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甲型H1N1流感T细胞表位识别及对蛋白-O-甘露糖基转移酶1蛋白的交叉反应

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发表时间:2021-04-20 11:10作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

嗜睡症1型(NT1)是一种慢性神经系统疾病,与HLA-DQB 1*0602有很强的相关性,提示有免疫学起源。据报道,接种AS 03佐剂补充的甲型H1N1流感疫苗潘德母克斯疫苗的儿童或青少年中NT1的风险增加。在此,我们发现儿童潘德母线相关的NT1患者对病毒表位神经氨酸酶175-189(NA)的T细胞免疫增强。175–189)和核蛋白214-228(NP)214–228),但也会对NA作出响应。175–189-模拟,脑自表位,蛋白质-O-甘露糖转移酶1(POMT 1)675–689)。流感病毒特异性T细胞和T细胞交叉反应性在NT1中的致病作用是由IFN-γ、穿孔素1和颗粒酶B的上调和T细胞受体TRAV 10/TRAJ 17和TRAV 10/TRAJ 24克隆型的融合选择支持的。175–189或POMT 1675–689。此外,抗POMT 1的自身抗体在接种潘德梅克斯疫苗的儿童或青少年中增加.这些结果表明POMT 1是NT1中T细胞和B细胞识别的一种潜在的自身抗原。

导言

嗜睡症1型(NT1)是一种罕见的慢性脑疾病,其特点是白天嗜睡过度、昏昏欲睡和夜间睡眠紊乱。1,2,3。NT1与人类白细胞抗原II类等位基因的异常高度关联DQB 1*0602,编码T细胞受体α-链、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)启动子、肿瘤坏死因子受体2和P2Y11受体的基因多态性,强烈提示了本病的免疫学起源。4,5,6,7,8。尤其是T细胞介导的导致hcRT信号受损的机制参与了nt1的形成。4,9,10,11。据报告,有几个欧洲国家增加了NT1的风险,2009/10年度接种了AS03佐剂补充的甲型H1N1流感疫苗(Pandemrix)的儿童和青少年。12,13,14,15。我们以前曾报道过,潘德母线相关的NT1患者对潘德母线疫苗中存在的甲型流感病毒蛋白有更强的抗体应答。16。这表明后来发展出NT1的接种者也可能对潘德母线产生了异常的T细胞反应。进一步,我们假设由甲型H1N1流感病毒肽启动的CD4+T细胞与CNS自身抗原发生交叉反应,并在NT1中组织一次免疫介导的对次生质神经网络的攻击。

在这里,我们证明了增强的T辅助1(Th1)细胞/细胞毒性T细胞反应在潘德母线相关的NT1患者对不同的病毒NA和NP肽表位。患者来源的T细胞也对脑表达蛋白-O-甘露糖转移酶1(POMT 1)中的一个自表位作出反应,该表位代表患者强烈识别的NA T细胞表位的肽模拟。外周血单个核细胞(PBMC)基因表达谱密切匹配,TCR谱分析检测到NA或POMT 1肽刺激对相同克隆型的上调,从而支持病毒导向的自身反应性T细胞克隆型在NT1中的分子模拟和致病作用。最后,接种者提高了抗人POMT 1的抗体水平,提示Pandemrix疫苗可触发POMT 1自身免疫。这些发现提供了甲型H1N1流感病毒诱导的T细胞免疫与NT1自身免疫的发展之间的联系。

结果

流感病毒HLA-DQ6.2转基因小鼠及HLA-DQB1*0602阳性个体的T细胞表位筛选

为确定流感病毒A(H1N1)T细胞表位在Pandemrix相关的NT1中的分布,制备了15-聚肽,分别覆盖流感的血凝素(HA)、NA和NP(A/Re杂合物/NYMC X-179A(California/07/2009×NYMC X-157)(H1N1))。T细胞表位发现的实验设计如图所示.1。首先,我们筛选了T细胞对肽池的反应(补充数据)。1)用脾细胞接种HLA-DQ6.2转基因小鼠。17。以干扰素-γ(IFN-γ)和(或)白细胞介素-2(IL-2)mRNA或蛋白质(荧光多重珠免疫分析法)的上调作为读出(图1)。2A-C)。作为第二步,在Pandemrix免疫的HLA-DQ6.2小鼠脾细胞中检测刺激IFN-γ或IL-2上调的单个肽对T细胞的反应性(附图)。1A-C)和外周血单个核细胞(PMBC)从Pandemrix接种HLA-DQB 1*0602阳性个体(睡眠临床对照病人,未诊断为NT1;图1。二维f;补充表1)。来自HA、NA或NP的单个T细胞肽刺激小鼠或HLA-DQB 1*0602阳性个体的IFN-γ上调,被确认为随后T细胞分析的抗原,并与NT1患者和对照组进行比较(补充表)。2).

