑色素瘤细胞系(CCLE)n=49)和利兹黑色素瘤组原发黑色素瘤样本(LMC,n=703)29并进行了分析。在所有数据集中,样本是根据它们的AMBRA 1MRNA水平定义了AMBRA 1高和AMBRA 1低子群,考虑到人口的前15%和最底层15%AMBRA 1MRNA表达。有趣的是,所有数据集的GSEA显示,AMBRA 1_low亚基在ECM、EMT和FA基因以及与黑色素瘤侵袭性相关的基因中都有丰富的分布。19(无花果)6I).

最后,我们试图评估AMBRA 1的表达水平是否会对人黑色素瘤细胞株的敏感性产生不同的影响。法基。为此,我们治疗了一个由15个黑色素瘤细胞系组成的小组。法基24小时(附图)8A),表明AMBRA 1蛋白表达水平与对法基(无花果)6J)。此外,我们还观察到法基有效(附图)。8B,c)并明显改变所选的AMBRA 1-低表达人黑色素瘤细胞株的侵袭/迁移能力。6K和补充图。8D).

总的来说,这一证据表明AMBRA 1与侵袭性表型相关,并增加了对法基在人类黑色素瘤细胞中。

讨论

本文报道的结果表明,安布拉1在黑色素瘤发展的不同阶段,如BRAF/PTEN小鼠黑色素瘤模型,该模型概括了人类疾病的主要病理生理方面15。特别是,我们发现安布拉1缺乏症加速肿瘤生长并导致早期侵袭性和侵袭性表型BRAF/PTEN黑色素瘤。具体来说,我们已经证明安布拉1-缺乏的黑色素瘤更大,生长动力学更快,小鼠整体存活率下降,黑色素瘤细胞表现出更强的影响ECM结构、迁移和侵袭,最终促进黑色素瘤转移的能力(图1)。7).

图7:安布拉1对黑色素瘤发展的影响。
figure7

安布拉1缺乏症通过影响黑素细胞增殖促进痣的形成BRAFV600E突变的老鼠。当黑色素瘤发生时BRAFV600EPTEN消融,没有安布拉1通过增加细胞迁移和侵袭,激活EMT过程,重构ECM,触发FAK 1信号通路,促进肿瘤的生长和转移。

AMBRA 1发挥其作为支架蛋白的大部分功能,与不同的伙伴相互作用,并调节各种细胞过程,包括凋亡、自噬和细胞增殖。10,12。与AMBRA 1参与细胞生活的许多方面相一致,已经出现了小鼠单倍体功能不全的现象。安布拉1促进多个器官的自发肿瘤发生。事实上,Ambra1作为抑癌基因的作用与其与pp2a和dbb 1/cullin4的相互作用及其对c-myc的调节直接相关。11和Cyclin D112表明Ambra1是细胞增殖的负调节因子。考虑到我们观察到:(I)小鼠皮肤色素沉着增加BRAFV600E背景和(Ii)大型和早期肿瘤BRAF/PTEN-小鼠黑色素瘤模型安布拉1缺乏症,我们调查和相关的增殖优势。安布拉1-缺乏症黑色素细胞和黑色素瘤对c-Myc和Cyclin D1均有影响。

众所周知,黑色素瘤的特点是肿瘤高度异质性和可塑性,并且可能会发生从高增殖/低侵袭到低增殖/高侵袭状态的表型重组。30,31。这两种状态与黑色素瘤进展的不同阶段和对治疗的反应有关。32,33。特别是,已经证明表型转换为缓慢循环/高侵袭状态与黑色素瘤侵袭性增加、转移形成和对braf抑制剂(Brafi)的抗药性有关。33,34,35,36,37。最重要的是,我们的数据清楚地表明安布拉1不仅促进了肿瘤的生长,而且促进了黑色素瘤的侵袭状态。的确,安布拉1-缺乏的肿瘤表现为转移到局部淋巴结的增加,黑色素瘤细胞向肺部的归巢增多。一致地,AMBRA 1-沉默的细胞更容易侵入和迁移。黑色素瘤的表型转换是由关键的转录因子调控的,例如黑色素瘤转录主调节因子微眼炎相关转录因子(Mitf)。38,39神经生长因子受体CD 271(Ngfr)40,后者促进侵袭性和转移性细胞行为,并伴有神经嵴干细胞基因的上调。32,34,35,39。与Ambral的抗侵袭作用一致,安布拉1-缺乏性肿瘤的表达增加恩格尔以及其他与神经嵴相关的基因,这些基因被神经系统发育去过程的上调所证实(如图所示)。3A和补充图。3E)。这表明,至少在黑色素瘤的情况下,侵袭性的表型安布拉1-空细胞可能与更多的去分化状态下的肿瘤相关联。

