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Dp胸腺细胞的经典mhc表达影响非经典mhc限制性先天样T细胞的选择

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发表时间:2021-04-19 14:11作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

传统的T细胞是由胸腺皮质上皮细胞表达的肽-mhc选择的,而不是由不表达mhc i或mhcⅡ的皮质胸腺细胞本身选择的,而皮质胸腺细胞表达的不是肽呈现mhc分子,如cd1d和mr1,促进了plzf的选择。+INKT细胞和MAIT细胞。在此,我们报道了一种诱导型I类反式激活剂小鼠,它能在不同的细胞类型中表达MHC I分子。我们发现,MHC i在dp胸腺细胞中的表达导致肽特异性PLZF的扩增。+先天样T细胞。与iNKT细胞相似,PIL T细胞在胸腺中分化为三种功能效应子,依赖于SAP信号。我们发现PIL和NKT细胞竞争的范围很窄,提示在DP胸腺细胞上缺乏肽-MHC有利于选择非肽特异性淋巴细胞。

导言

先天性T细胞,即不变自然杀伤T细胞(INKT)、粘膜相关不变T细胞(MAIT)和γδT细胞的研究正迅速扩大并引起人们的关注。根据其表型,先天性T细胞具有功能性T细胞受体(Tcr)重排,但在发育过程中获得记忆表型,并且在不经历广泛克隆扩张的情况下对刺激反应迅速。1,2。它们通常被认为能识别保守的抗原。3。由于这些原因,它们被认为是适应性免疫和先天免疫之间的桥梁,被认为是免疫治疗的一个有吸引力的靶点。INKT细胞作为这一群体的重要成员,最初被描述为具有这种非常规表型的细胞。4,5,6,7。结果表明,iNKT细胞与传统的αβT细胞具有相同的发育过程,直到双阳性胸腺细胞阶段。8。然而,它们遵循一个不同的胸腺选择过程。传统的αβT细胞由胸腺上皮细胞(TECs)通过经典的Ⅰ类和Ⅱ类主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递肽抗原进行阳性和阴性选择。相反,iNKT细胞在造血细胞(Hcs)上被选中,特别是另一个通过非经典mhc样分子cd1d呈现脂质抗原的dp胸腺细胞。3,9,10,11。此外,iNKT细胞的阳性选择需要一个强的tcr信号传递过程,一个称为“激动剂选择”的过程,以及信号淋巴细胞活化分子家族(SLAMF)受体之间的同源相互作用提供的次级共刺激信号。12,13。因此,选定的细胞上调关键转录因子plzf,该因子控制iNKT细胞谱系的承诺。14,15。随后,描述了更多类似先天的T细胞亚群,包括plzf。+γδT细胞和MAIT细胞。与iNKT细胞相似,表达plzf的两个细胞亚群和dp胸腺细胞均为阳性选择。16,17。此外,据报道,非经典的MHC Ib限制细胞可以由技术经济或HCS选择。然而,只有在hcs上选择而不是在tecs上选择时,它们才会产生先天的表型。18。因此,胸腺细胞对先天性T细胞的一个共同特征似乎是积极地选择。因此,dp-dp相互作用被证明是诱导PLZF表达和启动T细胞先天性程序的关键。然而,管理这些细胞的选择和发展的基本机制仍然是难以捉摸的。

值得注意的是,小鼠dp胸腺细胞不表达经典的mhc i或mhcⅡ分子。19,20。MHC在这一阶段的下调可能是一种机制,可以阻止大量转移到PLZF表达的天生性T细胞系,这可能会损害传统的CD4和CD8 T细胞库的发展。或者,它可以通过减少竞争来促进非经典MHC I限制性T细胞的更大发展和选择.两个独立的组在dp胸腺细胞阶段产生mhcⅡ表达的转基因小鼠。21,22。在CD4或Lck启动子区的控制下,表达人Ⅱ类MHC反式激活物(CIITA)。因此,在这两种转基因小鼠中,MHCⅡ在DP胸腺细胞上均有表达。这导致胸腺细胞选择的PLZF的扩展。+具有与iNKT细胞相似的先天表型的T细胞23,24.