图1:Pandemrix相关NT1中T细胞表位发现的总体实验研究设计。

作为第一步,对甲型H1N1流感病毒HA、NA和NP肽T细胞识别进行了检测,分别接种HLA-DQ6.2小鼠脾细胞,每组5肽(15-MERS)。刺激IFN的池或将IL-2的表达分解,分别用脾细胞和pandemrix免疫的HLA-DQ6.2小鼠的脾细胞和pandemrix免疫的pbmc进行单肽检测。HLA-DQB 1*0602积极的个体。作为第二步,然后用PBMC检测单个肽的识别。PBMC来自儿童潘德母线相关的NT1患者和健康的Pandemrix免疫对照者。作为第三步,甲型H1N1流感T细胞肽显示干扰素的刺激作用增强-γ或IL-2分泌在患者与对照组的验证和映射.用人蛋白组BLAST预测交叉反应性T细胞自身表位,并对Pandemrix相关的NT1患儿和健康的Pandemrix免疫对照者的PBMC进行识别试验。

图2:甲型H1N1流感病毒T细胞表位筛选在HLA-DQ6.2小鼠和Pandemrix免疫的HLA-DQB 1*0602阳性个体中的应用。

免疫Pandemrix免疫的HLA-DQ6.2小鼠脾细胞在体外培养,每组5个重复的15肽肽,包括:a血凝素(HA)b神经氨酸酶(NA)或c流感病毒核蛋白(A/Re杂合/NYMC X-179A(California/07/2009×NYMC X-157)(H1N1))疫苗在Pandemrix(从2×2小鼠中汇集细胞)中的应用n=2)。以重组血凝素(RHA)和核蛋白(RNP;A/波多黎各/8/34)作为阳性对照。dfPandemrix的PBMC-接种疫苗HLA-DQB 1*0602阳性个体(未诊断为NT1的睡眠诊所患者)在同一个疫苗病毒株中用单一的15-聚肽进行培养。n=1-2)。FMIA(蛋白质)或RT-qPCR(MRNA)检测IFN-γ或IL-2的表达.结果表示为在肽刺激和阴性对照样本(刺激指数)中细胞因子浓度(代表均值的线)或相对基因表达(代表单个值的点,代表平均值的条形图)之间的比值。星号(*)表示被选择用于进一步测试的池或单个肽。

Pandemrix相关NT1患者甲型H1N1病毒T细胞表位的鉴定

为了剖析甲型H1N1流感的T细胞免疫,pbmc来自一组特征良好的芬兰儿童pandemrix相关nt1病例,以及健康年龄匹配的pandemrix免疫对照儿童(表)。1、补充表3A,B),用从HA、NA或NP(补充表)中预先选择的15-聚肽组进行刺激。2)。有趣的是,Pandemrix相关的NT1患者与健康接种者相比,有两个病毒T细胞表位被不同程度地识别和诱导出较高的IFN-γ和IL-2应答。这些表位是AWSASACHDGINWLT(NA)178–192)和KTRIAYERMCNILKKFQ(NP)214–231)。表位AFAMERNAGSGIIIS(HA)271–285)和MERNAGSGIIDTP(医管局)274–288),以前与NT1相关联。18但IFN-γ和IL-2的应答相对较低,患者与健康接种者之间无显着性差异(图二)。3A-f,补充图。2A-F)

表1 PBMC和血浆样本供者的临床资料。
图3:Pandemrix相关NT1患者甲型H1N1流感病毒T细胞表位的鉴定。

采用流感病毒单聚肽(A/REXATION/NYMC X-179A(California/07/2009×NYMC X-157)(H1N1))、流感病毒血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)或核蛋白(NP)(发现队列)刺激儿童潘德母线相关NT1患者(NT1)或正常儿童(C)PBMC。以重组神经氨酸酶(RNA)和核蛋白(RNP)为阳性对照。干扰素-γ的分泌a, c, e)或IL-2(b, d, f)用FMIA(蛋白质)法测定。结果表示为刺激肽和阴性对照样品中细胞因子浓度的比值(刺激指数)。采用Kruskal-Wallis和Dunn的多重比较方法进行各组间的统计比较。

接下来是AWSASACHDGINWLT(NA)178–192)和KTRIAYERMCNILKG(NP)214–228)表位被定位在芬兰儿童潘德里克斯相关NT1患者的验证队列中,以及健康年龄匹配的潘德梅克斯疫苗接种对照组(表)。1、补充表3A,B)。T细胞分析中的15-聚肽重叠刺激表明AWSACHDGIN(NA)178–189)和IAYERMCNILKG(NP)217–228)是T细胞核心表位。4A,d,补充图。3A,D)。有趣的是,AWSACHDGIN(NA)178–189)表位包括WSASACHD(NA)179–186),一个甲型H1N1流感B细胞表位,通过噬菌体展示-模拟表位变异分析,与潘德梅克斯相关的NT1患者血清发生反应。19.

