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TREM 2是分枝杆菌非糖基化菌落酸的受体,限制了抗分枝杆菌巨噬细胞的活化

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发表时间:2021-04-19 14:04作者:武汉新启迪Xinqidibio

摘要

分枝杆菌细胞壁糖脂通过fcrγ相关C型凝集素受体(包括Mincle)和caspase招募结构域家族成员9(CARD 9)诱导抗分枝杆菌免疫应答.此外,分枝杆菌携带免疫逃避细胞壁脂质与毒力和潜伏期有关,然而,其作用机制尚不清楚。在此,我们发现DAP 12相关触发受体在髓系细胞2(TREM 2)上表达,能识别含脂的分枝杆菌细胞壁肌结肠酸(MA),并提示分枝杆菌通过TREM 2控制宿主免疫的机制。巨噬细胞以Mincle/FCR、γ/CARD 9依赖的方式对含MA的糖基化脂质反应,产生炎性细胞因子,形成诱导型一氧化氮合酶(INOS)阳性的杀菌巨噬细胞。相反,巨噬细胞以TREM 2/DAP 12依赖但与CARD 9无关的方式对非糖基化的MAA产生反应,以吸引iNOS阴性的分枝杆菌允许的巨噬细胞。此外,TREM 2的缺失增强了Mincle诱导的巨噬细胞体外活化和体内炎症反应,加速了分枝杆菌感染的消除,提示TREM2-DAP 12信号通路对抗Mincle-FCRγ-CARD 9介导的抗分枝杆菌免疫。因此,分枝杆菌可以利用TREM 2来逃避免疫。

导言

结核病(TB)是一种慢性传染病。结核分枝杆菌(MTB),并且仍然是全世界发病率和死亡率的一个主要原因。大多数感染者没有表现出结核病的临床症状(称为潜伏感染)。在此阶段,细菌处于休眠状态,不复制表型,对反应中间体和抗生素产生抗药性,始终逃避宿主的免疫识别。1.

分枝杆菌的一个显著特点是其外膜脂含量高,这不仅对其复制、耐酸性和耐药至关重要,而且在致病性中起着关键作用。2,3其中一些脂类可触发免疫病理反应,而另一些则具有与毒力和潜伏期有关的免疫逃避功能。4。分枝杆菌酸(Mas)是分枝杆菌和相关的spp.特异性脂类,具有极长的脂肪酸(C)。60-C90)并代表分枝杆菌细胞壁的主要成分。MAS通过共价键连接到阿拉伯半乳糖(Abg)和肽聚糖(Pgn)基底层形成细胞壁骨架,并以糖基化或非糖化形式存在于细胞壁表面。5。它们的组成会根据分枝杆菌的生命周期阶段和外部环境条件而动态变化。6,7,这通过控制宿主免疫来影响细菌的毒力和潜伏期。例如,糖基化的MA类脂类,如海藻糖二肌醇酸盐(tdm;又称脐带因子)和葡萄糖单肌醇酸(Gmm),具有较强的促炎和佐剂活性,可在动物体内注射时诱发肺肉芽肿。8,9。这些糖脂主要是在活跃复制的分枝杆菌中合成的,而在休眠的分枝杆菌中,糖脂的含量则明显降低。6。非糖基化的MA脂,如游离MA(FMA)和单肌酸甘油(GroMM),与分枝杆菌的持久性、免疫抑制和生物膜形成有关。FMA在非复制的持续性分枝杆菌细胞壁中增加。6,形成生物膜10,11,抑制巨噬细胞中细胞因子的产生和巨噬细胞吞噬溶酶体的融合。一株高毒突变株(∆)MCE 1)受到干扰MCE 1操纵子,导致FMA在细胞壁中过量积累。12,13,诱导弱巨噬细胞趋化因子反应。14,不能引起强烈的Th1反应,导致小鼠肺肉芽肿组织不良。13,相对于野生型(WT)菌株。GroMM与潜伏感染有关15,并诱导嗜酸细胞炎症和T辅助因子(Th)2型细胞因子的产生。16,这可能会抵消Th1介导的抗细菌免疫。然而,这些非糖基化MA脂质调节宿主免疫的分子机制尚不清楚。

虽然巨噬细胞的病原体识别通常会触发消除病原体的免疫反应,但巨噬细胞是mtb的主要靶细胞,是mtb增殖和潜伏期的细胞内利基。17。MTB已经进化出显著的免疫逃避策略,使细胞内持续存在于巨噬细胞中。18。细胞壁脂质phthiocerol dimycocerosate(PDIMs)和结构相关的酚醛糖脂(Pgls)代表的毒力因子仅存在于少数致病性分枝杆菌中,如mtb的高致病性W-京株。19。这些脂质在分枝杆菌表面的表达掩盖了诱导诱导型一氧化氮合酶(INOS)阳性的m1型微杀菌巨噬细胞所需的Toll样受体(TLR)的配体,取而代之的是将iNOS阴性的非微杀菌巨噬细胞(称为“允许性巨噬细胞”)招募到感染部位,从而促进mtb细胞的存活和繁殖。20。允许性巨噬细胞的形成依赖于CCR 2及其配体单核细胞趋化蛋白-1[MCP-1(CCL 2)]的诱导。20,21.