然而,先天性T细胞,如iNKT和MAIT细胞,是自然选择在胸腺细胞上表达非经典成员的mhc I家族。因此,我们想研究经典的MHC I强制表达的影响。最近,据报道,I类反式激活剂(CITA,又称Nlrc 5)是MHC I表达的正转录调节因子。25,26,27。此外,nlrc 5驱动mhc i处理和肽加载所需的组分的转录,如β2m、tap 1和lmp 2。25,28。我们发现Nlrc 5在DP胸腺细胞中不表达,尽管它们高表达CD1d。我们描述了一种可诱导的转基因小鼠,其中小鼠Nlrc 5可以在不同的细胞类型中特异表达。值得注意的是,强迫dp胸腺细胞中nlrc 5的表达导致细胞表面肽提呈mhc i分子的显著上调,从而使它们有可能选择和引导肽特异性mhc i限制性T细胞进入一种与生俱来的T细胞发育途径。事实上,与MHCⅡ类似,dp胸腺细胞上MHC I的表达促进了PLZF的扩增。+先天样T细胞。此外,MHCⅠ和II限制性PIL T细胞表现出与iNKT细胞相似的表型,根据特征转录因子、细胞因子和表面标记的表达模式,发现它们存在于三个功能亚组中,它们的发育需要SLAM相关的适配蛋白(SAP)。通过对骨髓(BM)嵌合体的分析,PIL T细胞的选择是由于MHC I在邻近的DP胸腺细胞上的表达,而不是细胞内禀效应。虽然这些小鼠的传统CD4和CD8 T细胞的发育没有受到影响,但iNKT细胞的发育减少,表明PIL T细胞和iNKT细胞争夺一个有限的胸腺生态位。这些结果提示,在DP胸腺细胞上缺乏肽提呈的MHCⅠ类分子是由于不表达Nlrc 5和促进非肽特异性淋巴细胞亚群如iNKT细胞的发育所致。

结果

Nlrc 5的生成-停止浮子转基因小鼠作为MHCⅠ类分子条件表达的工具

以往研究表明,mhcⅡ在dp胸腺细胞上的表达促进了具有NKT样表型的mhcⅡ限制性胸腺细胞选择的CD4 T细胞(T-CD4)的发育。21,22,24,29。因此,我们假设通过选择MHC I限制性NKT样T细胞在DP胸腺细胞上表达MHC I可能具有类似的作用。1A)。正常情况下,处于dp发育阶段的小鼠胸腺细胞不表达经典的mhc i或mhcⅡ分子。19。为了寻找一种合适的方法来驱动稳定的MHC I在DP中的表达,我们选择转录因子Nlrc 5(又称CITA)作为具有这种潜在功能的最佳候选基因。Nlrc 5不仅对mhcⅠ基因的转录非常重要,而且对于mhcⅠ的加工和肽加载所必需的组分(如β2m、TAP 1和lmp 2)也是至关重要的。25,28。此外,Nlrc 5在dp胸腺细胞阶段,表达受到严重抑制(如图所示)。1B来自ImmGen的数据30)。为了检测nlrc 5在体外是否有更高的mhc i表达,我们克隆了小鼠的编码序列(Cds)。Nlrc 5将基因转化成慢病毒表达载体。事实上,经转导的HEK 293细胞样品显示,Nlrc 5足以驱动MHC I的高表达(如图所示)。1C).

图1:诱导性Nlrc 5(CITA)强迫DP胸腺细胞表达MHCⅠ类分子的方法。

a先天性T细胞在DP胸腺细胞上阳性选择的示意图。b小鼠mRNA表达水平Nlrc 5B6WT小鼠不同T细胞亚群。数据来源于IMMGEN。c小鼠慢病毒表达载体转染HEK 293细胞流式细胞仪分析Nlrc 5编码序列(CDS)或以空病毒为对照。作为附加对照,显示非转导细胞和同型对照染色.细胞转染48h后进行分析。d野生型rosa 26的结构和转基因小鼠的靶等位基因(Nlrc 5-Stop)浮子). e流式细胞术检测T细胞MHCⅠ和MHCⅡ的表达浮子(T-MHCⅠ)和PLCK-CIITA(T-MHCⅡ)转基因小鼠。数据是五个独立实验的代表,n≥5小鼠/实验组。源数据作为源数据文件提供。

测试…的作用Nlrc 5在体内,我们产生了一种可诱导的转基因敲入小鼠,在表达cre重组酶的细胞中,nlrc 5的表达可以以一种组织特异性的方式被上调。简单地说,在老鼠面前有一个由氧氟沙星组成的停放卡带。Nlrc 5光盘被插入到Rosa 26轨迹(图)1D)。这个设计允许Nlrc 5一旦Cre重组酶在细胞中表达。该小鼠系与CD4-CRE小鼠交叉,在DP期启动CRE表达。我们观察到MHC I(H-2DB和H-2kb)在这些小鼠的DP胸腺细胞上高表达,与正常对照组相比,后者通常不表达。1E和补充图。1A)。单阳性(SP)胸腺细胞和脾细胞通常表达较高水平的MHC I,在这些小鼠中只表现出略高的水平。值得注意的是,mhc ii的表达不受Nlrc 5转基因1E).