图4:Pandemrix相关NT1患者甲型H1N1流感病毒T细胞表位图。

a, d以流感病毒(A/Re杂合物/NYMC X-179A(California/07/2009×NYMC X-157)(H1N1))疫苗病毒神经氨酸酶(NA)或核蛋白(NP)为抗原,对儿童潘德母线相关NT1患者(NT1;验证队列)或儿童Pandemrix接种的健康对照组(C)的PBMC进行了体外培养,并与A/Re杂合物/NYMC X-179A(加利福尼亚/07/2009×NYMC X-157)(H1N1)进行了比较。b, c, e, fNT1患者外周血单个核细胞(无一例外)HLA-DQB 1*0602阳性;发现和验证组合;HLA-DQB 1*0602纯合子NT1患者用红点标记)或HLA-DQB 1*0602用单个NA或NP衍生肽刺激正常对照组(C/DQ 6+)和阴性对照组(C/DQ 6−)。用FMIA(蛋白质)法测定IFN-γ的分泌.结果表示为刺激肽和阴性对照样品中细胞因子浓度的比值(刺激指数)。采用Kruskal-Wallis和Dunn的多重比较方法进行各组间的统计比较。

NT1和NT1患者对甲型H1N1流感抗原表位的差异T细胞反应HLA-DQB 1*0602阳性或阴性健康疫苗接种者

T细胞对表位NA的反应175–189178–192,和NP214–228NT1组强于两组HLA-DQB 1*0602阳性或阴性对照(NT1患者发现和验证队列的组合;图1。4B、c、e,补充图。3B、C、E)。纯合性HLA-DQB 1*0602似乎没有增加对这些T细胞肽的反应。HLA-DQB 1*0602NT1杂合子患者。相反,T细胞对HA的反应271–285和HA274–288NT1患者与对照组相比无明显增加,而对NP的反应无明显增加。217–231NT1患者仅与HLA-DQB 1*0602阴性,但不是阳性对照(补充图)。4A-D、图1.4F,补充图。3F)。结果表明NT1患者对NA的T细胞反应异常强烈。175–192和NP214–228病毒抗原表位对Pandemrix疫苗的反应,这不仅仅是HLA分子限制的结果DRB 1*1501-DRB 5*0101-DQA 1*0102-DQB 1*0602单倍型这些发现与我们先前报道的NT1患者对潘德母线病毒蛋白的抗体反应增强相一致,并与携带HLA-DQB 1*0602等位基因16.

从NA和NP中寻找与甲型H1N1流感T细胞表位同源的人类蛋白序列

为了确定可能的交叉反应自表位,我们对人类蛋白质组(BLASTP)的12-聚肽进行了基本的局部比对.IAYERMCNILKG(NP)序列相似性搜索217–228)和ESVAWSACHD(NA)175–186)产生的同养素γ-1(YEIMCKILK,SNTG 1)的最高点击率338–346;E-值2.0,75%的查询覆盖率,78%的标识)和蛋白-O-甘露聚糖转移酶1(VAWYSSACH,POMT 1)681-689;E值0.083,查询覆盖率75%,标识78%).这两种蛋白质都在人脑中表达。

Pandemrix相关NT1患者甲型H1N1病毒交叉反应性T细胞自表位的发现

为了检测免疫交叉反应性,我们对sntg 1和POMT 1中的Blastp识别的两个可能的自表位进行了重叠的15聚肽T细胞分析。2)。有趣的是,干扰素-γ对肽IFSALVVAWYSSACH(POMT 1)的反应增强。675–689NT1患者(p < 0.01, Fig. 5A;补充图。5A)。提示POMT 1可以代表NT1中的自身抗原。T细胞对肽NA的反应175–189、纯合性HLA-DQB 1*0602似乎没有增加对POMT 1的响应675–689超过达到的水平HLA-DQB 1*0602NT1杂合子患者。相反,肽RAEKTFSVYIMCKI(SNTG 1)330–344)仅由一名NT1患者和接种过疫苗的对照组(注:图1)确认。5B;补充图。5B).