免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)偶联受体(包括C型凝集素受体(ClRs)和免疫球蛋白超家族受体)的重要性的证据正在积累起来,涉及到对多种病原体的天然免疫。22,23,24,25。这些受体与载ITAM信号适配器dap 12或fcrγ相关联,或与称为hemITAM的胞质ITAM样结构的信号转导元件相关联。26。这些受体的配体识别激活ITAM中的酪氨酸磷酸化,然后激活酪氨酸激酶Syk,通过信号适配器caspase募集结构域成员9(CARD 9)下游激活丝裂原激活的蛋白激酶和核因子-κB。CARD 9与B细胞淋巴瘤/白血病-10和粘膜相关淋巴组织淋巴瘤易位蛋白-1有关,在ITAM偶联受体诱导的髓系细胞活化中起重要作用。26,27。最近的报道强调了CARD 9和fcrγ相关的clr在抗细菌天然免疫中的重要性,它们识别分枝杆菌细胞壁糖脂。28。CARD 9缺乏的小鼠对mtb感染高度敏感。29。Mincle(Clec4e)以fcrγ依赖的方式识别tdm诱发肺部炎症并诱导肉芽肿形成。30。MCL(Dectin-3/Clec4d)也能识别TDM,并与Mincle形成二聚体以稳定其表面表达。31,32。Dectin-2(Clecsf 10)识别甘露糖冠脂阿拉伯甘露聚糖(Lam),在分枝杆菌感染过程中对IL-10和IL-2的产生起着核心作用。33。DCAR(小鼠Clec4b1)识别磷脂酰肌醇甘露糖甙,促进单核细胞的吸收和Th1反应。34。与clr相关的fcrγ不同,另一种载ITAM信号适配器dap 12可能对抗结核杆菌免疫应答产生负调节作用,因为dap 12缺乏可加速mtb或mtb或肺内肉芽肿的清除和肺内肉芽肿的形成。牛分枝杆菌卡介苗感染35,36。这些观察表明,未知的DAP 12相关调节受体可能识别分枝杆菌中的免疫抑制配体。然而,这些理论受体,以及通过DAP 12免疫抑制的确切机制,还没有被描述。

在本研究中,我们提出的证据表明,DAP 12相关受体触发受体在巨噬细胞2(TREM 2)上表达,识别含有分枝杆菌MA的脂类,不同于Mincle识别的脂类,对抗Mincle-FCRγ-CARD 9介导的抗细菌免疫应答。结果表明,糖基化MA脂以Mincle/FCR、γ/CARD 9-依赖方式诱导巨噬细胞产生杀菌作用。相反,非糖基化的MA类脂以TREM 2/DAP 12依赖但不依赖CARD 9的方式诱导分枝杆菌允许的巨噬细胞。此外,TREM 2的缺失明显增强了Mincle诱导的小鼠体外巨噬细胞活化和体内炎症反应,加速了小鼠分枝杆菌感染的消除。这些结果提示分枝杆菌通过TREM 2逃避宿主免疫,从而通过Mincle-CARD 9途径来逃避杀菌巨噬细胞的激活。这一发现描述了分枝杆菌通过宿主调节的先天免疫受体来控制宿主免疫反应的一种机制,这种机制可能对包括结核在内的分枝杆菌病的治疗产生影响。

结果

TREM 2识别分枝杆菌

为了筛选能识别分枝杆菌的ITAM偶联受体,我们分析了20个已知的ITAM偶联clr、trem和白细胞单Ig样受体(lmir;cd 300)的结合。22,37,38,39融合到抗热杀分枝杆菌的fc抗体片段,包括强毒株mtb h37rv、弱毒株mtb h37ra和疫苗株。牛M.卡介苗,采用流式细胞术。除了以前报道的几个识别分枝杆菌的clr,包括Mincle,特异性的icam-3捕获非整合素相关(SIGNR)1,SINGNR 3和dc-符号。30,40,该筛选发现TREM 2和LMIR 5是能够与分枝杆菌结合的新受体(图1)。1A)。特别是,TREM 2对所有被检测的分枝杆菌具有很强的结合能力,这促使我们进一步研究这种相互作用。

图1:TREM 2识别曼氏菌。

a热杀mtb h37ra或h37rv,或牛M.BCG与CLR、Trem和LMIR家族受体融合于Fc-抗体片段或与对照Fc片段融合,用抗人IgG-FITC二次抗体染色。流式细胞术分析各受体-FC蛋白的结合情况。开放直方图显示所指示的受体-FC蛋白的结合数据。灰度直方图显示对照染色的背景荧光。b仅表达trem 2+dap 12或dap 12的nfat-gfp报告细胞被热杀伤mtb h37ra或h37rv刺激,或牛M.BCG作用24h,流式细胞术分析GFP荧光。左边的直方图显示了100μg/ml的指示分枝杆菌的刺激数据。右面板中的数据显示为比未受刺激细胞的控制值增加的百分比。数据是重复试验的平均值±扫描电镜,是三个独立实验的代表。源数据作为源数据档案。

为了研究TREM 2对分枝杆菌的识别是否激活细胞内ITAM信号,我们使用活化T细胞(NFAT)驱动的绿色荧光蛋白(Gfp)报告细胞(2B4)的核因子。30异位表达TREM 2及其信号亚基DAP 12(参考文献。41,42)。如以前报告的那样30、Mtb H37Rv、Mtb H37Ra和牛M.卡介苗刺激表达Mincle和FCRγ的报告细胞NFAT-GFP信号。1A)。我们发现,所有这些分枝杆菌菌株都清楚地激活了表达TREM 2和DAP 12的报告细胞,但在仅表达DAP 12的细胞中却没有激活,呈剂量依赖性(图一)。1B)。然而,这些菌株中没有一株能激活表达TREM 1+DAP 12的报告细胞(补充图)。1B)。重要的是,TREM 2和Mincle的刺激水平在不同菌株之间存在差异(图1)。1B和补充图。1A),提示TREM 2和Mincle能识别这些分枝杆菌菌株共同表达的不同配体。