越有侵入性的状态安布拉1-缺陷性肿瘤伴随着其他高侵袭性黑色素瘤特有的关键过程,如ECM蛋白分解/重构、EMT激活和FA激活等。19,23,41。Schoenherr和他的同事最近发现,AMBRA 1通过与FAK 1和几种转运蛋白的相互作用参与了src/fak 1依赖的极化和趋化性侵袭,从而调节了粘附和迁移。20。与这些数据一致,我们在这里展示了在体外和体内的相关性。安布拉1-介导FAK 1在黑色素瘤发展中的调节作用。我们的结果显示FAK 1信号在双酚A−/−黑色素瘤,直接或间接贡献于大多数观察到的表型。具体来说,FAK 1信号在癌症中的激活可以调节大量的致癌过程,包括EMT、细胞运动和金属蛋白酶(MMPs)的表达。42。我们一直表明安布拉1缺失严重影响黑色素瘤的微环境,其特征是ECM相关基因的上调,例如MMPs和赖氨酰氧化酶(洛克斯)。这些酶在改变ECM结构和促进肿瘤进展方面的作用已经在不同类型的肿瘤中得到了很大的证明。41,43,44。与此同时,观察到了几种类型的胶原蛋白的上调和ECM结构的改变。安布拉1-零黑色素瘤,因此需要一个更有利于肿瘤的环境。44,45。在这方面,我们已经提供证据表明AMBRA 1缺陷的黑色素瘤细胞能有效地降解明胶基质,从而表明它们直接参与了ECM的重构。虽然Ambra1可能调控ECM结构的确切机制仍不清楚,但在大量RNAseq中观察到基因表达的大量调控。双酚A−/−肿瘤强烈暗示转录重组发生在安布拉1击倒。值得注意的是,虽然这些变化在很大程度上可能与肿瘤的基质成分(如成纤维细胞)有关,但有证据表明,在AMBRA 1和Ampa 1沉默的人黑色素瘤细胞中,EMT标记的表达增加。安布拉1Ko肿瘤来源的原代细胞支持黑色素瘤细胞的贡献.与此相一致,值得一提的是,最近报道了Ambra1在细胞核中的一种新的转录功能。46。事实上,它与染色质的联系和与转录因子的相互作用可能暗示Ambra1对观察到的转录重编程的直接贡献。安布拉1-缺乏肿瘤。

自噬在黑色素瘤的发生发展中起着重要作用。47,48。然而,我们无法将这两种情况联系起来。双酚A−/−黑色素瘤或FAK 1信号向AMBRA 1前自噬功能的过度激活7。事实上,在AMBRA 1-沉默细胞中,自噬通量受到影响(附图)。6J,k),散装自噬在安布拉1-零BRAF-突变的黑素细胞(附图)。2F,j)和黑色素瘤(附图)。6L,m),因此意味着肿瘤中发生的代偿性事件。

另一方面,我们证明FAK 1信号转导的药理抑制作用足以使其恢复生长。安布拉1-缺乏BRAF/PTEN-体内黑色素瘤。此外,减少了侵袭性,也增加了对以下问题的敏感性法基在空表达或低表达的ambra 1黑色素瘤细胞中观察到法基在体外。虽然这个证据应该在体内通过FAK 1为了避免药物抑制的可能的非靶点效应,FAK 1和AMBRA 1的体外沉默证实了黑色素瘤细胞迁移和侵袭的可能性降低。这一发现为一种可能的治疗应用铺平了道路。AMBRA 1-FAK 1抑制剂的缺陷性黑色素瘤,已在具有获得性BRAFi耐药性的黑色素瘤的临床前模型中得到应用。49,在固体肿瘤的临床试验中42,50,51。为了支持这一点,我们也注意到AMBRA 1-低表达的人黑色素瘤细胞系和肿瘤(来自TCGA数据库和LMC队列的患者数据)显示FAK 1信号、ECM重塑、EMT和侵袭性基因的上调。

综上所述,我们的发现将AMBRA 1定位为黑色素瘤的抑癌剂,并提出FAK 1抑制剂在目前治疗AMBRA 1-低肿瘤中的潜在应用。


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