图5:Pandemrix相关NT1中的自身反应性T细胞。

a, b以人蛋白-O-甘露糖基转移酶1(POMT 1)或同步营养素γ-1(SNTG 1)为抗原的15-肽重叠肽刺激儿童潘德母线相关NT1患者(NT1)和正常对照组(C)外周血单个核细胞(PBMC)。用FMIA(蛋白质)法测定IFN-γ的分泌.HLA-DQB 1*0602纯合子NT1患者有红点标记。结果表示为刺激肽和阴性对照样品中细胞因子浓度的比值(刺激指数)。采用Kruskal-Wallis和Dunn的多重比较方法进行各组间的统计比较。

干扰素-γ对肽NA的反应175–189和POMT 1675–689,或NA178–192和POMT 1675–689,显示了相关性,进一步暗示了特异性病毒定向T细胞与NT1中这个自表位的交叉反应(Spearman的秩相关系数)。rs=0.511和rs分别=0.778(p=0.078;**p=0.007)。

甲型~(H1N1)NA流感刺激PBMC的转录分析175–189或人类POMT 1675–689提示Pandemrix相关NT1中T辅助细胞活化及具有交叉反应性的细胞毒性T细胞反应

为了进一步表征T细胞对甲型H1N1流感病毒NA和人POMT 1表位的反应,并确定NT1的致病途径,我们研究了病毒NA的基因表达水平。175–189-或人类POMT 1675–689-Pandemrix相关NT1患者和接种Pandemrix疫苗的健康对照者的受刺激PBMC。在RNA测序中,刺激诱导NT1患者与健康对照者发生明显的反应。总共有74个基因被差异表达,要么是对NA的反应。175–189(49个基因),或POMT 1675–689(28个基因;3个基因重叠,**)p < 0.01; Fig. 6,补充图。6,补充数据2)。结果进一步表明,NT1患者PBMC基因表达谱与这两种多肽反应密切匹配(图一)。6),且NT1患者PBMC中未见任何一种多肽刺激后PBMC中基因的差异表达。p-水平<0.05)。这些发现证实了IFN-g反应的相关分析,并支持NA和POMT 1之间的T细胞交叉反应.74个差异表达基因的列表中包含了几个与细胞毒性T细胞功能密切相关的基因,例如,干扰素-γ、趋化因子/趋化因子配体已知与干扰素-γ, 穿孔素1,和颗粒酶B。对T细胞效应分子的关注也显示,单个NT1患者的T细胞对病毒NA的刺激有相似的反应。175–189或人类POMT 1675–689,与NT1中自身抗原POMT 1对甲型H1N1流感病毒定向T细胞的交叉反应性一致(图1)。7)。最明显的例子是NT1患者P 003和P 015(图1所示)。6, 7这两种疾病的临床特征都是在接种潘德母线疫苗后4周内迅速发病,白昼嗜睡和晕眩。

图6:Pandemrix相关NT1患者PBMC的rna-seq基因表达谱。

基因表达水平的层次聚集热图(z-用Heatmapper程序对所有测试的PBMC样本中74个基因进行评分,结果显示表达有显着性差异(*)p < 0.01) between NT1 patients and controls either after stimulation with NA175–189(49个基因)或POMT 1675–689多肽(28个基因;重叠3个)。差异表达的基因是根据与Fisher的精确测试类似的Edger鉴定的。采用配对法进行比较,计算双面值。p-使用BH校正值并为多次测试进行调整。如果达到了意义(*)p < 0.05), log2 fold changes between NT1 patients and controls are shown on the right. Data derived from FACS-sorted CD4+ and CD8+ cells available from one NT1 patient were added for comparison.

图7:T细胞相关基因在肽刺激的Pandemrix相关NT1患者PBMC中的差异表达(RNA-seq)。

点图显示9个T细胞相关基因的表达水平(标准化阅读计数),在表达(**)上有显着性差异。p < 0.01) between NT1 patients and controls either after stimulation with NA175–189或POMT 1675-689肽(比较图。6)。差异表达的基因是根据与Fisher的精确测试类似的Edger鉴定的。采用配对法进行比较,计算双面值。p-使用BH校正值并为多次测试进行调整。这些线显示两个强反应者的配对数据,NT1患者P 003和P 015。

此外,rna测序的fcs-排序,NA。175–189刺激CD4+和CD8+T细胞的单个儿童,潘德母线相关的NT1患者(P 003)显示上调干扰素-γ,穿孔素1,颗粒酶B,趋化因子(C-C基序)配体4,和趋化因子(C基序)配体在CD8+T细胞中,CD4+T细胞的基因表达谱主要表现为干扰素-γ(无花果)6;FACS选通和排序策略,如附图所示。7)。总之,基因在NA中的表达175–189-刺激的CD8+T细胞样本符合NA的特征。175–189-刺激PBMC,提示肽NA175–189这一发现与细胞毒性T细胞是介导甲型流感病毒免疫的关键效应细胞群体的观点是一致的。20.