TREM 2识别MAS

TREM 2与分枝杆菌结合意味着它的配体存在于细胞壁表面,在细胞壁表面,分枝杆菌表达大量独特的脂类,影响宿主的免疫反应。43。考虑到TREM 2与多种内源性哺乳动物脂类结合44,45,我们首先研究了分枝杆菌脂类是否含有TREM 2配体。Mtb H37Ra的氯仿-甲醇脱脂反应(C:M;图1.2A)明显降低TREM 2报告细胞的刺激水平(图1)。2B),以及Mincle的报告细胞30(无花果)2C)。相应地,含脂C:m组分(图1)。2A而亲水M:W组分对TREM 2报告细胞有较强的刺激活性(图1)。2B)和Mincle报告细胞一样。2C),表明TREM 2配体存在于细胞壁脂质组分中,与SO Mincle配体一样。30。接下来,我们使用已知的分枝杆菌细胞壁的主要成分,包括糖聚糖、PGN和ABG、免疫刺激糖脂LAM和TDM来测试TREM 2的刺激活性。二维空间)和FMA(图1.二维空间)。我们观察到ABG、PGN和LAM不激活TREM 2报告细胞,即使在高浓度时也是如此。2e-g),而我们观察到TDM和FMA有大量的配体活性。2H)。重要的是,TDM(即FMA)中海藻糖的丢失显著增加了TREM 2的刺激活性。2H),同时,正如报道的那样,它完全取消了刺激Mincle的活动(如图所示)。2I)30。这些结果提示TREM 2认识TDM的MA结构,糖类干扰了这一识别。

图2:TREM 2识别MAS。

aMtb H37Ra溶剂型脱脂分馏示意图。细菌经氯仿/甲醇处理后脱脂。经离心(CFG.)后,将可溶性提取物(SUP)与水混合,分离成脂溶性(C:M)和水溶性甲醇:水(M:W)两组分。b, c表达TREM 2+DAP 12的NFAT-GFP报告细胞b)或Mincle+fcrγ(c)用未处理或脱脂细菌(Ppt)或涂有平板的C:m或M:W组分刺激24h。a,用流式细胞仪分析GFP荧光。dTDM的化学结构给出了含有α菌丝体的TDM的结构.eg单独表达TREM 2+DAP 12或DAP 12的NFAT-GFP报告细胞用指示量的ABG(e)、PGN(f),而林(g)2 4h,流式细胞仪分析GFP荧光。数据显示为比未受刺激细胞的控制值增加的百分比。h, i仅表达TREM 2+DAP 12或DAP 12的NFAT-GFP报告细胞(h)或Mincle+fcrγ(i)用指示量的tdm或fma刺激,并按eg. j, k用BCG MA刺激表达TREM 2+DAP 12的NFAT-GFP报告细胞,马氏或广管局(j)或THA、PA或HBA(k)并进行分析,如eg。数据显示为重复的平均值±扫描电镜(b, c, ei, j)或一式三份(k)三个独立实验的测试和代表性。源数据作为源数据档案。

然后研究了TREM 2识别所需的MA结构。极长(C)60-C90)和支链烷基是分枝杆菌Mas的标志。为了评估分枝和长度的重要性,我们比较了分枝杆菌MA的刺激活性。马红球菌马,它有较短的烷基链(C)35)和丁烯酸(BA),它是一种具有烷基链(C)的线性脂肪酸。22)的长度与马氏马(图)2J). 马氏MA对TREM 2报告细胞的刺激活性与分枝杆菌MA相似,而BA的刺激水平很低,即使BA浓度较高(图1)。2J表明TREM 2识别MA的关键是支链结构,而不是烷基链长度。为了进一步研究这一点,我们测试了棕榈酸(PA;C)的配体活性。16),2-十四烷基十六烷酸(THA;C;14/C16),它含有一种PA基合成脂肪酸,其分支结构与MA相似,但缺乏3-羟基残基,而3-羟基丁酸(HBA)在MA的分支结构中仅含有羧基和羟基残基。2K)。我们用THA检测到TREM 2的刺激,虽然低于MA,但不能检测到PA和HBA的刺激。2K),表明TREM 2的识别需要一个带有烷基链的支化脂肪酸结构。

TREM 2中R47H突变与多种神经退行性疾病的高风险46,47,48,49,影响对脑脂的识别。45,50。我们发现TREM2R47H突变也减弱了MA的识别(附图)。2),表明该残基对TREM 2对MA的识别具有重要意义。

