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东莨菪碱对小鼠神经炎症和精神错乱的促进作用

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发表时间:2021-04-20 11:31作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

术后精神错乱是一种常见的神经精神综合征,术后死亡率高,出院后功能下降。由于其临床意义,人们对人和动物惊厥样模型进行了广泛的研究,重点研究了系统性炎症及其引起的神经炎症在术后认知功能障碍的发病机制中起着关键作用。由于动物模型被广泛应用于神经精神障碍的病理生理学研究,本研究旨在验证东莨菪碱诱导的精神错乱小鼠模型对精神错乱的神经炎症假说的有效性。雄性C57BL/6小鼠腹腔注射东莨菪碱2mg/kg。进行神经行为测试,评估手术或东莨菪碱治疗后认知功能(包括学习记忆)和焦虑水平的变化。测定不同脑区促炎细胞因子(IL-1β,IL-18,TNF-α)和炎症组分(NLRP 3,ASC,caspase-1)的水平.用全基因组RNA序列分析检测基因表达谱,比较不同小鼠模型的基因表达模式。东莨菪碱治疗显示,焦虑水平和记忆和认知功能损害水平显著增加,相关的促炎细胞因子和NLRP 3炎症组分增加。基因分析证实了在外科手术和东莨菪碱诱导的小鼠模型中,参与免疫反应和炎症的基因的不同表达模式以及与神经系统发育有关的基因表达模式。东莨菪碱诱导的精神错乱小鼠模型成功地表明,类似的神经精神改变与精神错乱发病机制的神经炎症假说相一致。

导言

术后认知功能障碍(POCD)是术后中枢神经系统常见的并发症,表现为记忆力、智力、语言能力或脑功能的其他方面的损害。1认知障碍的急性期被定义为术后精神错乱(POD)2。POD表现出典型的临床特征,如注意力不集中、情绪变化和精神障碍。3。POCD和POD与临床上显著的不良结果有关,包括延长住院时间,降低生活质量,增加术后并发症和死亡率。4,5。由于POCD和POD的确切机制有待探索,炎症和免疫系统的激活被认为是术后认知恶化的关键机制。6.

前脑胆碱能神经元在控制中枢神经系统的注意、记忆和认知功能方面起着基础性作用,并与认知功能减退和多种神经退行性疾病有关。7,8,9。胆碱能通路对免疫系统的影响也是有据可查的。7表明全身炎症反应受迷走神经连接提供的胆碱能抗炎通路的控制。7,10。胆碱能信号还可以通过胆碱能抗炎通路的活性来控制外周细胞因子的产生。11。据报道,老年患者术后精神错乱与胆碱能系统改变有关。12。在类似的背景下,针对精神错乱发病机制的实验和临床研究表明,它伴随着胆碱能通路和药物。13,14.

东莨菪碱是一种抗胆碱能药物,可拮抗毒蕈碱胆碱能受体(MAChRs),并能在学习获得和巩固过程中产生缺陷。15。东莨菪碱治疗的动物模型在神经认知研究中被广泛应用,因为东莨菪碱给药会引起阿尔茨海默病和其他神经认知障碍的行为和分子特征,包括认知受损,以及海马和前额叶皮质胆碱能传递的不平衡。16,17,18。与精神错乱的发生有关,东莨菪碱治疗对骨科手术患者术后精神错乱具有相对的风险。19。东莨菪碱贴片也可引起东莨菪碱引起的精神障碍,特别是在老年人中。20.

尽管东莨菪碱治疗动物模型具有高度相似的临床特征和胆碱能神经传递改变21与POD炎症反应有关的确切发病机制尚不充分。本研究的目的是验证东莨菪碱诱导的动物模型作为POD实验模型的有效性,通过比较东莨菪碱诱导的惊厥样小鼠模型和手术小鼠模型,确定不同脑区炎症相关细胞因子和炎症组分及候选基因的变化。

方法

动物与伦理声明

雄性C57BL/6小鼠,9~12周龄(25~28g),分别来自韩国京木道(Seongnam,Gyeonggi-do)东方生物(Seongnam,Gyeonggi-do)。所有活体实验程序均经延世大学卫生系统动物保护和使用机构委员会(IACUC)认证和批准,该委员会经国际实验动物保护评估和认证协会(AAALAC)认证。所有的实验程序都是根据美国国家研究委员会委员会的“实验动物护理和使用指南”(第8版)进行的。所有小鼠都被安置在受控制的环境下,有12小时的光暗周期和温度,并在延世生物医学研究所的特定无病原体(SPF)设施中接触到咀嚼物和水。本实验是根据一项经批准的动物议定书(第2016-0335号)进行的。这项研究是根据“动物实验报告指南”(Http://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines).