存在多肽的非经典MHC Ib等位基因Qa-1、Qa-2和H2-M3在胸腺细胞上的表达模式与传统的MHC Ia等位基因H2-KB和H2-DB(即DP胸腺细胞低)表达模式相同(补充图)。1D). Nlrc 5过度表达也导致了他们的升华(补充图)。1B)。相反,非肽呈递分子CD1d和MR1在DP胸腺细胞中的基因表达较高(附图)。1E),并且没有被过度表达的Nlrc 5(补充图。1C)。这表明通过mhc ia/ib分子,尤其是在dp皮质胸腺细胞中,由于缺乏Nlrc 5表达,而脂质和代谢物的呈现被保留。

作为附加对照,我们获得了pclk-ciita转基因小鼠。21,从DP胸腺细胞期开始,在T细胞上过表达MHCⅡ。1E)。在下面的部分,这两个菌株进行并行分析。为了简单起见,我们参考了CD4-cre/nlrc 5-停止。浮子为“T-MHC I”小鼠和PLCK-CIITA为“T-MHC II”小鼠。

MHC I在DP胸腺细胞上的表达导致PIL T细胞增多

野生型(WT)与T-MHCⅠ型间胸腺结构及胸腺内一般子集分布无明显变化(图一)。2A-C和补充图。2)。DN、DP、CD4 SP T细胞、γδT细胞或γδNKT细胞(简称PLZF)的频率无显着性差异(P>0.05)。+γδT细胞)。如上文所述,t-mhcⅡ小鼠由于“记忆表型”CD8 T细胞的诱导,CD8 SP频率增加。31。相比之下,T-MHC I小鼠的CD8、SP T细胞数量和频率略有下降,MAIT细胞数量略有增加(图1)。2A-C以及附图中的门控。3A-c)。在T-MHCⅠ和T-MHCⅡ小鼠中,iNKT细胞的数量和频率大约减少了两倍.脾脏iNKT细胞数量和频率的减少更为明显,肝脏也有同样的减少趋势(附图)。4A,b)。脾脏MAIT细胞和γδNKT细胞数无显着性差异(附图)。4D,e)。令人惊讶的是,T雷格T-MHCⅡ小鼠细胞频率未受影响,但T-MHCⅠ小鼠胸腺和脾脏细胞频率增加。在脾脏中,这种差异在细胞数量上也有统计学意义(补充图)。4B下面板)。总体而言,转基因小鼠T-mhc i没有表现出主要的淋巴细胞发育变化,只是T细胞略有增加。雷格INKT细胞频率和数量减少。

图2:mhc i在DP胸腺细胞上的表达增加PLZF+先天性T细胞(PILS)和NKT细胞数量减少。

aWt、T-MHCⅠ和T-MHCⅡ小鼠胸腺细胞的典型流式细胞术分析。b中显示的门控策略对数据进行量化。a。在左轴绘制单元频率,在右轴绘制数字。cWT和T-MHCI小鼠胸腺中MAIT细胞和γδNKT细胞总数。d流式细胞术鉴别胸腺中PIL细胞策略的代表性图。ePIL细胞代表流式细胞仪染色图与胸腺和脾脏T-MHCⅠ和T-MHCⅡ小鼠相比较。f流式细胞术所描述的WT、T-MHC I和T-MHCⅡ小鼠PIL细胞的频率(在左轴上作图)和数目(在右轴上作图)d. b, c, f每一点代表一个动物:n=每组10只动物(WT和T-MHC I组)和n=8只动物(T-MHC II组)b, n=每组4只动物cn=每组9只动物f。数据代表五个a, b八块df独立实验。一个实验是在c。未配对的双尾Mann-Whitney检验b, c, f); p≥0.01没有被描绘,**p < 0.01, ***p < 0.001, and ****p < 0.0001. Data are p厌恶为平均值±SD。源数据作为源数据文件提供。

接下来,我们试图确定NKT样表型的细胞在T-MHC I转基因小鼠中是否与T-MHC II小鼠相似(见图)。1A)。PLZF是赋予iNKT细胞先天特征的主要转录因子。14。因此,我们建立了一种门控策略,通过在tcrβ上进行门控来识别肽特异性pIL T细胞。+PLZF+细胞和排除其他已知的表达PLZF的子集,如iNKT细胞,γδT细胞,和MAIT细胞(图)。二维空间)。利用这一策略,我们确定了一小部分PIL T细胞存在于WT细胞中,在T-MHC I小鼠中增加了4倍(图1)。2E,f)。尽管如此,这一变化并不像T-MHC II中PIL T细胞增加10~15倍那样强劲.