Mincle和TREM 2对含MA脂质的对比识别

分枝杆菌在细胞壁上表达多种MA类脂类。51。由于Mincle和TREM 2都具有识别MA类脂的能力,我们接下来比较了它们与糖基化(TDM和GMM)或非糖化(GroMM和FMA)MA类脂的结合活性。3A)。利用受体-FC融合蛋白。我们观察到,Mincle-FC不仅与TDM有较强的结合,而且与GMM结合,而与FMA的结合不明显,仅在高浓度时才与GroMM有弱的结合(图一)。3B)。相比之下,TREM2-FC与GroMM和FMA有较强的结合,但与TDM和GMM的结合相对较弱。3B)。然后,我们用NFAT-GFP报告细胞研究了含有MA的脂质与TREM 2和Mincle的不同结合是否反映了它们的受体刺激活性。与结合数据一致,TREM 2报告细胞对MA和GroMM有较强的反应,对TDM和GMM的反应较弱,而Mincle报告细胞对TDM和GMM的反应较强,但仅在高浓度时才对GroMM弱反应,对FMA无反应(图1)。3C)。因此,TREM 2和Mincle优先识别非糖基化和含糖基MA脂。

图3:TREM 2和Mincle根据它们的糖基化优先识别不同的含有MA的脂类。

aMtb中发现的糖基化(TDM和GMM)和非糖化(GroMM和FMA)MA脂的化学结构。包括含有α菌落酸脂的结构。b将所指示的TREM 2或Mincle-FC融合蛋白添加到包被0.5μg/孔TDM、GMM、GroMM或FMA的水井中,然后与抗人IgG辣根过氧化物酶孵育,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测结合蛋白。c将表达TREM 2+DAP 12或Mincle+FCRγ的NFAT-GFP报告细胞,用标记量的TDM、GMM、GroMM或FMA刺激24 h,用流式细胞仪分析GFP。值被绘制为最大值的最大响应百分比。数据表示为平均±扫描电镜的重复测试,并代表至少三个独立的实验。源数据作为源数据档案。

Mincle和TREM 2诱导巨噬细胞活化

为了探讨TREM 2与Mincle识别MA类脂类物质在激活天然免疫细胞中的作用,我们从WT,TREM 2缺陷的腹腔巨噬细胞中刺激巨噬细胞。TREM 2−/−),或Mincle缺陷(Clec4e−/−)含有糖基化或非糖化MA脂的小鼠,并检测其产生MCP-1,这是一种与结核病病理有关的关键单核细胞趋化因子。52,53,54肿瘤坏死因子(TNF)是肉芽肿形成和结核病控制的重要细胞因子。55,56。有趣的是,糖基化的含MA脂类TDM或GMM或脂多糖(LPS)激活WT巨噬细胞可诱导MCP-1和TNF的产生,而非糖基化的MA-脂类GroMM或FMA激活的巨噬细胞则可诱导MCP-1的产生,但不能诱导TNF的产生(如图1所示)。4A),以及其他促炎细胞因子,包括IL-6和IL-12p40(补充图1)。3A)。Mincle公司的损失几乎完全废除了TNF,就像以前一样30,以及mcp-1对tdm的预期反应。30。我们发现Mincle缺乏症也可以消除GMM诱导的这些产物(图1)。4A)。然而,Mincle缺乏对GroMM或FMA没有影响MCP-1的产生.相反,TREM 2的丢失几乎完全取消了对GroMM或MA的MCP-1生产,但对TDM或GMM不起作用(图1)。4A)。这些结果表明,糖基化和非糖基化的MA类脂诱导了巨噬细胞的活化,而巨噬细胞的激活分别依赖于Mincle和TREM 2。

图4:通过Mincle和TREM 2明显的脂类识别和巨噬细胞活化。

ac野生型腹腔巨噬细胞,TREM 2−/−,或Clec4e−/−老鼠(a)、泰罗普−/−,或Fcer1g−/−老鼠(b),或WT或CARD 9−/−老鼠(c)在平板上涂有一定量的tdm、gmm、gromm或fma,或用LPS(100 ng/ml)刺激24小时,在Syk抑制剂Bay-613606(Bay)存在或不存在的情况下刺激WT细胞(c)。ELISA法检测培养上清液中MCP-1和TNF的生成.数据作为三份分析的平均值±扫描电镜,是三个独立实验的代表。采用双向方差分析和Bonferroni检验计算统计学显着性。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Source data are provided as a 源数据档案。

在髓系细胞上启动ITAM偶联受体激活ITAM-Syk-CARD 9信号通路,诱导细胞因子的产生。57。为了研究含MA脂质诱导的MCP-1和肿瘤坏死因子的产生是否依赖于这一途径,我们首先证实了DAP 12和FCRγ的需求,它们分别是TREM 2和Mincle的ITAM信号亚基。正如我们所预期的,我们观察到fcrγ-缺陷(Fcer1g−/−)和DAP 12泰罗普−/−)巨噬细胞几乎与Mincle缺乏的巨噬细胞和TREM 2缺乏的巨噬细胞分别形成类似的TNF和MCP-1的缺陷,这与糖基化或非糖基化的MA类脂反应相似(如图所示)。4B)。然而,FCRγ缺乏对高浓度的FMA或GroMM诱导的MCP-1有一定的抑制作用,提示FCRγ可能部分参与了TREM 2信号转导。然后,我们检查了Syk和CARD 9对每一种反应的要求。用Syk抑制剂(BAY-613606)治疗WT巨噬细胞后,所有含有MA的脂质均能抑制MCP-1和肿瘤坏死因子的产生(如图所示)。4C),表明Syk在对这些脂质的反应中起着至关重要的作用。有趣的是,虽然糖基化Mas通过Mincle诱导的TNF生成在CARD 9缺乏中被取消(CARD 9−/−)巨噬细胞,如预期58CARD 9-缺乏症不影响糖基化和非糖化MA脂诱导的MCP-1的产生。4C)。这些结果表明,含MA的分枝杆菌脂类通过典型的FCRγ-Syk-CARD 9途径诱导肿瘤坏死因子的产生,而通过ITAM-Syk途径诱导MCP-1的产生,但与CARD 9信号通路无关(补充图1)。3B).