实验设计与程序

采用适当的随机化方法将小鼠分为4组:(1)假手术组(n=10,雄性);(2)手术组(手术组)(n=10,男);(3)车辆对照组(n=10,男);(4)东莨菪碱治疗组(n=10,男性)。假手术组小鼠不受实验条件影响,手术组小鼠接受腹部手术。东莨菪碱治疗组,东莨菪碱(2mg/kg)。21,22用无菌生理盐水(0.9%NaCl w/v)溶解,按体重配制给药体积。手术组和假手术组分别于术后第4天和第5天进行行为测试。行为试验后处死小鼠。在东莨菪碱或东莨菪碱治疗前第1天(假手术组和手术组),两组小鼠均在第1天进行行为测试。第2天(假手术组和手术组第5天),在神经行为试验前30分钟腹腔注射东莨菪碱。在进行神经行为试验前30 min,将相同剂量的无菌生理盐水注入到车辆组小鼠体内。神经行为试验后,于注射后3h处死小鼠。1A、B)。手术方法如下。手术组用4%异氟醚麻醉,1 L/min氧维持1.5~2%异氟醚。麻醉期间,小鼠被放置在加热垫上,以防止体温过低。由于腹部手术是发展POCD模型的良好的介入性方法。23,24,如前面提到的,它是在手术组小鼠身上进行的,但在本研究中有一些修改。25,26。腹腔切开后,分离肠系膜上动脉,夹闭20 min,模拟小鼠腹部手术。同时,操作人员将小肠暴露并摩擦30秒(秒),以模拟实际的临床手术过程。将小肠、腹肌和皮肤放回腹腔,缝合缝合。术后镇痛小鼠腹腔注射曲马多20 mg/kg。假手术组用同样的方法麻醉小鼠,但未做手术。老鼠被送回家的笼子里。术后第5天或东莨菪碱治疗后3h,处死后分离小鼠大脑,包括海马、前额叶皮质和杏仁核。

图1

实验设计和程序。(A东莨菪碱(2mg/kg)或车辆腹腔注射。结扎肠系膜上动脉,摩擦肠,行腹部手术。所有小鼠脑均分离,手术或东莨菪碱治疗后,对海马、前额叶皮质、杏仁核等脑亚区进行分析。(B手术组和假手术组分别于术后4、5天进行行为测试.在东莨菪碱和东莨菪碱治疗前1天和东莨菪碱或车辆治疗30 min时,两组小鼠均进行行为测试。

神经行为评价

采用开放视野试验(OFT)、高倍迷宫实验(EPM)和新物体识别试验(NORT)评价小鼠的神经行为学表现。在给药前1天或术后4天进行行为测试。根据治疗方案,给药后30 min或术后5天分别进行进一步的随访行为试验。所有的神经行为测试都由一位对治疗组视而不见的评估人员用图像分析系统(Smart v2.5.21软件和智能视频跟踪系统,Panlab Harvard器具,西班牙巴塞罗那)自动录制和分析。小鼠依次进行OFT、EPM和NORT。

开场试验

将小鼠置于40×40×40 cm的方形露天竞技场内,进行5 min的探索,同时记录小鼠的行为。以总距离移动作为一般活动和运动功能的指标。动物回避中心区的倾向反映了焦虑相关的行为变化27.