PIL T细胞的扩增依赖于SAP,而不是由nlrc 5以细胞内禀方式介导的。

虽然我们没有观察到表面CD1d对DP胸腺细胞Nlrc 5表达的上调,但PIL T细胞在形式上可能是CD1d依赖性的。因此,我们将T-MHC i小鼠杂交到CD1d−/−老鼠。CD1d缺乏抑制iNKT细胞的发育,如预期的那样,但如果有的话,会增加T-MHC I小鼠的PIL-T细胞数量(图一)。3A,b)。因此,大多数PIL T细胞可能受到MHC Ia/Ib的限制,因为它们的数量依赖于DP胸腺细胞中MHC I的表达,而不依赖于CD1d。

图3:PIL T细胞依赖SAP,以细胞外的方式需要MHC I.

a具有代表性的胸腺细胞流式细胞仪图谱CD1d−/−CD1d−/−T-MHC I小鼠。b胸腺iNKT和PIL细胞频率及WT与PIL细胞数量的比较CD1d−/−,T-MHC I和CD1d−/−T-MHC I小鼠。c具有代表性的流式细胞术从移植后8周的一组不平等骨髓(BM)嵌合小鼠中提取。WT CD 45.1+用WT CD 45.1/2混合液对小鼠进行致死性照射和移植。+和T-MHC I CD 45.2+骨髓比例为1:10。本实验组为WT+T-MHC I组。对照组用WT CD 45.1/2混合液进行小鼠移植。+和WT CD 45.2+骨髓比例为1:10。该实验组为WT+WT组。图示有代表性的流式细胞术图,显示WT+WT组(左侧两个面板)的选通策略。在右边的四个面板(绿色)显示有代表性的图形显示PIL细胞频率(门控在WT CD 45.1/2上)。+)来自WT+WT组(左侧)和WT+T-MHC I组(右侧)。PIL细胞频率评估显示在d. e具有代表性的胸腺细胞流式细胞仪图谱Sh2d1a/−(SAP缺陷)和Sh2d1a−/−T-MHC I小鼠。INKT、PIL和T雷格细胞频率显示在f. b, d, f每一点代表一个动物:n=每组10只动物(WT和T-MHC I组),n=7只动物(CD1d−/−(集团),n=3只动物(CD1d−/−T-MHC I组),n=8只动物(WT+WT组),n=9只动物(WT+T-MHC I组),n=5只动物(Sh2d1a−/−),以及n=6只动物(Sh2d1a−/−T-MHC I组)。数据代表四个a, b, e, f两个人c, d独立实验。未配对的双尾Mann-Whitney检验b, d和一个没有配对的双尾学生t-测试是在f;ns,不显着(p≥0.05),*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, and ****p < 0.0001. Data are presented as mean values ± SD. Source data are provided as a Source Data file.

接下来,我们研究了PIL T细胞的发育是否需要MHCⅠ,或者是由于Nlrc 5过表达的未知细胞内禀效应所致。为此,我们建立了一组不相等的BM嵌合小鼠,其中WT受体被致死照射,并以1:10的比例将WT和T-MHC I BM以1:10的比例从不同的同型小鼠中移植。在此基础上,90%的邻近胸腺细胞会表达MHC I,从而能够在WT祖细胞中诱导PIL T细胞的选择。对照组接受不同同源小鼠的WT和WT BM的混合。事实上,移植8周后,当邻近胸腺细胞表达MHC I时,WT-BM衍生细胞的PIL T细胞明显增加,与对照组相比(图1)。3C,d)。脾内PIL T细胞频率也显著增加.因此,这一结果否定了Nlrc 5的强制表达以细胞内的方式促进PILs的发育的可能性,并证实了PIL T细胞因MHC I上调而在邻近的DP胸腺细胞上增殖的假说。值得注意的是,T的频率雷格WT-BM-衍生细胞中的细胞没有增加,而仅在T-MHC-I衍生细胞中观察到(附图)。5A,b)。这表明观察到T的膨胀雷格T-MHC I小鼠的细胞是由Nlrc 5的表达以细胞内源性的方式介导的.

INKT细胞发展的一个关键要求是在激动剂选择过程中触发SLAM-SAP信号通路。13。因此,我们试图确定SAP缺乏对PIL T细胞的影响是否与对iNKT细胞发育的影响相同。预期,SAP的缺乏完全阻断了iNKT细胞的发育。它还能抑制胸腺内PIL T细胞的产生(图1)。3E,f)和脾脏(附图。5C,d)。这表明PIL T细胞和iNKT细胞在选择和发育过程中具有相似的信号通路。