TREM 2/DAP 12信号抑制Mincle诱导的巨噬细胞活化

有趣的是,我们观察到TDM或GMM对腹腔巨噬细胞产生MCP-1和TNF有明显的促进作用。4A)。这也适用于泰罗普−/−巨噬细胞4B提示TREM 2/DAP 12信号通路在Mincle/FCRγ-诱导的巨噬细胞活化中具有抑制作用。我们没有观察到细胞因子的反应在相同的制备过程中增加。TREM 2−/−巨噬细胞被TLR配体刺激,例如pam。3CSK4(对于TLR 2)、LPS(用于TLR 4)、PolyI:C(用于TLR 3)、CpG-ODN(用于TLR 9)或与Dectin-1配体合子赞(图1)。4A和补充图。4A,b)。在缺乏TREM 2的情况下,Mincle活化的选择性增强作用在骨髓源性巨噬细胞(BMDMs)中更为明显,其中TDM诱导的TNF在WT BMDMs中检测到的水平很低。尽管如此,TREM 2−/−泰罗普−/−BMDMS对TDM(补充图)的反应显示出大量TNF的产生。4C),而在PAM之后没有观察到这种增强3CSK4或者LPS刺激。此外,我们观察到刺激后细胞因子反应增加。TREM 2−/−含分枝杆菌总脂的BMDM(C:M组分见图)。2A)由Mtb R37Ra或牛M.补充图4D)。这一反应在很大程度上取决于Mincle,如Clec4e−/−与WT相比,BMDMs对总脂类产生的TNF明显低于WT BMDMs(补充图)。4D)。提示TREM 2/DAP 12信号通路选择性地抑制Mincle-FCRγ信号诱导的巨噬细胞活化。

TREM 2触发巨噬细胞

鉴于NO在控制分枝杆菌感染中起着关键作用。59,60研究了TREM 2和Mincle对巨噬细胞产生NO的影响。我们观察到tdm刺激强烈地诱导bmdms产生NO,这是以前报道过的。30,而FMA并不能实质上诱导NO的产生(图1)。5A)。这与观察到的NOS 2TDM刺激后表达iNOS,而非FMA(补充图)。5A)。此外,TDM诱导的巨噬细胞产生NO的作用在TNF阻断抗体的作用下受到抑制(如图1所示)。5B)。相反,在FMA刺激的培养中加入重组TNF可诱导巨噬细胞产生NO。5B),表明NO的产生依赖于TNF,这与以前的研究结果是一致的。61,62,63.

图5:MA触发TREM 2诱发巨噬细胞。

a, b在10 ng/ml的IFN-γ存在下,用指示量的tdm或fma刺激bmdms 24 h。a),1μg的tdm有或没有指示量的α阻断抗体(αTNF Ab)或同类型的对照抗体(对照Ab)。b),或1μg含或不含重组肿瘤坏死因子(RTNF)(b)。Griess法检测NO含量。数据表示三个独立实验的三份分析的平均值±扫描电镜。采用单因素方差分析和Bonferroni检验计算统计学显着性。**p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. not significant. c苏木精和伊红染色肺的典型图像,Clec4e−/−,或CARD 9−/−小鼠静脉注射50μg tdm或250μg fma乳剂后第7天。这些图像是两个独立实验的代表。标尺:0.1毫米。df在小鼠腹腔注射5 0 0μg fma或10 0μg tdm乳剂后4、2 4、72 h收集腹腔灌洗液。n=4)。用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定洗液中MCP-1和TNF的浓度。NOS 2RT-PCR定量检测mRNA水平。e腹膜中性粒细胞CD11b的流式细胞术分析+Ly6G+F4/80)和单核巨噬细胞(CD11b)+Ly6GF4/80低层来自WT小鼠的SPMS(n=4)注射MA或TDM乳剂后48和72h,如d. f, gWT或TREM 2−/−小鼠腹腔注射FMA或对照组(Vehicle)乳剂。MCP-1的浓度(对照,n=4;FMA,n=6;在4小时)和肿瘤坏死因子(n=4;72h时用ELISA法测定腹腔灌洗液中的含量。f)。腹膜渗出细胞(n=4;在72小时时进行了分析,如eg. hkWT小鼠we分别于第1、2、3天腹腔注射TDM、FMA或对照组(Vehicle)乳剂及浸润的巨噬细胞,流式细胞术检测CD 38和iNOS的表达。h)。收集的单核巨噬细胞总数(CD11b)+Ly6C+F4/80+) (i),m1巨噬细胞(CD11b)+Ly6C+F4/80+CD 38诺斯+) (j)和允许的巨噬细胞(CD11b)+Ly6C+F4/80+CD 38真没意思诺斯) (k第三天显示。数据dk表示至少三个独立实验的平均±扫描电镜。统计显着性采用双向方差分析和Bonferroni检验(fg)或由两尾未配对t试验(ik). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, n.s. not significant. Source data are provided as a 源数据档案。