高架加迷宫

用EPM评价小鼠的焦虑相关行为、学习和记忆功能。28,29,30。该迷宫由两个张开臂(31×6×1cm)和两个闭合臂(31×6×15 cm)组成,从中央平台(5×5×1cm)延伸至50 cm(JEUNGDO生物与植物有限公司)。从地板上。小鼠在手术前或东莨菪碱治疗前进行基线实验,术后第5天或东莨菪碱治疗后30 min再次检测。小鼠分别置于开放臂末端,面向另一开放臂,允许探索5 min。分别记录在张开臂和关闭臂上的总持续时间。还测量了在张开手臂上所花时间的百分比。在双臂上停留的时间也反映了与焦虑相关的行为。30。试验前用70%乙醇清洗装置。条目的定义是将所有的爪子放在迷宫的手臂上。学习记忆能力计算如下:传递潜伏期=进入闭合臂的第一潜伏期(基线/训练期)-进入闭合臂的第一潜伏期(测试期)。传递延迟反映学习记忆功能的变化。28,29.

新型目标识别测试

用Nort评估小鼠的认知能力,特别是识别记忆。31。在习惯性阶段,允许每只小鼠自由探索方盒(40×40×40 cm)5 min。在熟悉阶段,将小鼠放置在包含两个相同物体(A+A)的盒子中,并允许其探索5分钟。在实验阶段,将每只小鼠与这两个对象一起返回到盒子中,其中一个对象被转换为一个新的对象(A+B),并允许小鼠探索5分钟。在熟悉阶段和测试阶段,每个物体的近距离探测所花费的时间(%)被自动测量和记录。每次试验结束时,用70%乙醇清洗仪器和物体。术前立即进行习惯化阶段,术后第4天进行熟悉阶段,术后第5天进行试验试验。判别指数为:(探索新对象的时间(B))/(探索熟悉的和新的对象的时间(A+B)×100),以反映认知能力。

酶联免疫吸附试验(ELISA)

在体细胞因子实验中,分别于术后第5天、东莨菪碱或药物治疗后3 h取小鼠海马、前额叶皮质和杏仁核。样品在−80°C保存,直至使用。用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒的组织蛋白提取试剂(组织蛋白提取试剂、热科学、沃尔塔姆、MA、美国)对3个不同区域的脑组织进行TNF-α、IL-1β和IL-18水平的测定(100×Hit蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒,#1861281热科学)。组织匀浆后,以13,000 rpm离心10 min,获得样品上清液。根据制造商的规格,用BCA蛋白分析试剂盒(ThermoScience)测定上清液蛋白浓度。采用高灵敏度ELISA试剂盒(R&D系统公司,明尼阿波利斯,明尼苏达州,美国),根据制造商的规格,测定溶出物中肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-18的水平。将样品加入50μL/孔的检测板中,室温下孵育2h。用试剂盒中的洗涤缓冲液冲洗平板后,将TNF-α、IL-1β和IL-18结合物加入每口井中孵育2h,用微板阅读器在4 5 0nm处测定各孔的吸光度。为检测含NLR家族蛋白3(NLRP 3)、含C端caspase募集区(ASC)的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和裂解液中Caspase-1的水平,采用MyBioSource(美国圣地亚哥,美国)的ELISA试剂盒进行检测,所有程序均按生产指令进行。

Caspase-1活性测定

为了测定caspase-1的活性,使用了Caspase-1测定试剂盒(ABCAM,英国剑桥).用于检测Caspase-1的活性,识别YVAD的序列.术后第5天,或东莨菪碱或车辆治疗后3h,取小鼠海马、前额叶皮质和杏仁核。根据生产厂家的规程,在96口井板中加入制备样品.然后,加入反应缓冲液和YVAD-AFC底物,在36°C下孵育1h,用FlexStation多模微板阅读器测量每口井的荧光(Ex/Me=400/505 nm)。