T细胞受体序列分析显示甲型H1N1流感的融合选择175–189-和人类POMT 1675–689-Pandemrix相关NT1中的反应性克隆型

为了在克隆水平上表征T细胞对假定的交叉反应表位的反应,我们对T细胞进行了测序。TCRα链β链从病毒NA的RNA175–189-或人类POMT 1675–689-Pandemrix相关NT1患者和接种Pandemrix疫苗的健康对照者的受刺激PBMC。TRA变量(TRAV)、TRA连接(TRAJ)、TRB变量(TRBV)、TRB多样性(TRBD),和TRB加入(TRBJ)基因片段的使用在肽刺激样本和中对照样本之间没有显着性差异,无论是在患者中还是在对照组中(补充数据)。3)。我们鉴定了在≥3 nt1患者标本中被上调的trA克隆型,它们中的任何一种都受到NA的刺激。175–189或POMT 1675–689肽(图1.8)。在这些公共的TRA阵挛型中,6个阵挛型在NA刺激下显著增加。175–189,或POMT 1675–689(假阳性率<0.05),进一步支持T细胞交叉反应性.最引人注目的是,clonotype CVVIKAAGNKLTF-TRAV 10/TRAJ 17和CVV萨姆TTDSWGKFQF-TRAV 10/TRAJ 24在8中的3(3/8)NA中被上调。175–189-受刺激,10人中有5人(10人中有4人)POMT 1675–689-受刺激样本。NT1患者P 003和P 015,其特征为T辅助1(Th1)细胞/细胞毒性T细胞基因在NA刺激下的表达。175–189或POMT 1675–689,两种克隆型对这两种多肽均有上调作用。在刺激后发现了另外三种克隆型,其中至少一种肽刺激后更丰富,并且与上述两种克隆类型中的任何一种都有很高的相似性:cvv。IKAAGNKLTF-TRAV 10/TRAJ 17,在POMT 1中显著上调675–689-受刺激样本,包括P 003;CVVSGMTTDSWGKLQF-TRAV 10/TRAJ 24,NA上调175–189-受刺激样本,包括P 015;和CVVSGMTTDSWGKFQF-TRAV 10/TRAJ 24,两者均上调175–189-和POMT 1675–689-受刺激样品,包括P 003和P 015。这些结果证明了NA的收敛选择。175–189-和(或)POMT 1675–689-Pandemrix相关NT1患者TRAV 10/TRAJ 17或TRAV 10/TRAJ 24基因片段的反应性T细胞克隆。

图8:Pandemrix相关NT1患者肽刺激PBMCTCRα链序列分析。

α链(TRA)是从相同的RNA样品中进行测序的。P:病人;HC:健康对照。根据肽-(NA)的折叠变化,显示了在≥3 nt1患者标本中上调的tRA克隆型。175–189-或POMT 1675–689-)同一参与者经处理和中等控制的样本,数据经下采样归一化(热图)。组水平上有统计学意义(仅NT1例,秩积检验,假阳性率<0.05)。

图中提供了NT1患者或健康对照者使用TRAV 10/TRAJ 17和TRAV 10/TRAJ 24的公共和私人阵挛型的完整列表。9a,b。结果表明,除了使用TRAV 10/TRAJ 17(CVV)识别的公共克隆类型外,IKAAGNKLTF,CVVIKAAGNKLTF)和TRAV 10/TRAJ 24(CVV)萨姆TTDSWGKFQF,CVVSGMTTDSWGKLQF,CVVSGMTTDSWGKF(Qf)在包括cvv在内的不同nt1患者的肽刺激样本中出现了几种高度相似的克隆型。SMIKAAGNKLTF-TRAV 10/TRAJ 17,CVVSSMTTDSWGKFQF-TRAV 10/TRAJ 24,CVVTVMTTDSWGKFQF-TRAV 10/TRAJ 24和CVVSSLTTDSWGKFQF-TRAV 10/TRAJ 24。所识别的公共阵挛型并不是NT1患者独有的,但也偶尔出现在健康对照者身上。特别是,HLA-DQB 1*0602阴性健康对照HC27在NA刺激的NT1患者标本中有几个克隆型表达上调。175-189或POMT 1675-689。然而,与NT1患者相比,HC27在肽刺激时并没有表现出炎症细胞因子/趋化因子的表达增加(比较图)。4A,b;5a;7)。因此,这些TRAV10-TRAJ17和TRAV10-TRAJ24克隆型可能参与了NT1患者的炎症反应,但当正常人存在时,其功能表型可能受到有效调控。