然后我们描述了在体内通过Mincle和TREM 2引发的炎症反应。因为TDM通过Mincle/FCRγ途径诱导小鼠肺肉芽肿30,我们研究了FMA是否有类似的效果。在小鼠体内静脉注射tdm(油包水)乳剂,可使肺内大量肉芽肿性病变消失。Clec4e−/−老鼠(图1.5C),如以前报告的那样30。此外,这种影响在CARD 9−/−提示TDM诱导的肉芽肿形成依赖于Mincle/CARD 9信号转导。相反,我们没有观察到注射FMA乳剂的小鼠肺肉芽肿病变(如图所示)。5C),提示FMA不能激活CARD 9信号。为了进一步探讨TDM或MA体内诱导的天然免疫反应,我们将TDM或FMA乳剂腹腔注射到小鼠体内,并测定MCP-1和TNF的水平。NOS 2MRNA水平,以及吸收的炎症细胞的数量,在腹腔诱导。我们在相同水平的FMA和TDM给药后腹腔灌洗中检测到MCP-1,分别在注射后4和24 h检测到峰值MCP-1水平(如图1所示)。5D)。然而,TNF的产生和NOS 2MRNA表达仅由TDM诱导,而非FMA诱导。5D),这与体外刺激的巨噬细胞的结果是一致的。4)。此外,我们观察到tdm吸收了大量的巨噬细胞[CD11b]。+Ly6GF4/80低层小腹腔巨噬细胞(SPMS),补充图。5B)和中性粒细胞(CD11b)+Ly6G+F4/80,补充图。4B)进入空腔,而FMA吸收的巨噬细胞数量与TDM相当,但仅在给药后才能立即减少中性粒细胞(如图所示)。5E)。重要的是,MCP-1水平。5F)和被招募细胞的数量(如图所示)。5G)由FMA诱导TREM 2−/−小鼠与对照药诱导的小鼠几乎相同,表明FMA诱导的炎症依赖于TREM 2。

为了研究TDM-或FMA诱导的巨噬细胞的表型,我们检测了炎性M1-巨噬细胞标志物iNOS和CD 38的表达。64)在所招募的巨噬细胞中(如图所示)。5H和补充图。5C)。腹腔注射TDM和FMA吸收了相当数量的巨噬细胞进入腹腔(如图所示)。5I);然而,尽管TDM诱导的巨噬细胞显示出CD 38iNOS+表型(图1.5JFMA诱导的大鼠CD 38表达降低,iNOS阴性。5K)。这种表型类似于先前报道的一种与允许的巨噬细胞相关的表型,这些巨噬细胞是由一群以mcp-1和ccr 2依赖的方式表达毒力脂pdIM和pgl的致病性分枝杆菌所招募的,并为分枝杆菌的繁殖提供了一个利基。21,65.

提示触发Mincle-CARD 9通路可诱导肺肉芽肿形成,并吸收M1型杀菌巨噬细胞产生TNF和NO,而TREM 2激活则可诱导缺乏TNF和NO生成的分枝杆菌允许的巨噬细胞。

TREM 2缺乏症加重Mincle所致炎症

为了探讨TREM 2抑制Mincle诱导的巨噬细胞活化的作用,我们观察了TREM 2缺乏症对TDM诱导的组织炎症反应的影响。TDM乳剂腹腔注射TREM 2−/−小鼠TNF和mcp-1水平显著升高,mcp-1水平升高。NOS 2MRNA表达6A),以及更多的巨噬细胞和中性粒细胞进入腹腔(如图所示)。6B),与在WT小鼠中观察到的相比较。静脉注射tdm乳剂致小鼠肺肿胀(肺重量指数增加:lwi)和胸腺萎缩(胸腺重量指数降低:twi)依赖于mincle-fcrγ通路。30。我们观察到TREM 2−/−注射TDM后小鼠的LWI明显高于WT小鼠,TWI明显低于WT小鼠(图1)。6C)。肺组织病理学分析显示肉芽肿性病变明显突出。TREM 2−/−老鼠(图1.6d)。此外,还观察到明显血管炎和水肿的特殊病理特征,表明炎症加速。TREM 2−/−但未见WT小鼠(附图)。6)。与这些结果一致,肿瘤坏死因子和mcp-1的水平NOS 2炎症肺组织中mRNA表达明显增高。TREM 2−/−小鼠比WT小鼠(图1)。6E)。提示TREM 2可抑制小鼠体内炎症反应。

图6:TREM 2缺乏症加重了Mincle所致的炎症反应。

a, bWT或TREM 2−/−老鼠(n4)腹腔注射100μg TDM或对照乳剂(Vehicle)。用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测腹腔灌洗液中TNF和MCP-1的含量。NOS 2于注射后24h用qrt-PCR法检测腹腔细胞mRNA水平。a)。用流式细胞仪分析腹腔注射后72h腹腔巨噬细胞和中性粒细胞的数量。b). ceWT或TREM 2−/−老鼠(n5)静脉注射50μg TDM或对照乳剂,于注射后第7天取肺和胸腺。LWI和TWI显示(c)。典型的肺叶苏木精和伊红染色切片TREM 2−/−鼠标(标尺:上板,1毫米;下板,0.1毫米)显示(d)。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定肺组织匀浆中细胞因子浓度。NOS 2用qRT-PCR法检测肺组织中mRNA的表达。e)。数据ace均为平均±扫描电镜,代表了至少两个独立的实验。统计显着性采用双向方差分析和Bonferroni检验(a, b)或由两尾未配对t试验(c, e). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Source data are provided as a 源数据档案。