RNA提取与基因表达谱分析

术后第5天或东莨菪碱治疗后3h,处死后分离小鼠大脑。用Trizol试剂提取小鼠海马组织总RNA(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)。分别用Agilent 2100生物分析仪(美国Agilent Technologies,USA)和ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies,USA)对RNA质量和数量进行评估。RNA样本被作为输入到阿弗莱梅特里克斯程序(阿弗莱米特里,圣克拉拉,加利福尼亚州,美国),按协议(Http://www.affymetrix.com),其中每个样品的总RNA转化为双链cDNA。扩增RNA(Crna)是从双链cDNA模板中通过IVT(体外转录)反应产生的。用含有dUTP的dNTP混合物从随机启动的反转录中再生cDNA.利用UDG和APE 1限制性内切酶对cDNA进行片段化,并与生物素化的二脱氧核苷酸进行末端转移酶反应。按照基因芯片全转录(WT)意义靶标分析手册(Affymetrix)的描述,将片段末端标记的cDNA与阿霉素阵列杂交16h(45℃和60 rpm)。切片用SAPE(链霉亲和素)染色,在基因芯片流体工作站450(Affymetrix)洗涤,并用Affymetrix型3000 G扫描仪扫描。扫描图像数据通过Affymetrix命令控制台1.1软件提取,生成原始CEL文件,显示表达强度数据。表达式数据由Transcriptome分析控制台4.0.1生成。在规范化方面,采用了在Transcriptome分析控制台软件中实现的鲁棒多平均(RMA)算法.

差异表达基因的RNA序列分析

与对照组相比,归一化信号相差两倍以上的基因作为差异表达基因(DEG)。用exDEGA(Excel基差异表达基因分析,eBIOGEN,Inc.,Korea,Korea)工具对DEGS进行基因本体论分析。这些基因的分类是基于使用DavidV6.8进行的搜索(Http://david.abcc.ncifcrf.gov)。在每一组中,基因表达水平转换为log 2值,并显示相对于对照组的相对水平。用多个实验观察软件V4.9(MeV)比较各组间DEGS的聚类热图分布。每个基因的平均折叠变化(FC)表示为标准化的z评分。

统计分析

使用GraphPad Prism 7.00软件(GraphPad软件,圣地亚哥,美国)进行统计分析。数值表示为均值(SEM)的均值±标准差。未配对t-检测行为测试和caspasae-1活性的统计学意义。采用单因素方差分析(ANOVA)对两组间的ELISA和RNA序列进行统计学比较.p值<0.05者有显着性意义。所有图形都是使用GraphPad Prism 7.00软件(GraphPad软件)和图(图)创建的。1图像是通过使用MicrosoftPowerPoint增加的。

结果

东莨菪碱治疗致小鼠惊厥样认知功能障碍

精神错乱与加速认知功能障碍有关。2。因此,我们研究东莨菪碱作为POD模型引起认知障碍的作用和有效性,类似于腹部手术所致的POCD。进行EPM和NORT行为测试,观察手术或东莨菪碱治疗后小鼠学习记忆的变化。2(a-C)在行为后实验中,在EPM实验中,手术小鼠的转移潜伏期(Sec)较假手术组明显降低,提示POCD。同样,东莨菪碱治疗组小鼠的转移潜伏期明显降低,手术组与东莨菪碱组之间没有差异(图二)。2(A)与车辆组小鼠比较。为了观察手术或东莨菪碱治疗后小鼠学习记忆的变化,采用NORT进行行为后测试,以证实学习记忆的变化。在手术组和东莨菪碱治疗组中,探索新对象的时间(按给定公式的百分比计算)明显减少,强调手术和东莨菪碱治疗对认知能力损害的影响(图一)。2b)。辨别指数也显示出在手术或东莨菪碱治疗中学习和记忆能力的下降,与每个对照组相比(如图所示)。2c)。智能视频跟踪系统显示了NORT(补充图)中各组的实时跟踪。1a)。综上所述,神经行为试验表明东莨菪碱治疗可引起小鼠记忆障碍和认知功能下降,与手术组小鼠的结果相似。

图2

东莨菪碱对行为后测验记忆障碍和心理行为的影响。(A)学习和记忆的变化表现为EPM中的传输延迟(Sec),(B手术或东莨菪碱治疗后NORT中新物体的探索时间;C手术或东莨菪碱治疗后NORT的判别指数。(D减少手术后张开臂时间或东莨菪碱治疗EPM的百分比。(E增加手术或东莨菪碱治疗后OFT的总行程。(F手术或东莨菪碱治疗后较低距离在OFT中心区旅行。平均值为平均±SEM(n=4~5)。p 数值<0.05被认为是显著的(*p < 0.05, **p < 0.01, *p < 0.001 vs. control (sham or vehicle), #p < 0.05, ##p < 0.01, #p < 0.001 vs. surgery). EPM; elevated plus maze, NORT; novel object recognition test, EPM; elevated plus maze, OFT; open field test.