图9:利用TRAV10-TRAJ17和TRAV10-TRAJ24基因片段克隆T细胞。

TCRα链(TRA)是从相同的RNA样品中进行测序的(比较图)。8)。P:病人;HC:健康对照。热图显示克隆组分,即使用TRAV10-TRAJ 17的克隆的比例(a)和TRAV10-TRAJ 24(b)所有克隆在总数据中所占的比例。克隆基于CDR 3序列进行聚类。

应用与tra相同的搜索标准,我们还在≥3 nt1患者样本中发现了较少数量的trb克隆型。175–189或POMT 1675–689肽(附图)8)。在这些公共的trb克隆型中,同样有一个克隆型在两个NA中都显著增加。175–189-或POMT 1675–689-刺激病人样本,进一步支持T细胞交叉反应性.该克隆型为CASSEAGQGAYEQYF-TRBV6-1/TRBJ2-7(在P 003、P 015和P 023中上调)。

Pandemrix疫苗接种儿童POMT 1自身抗体的发现

最后,我们用放射免疫分析法(Ria)研究了血浆中POMT 1抗体的水平,这是一种灵敏而特异的液相法,用于检测识别构象表位的自身抗体。21。注射Pandemrix疫苗的儿童(NT1患者和健康对照组)对POMT 1的自身抗体高于未接种的对照组儿童,提示潘德母线对POMT 1(*)有诱导的自身免疫作用。p < 0.0001, Fig. 101).

图10:Pandemrix相关NT1的自身抗体。

采用POMT 1放射免疫分析法对儿童潘德母线相关NT1(NT1)患者和未接种Pandemrix疫苗的健康儿童对照血浆进行了分析。放射性以相对单位(RU)表示。显示每组的中位数(框内行)、75%和25%的四分位数(上、下框边界)和最大值/极小值(上、下须)。采用Kruskal-Wallis和Dunn的多重比较方法进行各组间的统计比较。

讨论

HLA-DQ6.2-限制性CD4+T细胞与NT1发病机制的遗传学研究4,5。CD4+T细胞在许多自身免疫性疾病中发挥着重要作用,例如腹腔疾病和1型糖尿病。这两种疾病表现出异常强烈的HLAⅡ类关联。22,在NT1中仍将被超越。HLAⅡ类自身免疫性疾病被认为是抗原驱动的疾病(例如,由小麦醇溶蛋白在腹腔疾病),尽管组织病理学不是由CD4+T细胞介导。其他免疫细胞参与组织破坏,抗原扩散导致广泛的自身免疫。在pandemrix相关的NT1中,我们假设由甲型H1N1流感病毒抗原表位启动的CD4+T细胞是疾病驱动因子,与中枢神经系统自身抗原发生交叉反应,并参与免疫介导的对亚克隆蛋白神经网络的攻击。因此,我们的研究重点是甲型H1N1流感T细胞表位,这些表位是在HLA-DQ6.2背景下识别的,尽管HLA-DQ6.2肽结合还没有被直接检测。由于儿童Pandemrix相关NT1患者血液样本的可获得性受到限制,我们开始使用Pandemrix启动的小鼠寻找显性T细胞表位,这些小鼠将HLA-DQ6.2作为唯一的MHC II类等位基因,并接种了Pandemrix疫苗,HLA-DQB 1*0602-阳性个人。选择这一策略,所选的T细胞肽被富集为HLA-DQ6.2-结合,但可能包括MHCⅡ类和/或I类结合肽。

我们发现与Pandemrix相关的NT1儿童和青少年对两个NA和NP衍生表位的T细胞反应与Pandemrix免疫对照相比增强。此外,我们的研究为甲型H1N1流感病毒导向的T和B细胞与人POMT 1的交叉反应提供了证据。病毒NA肽序列与人POMT 1序列的同源性是通过基本的局部比对得到的。我们可以证明干扰素-γ的分泌是对NA的反应。175–189/纳178–192-和POMT 1675–689刺激与T细胞因子/趋化因子基因表达模式密切匹配。这是两个强有力的反应者,P 003和P 015的例子,他们都在接种Pandemrix疫苗后的一个月内发展为临床嗜睡症伴麻痹。NT1患者TCR再灌注谱分析显示,在NA刺激下,7种公共阵挛型增多。175–189和POMT 1675–689NT1患者。此外,Pandemrix疫苗还可诱导儿童产生抗POMT 1自身抗体。这些结果与Pandemrix相关的NT1中特异性、病毒导向的T细胞和自身抗原POMT 1的交叉反应相一致。

在本研究中,在Pandemrix疫苗接种后出现NT1的患者中,T细胞对不同的甲型H1N1流感蛋白片段的反应性增强,其原因尚不清楚。我们先前的研究表明,潘德母线抗原悬液中含有的病毒蛋白形成复合物,这可能有助于增强对NA和np衍生表位的反应性。16。另外,NT1患者T和B细胞反应性增强,而不是相互排斥,可能与免疫遗传倾向有关。6,7,8,23,导致对前炎症信号和AS 03佐剂补充甲型H1N1流感(H1N1)的高反应性。