TREM 2缺乏症加速分枝杆菌感染的清除

由于我们的数据提示TREM 2在Mincle杀微生物天然免疫反应中具有抑制作用,我们研究了TREM 2缺乏症对细菌感染清除的影响。首先,我们感染了WT和TREM 2−/−BMDM牛M.体外卡介苗,检测巨噬细胞中NO的产生和分枝杆菌的杀伤作用。不生产TREM 2−/−BMDM显著高于WT BMDM(图1)。7A)。因此,细胞内bcg集落形成单位(Cfu)的数量显著减少。TREM 2−/−BMDM大于WT BMDM(图1)。7b)。TREM 2缺乏对BMDMs的吞噬活性无影响牛M.补充图7),表明较低的细菌CFU在TREM 2−/−BMDMs可能是由杀菌活性增强所致,而不是由于吞噬功能受损所致。

图7:TREM 2缺乏症加速了分枝杆菌感染的清除。

a, bWT或TREM 2−/−BMDM体外感染牛M.BCG(MOI 10)培养4h,洗涤后继续培养24h,Griess法测定培养上清液中亚硝酸盐浓度。a)。细胞被收集,溶解,和CFU牛M.卡介苗计数(b)。统计意义用双尾不成对法计算。t测试一下。cfWT或TREM 2 −/−老鼠(第3天,n=5;第14天,n(7)感染范围为7.5×10。6CFU牛M.卡介苗。于感染后第3、14天取肺组织匀浆,测定CFU。c)。的表达方式CCL 2, Adgre1,和NOS 2来自未受感染的对照者的肺部(n用qrt-PCR分析感染小鼠(df)。数据表示为平均值±扫描电镜,代表了两个独立的实验。统计意义用双尾不成对法计算。t测试一下。*p < 0.05, **p < 0.01. Source data are provided as a 源数据档案。

接下来,为了研究这一观察在体内的相关性,我们在体内感染了WT和TREM 2−/−小白鼠牛M.在感染后第3天和第14天检测感染肺的细菌负担和炎症介质。第14天肺部细菌负荷明显低于第3天,而第3天则明显低于第3天。TREM 2−/−小鼠比WT小鼠(图1)。7C)。细胞因子产生(MCP-1和TNF)、巨噬细胞浸润的分析Adgre1(F4/80)表达)NOS 2(INOS)在感染的肺中检测到较高的表达CCL 2(mcp-1)7D), Adgre1(无花果)7E),以及NOS 2(无花果)7F)在TREM 2−/−小鼠感染后第3天比WT小鼠。肿瘤坏死因子(TNF)在WT肺中均未检测到上调。TREM 2−/−小鼠在任何时间点(补充图。8A)。而在第14天肺部的表达CCL 2Adgre1低得多TREM 2−/−老鼠比WT老鼠NOS 2这种表达可以被认为是由于肺部细菌清除速度加快而引起的炎症消退。TREM 2−/−老鼠在这个时间点。同样,早期有较高的炎症反应,在较晚的时间点有较低的细菌cfu。TREM 2−/−小鼠比WT小鼠观察到,以及在腹腔内。牛M.卡介苗感染(附图)8B-e)。为了研究TREM 2缺乏对分枝杆菌T细胞免疫的影响,我们从WT和Wt中收集了纵隔淋巴结细胞。TREM 2−/−小鼠气管内感染后第14天,用分枝杆菌抗原纯化蛋白衍生物(PPD)刺激其产生干扰素(IFN)-γ和IL-17A。我们观察到TREM 2缺乏对淋巴结细胞产生这些细胞因子没有明显影响(补充图)。8F),表明加速细菌清除TREM 2−/−肺部可能是感染早期巨噬细胞的杀菌反应增强所致,而不是随后T细胞介导的免疫。这一假设可能得到的数据的支持,无论是添加MA(补充图)。8g)或TREM 2缺乏症(补充图。8F,h)明显影响接种含有分枝杆菌成分的完全弗氏佐剂(CFA)的小鼠的T细胞回忆反应。总之,TREM 2在分枝杆菌感染早期的杀菌天然免疫反应中起着重要的调节作用。

讨论

本研究利用ITAM-偶联受体-FC融合蛋白文库筛选出DAP 12相关的TREM 2为分枝杆菌的受体。TREM 2在多种髓系细胞上表达,包括巨噬细胞和小胶质细胞。66,和TREM 2据报道,缺乏症与各种神经退行性疾病有关。纯合子功能缺失突变TREM 2泰罗普 (达普12)引起Nasu-Hakola病,伴有脱髓鞘和轴突丧失。67,68。单核苷酸多态性,包括trem 2 r47h变异,会增加患痴呆的风险,包括额颞叶变性、帕金森病、阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化症。46,47,48,49。这些遗传关联突出了TREM 2及其配体识别的生理重要性。以前的报道表明TREM 2与细菌的阴离子配体结合。69、脂寡糖(LOS)淋球菌70,71,与纤维蛋白淀粉样蛋白(β)相关的几种脑脂(参考文献)。45),以及载脂蛋白72。虽然这些配体已被鉴定,但TREM 2识别的配体结构先决条件仍不清楚。在此,我们确定了含有MA的脂类为TREM 2配体,并通过结构-活性关系分析发现它们的支链烷基链是TREM 2识别所必需的。O-脱乙酰化法去除LOS中的支链烷基能减少TREM2-los相互作用71,表明Los与TREM 2的相互作用与Los的脂质结构有关。此外,脑中的TREM 2配体包括携带支链的磷脂或鞘脂。45因此,我们的发现与先前的结果一致,并可能为将来寻找未知的TREM 2配体提供深入的见解。