东莨菪碱治疗促进小鼠精神错乱样焦虑和兴奋

我们测量焦虑水平,调查东莨菪碱是否会导致精神错乱,这是精神错乱的一个特征。用EPM和OFT进行小鼠行为测试。2(d-F)在行为后测试中,表现出焦虑状态的小鼠被认为有一种倾向于保持在EPM的闭臂状态,因此,东莨菪碱处理的小鼠在张开手臂上的时间比车辆组和手术组的小鼠要少得多,手术组小鼠在张开手臂上的时间也比假手术组少(图1)。2d)。在行为后测试中,假手术组和手术组小鼠的总行程没有显着性差异,但东莨菪碱治疗组小鼠表现出多动运动活动,与手术组相比,总行程明显延长(图1)。2e)。此外,东莨菪碱处理的小鼠在OFT中心区域的旅行距离较小(如图所示)。2(F),表明焦虑程度增加。智能视频跟踪系统显示了EPM和OFT(补充图)中各组的视觉跟踪。1b和C)。

转录组分析显示东莨菪碱治疗改变海马基因表达模式。

为了研究手术或东莨菪碱治疗对动物模型中基因表达模式的影响,我们采用RNA序列分析方法,比较了载体、手术和东莨菪碱处理小鼠海马组织的基因表达情况。热图显示双向分层聚类,比较不同组间的基因表达水平:手术组或东莨菪碱组(图1)。3a)。码头8, Myo1f., TREML 2, Gas5,和拉尔夫1,经手术或东莨菪碱治疗后上调或下调。归一化重复性系数(RC)Dhx 58与对照组相比,无论是手术组还是东莨菪碱治疗组,其参与免疫系统的过程均被上调。基因表达水平码头8, Myo1f.,和TREML 2无论是手术组还是东莨菪碱治疗组。如属Gas5与对照组相比,只有手术组的调节水平下降。与手术组相比,拉尔夫1药物治疗组和东莨菪碱治疗组均被下调(图1)。3b)。此外,涉及海马功能和神经系统的基因,如Lrn 4, S100a10, Slc5a7,和Wnt 6通过手术或东莨菪碱治疗改变。基因表达Lrn 4S100a10被放大,而Slc5a7手术组和东莨菪碱治疗组与车辆组相比均受到抑制。然而,只有东莨菪碱治疗组表现出有效的下调表达。Wnt 6,与车辆组和手术组比较(图1)。3c)。

图3

RNA测序转录组分分析。(A)车辆、手术和东莨菪碱治疗组海马样本的分层聚类。根据对照组、手术组和东莨菪碱组小鼠差异表达基因的基因表达谱对样本进行聚类分析。聚类树显示在左侧,样本聚类树出现在顶部。顶部显示的颜色表示相对基因表达水平,红色代表高表达水平,蓝色代表低表达水平。(B)与免疫/炎症反应相关的差异表达的mRNAs,以及(C)手术或东莨菪碱治疗后的海马功能和神经系统。其数值为均值±扫描电镜(n=2~3)。p 数值<0.05被认为是显著的(*p < 0.05, **p < 0.01, *p < 0.001 vs control (sham or vehicle), #p < 0.001 vs surgery).