HLAⅠ类等位基因,最一致HLA-A*11:01,说明NT1中额外的遗传风险贡献,独立于Hla-DQB 1*06:0224,25。细胞毒性CD8+T细胞可能与CD4+Th1-细胞协同作用,常与自身免疫性疾病(包括多发性硬化症)的发病有关。26和NT125。Pandemrix相关NT1、细胞因子和趋化因子基因表达的研究PBMC对甲型H1N1流感刺激后的细胞因子和趋化因子基因表达的影响175–189或人类POMT 1675–689紧密匹配,并显示出一个细胞毒性T细胞信号,其特征是干扰素-γ,IFN-γ−相关基因、穿孔素1,和颗粒酶B。这种表型与CD8+T细胞一致,但也与以前在甲型流感感染中观察到的非常规细胞毒性CD4+T细胞一致。20。在FACS分类的T细胞组分中,只有一名Pandemrix相关的NT1患者可以进行研究,穿孔素1颗粒酶BNA表达上调175–189-刺激CD8+T细胞,而不刺激CD4+T细胞。因此,NA175–189肽最有可能与HLAⅠ类和Ⅱ类分子结合。

Pandemrix相关的nt1患者的6个tRA克隆型和1个trb克隆型在NA刺激时均显著增加。175–189,或者使用POMT 1675–689。引人注目的是,公共的TRA克隆型CVVSAIKAGNKLTF-TRAV 10/TRAJ 17和CVVSAMTTDSWGKFQF-TRAV 10/TRAJ 24在NA中被上调了37.5%。175–189-刺激,40-50%的POMT 1675–689-受刺激样本。此外,我们还在NT1患者的标本中鉴定了几种与这两个显性阵挛型高度相似的公共TRA克隆型。这些结果提示不同NT1型NA患者的会聚选择。175–189-和(或)POMT 1675–689-利用TRAV 10/TRAJ 17或TRAV 10/TRAJ 24基因片段的反应性T细胞克隆。提示这些克隆型可能与NT1的发病机制有关。

然而,所确定的公共阵挛型并不仅限于NT1患者。偶尔,他们也会出现在Pandemrix--接种了健康对照疫苗的人群中。有趣的是HLA-DQB 1*0602-阴性健康对照具有显性TRAV10-TRAJ 17和TRAV10-TRAJ24克隆型,提示表达这些克隆型的T细胞可能不受HLA-DQ6.2-的限制。因此,TRAV 10-TRAJ 17和TRAV 10-TRAJ 24克隆型可能参与了NT1患者的炎症反应,这可能是由于CD8+T细胞识别NA所致。175–189和假定交叉反应的POMT 1675–689(自动)抗原,而相同的克隆型出现时,有效地调节时,在健康对照。在未来的单细胞技术研究中可能允许NT1患者和对照组T细胞克隆型的直接功能特征。

特别令人感兴趣的是CVVSAMTTDSWGK的识别。FQF-TRAV 10/TRAJ 24为显性公共克隆型,另有高度相似的TRAV 10-TRAJ 24克隆型,在NA中上调。175–189-或POMT 1675–689-NT1患者的受刺激样本。汉等人描述了与NT1,rs 1483979相关的单核苷酸多态性(SNP)。此SNP位于TRAJ 24TCR(F8L)的CDR 3肽结合位点中的一个氨基酸片段和一个氨基酸的改变27。在我们研究的NT1患者标本中检测到的最高公共TRAV10-TRAJ24克隆型中,两个编码苯丙氨酸(F),一个编码亮氨酸(L)。所有TRAJ 24(和4个TRAJ 17中的3个)克隆型,对NA的反应被上调175–189-或POMT 1675–689-刺激共享TRAV 10基因片段的使用。这些克隆型不同于TRAV2-TRAJ 24。18和TRAV6-TRAJ 2428以前使用HLA-DQ6.2-HCRT四聚体从NT1患者中分离出的克隆型。据我们所知,使用TRAV 10、TRAJ 17或TRBV 6-1/TRBJ 2-7的克隆型以前从未在NT1患者中被描述过。本文描述的主要公共TRAV10-TRAJ17、TRAV10-TRAJ24和TRBV 6-1/TRBJ2-7克隆型是NT1潜在的生物标志物。