我们发现,糖基化和非糖基化的MA脂质对巨噬细胞的激活导致不同受体需求的反应模式不同。而Mincle对糖基化的Mas进行识别,诱导MCP-1、TNF和NO的产生,而非糖基化的Mas则被TREM 2所识别,仅诱导MCP-1的产生。以前的研究表明,人Mincle(而不是小鼠Mincle)能够识别GroMM并诱导人巨噬细胞产生TNF。73表明Mincle识别的MA配体的结构范围在人和小鼠之间可能存在差异。然而,Hattori等人。结果表明,人Mincle与GroMM的结合亲和力比TDM低100倍,说明糖类对Mincle识别的重要性。重要的是,我们的数据表明,小鼠Mincle也能够与GroMM结合在较高的浓度,虽然它不是必需的巨噬细胞对GroMM的反应。未来的研究应该澄清TREM 2和Mincle对识别人体中含有MA的脂质的贡献。

Mcp-1在mtb感染的早期阶段起着重要作用。53,54。此外,较高水平的mcp-1生产与更严重的结核病在人类病人。74。Mcp-1启动子−2518位点多态性与结核易感性有关。75,76与AA基因型相比,MCP-1基因型AG和GG患者发生结核病的几率高出2.3~5.5倍。携带AG或GG基因型的患者MCP-1浓度极高,可抑制IL-12的表达(参考文献)。76),提示MCP-1水平的升高和炎症细胞因子水平的降低促进了结核病的发展。这是一个类似的现象,观察到TREM 2承认非糖基化MAS在本研究中。分枝杆菌细胞壁组分PDIM和pgl通过选择性诱导mcp-1促进巨噬细胞的形成而增强传染性。77。这些结果表明,通过TREM 2独家产生MCP-1可能对分枝杆菌有益。

巨噬细胞的生成和Mincle-FCR、γ-CARD 9信号转导的抑制是TREM 2的关键功能。在此,我们发现TREM 2/DAP 12信号特异性地抑制了Mincle-FCRγ-CARD 9信号,而不抑制TLR信号。然而,以往的研究表明,TREM 2缺乏可促进TLRs诱导的细胞因子的产生。78,79。虽然这种差异的原因尚不清楚,但通过Mincle的上调信号可能是增强TLR反应的原因。因为Mincle能识别受损的细胞内源性配体80,81,TLR刺激诱导的Mincle表达30之后可能会放大TLR的反应。82取决于细胞状况。或者,TREM 2与TDM结合。3)TLR配体对TDM的刺激不产生明显的抑制信号,因此,TREM 2缺乏对TDM信号的影响可能比TLR对信号的影响更明显。

含MA脂质的组成随外界环境的变化而动态变化。摘要tdm是培养的分枝杆菌细胞壁中主要的糖化MA,但在富葡萄糖条件下,tdm合成下调,而gmm是由利用宿主来源的葡萄糖的菌丝转移酶产生的。7。因为糖基化的MAS具有很强的佐剂活性83,这些脂质的存在优先激活免疫反应通过Mincle,以消除分枝杆菌。在潜伏性分枝杆菌感染中,脂类成分不同。GroMM可能与潜伏的分枝杆菌有关,因为GroMM-反应性T细胞只在潜伏的结核病病例中观察到,而不是在活动性结核病病例中观察到。15,73。此外,在非复制的休眠状态下,糖化mas的水平在mtb中降低。6。因此,我们推测TREM 2对潜伏的分枝杆菌细胞壁的识别可能导致巨噬细胞的生成,从而促进慢性感染(补充图1)。9).

巨噬细胞或小胶质细胞通过TREM 2吞噬细菌或凋亡细胞碎片(参考文献2)。70,84,85,86)。巨噬细胞大致分为M1和M2两种亚型,它们对炎症反应产生相反的影响。87。M1型巨噬细胞是促炎型巨噬细胞,而M2型巨噬细胞具有抗炎作用,具有促进组织修复和稳态的吞噬活性。与γ偶联的分枝杆菌受体(包括Mincle)不同,TREM2-DAP 12信号通路似乎赋予巨噬细胞类似M2的抗炎特性.事实上,IL-4使巨噬细胞极化向M2方向倾斜,诱导巨噬细胞表达trem 2。79。此外,TREM 2缺乏症还会损害结肠粘膜损伤的愈合,同时减少M2分化,增加TNF和IFN-γ的生成。88。此外,通过脑脂识别清除死细胞或淀粉样蛋白-β,trem 2在维持脑内稳态方面发挥着重要作用。84。因此,分枝杆菌可能通过用含有MA的脂类刺激TREM 2来控制TREM 2的功能,从而获得适合其繁殖的生态位。

总之,我们的数据提示TREM2-DAP 12信号是由非糖基化的MAS激活的,这种激活与强毒或潜伏的分枝杆菌感染有关,并通过Mincle-FCRγ-CARD 9信号通路抑制糖化Mas诱导的抗真菌免疫应答。因此,本研究阐明了分枝杆菌通过以其特有的细胞壁脂质刺激宿主调节受体来控制宿主免疫应答的机制。我们的研究结果表明,靶向TREM2-DAP 12通路可能是一种新的控制分枝杆菌疾病的治疗措施。


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