东莨菪碱治疗可增加脑内的促炎细胞因子和炎症成分。

根据RNA序列分析中炎性基因的变化,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定海马组织中促炎细胞因子水平,比较手术后第5天和东莨菪碱(注射后3 h)对炎症反应的影响。4)。手术和东莨菪碱治疗后小鼠的促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-18)水平均显著升高(图1)。4(a-C)炎性细胞因子IL-1、β和IL-18的水平受炎症小体的调节.因此,我们测定了海马炎症组分的蛋白质水平。手术组和东莨菪碱治疗组大鼠海马NLRP 3、ASC和caspase-1等炎症成分的表达水平均显著高于对照组(图1)。4(d-F)前额叶皮质和杏仁核参与情绪反应和情绪调节,如焦虑和抑郁。32。我们进一步检查了前额叶皮质和杏仁核中促炎细胞因子和NLRP 3炎症组分的水平。与载体组比较,手术组TNF-α、IL-1β、IL-18等促炎细胞因子水平明显升高.此外,东莨菪碱治疗组小鼠的肿瘤坏死因子-α、IL-1β和IL-18水平明显升高;但东莨菪碱治疗组小鼠IL-1β和IL-18蛋白水平明显低于手术组(图1)。4(a-C)NLRP 3炎症组分NLRP 3、ASC和Caspase-1在手术组前额叶皮质和杏仁核均有高表达。与手术组类似,东莨菪碱治疗组前皮质NLRP 3炎性组分含量增加。此外,手术组和东莨菪碱治疗组杏仁核NLRP 3水平差异不显著,后者无明显变化。然而,东莨菪碱治疗组ASC和Caspase-1的表达较高(图一)。4(d-F)

图4

脑区促炎细胞因子和NLRP 3炎症组分的水平。(AC)手术或东莨菪碱治疗后,海马、前额叶皮质和杏仁核中的促炎细胞因子(包括TNF-α、IL-1β和IL-18)水平升高。(DF)手术或东莨菪碱治疗后海马和前额叶皮层NLRP 3、ASC、ad caspase-1水平升高。此外,除NLRP 3外,手术或东莨菪碱治疗后,杏仁核ASC、ad caspase-1水平升高。平均值为平均±SEM(n=4-6)。p数值<0.05被认为是显著的(*p < 0.05, **p < 0.01, *p < 0.001 vs control (sham or vehicle), #p < 0.05, ##p < 0.01, #p < 0.001 vs surgery).

东莨菪碱诱导炎症复合物诱导caspase-1活化

术后第5天或注射东莨菪碱后3h,测定海马、前额叶皮质和杏仁核caspase-1活性的程度。5)。在图中。5A组、手术组和东莨菪碱组海马内caspase-1活性水平均高于对照组。在前额叶皮质中,只有东莨菪碱组caspase-1活性高于车辆组。然而,假手术组与手术组之间没有显着性差异(图二)。5b)。在杏仁核中,手术组小鼠caspase-1活性高于假手术组,而东莨菪碱处理组小鼠caspase-1活性也高于载体组(图1)。5c)。

图5

脑区caspase-1的活性水平。(A术后第5天(术后第5天)和东莨菪碱(注射后3h),海马内caspase-1和东莨菪碱的高活性水平。(B)东莨菪碱治疗后前额叶皮质caspase-1活性增强。(C)手术组和东莨菪碱组杏仁核caspase-1活性升高。平均值为平均±SEM(n=5)。p 数值<0.05被认为是显著的(*p < 0.05, **p < 0.01, *p < 0.001 vs. control (sham or vehicle)).

讨论

在本研究中,东莨菪碱处理的动物表现出特征性的精神错乱样行为模式,与神经炎症变化相一致的生化表现,以及炎症小体的激活。RNA序列分析还显示,在手术组和东莨菪碱治疗组中,与免疫/炎症反应和神经系统发育相关的基因表达模式有一致的变化,尽管炎症相关基因的表达模式存在一些差异。这些结果提示东莨菪碱治疗的精神错乱样动物模型在重新建立过氧化物酶的临床特征方面具有兼容性,但对神经炎症相关过氧化物酶的解释尚不清楚。

胆碱能神经递质系统负责控制认知过程、获取和保留信息以及任务表现。许多研究报告了胆碱能功能在与年龄相关的记忆障碍和其他神经认知疾病中的作用。33,34。东莨菪碱在人类和实验动物中都能复制类似神志的状态。35,36,37东莨菪碱通过引起脑内胆碱能信号的异常调节,导致东莨菪碱在神经认知研究中的广泛应用。