PIL T细胞与iNKT细胞在相同的效应子亚群中存在。

胸腺iNKT细胞存在于三个定义良好的效应子亚群(iNKT 1、2和17)中,类似于外周激活的辅助T细胞。32。通过转录因子染色,我们发现PIL T细胞也分离成三个相似的亚群,我们称之为PIL 1(PLZF)。罗氏特贝特+RORγt-),PIL 2(PLZF)RORγt-)和PIL 17(PLZF)INTRORγt+)细胞(图1.4A)。NK1.1在PIL 1上的表达,CD4在PIL 2上的表达,CD 138在PIL 17细胞上的表达也与iNKT细胞亚群相似(附图)。6A)。因此,这提示每个PIL部分可能表现出与相应的iNKT细胞子集相似的功能特性。几项独立的研究表明,这三个NKT亚组有相当不同的基因表达程序。33,34,35。事实上,包括CD 122、CXCR 3、CD 69、PD1、CCR 6和CD 25在内的大量功能相关分子在PIL和iNKT亚群中的表达是相似的(补充图)。6B体外刺激后细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)和白细胞介素-17A(IL-17A)的产生。6C)32,33。综合来看,这些数据推断类似的转录和功能程序在PIL和iNKT细胞中运行。

图4:MHCⅠ和MHCⅡ诱导的PIL T细胞均存在于3个主要亚群中,类似于NKT细胞。

aPIL T细胞与iNKT细胞相似,通过转录因子PLZF和RORγt的表达模式,将PIL T细胞分为三个亚组,并对WT、T-MHCI和T-MHCⅡ小鼠的PIL T细胞亚群进行了比较。bPIL T细胞子集频率(上行)和数字(下行)的比较.cWt、T-MHCI和T-MHCⅡ小鼠PIL细胞CD4、CD8α的典型流式细胞仪染色。d流式细胞术检测WT、T-MHCI和T-MHCⅡ小鼠胸腺PIL T细胞TCR Vβ链序列与常规T细胞比较。e与WT、T-MHCI和T-MHCⅡ小鼠的pIL T细胞亚群比较,tcrβ在iNKT细胞亚群上的染色示范性图。所有被分析的动物都是BALB/c小鼠的F1代。6). fCD 44和NK1.1在iNKT、WT PIL、T-MHC I PIL和T-MHCⅡPIL T细胞上的表达模式。b每一点代表一个动物:n=每组8只动物(WT和T-MHC II组)和n=9只动物(T-MHCⅠ组)。数据代表七个ac还有三个df独立实验。未配对的双尾Mann-Whitney检验b;ns,不显着(p≥0.05),*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, and ****p < 0.0001. Data are presented as mean values ± SD. Source data are provided as a Source Data file.

值得注意的是,MHC I-和MHCⅡ限制性PIL T细胞均被分化为三个亚群(图1)。4A,b)。然而,在T-MHCⅡ动物中,MHCⅡ限制的PIL T细胞表现出强烈的向PIL 2效应表型的倾斜,而PIL 17则以牺牲PIL 17为代价。这与PLZF大量生产IL-4是一致的。+T-CD4s在PLCK-CIITA小鼠中的作用31。然而,这三个亚群在WT和T-MHC I小鼠中所占比例相似(图1)。4A,b).

如上所述,PIL T细胞可能与iNKT细胞在表型和功能上相似。然而,与iNKT细胞不同的是,它们是在经典的MHC分子上选择的。因此,我们检测了它们的TCR共受体表达和TCR Vβ链的使用情况.正如以前报道的那样,在T-MHCⅡ小鼠体内发育的PIL T细胞主要是CD4 SP,有一小部分DN细胞(如图所示)。4C)。令人惊讶的是,T-MHC I小鼠的PIL T细胞不完全表达CD8,而是分化成CD4 SP、CD8 SP和DN,与WT小鼠相似,提示WT小鼠PIL T细胞可能与MHC I限制性细胞有更密切的关系(图1)。4C)。虽然我们没有观察到pIL T细胞在TCR Vβ链使用上有严重的偏差,但Vβ3的频率明显增加。+和Vβ5.1/Vβ5.2+来自WT和T-MHC I小鼠的PIL T细胞池中的细胞。此外,Vβ6的频率略有增加+T-MHCⅡ小鼠的PIL T细胞中有细胞存在(图1).4D).

以前曾发现胸腺iNKT细胞亚群在其表面显示不同水平的tcr,这一特性在BALB/c背景中更为突出。33,36。NKT 2细胞TCR水平最高,NKT 1细胞TCR水平最低,NKT 17细胞TCR水平最低。此外,这些tcr表达水平的差异,以及由此推测的信号强度,被认为是iNKT细胞亚群承诺和分化的关键。37,38,39。然而,表面TCR在PIL T细胞亚群之间没有显著差异(图1).4E),提示TCR表达水平以外的其他因素可能决定了这些细胞的子集承诺和分化。

INKT细胞生物学领域的历史研究用CD 44和NK1.1作为评价iNKT细胞成熟度和发育阶段的标记物40。利用这些标记物,发现较高比例的PIL T细胞是CD 44。低层与iNKT细胞相比,表现为较不成熟的阶段。4F).