在鉴定的T细胞表位中,IAYERMCNILKG(NP)217–228免疫表位数据库ID 145824),来源于NYMCX-157疫苗株,在不同的甲型流感病毒株之间共享。相反,ESVAWSACHD(NA)175-186;ID 97390)和MERNAGSGIIISDTP(医管局)274-288ID 188723主要由甲型H1N1流感病毒株携带。罗等人最近的一项研究。显示HA特异性T细胞的频率增加273–287NT1患者与HLA-DQB 1*0602阳性对照18。然而,Schinkelshoek等人的一份报告。发现T细胞对HA的反应性没有显著提高273–287NT1患者与HLA-DQB 1*0602阳性对照29。肽HA271–285和HA274–288被NT1患者和健康疫苗接种者确认为透明质酸。273–287作为甲型H1N1流感T细胞表位。再一次,我们没有看到nt1患者和健康疫苗接种者之间的明显差别,也没有看到与健康疫苗接种者之间的明显差别。HLA-DQB 1*0602积极或消极对照,质疑医管局的作用273–287-NT1发病机制中的反应性。

利用HLA-DQ6.2四聚体,罗等人的研究。证明了CD4+T细胞的存在,其特异性为C-端氨基化的人hcRT。54–66和HCRT86–97NT1患者和对照组的多肽,而非天然HCRT肽18。此外,TCR序列分析表明与HA的交叉反应。蒋等人最近的研究,也使用HLA-DQ6.2四聚体,检测了针对天然hcRT的CD4+T细胞。56–69和HCRT87–100NT1患者及对照组的多肽28。此外,Latorre等人。报道了NT1患者HLA-DR限制性CD4+T细胞克隆的频率增加,克隆识别的HCRT肽表位更加多样。这些克隆与HA没有反应。值得注意的是,在2型嗜睡症中也检测到T细胞对hcrt的反应性,这与hcrt缺乏无关。30。因此,目前关于NT1中T细胞对HCRT的反应性的文献仍然相互矛盾。在许多自身免疫性疾病中,自身免疫是针对在靶组织中表达的多种自身抗原的。我们的研究结果并不排除自身免疫对HCRT的作用,但与POMT 1的另一个自身抗原在NT1。

POMT 1是一种锚定在内质网中的糖基转移酶,与POMT 2配合物催化O-甘露糖聚糖合成的第一步。在人类中,O-甘露糖基化主要见于大脑、周围神经和肌肉糖蛋白.POMT 1/POMT 2最著名的底物是α-dystroglcan,介导细胞外基质组分(如层粘连蛋白)与dystrophin复合物的结合。POMT 1的先天性缺陷是引起肌营养不良症的原因之一??A1、B1和C1型糖基性疾病。31。某些类型的肌肉营养不良,最明显的是1型肌强直性营养不良,与快速眼动(REM)睡眠失调有关。32。目前尚不清楚POMT 1或其底物是否参与神经元睡眠调节,但这种可能性可以在实验研究中探索。

本研究检测了Pandemrix相关NT1患者T细胞与POMT 1的反应性.未接种NT1患者的样本无法进行比较。目前,还不清楚在未接触甲型H1N1流感疫苗或感染的NT1患者中是否能观察到T细胞对POMT 1的反应性。其他有待进一步研究的问题包括与限制显性公共TRAV10-TRAJ17、TRAV10-TRAJ24和TRBV6-1/TRBJ2-7克隆型有关的HLA等位基因的同源性、它们的功能、抗原肽特异性和交叉反应性,以及它们在NT1诊断中的价值。

总之,这项研究为甲型H1N1流感病毒在HLA-DQ6.2背景下NT1中的POMT 1交叉反应性T细胞反应提供了证据。我们在Pandemrix相关的NT1患者中鉴定了A(H1N1)NA和(NYMC X-157疫苗株)NP病毒蛋白的两个显性T细胞表位。患者对这些表位表现出强烈的Th1细胞/细胞毒性T细胞反应,并显示T细胞对POMT 1中的一个自身表位的反应性,POMT 1是一种在大脑中表达的酶。POMT 1表位是Pandemrix相关NT1中A(H1N1)NA显性T细胞表位的一个肽模拟。干扰素-γ穿孔素1颗粒酶BT细胞肽NA对趋化因子基因表达的影响175–189或POMT 1675–689NT1个体与之匹配。TCR曲线图分析显示,NT1中TRAV 10/TRAJ 17和TRAV 10/TRAJ 24克隆型的融合选择,都是针对任何一个NA而上调的。175–189-或POMT 1675–689-刺激,从而支持T细胞交叉反应和这些克隆型在NT1中的致病作用。此外,接种疫苗的人提高了抗人POMT 1的抗体水平,表明Pandemrix疫苗可引发对POMT 1的自身免疫反应。这一无偏搜索结果表明POMT 1是T细胞和B细胞在NT1中识别的自身抗原。


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