随着胆碱能假说的提出,氧化应激也被认为是神经认知疾病的可能原因。关于东莨菪碱的使用,先前的研究报告称,全身性服用东莨菪碱与大脑氧化应激增加有关,特别是与记忆和学习有关的区域,如海马和前额叶皮质。16,38。虽然胆碱能系统失调和氧化应激是解释POCD和精神错乱的一个很有前途的假说,但炎症增加仍然是解释神经认知障碍的重要原因,其中在痴呆、精神错乱和POCD患者的脑和血样中可观察到促炎细胞因子如TNF-α、IL-18、IL-6水平的升高。39,40,41...东莨菪碱还可引起促炎细胞因子的增加,炎症被认为是东莨菪碱所致记忆障碍的理论基础。16,42。神经炎在精神错乱中的意义与我们的结果是一致的,在手术组和东莨菪碱治疗组中都显示了促炎症细胞因子的增加。

Nlrp 3炎症小体是一种细胞内传感器,能检测到广泛的微生物基序,通过激活caspase-1来增加脑中的促炎细胞因子(如IL-1β和IL-18)的水平。43。NLRP 3炎症组进一步促进天然免疫细胞的聚集,启动下游炎症级联,最终加速神经认知疾病的病理进程。43,44,45。它的激活已成为各种炎症疾病宿主免疫防御机制的标志,神经退行性疾病的发展也不例外。本研究在三个不同的脑区观察到NLRP 3炎症小体和caspase-1的激活,其中东莨菪碱处理的小鼠海马区激活增强。手术小鼠海马NLRP 3炎症小体活化增加,提示POCD。因此,NLRP 3炎症可能是术后认知障碍和东莨菪碱治疗的主要原因。

杏仁核与额叶、间脑和海马一起,是大脑执行功能、记忆和注意力的关键区域,尤其是在精神错乱的发病机制中。37,46。此外,调节失调的前额叶皮质至杏仁核通路与焦虑有关。32。先前的研究表明,与对照组相比,东莨菪碱处理的动物杏仁核中多巴胺、3,4-二羟基苯乙酸(Dopac)、高香草酸(Hva)和乙酰胆碱等神经递质显著减少,并与同一东莨菪碱处理组内的海马区相比较。37,46。此外,有证据表明,尤其是与记忆有关的区域,如海马和杏仁核,与POD的结果相关的神经传递也发生了改变。在POD的神经炎症假说中,炎症体的意义是非常重要的。在本研究中,东莨菪碱处理小鼠前额叶皮质区NLRP 3炎症组分和caspase-1活性均较高,但杏仁核表达水平不同,东莨菪碱治疗后炎症组分和caspase-1活性升高,而NLRP 3无明显升高。对杏仁核内NLRP 3炎性物质的过渡方面的详细解释可能受到限制,因为局限于杏仁核内炎症成分的直接变化,其中NLRP 3炎性小体的表达减少只能从神经递质的改变或异常表达间接推断。另外,其他类型的炎症复合体(如NLRP 2、NLRC4和AIM 2)可能参与了杏仁核caspase-1的激活和炎症反应。然而,在本研究中,除假手术组外,我们还进行了炎性细胞因子的ELISA检测,因为在行为后测试中,载体组与假手术组之间没有差异。