记忆表型CD8 T细胞的发育需要pIL T细胞中CD4共受体的参与。

如前所述,CD8 SP T细胞在T-MHCⅡ小鼠胸腺中的频率增加(图1)。2B)21,22,31。这是由PIL T细胞(在该报告中称为T-CD4细胞)产生的IL-4所致,后者介导了记忆表型CD8 T(T)的发育。MP)细胞通过诱导eomesodermin(Eomes)41。因此,在T-MHCⅡ小鼠中,很大比例的CD8 SP T细胞表达Eomes(图1)。5A)并具有记忆表型31。令我们惊讶的是,埃梅斯并没有增加。+CD8 TMP在T-MHC I小鼠中。5B)。由于tcr与mhcⅡ的相互作用可以激活CD4共受体信号,我们推测pIL T细胞诱导IL-4的产生,从而导致CD8 T的增加。MP细胞可能是CD4共受体信号传导的结果。为了验证这一假设,我们将T-MHCⅠ小鼠与CD8.4转基因小鼠杂交.在这些小鼠中,内源性的细胞质尾Cd8a用CD4细胞质尾替换基因42。CD8.4转基因没有引起T-MHC I小鼠PIL T细胞总数的增加(图1)。5C),但它使PIL T细胞的比例向PLZF倾斜。PIL 2细胞5D),产生IL-4。与此一致的是,CD8 T的数量MPCD8.4T-MHCI小鼠显著增加(图一)。5E)。脾脏也有类似的趋势(附图)。7)。因此,参与感测dp胸腺细胞mhc配体的特殊共受体影响pIL T细胞的效应子集分化,并具有CD8 T的继发性作用。MP发展。

图5:MHCⅡ,而不是MHC I,驱动PIL T细胞产生2型细胞因子,并诱导记忆表型CD8 T(T)。MP)-细胞发育。

aWt、T-MHCⅠ和T-MHCⅡ小鼠CD8 SP胸腺细胞内Eomes染色的典型流式细胞仪图。bCD8 T的数目(在右轴绘制)和频率(在左轴上绘制)MPWt、T-MHC I和T-MHCⅡ小鼠胸腺中CD8 SP细胞之间的细胞,由门控策略所示a. cT-MHCⅠ小鼠胸腺细胞PIL-T细胞频率与CD8.4的典型流式细胞术比较TG/+T-MHC I小鼠。显示了对PIL T细胞数量和频率的汇总评估(右两个面板).dT-MHC I和CD8.4胸腺细胞PIL 2 T细胞亚群的代表流式细胞仪图及频率的汇总评价TG/+T-MHC I小鼠。将两组小鼠与WT小鼠进行比较。eCD8 T的流式细胞仪分析MPT-MHCⅠ型CD 8.4小鼠胸腺CD8 SP细胞的细胞频率TG/+T-MHCⅠ型小鼠(左两组)及CD8 T的总结评价MP单元格号(右面板)。每一点代表一个动物:n=每组9只动物(WT和T-MHC II组)a, b, n=9只动物(T-MHC I组)c, d, n=7只动物(T-MHC I组)b, e,和n=4只动物(CD8.4)TG/+T-mhc i组)ce。数据代表7a, b和2ce独立实验。未配对的双尾Mann-Whitney检验be;ns,不显着(p≥0.05),*p < 0.05, **p < 0.01, and ****p < 0.0001. Data are presented as mean values ± SD. Source data are provided as a Source Data file.