RNA序列分析技术在人类各种疾病中得到了广泛的应用,在过去的几十年中,从各种疾病中获得了大量的遗传数据。通过对不同治疗组的rna序列分析,本研究从神经炎症的角度成功地鉴定了东莨菪碱治疗后动物模型的基因表达模式的改变,进一步研究了东莨菪碱治疗动物模型作为相容的精神错乱样模型的可靠性。我们已经选择了海马,因为它是学习和记忆过程的特定大脑区域,并且通过各种研究已知与神经精神行为变化有显著的关联。此前的其他研究也从海马组织中提取RNA,以检测神经行为侮辱的rna变化以及认知和记忆的变化。47,48。东莨菪碱治疗后,小鼠胆碱能基因表达减少。Chrnb 3, CHRNB 4, 聊天, Camk2b, Slc18a3, Chrm 1)与车辆相比,虽然缺乏统计学意义。然而,东莨菪碱治疗显著降低胆碱能基因的表达水平(CHRNA 3, Slc5a7, Slc38a5与车辆相比。本研究还鉴定了与炎症和神经系统发育有关的基因,与东莨菪碱治疗的小鼠相比,这些基因在外科手术小鼠中表现出更明显的表达模式(表)。1)。例如,基因表达拉尔夫1,与假手术组相比,手术组小鼠的表达明显升高,东莨菪碱组小鼠的表达水平明显低于手术组小鼠。,在受体介导的内吞作用中起作用,是小gtp结合蛋白的下游效应。49. 拉尔夫1是众所周知的致癌作用和必要的作用在细胞增殖和侵袭在癌变。50,它还以调节促肥胖的促炎细胞因子而闻名。51。手术组和东莨菪碱治疗组的基因表达模式显示,许多显著的基因与类似的细胞功能有关,主要集中在炎症反应和神经系统的发育上,尽管表达水平和意义在一定程度上有所不同。例如,Dhx 58编码lgp 2与病毒感染过程中天然免疫反应、免疫系统和细胞凋亡的调节有关。52. Myo1f.编码肌球蛋白1f蛋白,主要在免疫系统中表达。53。在炎症过程中,它参与了m1-极化的调控。Myo1f.众所周知,缺乏可以减少巨噬细胞向炎症表型的承诺.Myo1f.虚证模型大幅度降低促炎细胞因子的分泌,减少上皮损伤,改善疾病活动,促进组织修复。54,55. TREML 2它是一个跨膜蛋白家族,在各种免疫细胞中表达,如单核细胞、巨噬细胞和小胶质细胞。TREML 2参与天然免疫和适应性免疫,导致炎症状态下巨噬细胞数量增加。56.

表1手术和东莨菪碱治疗小鼠差异表达基因。

另一个基因,Lrn 4,在手术组和东莨菪碱治疗组中都被上调,是一种蛋白质编码基因,在海马依赖的长时间记忆中起着至关重要的作用。57. S100a10编码S 100蛋白家族的一个成员,含有2个EF-手钙结合基序,称为S100A10或p11,参与调节各种细胞过程,如细胞周期进程和分化。上调水平S100a10在海马,参与加工情绪记忆和改变海马功能。58,这是由于p11与5-羟色胺-信号蛋白相互作用所致。此外,由于5-羟色胺神经传递功能失调导致的认知障碍在精神错乱中很常见,p11蛋白与5-羟色胺信号蛋白相互作用,并与情绪障碍的症状相关。58,59. Scl5a7参与了前体胆碱从突触间隙传递到突触前终末,这在胆碱能神经元通讯中起着重要作用。60。总之,东莨菪碱能根据神经炎症假说成功地再现精神错乱的神经精神行为改变,尽管描述性RNA序列分析研究中发现的一致性较低。在本研究中,我们只提出了东莨菪碱治疗精神错乱的候选基因.因此,需要进一步研究精神错乱和病理生理学研究中候选基因的参与。

精神错乱代表了认知和行为异常的大范围,从低活动形式,缺乏注意力和平淡情感的阴性症状,到具有特征性激动和焦虑的多动形式。61。在本研究中,神经行为测试显示,东莨菪碱治疗组焦虑和高运动活动水平显著增加,记忆和认知功能受损;这似乎与炎症反应水平增加有关。东莨菪碱通过破坏胆碱能传递而破坏啮齿动物和人类的学习和短期记忆功能。16,这使它成为最广泛使用的药物,在动物再生精神错乱。因此,东莨菪碱治疗模型与其它模型(尤其是单次ip注射东莨菪碱)相比,适合于POD研究,而动物腹部手术可能是以往研究支持的开发POCD的合适和广泛的方法。23,24,但对POD的发育缺乏明确的解释。

总之,我们的结果表明,东莨菪碱诱导的POD动物模型成功地表现出了类似的神经行为模式,从而呈现出与POD神经炎症反应相一致的结果。然而,遗传分析表明,这些限制是候选基因与精神错乱之间不可缺少的解释。不可否认,在东莨菪碱治疗后,进一步研究精神错乱与候选基因之间的相互作用对于病理生理学研究是必要的。


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