PIL T细胞与iNKT细胞竞争胸腺内的细胞生态位

类似于以前关于T-MHCⅡ小鼠的报道43我们观察到,由于MHC I或MHC II在DP胸腺细胞上的表达,小鼠脂质特异性iNKT细胞数量减少了2至3倍,PIL T细胞数量增加。2B)。值得注意的是,在WT和T-MHC I小鼠中,Pils+iNKT细胞的总细胞数没有显着性差异(数据未显示)。由于多肽和脂类特异性T细胞都需要表面SLAM家族共受体的SAP信号,才能分别发展成PIL T细胞或iNKT细胞,这表明这两种细胞类型可能在竞争,以争夺胸腺内的细胞生态位。为了进一步验证这一概念,我们研究了B6xBALB/c F1小鼠,它们的iNKT细胞小生境稍大一些(双倍)。32,44。如果一个类似的生态位调节PIL T细胞,那么我们可能期望在F1小鼠中有更多的PIL T细胞。事实上,在F1背景下,T-MHCⅠ和T-MHCⅡ小鼠PIL T细胞的比例和数量均高于B6背景小鼠(图6)。6a,b和补充图。8a,b)推测F1背景下PIL T细胞发育存在较大的利基。我们观察到在B6和F1小鼠中iNKT细胞和PIL T细胞的数量成反比关系(图1)。6C和补充图。8C)。结合在一起,在缺乏iNKT细胞的小鼠中,PIL T细胞的扩增(见图)。3B这些数据强烈表明PIL T细胞和iNKT细胞竞争同一细胞生态位。另外,据报道iNKT细胞向PFZF倾斜。NKT 2在F1小鼠中的表达32在PIL T细胞中也观察到。6d和补充图。8D)。这表明,同样的因素控制不同菌株的iNKT和PIL T细胞效应子子集,它们更可能是环境细胞因子、细胞内因子或共同刺激分子,而不是特定的自身抗原。

图6:PIL T细胞与iNKT细胞竞争。

aB6WT、T-MHCⅠ和T-MHCⅡ小鼠与BALB/c小鼠杂交,用流式细胞术检测胸腺中iNKT和PIL T细胞的频率。bB6和F1背景下WT、T-MHC I和T-MHCⅡ小鼠iNKT和PIL T细胞频率(左面板)和数目(右面板)的简要评价。c在B6(左面板)和F1(右面板)背景下,从WT(黑点)、T-MHC I(红色三角形)和T-MHCⅡ小鼠(蓝反三角形)的胸腺中iNKT细胞数与PIL T细胞数呈负相关。d在B6(上排)和F1(下排)背景下,比较了WT、T-MHCⅠ和T-MHCⅡ小鼠的iNKT和PIL T细胞亚群。每一点代表一个动物:n=每组10只动物(WT和T-MHC I组),n=8只动物(T-MHC II组),n=9只动物(F1 WT组),n=6只动物(F1 T-MHC I组),以及n=7只动物(F1 T-MHC II组)ad。数据是七个独立实验的代表。未配对的双尾Mann-Whitney检验b;ns,不显着(p≥0.05),*p < 0.001, and ****p < 0.0001. R2-价值观和p-c通过拟合非线性回归,进行拟合优度检验和平方和F检验。数据以平均值±SD表示。源数据作为源数据文件提供。

讨论

这里我们描述Nlrc 5-转基因小鼠(T-MHC I)允许细胞亚群特异性表达Nlrc 5,它是MHCⅠ基因肽表达和功能的中枢调节因子。因此,我们的数据表明Nlrc 5导致DP胸腺细胞MHCⅠ表达上调。据我们所知,这是第一个转基因小鼠模型,允许细胞亚群特异性的mhc i上调而不改变mhcⅡ的调节。因此,这条老鼠线可以作为一个强有力的工具,在未来的研究中,寻求稳定的MHC I表达。值得注意的是,Nlrc 5表达增加了一些非经典MHC Ib分子的表面水平,如Qa-1和Qa-2(肽提呈分子),但不影响CD1d和MR1(非肽提呈分子)。因此,在我们的小鼠模型中,我们假设DP胸腺细胞增强的自身肽mhc ia/ib表达使他们能够引导肽特异性T细胞向一种类似先天的发育途径发展。虽然我们没有为pIL T细胞识别抗原的性质提供直接证据,但先前的研究表明,在外源抗原特异性tcr转基因T mhcⅡ小鼠模型中,dp胸腺细胞不能选择pIL T细胞。22。这意味着PIL T细胞的选择是自身抗原特异性的,需要一个相反的DP胸腺细胞呈现。此外,随后的一项研究表明,来自T-mhcⅡ小鼠的pIL T细胞具有高度多样化的tcr库,这意味着它们可能识别多种自身抗原。45。综上所述,可以认为pIL T细胞可以通过dp胸腺细胞表达的内源性肽自身抗原来选择pIL T细胞,这与在dp胸腺细胞表达的内源性脂类自身抗原上选择的iNKT细胞非常相似。3,9,10,11.

虽然DP胸腺细胞通常不表达经典的MHC Ia分子,但在WT小鼠中已经存在一小部分PIL T细胞。然而,我们发现这些细胞大多不受CD1d或MR1的限制。因此,目前尚不清楚这些先天样细胞是如何被选择的。有趣的是,与T-MHCⅡ小鼠相比,WT小鼠的PIL T细胞数量更接近于T-MHCⅠ小鼠的PIL T细胞。这意味着在WT小鼠中PIL T细胞可能仅限于MHC Ib分子,这些分子仍在DP胸腺细胞(即H2-M3和Qa-1)上表达,尽管水平较低。事实上,以前已经证明肽特异性的mhc ib限制性T细胞可以在tecs或hcs上被选择。46。然而,这些细胞只有在hcs上被选择时才具有先天的表型。18,46。此外,这个过程被证明是依赖SAP的。47。因此,WT小鼠的PIL T细胞可能受到MHC Ib的限制。

虽然MHC I在DP胸腺细胞上的表达导致PIL T细胞的增殖,但其增殖幅度低于T-MHCⅡ小鼠。此外,T-mhc i小鼠PIL-T细胞频率的增加并没有导致CD8 T的显著增加。MP提示T-MHCⅠ和T-MHCⅡ小鼠PILs的功能差异。值得注意的是,成熟的小鼠iNKT细胞不表达CD8αβ。事实上,先前的一些研究表明,强制表达CD8αβ不利于iNKT细胞的发育,并导致iNKT细胞数量的大幅减少。7,48。随后,另一项研究表明,在发育中的iNKT细胞中,CD8表达的沉默是由转录因子Th-pok介导的,而转录因子Th-pok的表达是iNKT细胞功能成熟所必需的。49。因此,辅助受体的选择似乎也控制了PIL细胞的功能表型。因此,虽然在MHC I分子上被选择,但T-MHC I小鼠的PIL细胞可能由于启动先天的发育程序和Th-Pok的表达而下调CD8的表达。此外,以往的研究表明,tcr信号强度对iNKT细胞亚群的表达和分化有一定的调节作用。37,38,50。较强的TCR信号强度有利于iNKT 2细胞的发育,较低的强度优先引导iNKT 1细胞通路。此外,CD4共受体信号强度高于CD8。51,52,53推测对T-MHCⅡ小鼠PIL 2细胞的增殖有一定的促进作用。因此,通过将T-mhcⅠ与CD8.4小鼠杂交,可增加共受体信号强度。42可能增加了PIL 2细胞的频率和CD8 T的增殖。MP细胞。

有几项研究表明,Nlrc 5在炎症和Ⅰ型干扰素反应中的表达54,55。虽然我们没有观察到传统T细胞发育的任何重大改变,Nlrc 5小鼠模型中T细胞的表达增加雷格手机号码和频率。此外,在这里,我们证明了这种扩展是以细胞内禀的方式Nlrc 5这并不是因为MHCI在邻近的DP胸腺细胞上表达。有趣的是,nlrc 5被认为是核因子-κB(NF-κB)信号的正或负调制器。56,57,58。NF-κb信号也被认为是T的关键。雷格细胞发育与功能59,60。考虑到这一点,有可能Nlrc 5DP期表达可能影响T雷格通过调节NF-κB信号,细胞的选择和发育。需要进一步研究,以确定Nlrc 5参与T的确切机制雷格细胞生物学。

最后,我们提供了支持先天T细胞发育的狭窄利基存在的几条线索。首先,T-MHCⅠ和T-MHCⅡ小鼠iNKT细胞数量和频率均降低.第二,iNKT细胞与PIL T细胞数的负相关在B6xBALB/c F1背景下更为深刻,其中iNKT细胞发育的生态位较大。此外,CD1d缺陷的T-MHCⅠ小鼠PIL T细胞增加.先天性T细胞之间可能相互竞争以获得丰富的细胞因子、激活配体,或通过未知的机制直接抑制彼此的发育和存活。值得注意的是,IL-7、IL-15和IL-25的本地丰度。61,62,63在胸腺中,是影响iNKT细胞发育、存活和终末细胞成熟的关键因素。因此,较高的PIL T细胞数可能改变这些细胞因子在胸腺中的生物利用度.然而,MAIT细胞和γδNKT细胞在T-MHCI小鼠中并没有表现出下降的趋势.因此,这提示PIL T细胞和iNKT细胞可能竞争相同的激活配体,可能是SLAMF受体的成员。

MHCⅠ类分子是体内表达最广泛的基因之一。与主要由专业抗原提呈细胞表达的MHCⅡ类分子相比,MHCⅠ类分子通常被认为是由所有有核细胞表达的。在此基础上,DP胸腺细胞中存在明显的MHCI缺乏症。当多肽提呈的mhc等位基因被迫在dp胸腺细胞中表达时,我们观察到了脂质特异性iNKT细胞的减少,这一事实表明在dp胸腺细胞中缺乏mhc i的进化理由是为了促进识别非肽配体的先天性T细胞的发育。事实上,iNKT细胞确实能识别非肽类配体,如脂类。64。由于这些细胞也是半不变的,这意味着它们的重排很少发生,尽管这些细胞在体内有大量的数值。10。因此,胸腺似乎有一种机制,从罕见的tcr基因重排中发育先天性T细胞是有利的


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